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KR100588241B1 - 공동-동결건조 방법을 이용한 펩티드-지질 복합체 - Google Patents

공동-동결건조 방법을 이용한 펩티드-지질 복합체 Download PDF

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KR100588241B1
KR100588241B1 KR1020007003586A KR20007003586A KR100588241B1 KR 100588241 B1 KR100588241 B1 KR 100588241B1 KR 1020007003586 A KR1020007003586 A KR 1020007003586A KR 20007003586 A KR20007003586 A KR 20007003586A KR 100588241 B1 KR100588241 B1 KR 100588241B1
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Abstract

본 발명은 펩티드의 동결건조방법을 통하여 펩티드/지질 소포 및 복합체를 만드는 것으로 적절하게는 양친화성 알파 헬릭스 모양을 채택할 수 있는 펩티드와 한 가지 이상의 지질을 함께 동결건조시키는 것이다. 이들 펩티드 및 지질을 용해시키는 단일 용액 또는 두 가지 별개 용액을 동결건조시킬 수 있다.

Description

공동-동결건조 방법을 이용한 펩티드-지질 복합체{Peptide-Lipid Complex Formation by co-lyophilization}
본 발명은 펩티드, 적절하게는 양친화성 알파-헬릭스 구조를 형성하는 펩티드 및 한가지 이상의 지질의 공동-동결건조 방법을 통한 펩티드-지질 소포와 복합체의 형성에 관계한다. 펩티드 및 지질을 모두 용해시키는 단일 용액, 또는 2개의 별개 용액이 동결건조될 수 있다. 상기 방법은 대량 제조물 및 더 작은 단위에서 미셀, 구 및 타원형 복합체를 비롯한 안정적인 펩티드-지질 소포와 복합체를 만드는데 이용된다.
리포좀은 수용성 코어를 둘러싸는 적어도 하나의 이중층으로 구성된 소포이다. 일반적으로, 인지질은 지질 이중층으로 구성되지만, 이중층은 다른 지질로 구성될 수도 있다. 리포좀 내에서 수용액은 "포집된 용적" 이라 한다.
리포좀은 특히, 약물, 화장품, 생활성 화합물을 운반하기 위한 소포로서 개발되었다. 지질 이중층은 리포좀의 포집된 용적 내에서 약물, 화장품, 생활성 화합물을 포집하는데, 약물은 지질 이중층이 세포 표면 막과 접촉하는 경우에 리포좀 코어로부터 방출된다. 리포좀은 지질 교환, 융합, 엔도사이토시스 또는 흡착 등의 방법에 의해 세포로 리포좀내 내용물을 방출한다(Ostro et al., 1989, Am. J. Hosp. Pharm.46:1576). 또는, 약물, 화장품, 생활성 화합물 등은 소포의 지질 이중층 막에 결합되거나 막으로 삽입될 수 있다.
소포에 추가하여, 지질-포함 복합체가 특정 형태의 물질을 운반하는데 이용된다. 예를 들면, 많은 연구자들은 고밀도 리포프로테인(HDL) 입자와 유사한 크기와 밀도를 가지는 재구성된 리포프로테인-형 입자 또는 복합체를 준비하는데 상기 복합체가 유용하다는 것을 밝혔다. 이와 같은 재구성된 복합체는 일반적으로, 정제된 아포프로테인(통상적으로, 아포프로테인 A-1) 및 포스파티딜콜린과 같은 인지질로 구성된다. 때때로, 비에스테르화된 콜레스테롤이 포함되는 경우도 있다. 이와 같은 입자를 준비하는 가장 일반적인 방법은 (a) 바스(bath) 초음파분쇄에 의한 또는 프로브 소니케이터를 이용한 구성요소의 초음파분쇄, (2) 미리 형성된 지질소포로 단백질 구성요소의 자발적인 상호작용, (3) 계면활성제-매개된 재구성 및 투석을 이용한 계면활성제의 후속적 제거이다(Jonas, 1986, Meth. in Enzymol. 128:553-582; Lins et al., 1993, Biochimica et Biophysica Acta, 1151:137-142; Brouillette & Anantharamaiah, 1995, Biochimica et Biophysica Acta, 1256:103-129; Jonas, 1992, Structure & Function of Apoproteins, Chapter 8:217-250). 유사한 복합체는 아포프로테인 성분의 양친화성 헬릭스-형성 펩티드를 치환시켜 형성된다. 불행하게도, 이와 같은 각 방법은 이상적인 비용-효과 측면에서 순수한 복합체를 다량으로 제조하는데 심각한 문제가 존재한다. 또한, 이들 간행물에서는 양친화성 알파 헬릭스 구조를 형성할 수 있는 펩티드 또는 펩티드 유사체 및 지질의 공동-동결건조 방법에 대해서 기술한 바가 없다.
지질 소포와 복합체를 생산하기 위한 다양한 기술이 공지되어 있다. 상이한 형태의 소포를 만드는 다양한 프로토콜을 이용하여 소포 또는 리포좀이 생산되고 있다. 다양한 형태의 리포좀에는 다층라멜라 소포, 작은 단층라멜라 소포. 큰 단층라멜라 소포 등이 포함된다.
수용액으로 인지질(또는 다른 지질)을 수화시키면, 지질 분산 및 다층 라멜라 소포("MLV")의 자발적 형성이 유도된다. MLV는 중앙의 작은 코어를 둘러싸는 다중 지질 이중층을 보유하는 리포좀이다. 이와 같은 형태의 리포좀은 작은 단층라멜라 소포(SUV)보다 크고, 직경이 350-400nm가 된다. MLV는 둥근-바닥 플라스크에 담긴 클로로포름에서 지질을 용해시키고, 지질이 플라스크의 벽에서 얇은 막을 형성할 때까지 클로로포름을 기화시켜 만든다. 수용액을 첨가하고, 지질층을 재수화시킨다. 플라스크를 교반함에 따라 소포가 형성된다(Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (citing Bangham et al., 1965, J. Mol. Biol. 13:238). 이후, Johnson et al.,은 이와 같은 방법을 이용하면 단일 라멜라 소포를 만들 수 있다고 보고하였다(Johnson et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 233:820.).
작은 단층라멜라 소포(SUV)는 수용성 코어를 둘러싸는 단일 지질 이중층을 보유하는 리포좀이다. SUV를 만드는데 이용되는 방법에 따라, 이들의 직경은 25-110nm 범위가 된다. 우선, SUV는 질소하에 클로로포름에서 인지질 제조물을 건조시키고, 수용성 층을 첨가하여, 밀리몰 범위의 지질 농도를 유도하고, 45℃에서 용액을 초음파분쇄하여 맑게 만든다(Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York.). 이와 같은 방식으로 준비된 SUV는 직경이 25-50㎚인 리포좀을 산출한다.
SUV를 만드는 다른 방법은 포집되는 수용성 용액에 에탄올/지질 용액을 신속하게 주입하는 것이다(Deamer et al., 1983 in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (citing Batzri et al., 1973, Biochim. Biophys. Acta 298:1015). 이와 같은 방법에 의해 만들어지는 SUV는 직경 범위가 30-110nm이다.
SUV는 다층라멜라 소포를 20,000psi에서 French Press에 4회 통과시켜 생산한다. 생산된 SUV는 직경 범위가 30-50㎚가 된다(Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (citing Barenholz et al., 1979, J. FEBS Letters 99:210).
다층라멜라 및 단층라멜라 인지질 소포는 고압에서 작은 구멍이 있는 막을 통하여 인지질 수용성 제조물을 압출시켜 만들 수도 있다(Hope et al., 1996, Chemistry and Physics of Lipids, 40:89-107).
큰 라멜라 소포(LUV)는 이들이 중앙 수성 코어를 둘러싸는 단일 지질 이중층이라는 점에서는 SUV와 유사하긴 하지만, LUV가 SUV보다 휠씬 크다. 이들의 구성 비율 및 이를 만드는 방법에 따라, LUV의 직경 크기는 50-1000nm가 된다(Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York.). LUV는 통상적으로는 계면활성제 희석, 역상 기화법, 주입법 중에서 한가지를 이용하여 만든다.
계면활성제 희석 기술에서, 콜레이트, 데옥시콜레이트, 옥틸 글루코시드, 헵틸 글루코시드, Triton X-100과 같은 계면활성제 용액을 이용하여 지질 제조물에서 미셀을 만든다. 이후, 용액을 투석하여 계면활성제를 제거하고 리포좀을 만든다(Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York). 이와 같은 방법은 시간 소모가 많고, 계면활성제가 완전하게 제거되지 않는다. 최종 제조물에 계면활성제가 존재한다는 것은 리포좀 제조물에 일부 독성이 존재한다는 것이고, 리포좀 제조물에 있어서 물리화학적인 성질이 변형될 수 있음을 의미한다.
역상 기화 기술을 이용하여 수용성-비극성 용액에 지질을 용해시키고, 역전된 미셀을 만들 수 있다. 비-극성 용매를 기화시키고 미셀을 응집시켜 LUV를 만든다. 이런 방법은 일반적으로 다량의 지질이 필요하다.
주입 방법은 비-극성 용액에 용해된 지질을 포집되는 수용액 안으로 주입하는 것이다. 비-극성 용액이 기화될 때, 지질은 기체/수용성 경계면에서 수집된다. 기포가 수용액으로 제공됨에 따라, 지질 쉬트는 LUV 및 올리고라멜라 리포좀을 만든다. 리포좀은 여과로 크기를 조절한다(Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (citing Deamer et al., 1976, Biochim. Biophys. Acta 443:629 and Schieren et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 542:137). 주입 과정에는 주입을 위해 상당히 높은 온도가 요구되고, 상대적으로 낮은 포집 효과를 가진다(Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York).
사용하기 전에 상당시간 동안 저장할 수 있는 리포좀 준비물을 개발하는 것이 리포좀 연구의 목표이었다. 예를 들면, U.S. Patent No. 4,229,360(Schneider et al.,)에서는 수용성 지질에서 콜로이드성 리포좀 분산액을 첨가하고, 용액을 동결건조 방법으로 탈수시켜 탈수된 리포좀을 만드는 방법에 대해 설명하고 있다. 친수성 화합물의 실례로는 고분자량의 친수성 고분자, 또는 슈크로즈와 같은 저분자량 화합물이 있다.
미국 특허 4,411,894(shrank et al.)에서는 초음파분쇄된 리포좀 제조물에서 고농도의 슈크로즈를 이용하는 방법에 대해 설명하고 있다. 리포좀은 포집된 용적안에 지용성 생성물을 함유하는데, 이와 같은 제조물은 동결건조될 수 있지만, 상기 방법은 고농도의 슈크로즈에도 불구하고, 포집된 내용물의 상당량을 상실하게 된다.
Crowe et al., U. S. Patent No. 4,857,319에서는 리포좀이 냉동-건조될 때, 리포좀을 안정화시키기 위해 슈크로즈, 말토즈, 락토즈 및 트레할로즈와 같은 이당류를 이용하는 방법에 대해 설명한다. 지질 성분에 대한 이당류의 양(w/w)은 0.1:1 내지 4:1이 된다. Crowe는 이런 방법을 이용하여 리포좀의 일체성을 보존하는데 있어, Shrank(U. S. Patent No. 4,441,894)의 방법에 의해 제공되는 것보다 높은 성공을 거두었다.
Janoff et al, U. S. Patent No 4,880,635에서는 가급적, 지질 이중층의 내측 및 외측 모두에서, 트레할로즈와 슈크로즈와 같은 보존성 당 존재하에 리포좀을 동결건조하여 리포좀을 탈수시키는 방법을 설명한다. Janoff의 벙법에서는 충분한 양의 물이 보존되어, 건조된 리포좀을 재수화시킬 경우에 실제적인 구조의 일체성을 보유하는 리포좀을 만들 수 있다.
하지만, 추후에 재수화되는 동결건조된 펩티드-지질 복합체를 만드는데 있어서, 간편하고 비용-효과적인 방법이 당분야에서 여전히 필요하다. 본 발명의 방법은 안정하고 동결건조된 분말의 펩티드-지질 혼합물을 산출하는데, 상기 혼합물은 저장되거나, 분말로서 이용되거나, 또는 재수화이후 펩티드-지질 복합체를 만드는 데 이용될 수 있다.
3. 발명의 요약
본 발명은 고밀도 리포프로테인(HDL)과 유사한 특징을 가지는 펩티드 또는 단백질-(인)지질 복합체 또는 소포를 준비하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 용매 시스템을 이용하는데, 이때 적어도 한가지 펩티드는 한가지 용액에 용해되고, 적어도 한가지 지질은 다른 용액에 용해된다. 서로 혼합될 수 있는 두 가지 용액을 선택한다. 용액은 이후 복합시키고, 생성된 용액은 동결건조시킨다.
상기 방법은 또한, 단백질 또는 펩티드 및 지질이 모두 용해되는 용액을 포함하는 두 번째 유형의 용매 시스템을 이용하여 실행할 수도 있다. 이와 같은 용액은 단일 용액이 되거나, 또는 펩티드와 지질을 첨가하기 전에 두 가지 또는 그 이상의 용액을 복합시켜 만든 혼성 용액이 될 수 있다. 펩티드 및 지질은 용액 또는 혼성 용액에 용해되고, 그 다음 펩티드-지질 용액은 동결건조된다.
적절하게는, 본 발명의 펩티드는 양친화성 헬릭스 구조를 형성할 수 있는 펩티드이다. 본 발명의 한 구체예에서, 펩티드는 지질 결합 단백질이다. 다른 구체예에서, ApoA-Ⅰ, ApoA-Ⅱ, ApoA-Ⅳ, ApoC-Ⅰ, ApoC-Ⅱ, ApoC-Ⅲ, ApoE의 유사체 펩티드 및 다른 아포리포프로테인 유사체 등을 펩티드에 대체하여 또는 펩티드에 복합하여 이용할 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, HDL과 유사한 ApoA1 유사체-(인)지질 복합체를 만드는 방법을 이용한다. ApoA1-지질 복합체는 과콜레스테롤혈증, 과트리글리세리드혈증, 낮은 HDL, 아포리포프로테인 A-1 결핍, 폐혈증 쇼크를 포함하나 이들에 국한되지 않는 이상 리포프로테린혈증과 연관된 질병을 치료하거나, HDL 집단에 대한 표식으로서 in vitro 진단 검사에 이용하거나, 또는 영상 기술에 이용된다.
본 발명의 방법은 동물 또는 사람에 장관외 투여, 예를 들면, 정맥내, 복막내, 피하, 근육내, 거환 주사용 펩티드-지질 복합체의 제조가 가능하다. 또한, 펩티드-지질 복합체는 동물 또는 사람에 입, 직장, 점막(구강) 및 국소 투여용, 또는 in vitro 실험용으로 조제될 수도 있다.
상기 방법은 양친화성 펩티드-인지질 복합체, 지질 결합 단백질-인지질 복합체, 및/또는 ApoA-I 펩티드 유사체-인지질 복합체를 대규모로 생산하는데 이용된다. 동결건조된 물질은 대량 제조물로 제조되거나, 또는 혼합된 펩티드-지질 용액은 동결건조에 앞서 더 작은 용기(가령, 단일 약량 단위(single dose unit))에 분량하고, 이와 같은 작은 단위는 멸균 단위 약형(unit dosage form)으로 준비할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 동결건조된 분말은 주입하기 직전에 입자-없는 멸균 용액으로 재수화시키거나, 또는 동결건조된 분말은 적절한 교체 약형으로 조제되고 즉시 투여될 수 있다.
상기 방법은 지질이 없는 상태에서 불안정하거나 불용성인 화합물을 보관하는 데에도 적합하다.
상기 방법은 과콜레스테롤혈증, 과트리글리세리드혈증, 낮은 HDL, 아포리포프로테인 A-1 결핍, 심장맥관 질환(죽상경화증), 폐혈증 쇼크 또는 감염성 질환 등이 포함되나 이들에 국한되지 않는 이상리포프로테인혈증의 치료 또는 예방을 위한 백신에서 항원의 동시-제공과 같은 적용을 비롯한 사람의 질병을 예방 또는 치료하기 위한 생성물을 제조하는데 이용될 수 있다.
상기 방법은 약물용 담체로서, 예로써 간 또는 간외 세포로 약물을 운반하는 벡터(약물, DNA, 유전자 수송용)로서, 또는 독소(가령, 살충제, LPS 등)를 포집시키는 제거물질로서 이용될 수 있는 복합체의 제조에 이용될 수 있다.
3.1. 정의
본 명세서에서, "용매 시스템" 은 서로 혼합될 수 있고, 펩티드 및/또는 지질을 용해시킬 수 있는 한가지 이상의 용매를 말한다.
본 명세서에서, "펩티드-지질 복합체" 는 고밀로 리포프로테인(HDL)의 크기 범위 내에서 입자를 형성하는 지질 부분 및 펩티드의 응집물을 말한다.
본 명세서에서, "공동-동결건조된" 은 동일한 용기에 담긴 용액에서 한가지 이상의 화합물(가령, 펩티드, 단백질, 지질, 인지질)을 동결건조, 냉동-건조, 또는 진공 건조시키는 것을 말한다. 예를 들면, 지질 용액은 동일한 용기내에 펩티드 용액과 복합시키고, 생성된 용액 복합체은 함께 동결건조시켜 펩티드와 지질을 동시에 동결건조시킨다.
본 명세서에서, "양친화성 지질" 또는 "양친화성 알파 헬릭스 펩티드" 는 각각, 양친화성 또는 양친화성 헬릭스 구조를 형성할 수 있는 펩티드를 말한다. 양친화성 알파 헬릭스는 생물학적 활성 펩티드 및 단백질에서 흔히 목격되는 2차 구조 모티프이다(Amphipathic helix motif: classes and properties by Jere P. Segrest, Hans de Loof, Jan G. Dohlman, Christie G. Brouillette, and G.M.Anantharamaiah. PROTEINS : Structure Functions and Genetics 8:103-117 (1990)). 양친화성 알파 헬릭스는 반대되는 극성 및 비극성 면이 헬릭스의 종축을 따라 배치된 알파 헬릭스이다. 전하를 띈 잔기는 극성 면을 따라 특정하게 분포된다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 양친화성 헬릭스는 수화된 큰 인지질의 극성-비극성 경계면을 보완한다; 이와 같은 지질-연합된 도메인은 지방 아실 사슬과 극성 머리 기 사이에 위치한 경계면에서 인지질을 부분적으로 침잠시킴으로써 인지질과 상호작용하는 것으로 추정된다(Jere P. Segrest. Febs Letter 1976, 69(1):111-114).
본 명세서에서, "펩티드" 및 "단백질" 은 상호 호환된다. 또한, 본 발명의 펩티드 유사체는 펩티드, 단백질, 비-펩티드, 가령, 펩티드 유사물질이 된다. 하지만, 모든 유사체는 가급적, 생활성 분자이다.
본 명세서에서, "지질" 은 천연과 합성 인지질을 포함하나 이들에 국한되지 않는다. 또한, "지질" 및 "인지질" 은 상호 호환된다.
도 1은 200㎕ 사람 혈청으로부터 밀도 한외원심분리에 의해 준비된 HDL의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
도 2(하단)는 1:1(w:w)의 비율로 준비된 복합체(DPPC: 펩티드 1)(PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; 서열:1)의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
도 2(상단)는 2:1(w:w)의 비율로 준비된 복합체(DPPC: 펩티드 1)의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
도 3(하단)은 3:1(w:w)의 비율로 준비된 복합체(DPPC: 펩티드 1)의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
도 3(상단)은 4:1(w:w)의 비율로 준비된 복합체(DPPC: 펩티드 1)의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
도 4(하단)는 5:1(w:w)의 비율로 준비된 복합체(DPPC: 펩티드 1)의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
도 4(상단)는 7.5:1(w:w)의 비율로 준비된 복합체(DPPC: 펩티드 1)의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
도 5는 10:1(w:w)의 비율로 준비된 복합체(DPPC: 펩티드 1)의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
도 6은 14C-라벨된 펩티드 1 복합체(Ri = 3:1)의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
도 7은 14C-라벨된 펩티드 1 복합체(Ri = 4:1)의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
도 8은 14C-라벨된 펩티드 1 복합체(Ri = 5:1)의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다.
본 발명에서 유용한 양친화성 알파 헬릭스 펩티드 또는 단백질, 지질 결합 단백질, ApoA-I 작용물질 펩티드, 아포리포프로테인 유사체 등은 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 반감기가 긴 안정한 펩티드 제조물을 재구성을 위한 대량 물질을 만들거나, 또는 개체에 투여하기에 앞서 무균 수 또는 적절한 무균 완충액으로 재구성될 수 있는 개별 분량이나 단위 약형을 만들기 위해 펩티드를 동결건조시켜 만든다.
본 발명자의 지식에 따르면, 본 발명은 양친화성 알파 헬릭스 펩티드 또는 펩티드 유사체 및 지질을 공동-동결건조시켜, 멸균 펩티드-지질 복합체로 재구성될 수 있는 혼합물을 형성하는 최초의 방법이다.
특정 구체예에서, 펩티드-지질 복합체에서 ApoA-I 작용물질을 포함하나 이들에 국한되지 않는 ApoA-Ⅰ 유사체를 제조하고 투여하는 것이 바람직하다. 이와 같은 방법은 특히, 복합체가 HDL 부류의 단백질, 구체적으로 pre-beta HDL 집단과 유사한 크기를 갖는 경우에, 복합체가 순환계에서 증가된 반감기를 보유하기 때문에 여러 장점을 가진다. HDL 부류의 피로프로테인은 크기, 밀도, 전기영동 이동성과 같은 특성에 기초하여 여러 아류로 구분될 수 있다. 예를 들면, 크기가 증가되는 순으로, 미셀 pre-beta HDL(직경 50 내지 60Å), 중간 크기의 디스크형 HDL(65kDa, 약 70Å), 구형 HDL3 또는 HDL2(직경 90 내지 120Å)이다(J. Kane, 1996 in V. Fuster, R. Ross and E. Topol 〔eds.〕 Atherosclerosis and Coronary Artery Disease, p. 99; A. Tall and J. Breslow, ibid., p. 106; Barrans et al., Biochemica et Biophysica Acta 1300, p. 73-85; and Fielding et al., 1995, J.Lipid Res 36, p,. 211-228). 하지만, HDL보다 작거나 큰 펩티드-지질 복합체 역시 본 발명에 따라 만들 수 있다.
본 발명의 펩티드-지질 복합체는 하기에서 설명하는 공동-동결건조 방법을 이용하여 반감기가 긴 안정한 제조물로 통상적으로 만들 수 있다. 동결건조된 펩티드-지질 복합체를 이용하면, 제약학적 재구성을 위한 대량 약물 재료를 준비하거나, 또는 개별 분량 또는 약형을 준비할 수 있는데, 이들은 개체에 투여하기에 앞서 무균 수 또는 적절한 완충 용액으로 재수화에 의해 재구성될 수 있다.
본 출원인은 HDL과 유사한 특징을 가지는 펩티드 또는 단백질-(인)지질 복합체를 준비하는 간편한 방법을 개발하였다. 이와 같은 방법을 이용하여 ApoA-I 펩티드-지질 복합체를 준비할 수 있는데, 이는 다음과 같은 장점을 가진다: (1) 대부분의 포함된 성분 또는 전체 성분을 이용하여, 설계된 복합체를 형성하고, 따라서 다른 방법에서 흔히 발생하는 시작 물질의 낭비를 피할 수 있다. (2) 동결건조된 화합물은 저장하는 동안에 매우 안정하다. 생성 복합체은 사용 직전에 재구성될 수 있다. (3) 생성된 복합체은 제조 이후에 또는 사용에 앞서 추가 정제 과정이 필요하지 않다. (4) 콜레이트와 같은 계면활성제를 비롯한 독성 화합물을 이용하지 않는다. 또한, 본 발명의 생산 방법은 용이하게 규모를 확대할 수 있어, GMP 제조(가령, 내독소가 없는 환경)에 적합하다.
적절한 방법에 따라, 펩티드와 지질은 각 성분을 공동-용해시키는 용매 시스템에 복합시킨다. 이를 위해, 용매 짝은 양친화성 펩티드와 소수성 지질 모두의 공동-용해성을 담보하기 위하여 신중하게 선택해야 한다. 한 구체예에서, 입자로 통합되는 단백질 또는 펩티드는 수용성 또는 유기 용매, 또는 용매 혼합물(용매 1)에 용해시킬 수 있다. (인)지질 성분은 수용성 또는 유기 용매, 또는 용매 혼합물(용매 2)에 용해시키는데, 이때 용매 2는 용매 1과 혼합될 수 있고, 이들 두 용액을 복합시킨다. 또는, (인)지질 성분을 바로 펩티드(단백질) 용액에 직접 용해시킬 수 있다. 또는, 펩티드와 지질을 공동-용매 시스템, 다시 말하면, 혼합될 수 있는 용매의 혼합물에 통합될 수 있다. 펩티드 또는 단백질의 지질 결합 성질에 따라, 당업자는 동결건조 이전에 강화된 또는 완전한 용해과정(또는 강화된 혼합)이 필수적이라는 것을 인지할 것이고, 따라서 용매를 적절히 선택할 수 있다.
지질에 대한 펩티드(단백질)의 적절한 비율은 일단 경험적으로 결정하는데, 생성된 복합체는 적절한 물리적 화학적 성질을 보유하지만 크기에서 HDL2 또는 HDL3과 항상 유사한 것은 아니다. 지질:단백질/펩티드의 몰비는 복합체의 원하는 타입에 따라 약 2 내지 약 200, 적절하게는 5 내지 50이다. 이와 같은 크기 부류의 펩티드-지질 또는 단백질-지질 복합체에는 미셀 또는 디스크형 입자(통상적으로, HDL2 또는 HDL3 보다 작은), HDL2 또는 HDL3과 유사한 크기의 구형 입자, HDL2 보다 큰 복합체 등이 포함되나, 이들에 국한되지 않는다. 크로마토그래피(도 1) 동안에 기준으로 이용된 HDL은 주로 구형의 완숙한 HDL2이다. Pre-β1 HDL은 아포리포프로테인 및 소수의 인지질로 된 미셀 복합체이다. Pre-β2 HDL은 아포리포프로테인 및 인지질 분자의 디스크형 복합체이다. 더 많은 지질(트리글리세리드, 콜레스테롤, 인지질)이 결합될수록, 더 큰 HDL이 되고, 이들의 형태가 변한다(Pre-β1 HDL(미셀 복합체)⇒Pre-β2 HDL(디스크형 복합체)⇒HDL3(구형 복합체)⇒HDL2(구형 복합체).
일단 용매가 선택되고 펩티드와 지질이 결합되면, 생성된 혼합물은 냉동시키고, 동결건조시켜 건조하게 만든다. 일부의 경우에, 추가 용매를 혼합물에 첨가하여, 동결건조를 조장한다. 이와 같이 동결건조된 생성물은 장시간동안 저장할 수 있고, 안정하게 유지된다.
작업 실시예에 따르면, 펩티드 1(PVLDLFRELLNELLEALKQKLK(서열:1) 및 (인)지질은 메탄올에 별도로 용해시키고 복합시키며, 이후 동결건조에 앞서 실렌과 혼합한다. 펩티드와 지질 모두 2가지 용매의 혼합물에 첨가할 수 있다. 또는, 메탄올에 용해된 펩티드 용액은 실렌에 용해된 지질 용액과 혼합할 수 있다. 펩티드가 염에 의해 분리되지 않도록 세심한 주의를 해야 한다. 메탄올-실렌에 동시 용해된 펩티드와 지질을 함유하는 생성된 용액은 동결건조시켜 분말을 만든다.
동결건조된 생성물은 재구성시켜, 펩티드-지질 복합체의 용액 또는 현탁액을 얻는다. 이를 위해, 동결건조된 분만은 수용액으로 재구성시켜, 적절한 용적(정맥 주사용으로 적합한 약 5mg 펩티드/㎖)을 만든다. 적절한 구체예에서, 동결건조된 분말은 인산염 완충액 또는 생리학적 염 용액으로 재수화시킨다. 혼합물은 교반시키거나 볼텍스하여 재수화를 조장하고, 대부분의 경우에, 재구성 단계는 복합체에서 지질 성분의 상 전이 온도(Tm)와 동일하거나 그 이상의 온도에서 실행한다. 수분 내에, 재구성된 지질-단백질 복합체 용액(복합체가 작은 경우에 맑은 용액)이 만들어진다.
만들어진 재구성된 제조물은 분량을 특성화함으로써, 제조물에 존재하는 복합체가 원하는 크기 분포, 가령, HDL의 크기 분포를 보유하는 지를 확인할 수 있다. 겔 여과 크로마토그래피가 이런 목적으로 이용될 수 있다. 여기에서 설명하는 작업 실시예에서, Pharmacia Superose 6 FPLC 겔 여과 크로마토그래피 시스템을 이용한다. 이용된 용출액은 탈이온수에 150mM NaCl을 함유한다. 전형적인 샘플 용적은 5㎎/㎖ 펩티드를 포함하는 20 내지 200㎕ 복합체이다. 칼럼 유속은 분당 0.5㎖이다. 분자량 및 Stokes 직경을 알고 있는 일련의 단백질 및 사람의 HDL을 기준으로 이용하여 칼럼을 조정한다. 단백질과 리포프로테인 복합체는 254 또는 280㎚에서 흡수도 또는 광 스캔으로 모니터한다.
본 발명에 이용되는 용매는 비-극성, 극성, 비-양성자성, 양성자성 용매 등을 포함하나 이들에 국한되지 않으며, 예를 들면, 에탄올, 메탄올, 사이클로헥산, 1-부탄올, 이소프로필 알코올, 실렌, THF, 에테르, 염화메틸렌 벤젠 및 클로로포름 등이다. 본 발명에는 또한, 용매 혼합물 및 단일 용매를 이용하는 것이 포함된다. 또한, 본 발명에 이용하기에 앞서, 유기 용매를 건조시켜 수분을 제거한다; 하지만, 수화된 용매 또는 물은 특정 지질, 펩티드, 단백질과 함께 이용될 수 있다. 다른 말로 하면, 물이 적절한 용매이거나, 또는 수화된 용매 또는 유기 용매-물 혼합물이 이용될 수 있는데, 이런 경우에 계면활성제는 존재하지 않는다. 전술한 것과 같이, 용매는 순도가 높은 것이 바람직하고(동결건조이후에 불순물이 농축되는 것을 피하기 위해), 용매는 염이 없고 미립자가 없어야 한다. 하지만, 용매는 멸균할 필요가 없는데, 그 이유는 생성 혼합물이 제약한 분야에 공지된 기술에 따라, 동결건조 이전, 동결건조 동안, 또는 동결건조 이후에 멸균될 수 있기 때문이다. 이는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th and 18th Eds., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980 and 1990) 및 미국 Pharmacopeia/National Formulary(USP/NF) XVII에서 상세하게 설명하고 있다.
본 발명에 이용되는 지질에는 다음과 같은 천연과 합성 지질 및 인지질이 포함되나 이들에 국한되지 않는다; 작은 알킬 사슬 인지질, 난 포스파티딜콜린, 콩 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디올레포스파티딜에탄올아민, 디라우일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린 스핑고리피드, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딕산, 디팔미토일포스파티딕산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 포스파티딕산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세리드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 글리코리피드, 콜레스테롤, 및 이의 유도체.
본 발명에 이용할 수 있는 적절한 펩티드에는 3가지 출원 9196-0004-999, 9196-0005-999, 9196-0006-999에서 설명된 것을 포함하나 이들에 국한되지 않는다.
모든 경우에 필수적인 것은 아니지만, 침전물은 지질과 펩티드 용액을 혼합하거나 교반하기에 앞서, 또는 동결건조에 앞서 제거하거나 용해시켜야 한다.
상기 방법은 펩티드-지질 복합체, 양친화성 펩티드-(인)지질 복합체, 지질 결합 단백질-(인)지질 복합체, ApoA-I 펩티드 유사체-(인)지질 복합체를 대규모로 생산하는데 이용될 수 있다. 동결건조된 물질은 대량 제조물을 위해 준비하거나, 또는 혼합된 펩티드-지질 용액은 동결건조에 앞서 더 작은 용기(예를 들면, 단일 약량 단위)에 분량하고, 이와 같은 더 작은 단위는 멸균된 단일 약형으로 준비할 수 있다.
본 발명의 진공 건조된 조성물은 적절한 용기에 멸균된 미리-진공 건조된 용액을 규정된 함량으로 무균 충전하고; 원하는 진공 조성물을 제공하고; 이후, 단일 약량 또는 다중 약량 용기를 무균 밀봉함으로써 단일 약량 또는 다중 약량 용기로 제공된 수 있다. 이와 같은 충전된 용기는 in situ에서 적절한 멸균 희석물로 재구성 직후에 건조된 조성물을 신속하게 재용해시킬 수 있어, 투여에 적합한 적절한 농도의 멸균 용액을 제공한다. 본 명세서에서, "적절한 용기" 는 무균 환경을 유지시킬 수 있는 용기, 예를 들면, 마개로 무균 밀봉된 진공 건조된 생성물을 운반할 수 있는 바이알을 의미한다. 추가로, 적절한 용기는 진공 건조된 조성물의 재구성 직후에 보유되는 용액의 용적을 고려한 적절한 크기 및 적절한 용기 재료, 일반적으로는 Type I 유리를 암시한다. 이용되는 마개, 예를 들면, 멸균 고무 또는 이와 등가물은 전술한 밀봉을 제공하면서도 원하는 용액의 재구성을 위한 희석물질, 예를 들면, 주사용 무균 수, USP, 정상 식염수, USP 또는 5% 덱스트로스/물, USP 등을 도입할 수 있어야 한다. 본 발명의 제약학적 조성물과 같은 제약학적 생성물용 용기의 이와 같은 적합성 특징은 당분야에 공지된 것이다. 특정 구체예에서, 생성물 단위 약량의 크기는 펩티드가 약 10mg 내지 2g, 바람직하게는 약 100mg 내지 1g, 재구성이후 약 1 내지 50mg/㎖, 바람직하게는 약 2 내지 25mg/㎖이 된다.
본 발명의 방법은 동물 또는 사람에 장관외 투여, 예를 들면, 정맥내, 복막내, 피하, 근육내, 거환 주사용 펩티드-지질 복합체의 제조가 가능하다. 또한, 펩티드-지질 복합체는 동물 또는 사람에 입, 직장, 점막(구강) 및 국소 투여용, 또는 in vitro 실험용으로 조제될 수도 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 동결건조된 분말은 주입하기 직전에 재수화시키거나, 또는 동결건조된 분말은 직접 투여될 수 있다. 동결건조된 분말에는 소포, 리포좀, 구형이나 디스크형 입자를 비롯한 입자, 미셀 등의 형태로 복합체를 형성할 수 있는 지질 및 펩티드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 동결건조된 분말을 재구성하거나 재수화시키기 위해, 최종 용도에 맞게 용액을 선택한다. 제약학적 용도의 경우에, 임의의 무균 용액이 이용될 수 있다. 또한, 완충 용액이 특정 용도에서는 바람직할 수 있는데, 여기에는 인산, 구연산, 트리스, 바르비탈, 아세테이트, 글리신-HCl, 숙신산염, 카코딜레이트, 붕산-보락스(boric acid-borax), 아메디올 및 탄산염 등이 포함되나 이들에 국한되지는 않는다.
본 발명의 동결건조된 분말은 당분야에 공지된 임의 동결건조 방법을 이용하여 만들 수 있는데, 여기에는 펩티드-지질을 함유하는 용액을 냉동시키고, 이후 감압 기화시키는 냉동-건조법이 포함된다.
상기 방법은 지질이 없는 상태에서 불안정하거나 불용성인 화합물을 보관하는 데에도 적합하다.
상기 방법은 과콜레스테롤혈증, 과트리글리세리드혈증, 낮은 HDL, 아포리포프로테인 A-1 결핍, 심장맥관 질환(죽상경화증), 폐혈증 쇼크 또는 감염성 질환 등이 포함되나 이들에 국한되지 않는 이상리포프로테인혈증의 치료 또는 예방을 위한 백신에서 항원의 동시-제공과 같은 적용을 비롯한 사람의 질병을 예방 또는 치료하기 위한 생성물을 제조하는데 이용될 수 있다.
상기 방법은 약물용 담체로서, 예로써 간 또는 간외 세포로 약물을 운반하는 벡터(약물, DNA, 유전자 수송용)로서, 또는 독소(가령, 살충제, LPS 등)를 포집시키는 제거물질로서 이용될 수 있는 복합체의 제조에 이용될 수 있다. 또는, 상기 방법은 in vitro 검사 시스템용으로, 또는 영상 기술에 이용되는 복합체를 만드는 데 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 ApoA-I 유사체(작용물질이 포함되나 이들에 국한되지 않음) 복합체를 준비하는데 이용할 수 있는데, 상기 복합체는 in vitro 진단 검사에 이용되고 HDL 집단의 표식으로 이용된다. 특정 구체예에서, ApoA-I 작용물질 복합체는 면역검사 또는 영상 기술(가령, CAT 스캔, MRI 스캔)에 이용된다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로 이를 한정하지 않는다.
6. 실시예
다음의 프로토콜을 이용하여 펩티드-지질 복합체를 만든다.
펩티드 1(PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; 서열:1)(22.4 mg)을 메탄올에 3.5mg/㎖ 농도로 수분간 배양하고, 간헐적으로 교반하여 용해시킨다. 상기 용액에 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)/메탄올(100mg/㎖ 원액)을 첨가하여, 최종 DPPC/펩티드 비율이 2.5:1(w/w)이 되도록 한다. 상기 용액을 볼텍스하여 혼합한다. 실렌은 최종 농도가 36%가 되도록 용액에 첨가한다. 생성된 용액의 분량은 겔 여과 크로마토그래피에 의한 추후 분석을 위하여 이전한다. 용액은 액체 질소에 냉동시키고, 동결건조로 진공에서 건조시킨다. 20㎎ 펩티드 1(서열:1)을 포함하는 분량 및 50mg DPPC는 무균 염용액(0.9% NaCl)에서 재수화시키고, 혼합하고, 수분간 41℃로 가열하여, 재구성된 펩티드-인지질 복합체 용액을 맑게 하였다.
6.1. 겔 여과 및 인지질 이용
6.1.1. 재료 및 방법
복합체의 제조 조건을 검사하기 위하여, 특성화를 위한 소량의 복합체를 준비하는 것이 편의하다. 이와 같은 제조물은 펩티드 1mg을 포함하고, 다음과 같이 만든다:
1㎎ 펩티드 1(서열:1)은 뚜껑이 달린 1mg 투명 유리 바이알(Waters #WAT025054)에서 250㎕ HPLC 등급 메탄올(Perkin Elmer)에 용해시킨다. 펩티드를 용해하는데 있어, 실온에서 10분간 간헐적으로 교반하면 도움이 된다. 이후, 용해되지 않은 소량의 미립자가 여전히 관찰될 수 있지만, 이는 결과에는 나쁜 영향을 주지는 않는다. 상기 혼합물에, 100㎎/㎖ 원액/메탄올로부터 1, 2, 3, 4, 5, 7.5, 10, 또는 15㎎ 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC; Avanti Polar Lipids, 99% 순도, #850355)을 함유하는 분량을 첨가한다. 메탄올을 첨가하여 혼합물의 용적을 400㎕로 하고, 혼합물은 실온에서 10분간 간헐적으로 교반한다. 이때, 매우 적은 용해되지 않은 물질이 튜브에서 관찰될 수도 있다. 각 튜브에, 200㎕ 실렌(Sigma-Aldrich 99% 순도, HPLC-grade)을 첨가하고, 튜브를 각 10초간 교반한다. 20 가우지 바늘을 이용하여 각 튜브의 꼭대기에 2개의 작은 구멍을 내고, 튜브는 액체 질소하에서 각 15초간 냉동시키고, 튜브는 진공하에서 하룻밤동안 냉동건조시킨다. 각 튜브에 200㎖ 0.9% NaCl 용액을 첨가한다. 튜브는 각 20초간 교반한다. 이때, 튜브에 있는 용액은 우윳빛을 띤다. 이후, 튜브는 41℃에서 30분간 수조에서 위치시켰다. 모든 튜브에서 용액이 맑아지는데(물과 비슷한 외양), 단 15mg DPPC을 포함하는 튜브만 흐린 상태를 유지한다.
복합체 제조물에 이용된 모든 인지질이 크로마토그램 흡수 피크에 상응하는 칼럼 분획물에서 실제로 나타나는지를 결정하기 위해, 재구성된 펩티드-지질 복합체에서 용출된 칼럼 용출물은 1 또는 2㎖ 분획물에 수집하고, 분획물은 제조업자의 지시에 따라 BioMerieux Phospholipides Enzymatique PAP 150 Kit(#61491)로 인지질의 함량을 효소적으로 검사한다.
복합체 제조는 대규모로 실행될 수 있다. 이와 같은 제조의 한가지 실례는 전술하였다. 이와 같은 복합체는 in vivo 실험에 이용할 수 있다.
6.2. 복합체 특징 조사 결과
도 1은 200㎕ 사람 혈청으로부터 밀도 한외원심분리에 의해 준비한 완전한 HDL의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다. 크로마토그래프는 254㎚에서 흡수도를 나타낸다. 용출 용적은 14.8㎖인데, 이는 108Å의 Stokes 직경에 상응한다(표 1 참고).
도 2 하단은 전술한 바와 같이, 1:1(w:w)의 비율(Ri는 시작 혼합물에 존재하는 전체 펩티드에 대한 전체 인지질의 비율)에서 준비된 DPPC:펩티드 1 복합체의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다. 흡수 피크의 용출 용적은 각 16.2㎖ 및 18.1㎖인데, 이는 HDL보다 작은 74Å와 82Å Stokes 직경의 입자에 상응한다. 칼럼에 제공된 인지질의 87%는 흡수 피크를 포함하는 분획물에서 회수되었다(표 1 참고).
도 2 상단은 전술한 바와 같이, Ri=2:1(w:w)의 비율에서 준비된 DPPC:펩티드 1 복합체의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다. 흡수 피크의 용출 용적은 각 16.4㎖(직경 77Å)이고, HDL보다 작은 입자에 상응한다. 칼럼에 제공된 인지질의 70%는 흡수 피크를 포함하는 분획물에서 회수되었다(표 1 참고).
도 3 하단은 전술한 바와 같이, Ri=3:1(w:w)의 비율에서 준비된 DPPC:펩티드 1 복합체의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다. 흡수 피크의 용출 용적은 16.0㎖(직경 80Å)이고, HDL보다 작은 입자에 상응한다. 칼럼에 제공된 인지질의 79%는 흡수 피크를 포함하는 분획물에서 회수되었다(표 1 참고).
도 3 상단은 전술한 바와 같이, Ri=4:1(w:w)의 비율에서 준비된 DPPC:펩티드 1 복합체의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다. 흡수 피크의 용출 용적은 15.7㎖(직경 90Å)이고, HDL보다 작은 입자에 상응한다. 칼럼에 제공된 인지질의 106%는 흡수 피크를 포함하는 분획물에서 회수되었다(표 1 참고).
도 4 하단은 전술한 바와 같이, Ri=5:1(w:w)의 비율에서 준비된 DPPC:펩티드 1 복합체의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다. 흡수 피크의 용출 용적은 각 15.1㎖(직경 104Å)이고, HDL보다 작은 입자에 상응한다. 칼럼에 제공된 인지질의 103%는 흡수 피크를 포함하는 분획물에서 회수되었다(표 1 참고).
도 4 상단은 전술한 바와 같이, Ri=7.5:1(w:w)의 비율에서 준비된 DPPC:펩티드 1 복합체의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다. 흡수 피크의 용출 용적은 각 13.6㎖(직경 134Å)이고, HDL보다 작은 입자에 상응한다. 칼럼에 제공된 인지질의 92%는 흡수 피크를 포함하는 분획물에서 회수되었다(표 1 참고).
도 5는 전술한 바와 같이, Ri=10:1(w:w)의 비율에서 준비된 DPPC:펩티드 1 복합체의 Superose 6 크로마토그래피를 나타낸다. 흡수 피크의 용출 용적은 각 13.4㎖(직경 138Å)이고, HDL보다 작은 입자에 상응한다. 칼럼에 제공된 인지질의 103%는 흡수 피크를 포함하는 분획물에서 회수되었다(표 1 참고).
15:1 DPPC:펩티드 1을 가지는 샘플을 포함하는 복합체는 탁도로 인하여 Superose 6 크로마토그래피를 하지 않았는데, 이는 큰 입자가 존재한다는 것을 암시한다.
상기 각 실험에서, 흡수 피크를 가지는 용출 물질을 포함하는 분획물 이외의 분획물에서는 별다른 인지질이 관찰되지 않는다(도 2-8). 이는 거의 모든 인지질(검사의 실험 오차 범위내에서)이 복합체에 통합된다는 것을 암시한다. 상기 실험결과는 펩티드에 대한 인지질의 초기 비율을 변화시킴으로써, 다양한 크기의 균질한 복합체(HDL보다 크거나 작은)를 만들 수 있다는 것을 입증한다.
6.3. 14C-라벨된 펩티드 1을 이용한 복합체의 특징 조사
14C-라벨된 펩티드 1(서열:1)(특이적 방사능활성 159,000DPM/mg, 50% 펩티드 함량으로 추정)을 포함하는 펩티드-인지질 복합체는 전술한 바와 같이, 공동-동결건조시켜 준비하였다. 제조물은 각각 1mg 펩티드 및 3, 4, 5mg DPPC를 함유한다(중량). 200㎕ 0.9% NaCl에서 복합체를 재구성한 이후, 20㎕(100㎍) 복합체를 Pharmacia Superose 6 칼럼에 적용하는데, 여기서 액상으로는 0.9% NaCl이 이용되고, 유속은 분당 0.5㎖이 된다. 5㎖ 지연(칼럼 공극 용적(void volume)=7.7㎖)이후, 1㎖ 분획물을 수집하였다. 20㎕ 분획물을 함유하는 분량은 bioMerieux Phospholipides Enzymatique PAP 150kit(#61491)를 이용하여 인지질의 함량을 검사한다. 각 분획물의 나머지는 Easy Count 프로그램을 이용한 Wallach 1410 액체 신틸레이션 카운터(pharmacia)에서 3분간 계산한다. 이들 분석 결과는 도 6-8에 도시한다. 몇몇 분획물에서 상당량의 인지질 및 펩티드가 함께 회수되었는데, 각 3:1, 4:1, 5:1 DPPC:펩티드 비율에서 준비된 복합체에 대한 피크는 대략 16㎖, 16㎖, 15㎖이다. 이들 샘플에서 UV 흡수도 프로필은 복합체가 각각 3:1, 4:1, 5:1 DPPC:펩티드 비율에서 준비된 복합체에 대하여 15.1㎖, 14.7㎖, 14.4㎖ 용적에서 칼럼으로부터 용출된다는 것을 나타낸다(UV 흡수도 유동 셀과 분획물 수집기 사이에서 튜빙의 무효 용적(dead volume)은 1.3㎖이다, 이는 방사능활성/인지질 검사 및 UV 흡수도에 의한 측정에서 용출 용적간의 불일치를 설명한다). 이와 같은 용출 용적은 각각 3:1, 4:1, 5:1 Ri 복합체에서 106, 114, 120 Å의 Stokes 직경에 상응한다.
Figure 112006500491975-pct00027
*HDL 입자에 대한 상대적인 크기
**ND, 결정하지 않음
본 발명은 여기에서 설명하는 특정 구체예에 국한되지 않고, 이와 같은 구체예는 본 발명의 개별적인 특징으로 설명하고자 함이며, 이의 기능적인 등가 방법과 성분 역시 본 발명에 속한다. 본 명세서에서 설명하는 것에 추가하여 다양한 변형과 수정은 본 발명의 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자가 충분히 실시할 수 있으며, 이들 역시 본 발명에 속한다.
여기에서 언급하는 모든 문헌은 참고를 목적으로 첨부한다.

Claims (38)

  1. 동결건조된 펩티드-지질 생성물을 준비하는 방법에 있어서,
    용매 시스템(solvent system)에서 양친매성 구조(amphipathic conformation)를 형성할 수 있는 한가지이상의 펩티드 및 한가지이상의 지질을 공동-동결건조시켜 동결건조된 펩티드-지질 생성물을 형성하고, 상기 지질은 계면활성제의 부재하에 상기 용매에 용해되고, 상기 동결건조된 생성물은 재수화시켜 펩티드-지질 복합체를 형성할 수 있고;
    상기 펩티드는 ApoA-Ⅰ, ApoA-Ⅱ, ApoA-Ⅳ, ApoC-Ⅰ, ApoC-Ⅱ, ApoC-Ⅲ, ApoE에서 선택되고;
    상기 지질은 난 포스파티딜콜린, 콩 포스파티딜콜린, 에테르 인지질, 작은 알킬 사슬 인지질, 콜레스테롤, 콜레스테롤유도체, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디올레포스파티딜에탄올아민, 디라우일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린 스핑고리피드, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딕산, 디팔미토일포스파티딕산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 포스파티딕산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세리드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 글리코리피드, 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 동결건조 이전, 동결건조 동안, 또는 동결 건조 이후에 생성물을 살균시키는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 펩티드-지질 복합체는 멸균된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 동결건조에 앞서 개별 용기에 펩티드-지질 생성물을 분량하여 단일 단위 약형(single unit dosage)을 형성하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 계면활성제로 인한 독성없이, 과콜레스테롤혈증, 과트리글리세리드혈증, 낮은 HDL, 아포리포프로테인 A-1 결핍, 심장맥관 질환, 폐혈증 쇼크 또는 감염성 질환과 같은 인간 질환의 치료 또는 예방을 위한 제 1 항 또는 제 7 항에 따라 준비된 멸균 동결건조된 펩티드-지질 생성물을 함유하는 제약학적 단위 약형(pharmaceutical unit dosage form).
  11. 동결건조된 펩티드-지질 생성물을 준비하는 방법에 있어서,
    (a) 한가지이상의 양친매성 펩티드를 제 1 용액에 용해시키고;
    (b) 계면활성제의 부재하에, 한가지이상의 지질을 제 2 용액에 용해시키고;
    (c) 제 1 용액과 제 2 용액을 복합하여 가용성 펩티드-지질 용액을 만들고;
    (d) 상기 펩티드-지질 용액을 공동-동결건조시켜 동결건조된 펩티드-지질 생성물을 만들고, 상기 생성물은 재수화시켜 펩티드-지질 복합체를 형성할 수 있고;
    상기 펩티드는 ApoA-Ⅰ, ApoA-Ⅱ, ApoA-Ⅳ, ApoC-Ⅰ, ApoC-Ⅱ, ApoC-Ⅲ, ApoE에서 선택되고;
    상기 지질은 난 포스파티딜콜린, 콩 포스파티딜콜린, 에테르 인지질, 작은 알킬 사슬 인지질, 콜레스테롤, 콜레스테롤유도체, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디올레포스파티딜에탄올아민, 디라우일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린 스핑고리피드, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딕산, 디팔미토일포스파티딕산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 포스파티딕산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세리드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 글리코리피드, 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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  17. 제 11 항에 있어서, 펩티드-지질 용액은 멸균된 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 11 항에 있어서, 펩티드-지질 복합체는 멸균된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 11 항에 있어서, 동결건조에 앞서 개별 용기에 펩티드-지질 생성물을 분량하여 단일 단위 약형(single unit dosage)을 형성하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 11 항에 있어서, 동결건조 이전, 동결건조 동안, 또는 동결 건조 이후에 생성물을 살균시키는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 계면활성제로 인한 독성없이, 과콜레스테롤혈증, 과트리글리세리드혈증, 낮은 HDL, 아포리포프로테인 A-1 결핍, 심장맥관 질환, 폐혈증 쇼크 또는 감염성 질환과 같은 인간 질환의 치료 또는 예방을 위한 제 11 항 또는 제 19 항에 따라 준비된 멸균 동결건조된 펩티드-지질 생성물을 함유하는 제약학적 단위 약형(pharmaceutical unit dosage form).
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  37. 동결건조된 펩티드-지질 생성물을 준비하는 방법에 있어서,
    펩티드-지질 생산물이 형성될 만큼 충분한 시간동안, 용매 시스템에서 양친매성 구조(amphipathic conformation)를 형성할 수 있는 한가지이상의 펩티드 및 한가지이상의 지질을 공동-동결건조시켜 동결건조된 펩티드-지질 생성물을 형성하고, 상기 지질은 계면활성제의 부재하에 상기 용매에 용해되고, 지질:펩티드의 비율은 2 내지 200이고, 상기 동결건조된 생성물은 용액에서 재수화시켜 펩티드-지질 복합체를 형성할 수 있고;
    상기 펩티드는 ApoA-Ⅰ, ApoA-Ⅱ, ApoA-Ⅳ, ApoC-Ⅰ, ApoC-Ⅱ, ApoC-Ⅲ, ApoE에서 선택되고;
    상기 지질은 난 포스파티딜콜린, 콩 포스파티딜콜린, 에테르 인지질, 작은 알킬 사슬 인지질, 콜레스테롤, 콜레스테롤유도체, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디올레포스파티딜에탄올아민, 디라우일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린 스핑고리피드, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딕산, 디팔미토일포스파티딕산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 포스파티딕산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세리드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 글리코리피드, 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 동결건조된 펩티드-지질 생성물을 준비하는 방법에 있어서,
    용매 시스템에서 펩티드 1 및 한가지이상의 지질을 공동-동결건조시켜 동결건조된 펩티드-지질 생성물을 형성하고, 상기 지질은 계면활성제의 부재하에 상기 용매에 용해되고, 상기 동결건조된 생성물은 재수화시켜 펩티드-지질 복합체를 형성할 수 있고;
    상기 지질은 난 포스파티딜콜린, 콩 포스파티딜콜린, 에테르 인지질, 작은 알킬 사슬 인지질, 콜레스테롤, 콜레스테롤유도체, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디올레포스파티딜에탄올아민, 디라우일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린 스핑고리피드, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딕산, 디팔미토일포스파티딕산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 포스파티딕산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세리드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 글리코리피드, 이들의 혼합물에서 선택되고;
    상기 용매는 유기 용매, 또는 수성-유기 용매 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11766444B2 (en) 2017-07-28 2023-09-26 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disorders including HDL-APOM-S1P as active ingredient

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5746223A (en) * 1996-10-11 1998-05-05 Williams; Kevin Jon Method of forcing the reverse transport of cholesterol from a body part to the liver while avoiding harmful disruptions of hepatic cholesterol homeostasis
US6004925A (en) * 1997-09-29 1999-12-21 J. L. Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6287590B1 (en) 1997-10-02 2001-09-11 Esperion Therapeutics, Inc. Peptide/lipid complex formation by co-lyophilization
DE19954843C2 (de) * 1999-11-09 2003-11-20 Novosom Ag Verfahren zur Verkapselung von Proteinen oder Peptiden in Liposomen, mit dem Verfahren hergestellte Liposomen und deren Verwendung
US6514523B1 (en) 2000-02-14 2003-02-04 Ottawa Heart Institute Research Corporation Carrier particles for drug delivery and process for preparation
GB0121171D0 (en) * 2001-08-31 2001-10-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US8568766B2 (en) 2000-08-24 2013-10-29 Gattadahalli M. Anantharamaiah Peptides and peptide mimetics to treat pathologies associated with eye disease
US7723303B2 (en) * 2000-08-24 2010-05-25 The Regents Of The University Of California Peptides and peptide mimetics to treat pathologies characterized by an inflammatory response
US7199102B2 (en) * 2000-08-24 2007-04-03 The Regents Of The University Of California Orally administered peptides synergize statin activity
US7148197B2 (en) * 2000-08-24 2006-12-12 The Regents Of The University Of California Orally administered small peptides synergize statin activity
US7166578B2 (en) 2000-08-24 2007-01-23 The Regents Of The University Of California Orally administered peptides synergize statin activity
US6664230B1 (en) * 2000-08-24 2003-12-16 The Regents Of The University Of California Orally administered peptides to ameliorate atherosclerosis
US7144862B2 (en) * 2000-08-24 2006-12-05 The Regents Of The University Of California Orally administered peptides to ameliorate atherosclerosis
US7687074B2 (en) * 2001-08-23 2010-03-30 Westgate Biological Ltd. Use of milk serum apoproteins in the treatment of microbial or viral infection
US20030229062A1 (en) * 2001-12-07 2003-12-11 The Regents Of The University Of California Treatments for age-related macular degeneration (AMD)
US7470659B2 (en) * 2001-12-07 2008-12-30 The Regents Of The University Of California Methods to increase reverse cholesterol transport in the retinal pigment epithelium (RPE) and Bruch's membrane (BM)
WO2003049685A2 (en) * 2001-12-07 2003-06-19 The Regents Of The University Of California Treatment for age-related macular degeneration
US20040009216A1 (en) * 2002-04-05 2004-01-15 Rodrigueza Wendi V. Compositions and methods for dosing liposomes of certain sizes to treat or prevent disease
US6930085B2 (en) 2002-04-05 2005-08-16 The Regents Of The University Of California G-type peptides to ameliorate atherosclerosis
NL1020962C2 (nl) * 2002-06-28 2003-12-30 Tno Therapie en prognose/monitoring bij sepsis en septische shock.
US20060051407A1 (en) * 2003-06-27 2006-03-09 Yoram Richter Method of treating ischemia-reperfusion injury
US10517883B2 (en) 2003-06-27 2019-12-31 Zuli Holdings Ltd. Method of treating acute myocardial infarction
PE20050438A1 (es) * 2003-10-20 2005-06-14 Esperion Therapeutics Inc Formulas farmaceuticas, metodos y regimenes de dosificacion para el tratamiento y la prevencion de sindromes coronarios agudos
US20060019870A1 (en) * 2004-01-28 2006-01-26 O'donnell Francis E Jr Apoprotein cochleate compositions
JP4617458B2 (ja) * 2004-02-10 2011-01-26 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 中空糸透析カラムを利用したリポソームの製造方法
SE0401942D0 (sv) * 2004-07-28 2004-07-28 Lipopeptide Ab New antimicrobial peptide complexes
EP1799242A4 (en) * 2004-09-16 2009-11-11 Univ California TYPE G PEPTIDES AND OTHER ACTIVE SUBSTANCES TO REDUCE ATHEROSCLEROSIS AND OTHER DISEASES
US7464012B2 (en) * 2004-12-10 2008-12-09 L'air Liquide, Societe Anonyme A Directoire Et Conseil De Surveillance Pour L'etude Et L'exploitation Des Procedes Georges Claude Simplified process simulator
US7582312B2 (en) * 2004-11-15 2009-09-01 Discovery Laboratories, Inc. Methods to produce lung surfactant formulations via lyophilization and formulations and uses thereof
EP1827472A4 (en) 2004-12-06 2012-09-05 Univ California METHODS FOR IMPROVING THE STRUCTURE AND FUNCTION OF ARTERIOLES
KR20070112289A (ko) * 2005-03-16 2007-11-22 프로사이트 코포레이션 노화 또는 광손상된 피부를 예방하고 치료하기 위한 방법및 조성물
US8206750B2 (en) 2005-03-24 2012-06-26 Cerenis Therapeutics Holding S.A. Charged lipoprotein complexes and their uses
US20080293639A1 (en) * 2005-04-29 2008-11-27 The Regents Of The University Of California Peptides and peptide mimetics to treat pathologies characterized by an inflammatory response
NZ580954A (en) * 2005-04-29 2011-05-27 Univ California Peptides and peptide mimetics to treat pathologies characterized by an inflammatory response
US20070254832A1 (en) * 2006-02-17 2007-11-01 Pressler Milton L Methods for the treatment of macular degeneration and related eye conditions
EP2537526A1 (en) 2006-06-01 2012-12-26 Institut de Cardiologie de Montréal Method and compound for the treatment of valvular stenosis
US20080206142A1 (en) * 2006-06-16 2008-08-28 Lipid Sciences, Inc. Novel Peptides That Promote Lipid Efflux
US20080199398A1 (en) * 2006-06-16 2008-08-21 Brewer H Bryan Novel Peptides That Promote Lipid Efflux
US20080227686A1 (en) * 2006-06-16 2008-09-18 Lipid Sciences, Inc. Novel Peptides that Promote Lipid Efflux
EP2049137A4 (en) 2006-08-08 2013-05-01 Univ California SALICYLANILIDES AS AMPLIFIERS OF THE ORAL RELEASE OF THERAPEUTIC PEPTIDES
WO2008039843A2 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Lipid Sciences, Inc. Novel peptides that promote lipid efflux
JP5484059B2 (ja) * 2006-10-06 2014-05-07 エスシーアイエル テクノロジー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 脊髄核インプラント
KR100817024B1 (ko) 2006-11-09 2008-03-26 재단법인 목암생명공학연구소 핵산 또는 약물을 간에 특이적으로 전달하는 복합체 및이를 포함하는 약학적 조성물
CN103864892A (zh) * 2007-06-27 2014-06-18 里兰斯坦福初级大学理事会 肽酪氨酸酶抑制剂及其应用
CA2970108C (en) * 2007-06-27 2020-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Oligopeptide tyrosinase inhibitors and uses thereof
JP2010538005A (ja) 2007-08-28 2010-12-09 ユーエービー リサーチ ファウンデーション 合成アポリポ蛋白質ｅ模倣ポリペプチドおよび使用方法
AU2008296487A1 (en) 2007-08-28 2009-03-12 The Uab Research Foundation Synthetic apolipoprotein E mimicking polypeptides and methods of use
CA2788223A1 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Institut De Cardiologie De Montreal Method for the prevention and treatment of diastolic dysfunction employing an apolipoproteina1 (apoa1) mimetic peptide/phospholipid complex
PL2396017T3 (pl) 2009-02-16 2015-12-31 Cerenis Therapeutics Holding Sa Mimetyki apolipoproteiny A-l
WO2010095912A2 (ko) * 2009-02-23 2010-08-26 성균관대학교 산학협력단 난용성 약물 나노복합체의 제조방법
WO2011002258A2 (ko) * 2009-07-02 2011-01-06 한양대학교 산학협력단 아르기닌 기제 양친성 펩티드 마이셀
US10894098B2 (en) 2012-04-09 2021-01-19 Signablok, Inc. Methods and compositions for targeted imaging
WO2011143362A1 (en) 2010-05-11 2011-11-17 Esperion Therapeutics, Inc. Dimeric oxidation-resistant apolipoprotein a1 variants
BR112013004397A2 (pt) 2010-08-30 2017-06-27 Hoffmann La Roche método para produzir uma partícula de lipídio, a partícula de lipídio em si e seu uso
RU2017126088A (ru) 2011-02-07 2019-01-31 Серени Терапеутикс Холдинг С.А. Липопротеиновые комплексы и их получение и применения
RU2457864C1 (ru) * 2011-07-28 2012-08-10 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная компания "ФАРМАСОФТ" (ООО "НПК "ФАРМАСОФТ") Гель, обладающий противовоспалительным, иммунотропным, противоаллергическим и ранозаживляющим действием
US9993427B2 (en) 2013-03-14 2018-06-12 Biorest Ltd. Liposome formulation and manufacture
CN105050614B (zh) 2013-03-15 2019-04-05 加利福尼亚大学董事会 刺激胆固醇流出的具有降低的毒性的肽
CN103860470A (zh) * 2014-03-05 2014-06-18 贵州中泰生物科技有限公司 一种口服高密度脂蛋白脂质体的制备方法
KR20170003611A (ko) 2014-05-02 2017-01-09 세레니스 쎄라퓨틱스 홀딩 에스에이 Ｈｄｌ 요법 마커
US10653747B2 (en) 2014-07-31 2020-05-19 Uab Research Foundation ApoE mimetic peptides and higher potency to clear plasma cholesterol
RU2671857C1 (ru) * 2014-10-30 2018-11-07 Дельта-Флай Фарма, Инк. Новый способ производства липоплекса для местного введения и противоопухолевое средство, в котором используется такой липоплекс
WO2016154542A2 (en) 2015-03-25 2016-09-29 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating cardiovascular related disorders
US20160346221A1 (en) 2015-06-01 2016-12-01 Autotelic Llc Phospholipid-coated therapeutic agent nanoparticles and related methods
CN108350036B (zh) 2015-07-10 2022-04-08 佩蒂诺沃生物制药有限责任公司 用于改善疏水性药物功效的制剂
CA3032229A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 Hartis-Pharma Sa Therapeutic combinations to treat red blood cell disorders
KR102752868B1 (ko) * 2016-08-31 2025-01-09 큐피가부시키가이샤 난황 인지질 조성물 및 그 제조 방법, 그리고 그 난황 인지질 조성물을 사용한 지방 유제 및 리포화 제제
TW201919712A (zh) * 2017-08-10 2019-06-01 法商塞勒尼斯醫療控股公司 運送子(cargomers)
CN111249451B (zh) * 2020-01-20 2022-11-04 成都医学院 一种糖脂类抗原注射液及其制备方法
CN112034175A (zh) * 2020-04-03 2020-12-04 苏州艾可瑞斯生物科技有限公司 一种ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5652339A (en) * 1993-12-31 1997-07-29 Rotkreuzstiftung Zentrallaboratorium Method of producing reconstituted lipoproteins

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH621479A5 (ko) 1977-08-05 1981-02-13 Battelle Memorial Institute
CA1173360A (en) 1979-06-22 1984-08-28 Jurg Schrank Pharmaceutical preparations
FR2521565B1 (fr) 1982-02-17 1985-07-05 Dior Sa Parfums Christian Melange pulverulent de constituants lipidiques et de constituants hydrophobes, procede pour le preparer, phases lamellaires lipidiques hydratees et procede de fabrication, compositions pharmaceutiques ou cosmetiques comportant des phases lamellaires lipidiques hydratees
US4880635B1 (en) 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
US4857319A (en) 1985-01-11 1989-08-15 The Regents Of The University Of California Method for preserving liposomes
US5178875A (en) * 1991-01-14 1993-01-12 The Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal-polyene preliposomal powder and method for its preparation
CA1335077C (en) * 1988-02-08 1995-04-04 Henri Isliker Process for the manufacture of apolipoproteins from human blood plasma or serum
US5077057A (en) * 1989-04-05 1991-12-31 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
US5753258A (en) * 1990-10-19 1998-05-19 University Of Florida Artificial viral envelopes
JPH07507554A (ja) * 1992-06-12 1995-08-24 エヌ・ブイ・イノゲネテイクス・エス・エイ 新規ペプチドおよびタンパク質，それらの調製方法，ならびにコレステロール受容体としてのそれらの使用
US5785984A (en) * 1993-02-05 1998-07-28 Kao Corporation Taste-modifying method and bitterness-decreasing method
US5534241A (en) * 1993-07-23 1996-07-09 Torchilin; Vladimir P. Amphipathic polychelating compounds and methods of use
DE4416166C2 (de) * 1994-05-06 1997-11-20 Immuno Ag Stabiles Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen
US5948756A (en) * 1995-08-31 1999-09-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Therapeutic lipoprotein compositions
US6004925A (en) * 1997-09-29 1999-12-21 J. L. Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6287590B1 (en) 1997-10-02 2001-09-11 Esperion Therapeutics, Inc. Peptide/lipid complex formation by co-lyophilization

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5652339A (en) * 1993-12-31 1997-07-29 Rotkreuzstiftung Zentrallaboratorium Method of producing reconstituted lipoproteins

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11766444B2 (en) 2017-07-28 2023-09-26 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disorders including HDL-APOM-S1P as active ingredient

Also Published As

Publication number Publication date
NZ503721A (en) 2001-08-31
WO1999017740A1 (en) 1999-04-15
DK1019025T3 (da) 2004-05-24
UA71551C2 (en) 2004-12-15
AU749344B2 (en) 2002-06-27
IL135322A0 (en) 2001-05-20
JP2001522781A (ja) 2001-11-20
US20030099714A1 (en) 2003-05-29
EP1019025A1 (en) 2000-07-19
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CN100415210C (zh) 2008-09-03
RU2224506C2 (ru) 2004-02-27
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US20070167351A1 (en) 2007-07-19
NO329155B1 (no) 2010-08-30
NO20001683D0 (no) 2000-03-31
PL339654A1 (en) 2001-01-02
PT1019025E (pt) 2004-07-30
PL196579B1 (pl) 2008-01-31
ATE260644T1 (de) 2004-03-15
IL135322A (en) 2005-11-20
EP1358874A1 (en) 2003-11-05
DE69822176T2 (de) 2004-09-16
DE69822176D1 (de) 2004-04-08
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HUP0003930A3 (en) 2001-06-28
CA2305704A1 (en) 1999-04-15

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