ES2217591T3

ES2217591T3 - Formacion de un complejo peptido/lipido por coliofilizacion.

Info

Publication number: ES2217591T3
Application number: ES98950743T
Authority: ES
Inventors: Jean-Louis Dasseux
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-10-02
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2018-09-28
Also published as: NZ503721A; WO1999017740A1; DK1019025T3; UA71551C2; AU749344B2; IL135322A0; JP2001522781A; US20030099714A1; EP1019025A1; KR100588241B1; EP1019025B1; WO1999017740A9; CN100415210C; RU2224506C2; CA2305704C; US20070167351A1; NO329155B1; NO20001683D0; PL339654A1; PT1019025E

Abstract

Un método para preparar un producto péptido/lípido liofilizado que consiste en liofilizar una solución solubilizada que comprende un péptido o análogo a péptido capaz de adoptar una conformación anfipática y un lípido, en el que dicho lípido es disuelto en dicha solución, sin ayuda de un detergente, y en el que dicho producto liofilizado puede ser rehidratado para formar un complejo péptido/lípido.

Description

Formación de un complejo péptido/lípido por coliofilización.

1. Campo de la invención

La invención se refiere a la formación de vesículas de péptido/lípido y complejos a través de la coliofilización de péptidos, preferiblemente los que son capaces de adoptar una conformación alfahelicoidal, y uno o más lípidos. Se puede liofilizar una solución única que solubiliza tanto los péptidos como los lípidos o dos soluciones separadas. Los métodos se usan para generar vesículas estables de péptidos/lípidos y complejos que incluyen complejos micelares, esféricos y discoidales, aunque sin limitares a ellos, en preparaciones a granel y en unidades menores, según puedan ser adecuadas para las dosificaciones.

2. Antecedentes de la invención

Los liposomas son vesículas compuestas de al menos una membrana bicapa lípida que encierra un núcleo acuoso. Generalmente, los fosfolípidos comprenden la bicapa lípida, pero la bicapa puede estar compuesta de otros lípidos. La solución acuosa dentro del liposoma se denomina el "volumen capturado".

Los liposomas han sido desarrollados como vehículos para suministrar drogas, cosméticos, compuestos bioactivos, entre otras aplicaciones. La bicapa de lípidos encapsula la droga, el cosmético o el compuesto bioactivo, y los elementos análogos, dentro del volumen capturado del liposoma y la droga es expulsada del núcleo del liposoma cuando la bicapa lípida se pone en contacto con una membrana de la superficie celular. El liposoma suelta su contenido a la célula por intercambio lípido, fusión, endocitosis, o adsorción. Ostro y otros, 1989, Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576. Alternativamente, la droga, cosmético, compuesto bioactivo o análogo podría ser asociado con la membrana bicapa lípida de la vesícula o insertado en la misma.

Además de las vesículas, se han usado complejos que contienen lípidos para proporcionar agentes en forma de partículas. Por ejemplo, muchos investigadores han encontrado útil preparar partículas análogas a las lipoproteínas reconstituidas o complejos que tienen tamaño y densidad similares a las partículas de lipoproteínas de alta densidad (HDL). Estos complejos reconstituidos consisten habitualmente en apoproteínas purificadas (habitualmente apoproteína A-1) y fosfolípidos tales como la fosfatidilcolina. A veces, también se incluye colesterol no esterificado. Los métodos más comunes para preparar estas partículas son (1) la aplicación conjunta de ultrasonidos a los constituyentes, sea por aplicación de ultrasonidos en baño o con un aplicador de sonda, (2) la interacción espontánea de la proteína constituyente con vesículas lípidas preformadas, (3) la reconstitución por medio de detergentes seguida de la retirada del detergente por medio de diálisis. Jonas, 1986, Meth. in Enzymol, 128-553-582; Lins y otros, 1993, Biochimica et Biophysica Acta, 1151:137-142; Brouillette & Anantharamaiah, 1995, Biochimica et Biophysica Acta, 1256:103-129; Jonas, 1992, Estructura y Funciones de las Apoproteínas, Capítulo 8: 217-250. También se han formado complejos similares por sustitución de péptidos que forman hélices anfipáticas en vez de los componentes apoproteínicos. Desgraciadamente, cada uno de estos métodos presenta serios problemas para la formación de grandes cantidades de complejos puros en base razonablemente efectiva en coste. Además, ninguna de estas publicaciones describe la coliofilización de péptidos/ o de análogos a péptidos que sean capaces de adoptar una conformación helicoidal alfa anfipática y un lípido.

Se conoce un elenco de tecnologías para producir vesículas lípidas y complejos. Se han producido vesículas, o liposomas, usando una variedad de protocolos, formando diferentes tipos de vesículas. Los diversos tipos de liposomas incluyen vesículas multilaminares, vesículas unilaminares pequeñas y vesículas unilaminares grandes.

La hidratación de fosfolípidos (o de otros lípidos) por solución acuosa puede dar lugar también a la dispersión de los lípidos y a la formación espontánea de vesículas multimelares ("MLV"). Una MLV es un liposoma con múltiples bicapas lípidas que rodean el núcleo acuoso central. Estos tipos de liposomas son mayores que las vesículas unilaminares pequeñas (SUV) y pueden ser de 350-400 nm de diámetro. Las MLV se prepararon originalmente disolviendo los lípidos en cloroformo en un matraz de fondo redondeado y evaporando el cloroformo hasta que se formaba el lípido en una capa delgada sobre la pared del matraz. Se añadía la solución acuosa y se permitía a la capa lípida que se rehidratara. Se formaban vesículas conforme se agitaba o se hacía describir vórtices al matraz. Dearner y otros, 1983 en Liposomes (Ostro, Ed.), Mercer Dekker, Inc., New York (citando a Bangham y otros, 1965, J. Mol. Biol.. 13:238). Johnson y otros dieron cuenta posteriormente de que este método también generaba vesículas laminares simples. Johnson y otros 1971, Biochim. Biophys. Acts 233-820.

Una vesícula unilaminar pequeña (SUV) es un liposoma con una única bicapa lípida que rodea un núcleo acuoso. En función del método empleado para generar las SUV, pueden estar comprendidas en tamaño entre 25 y 110 nm de diámetro. Las primeras SUV se produjeron secando una preparación de fosfolípidos en cloroformo bajo nitrógeno, añadiendo la capa acuosa para producir una concentración de lípidos en el intervalo milimolar y sometiendo a ultrasonidos la solución a 45ºC hasta que se aclare. Dearmer y otros, 1983 en Liposomes (Ostro, Ed.), Mercer Dekker, Inc., New York. Las SUV preparadas de este modo dieron lugar a liposomas con diámetros comprendidos entre 25 y

\hbox{50 nm.}

Otro método para obtener SUV es inyectar rápidamente una solución de etanol/lípido en la solución acuosa a encapsular. Dearner y otros, 1983, en Liposomes (Ostro, Ed.), Mercer Dekker, Inc., New York (citando a Batzil y otros, 1973, Biochim. Biophys. Acta 298:1015). Las SUV preparadas de este modo dieron lugar a liposomas con diámetros comprendidos entre 30 y 110 nm.

También se pueden producir SUV haciendo pasar vesículas multilaminales a través de una Prensa French cuatro veces a 20.000 psi (1,379 bar). Las SUV producidas estarían comprendidas en tamaños de 30 a 50 mnm de diámetro. Dearner y otros, 1983, en Liposomes (Ostro, Ed.), Mercer Dekker, Inc., New York (citando a Barenholz y otros, 1979, FEBS Letters 99:210).

También se pueden formar vesículas multilaminares y unilaminares de fosfolípidos por extrusión de una preparación acuosa de fosfolípidos a alta presión a través de membranas de pequeños poros (Hope y otros, 1996, Chemistry and Physiscs of Lipids 40:89-107).

Una vesícula unilaminar grande (LUV) es similar a una SUV en que son bicapas lípidas únicas que rodean el núcleo acuoso central, pero las LUV son mucho mayores que las SUV. En función de sus partes constitutivas y del método empleado para prepararlas, las LUV pueden estar comprendidas en tamaño entre 50 y 1000 nm de diámetro. Dearner y otros, 1983, en Liposomes (Ostro, Ed.), Mercer Dekker, Inc., New York. Las LUV se preparan habitualmente usando uno de los tres métodos siguientes: dilución con detergentes, evaporación de fase inversa, e infusión.

En la técnica de la dilución con detergentes, soluciones detergentes tales como colato, deoxicolato, octil glucósido, heptil glucósido y Tritón X-100 se usan para formar micelas a partir de la preparación de lípidos. La solución es dializada a continuación para eliminar el detergente y da lugar a la formación de liposomas. Dearner y otros, 1983, en Liposomes (Ostro, Ed.), Mercer Dekker, Inc., New York. Este método consume tiempo y la eliminación del detergente por lo general es incompleta. La presencia de detergente en la preparación final puede dar lugar a cierta toxicidad de la preparación de liposomas y/o a la modificación de las propiedades fisicoquímicas de la preparación de liposo-
mas.

La técnica de la evaporación de fase inversa solubiliza lípidos en soluciones acuosas no polares, formando micelas invertidas. El disolvente no polar es evaporado y las micelas se agregan para formar LUV. El método general requiere una gran cantidad de lípido.

El método de infusión inyecta un lípido solubilizado en una solución no polar en la solución acuosa para ser encapsulado. Conforme se evapora la solución no polar, los lípidos se recogen en la interfaz gas/acuosa. Las hojas lípidas forman LUV y liposomas oligolaminares conforme el gas burbujea a través de la solución acuosa. Los liposomas se clasifican según tamaño por filtración. Dearner y otros, 1983 en Liposomes (Ostro, Ed.), Mercer Dekker, Inc., New York (citando a Dearner y otros, 1976, Biochim. Biophys. Acta 443:829 y Schieren y otros, 1978, Biochim. Biophys. Acta. 542:137). Los procedimientos de infusión pueden requerir una temperatura bastante alta para la infusión y pueden tener una eficiencia de encapsulación relativamente baja. Dearner y otros, 1983 en Liposomes (Ostro, Ed.), Mercer Dekker, Inc., New York.

Ha constituido una meta en la investigación de los liposomas desarrollar preparaciones de liposomas que puedan ser almacenadas durante períodos prolongados de tiempo antes de su utilización. Por ejemplo, la patente U.S. Nº 4.229.360 a Schneider y otros describe un método de deshidratar los liposomas por adición de un compuesto hidrófilo a una dispersión coloidal de liposomas en un líquido acuoso y deshidratación de la solución, preferiblemente por liofilización. Son ejemplos de compuestos hidrófilos los polímeros hidrófilos de alto peso molecular o los compuestos de bajo peso molecular como la sacarosa.

La patente U.S. Nº 4.411.894 a Shrank y otros describe el uso de concentraciones elevadas de sacarosa en preparaciones de liposomas sometidas a ultrasonidos. Los liposomas contienen productos solubles en grasas en el volumen capturado; aunque las preparaciones podrían ser liofilizadas, el método no podría evitar la pérdida de una cantidad significativa de los contenidos capturados a pesar de la alta concentración de sacarosa.

Crowe y otros, patente U.S. 4.857.319 describieron el uso de disacáridos tales como la sacarosa, maltosa, lactosa y trehalosa para estabilizar liposomas cuando los liposomas se secan por congelación. La cantidad de disacáridos con respecto al contenido de lípidos del componente (peso/peso) es de Q:1:1 a 4:1. Crowe logró un mayor éxito en la conservación de la integridad de los liposomas usando este método que la permitida por el método revelado por Shrank en la patente U.S. Nº 4.411.894.

Janoff y otros, patente U.S. 4.880.635 describe un método para deshidratar liposomas en el cual los liposomas eran estabilizados en presencia de azúcares protectores tales como la trehalosa y la sacarosa, preferiblemente tanto en las hojas interior como exterior de la bicapa lípida. Se retiene suficiente agua en el método de Janoff y otros para que la rehidratación de liposomas secados dé lugar a liposomas con una substancial integridad estructural.

Lerch y otros, patente U.S. 5.652.339 se refiere a un método para producir, a escala industrial, lipoproteínas reconstituidas de alta densidad a partir de apolipoproteínas y lípidos.

Sin embargo, existe necesidad en la técnica de un método simple y efectivo en cuanto a coste para formar complejos de péptidos/lípidos liofilizados que puedan ser posteriormente rehidratados.

El método de la presente invención da lugar a mezclas de péptidos/lípidos en un polvo estable liofilizado que puede ser almacenado, usado en polvo o usado después de su rehidratación para formar complejos péptido/lípido.

3. Resumen de la invención

La invención es un método de preparar complejos o vesículas de péptidos o proteínas-(fosfo)lípidos que pueden tener características similares a las de las lipoproteínas de alta densidad (HDL). El método utiliza un sistema de disolventes en el cual al menos un péptido es disuelto en una solución, y al menos un lípido es disuelto en otra solución sin la ayuda de un detergente. Las dos soluciones se seleccionan de tal manera que son miscibles entre sí. Las soluciones son combinadas a continuación, y la solución resultante es liofilizada.

Se puede practicar también el método por un segundo tipo de sistema de disolventes que comprende una solución en la cual tanto la proteína o péptido como el lípido pueden ser disueltos. La solución puede ser una solución única o puede ser una solución compuesta hecha por combinación de dos o más soluciones antes de la adición de péptidos y lípidos. Los péptidos y lípidos son disueltos en la solución o solución compuesta y a continuación la solución de péptidos/lípidos es liofilizada. Preferiblemente, los péptidos de la presente invención son péptidos que son capaces de adoptar una conformación de hélice anfipática. En una realización específica de la invención, el péptido es una proteína fijadora de lípidos. En otra realización, se utilizan análogos a péptidos de ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoE-I, otros análogos a apolipoproteínas y similares en vez de los péptidos o en combinación con éstos. En otra realización específica, se usa el método para preparar complejos de análogos al ApoA1/ (fosfo)lípidos similares a la HDL. Los complejos ApoA1/lípidos son útiles para tratar los desórdenes asociados con las dislipoproteínemias, incluyendo pero sin limitarse a ellas, la hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, el HDL bajo, y la deficiencia de apolipoproteína A-1, el choque séptico, para ensayos de diagnóstico in vitro como marcadores de poblaciones de HDL y para su uso con tecnología de imágenes.

El método de la invención permite la preparación de complejos péptido/lípido para administración parenteral, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, inyecciones intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular y píldora gruesa, a animales o humanos. Además, los complejos péptido/lípido pueden ser también formulados para administración oral, rectal, mucosal (por ejemplo, cavidad oral) o tópica a animales o humanos, o para la experimentación in vitro.

Se puede usar el método para la producción a gran escala de complejos péptidos anfipáticos/fosfolípidos y/o para complejos de análogos a péptido ApoA -I/fosfolípido. Se puede preparar el producto liofilizado para preparaciones a granel, o alternativamente, la solución péptido/lípido mezclada puede ser distribuida en porciones en envases más pequeños (por ejemplo unidades de una sola dosis) antes de su liofilización, y tales unidades más pequeñas pueden ser preparadas como formas estériles de dosificación unitaria.

El polvo liofilizado preparado por el método de la invención puede ser rehidratado en una solución estéril libre de partículas inmediatamente antes de la inyección, o alternativamente, se puede formular el polvo liofilizado en una forma de dosificación sólido apropiado y administrarlo directamente.

También puede ser adecuado el método para el almacenamiento de compuestos que de otra forma resultarían inestables o insolubles en ausencia de líquidos.

Se puede usar el método para la formulación de productos para el tratamiento o prevención de enfermedades humanas, incluyendo aplicaciones tales como la presentación conjunta de antígenos en vacunas, tratamiento o prevención de disipoproteínemias, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, HDL bajo, y deficiencia de apolipoproteína A-I, enfermedades cardiovasculares tales como arteriosclerosis, choque séptico o enfermedades infecciosas.

Se puede usar el método para la preparación de complejos que podrían ser utilizados como portadores de drogas, como vectores (para proporcionar drogas, DNA, genes), por ejemplo al hígado o a células extrahepáticas, o como limpiadores para atrapar toxinas (por ejemplo, pesticidas, LPS, etc.

3.1 Definiciones

Tal como se usa aquí, un "sistema disolvente" se refiere a uno o más disolventes que son capaces de disolver péptidos y/o lípidos y, si se trata de más de uno, que son miscibles entre sí.

Tal como se usa aquí, "complejo péptido/lípido" se refiere a una agregación de fracciones de lípidos y péptidos que forman partículas dentro del intervalo de tamaños de las lipoproteínas de alta densidad (HDL).

Tal como se usa aquí, "coliofilizado" se refiere a la liofilización, secado por congelación, o secado al vacío de más de un compuesto (por ejemplo, péptido, proteína, lípido, fosfolípido) en solución en el mismo recipiente. Por ejemplo, se puede combinar una solución de lípidos con una solución de péptidos en el mismo recipiente y la combinación de soluciones resultante es liofilizada conjuntamente, con lo cual se liofilizan los péptidos y los lípidos simultáneamente.

Tal como se usa aquí, "péptido anfipático" o "péptidos helicoidales alfa anfipáticos" significan péptidos que son capaces de adoptar una conformación anfipática o helicoidal anfipática respectivamente. La hélice alfa anfipática es un motivo estructural secundario encontrado a menudo en péptidos y proteínas biológicamente activos. Véase Clases y Propiedades de Motivos helicoidales Anfipáticos por Jere P. Segrest, Hans de lof, Jan G. Dohlman, Christie G. Brouillette y G.M. Anantharamaiah. PROTEÍNAS: Estructura, Funciones y Genética 8-103-117 (1990). Una hélice alfa anfipática es una hélice alfa con caras polares y no polares opuestas orientadas a lo largo del eje longitudinal de la hélice. A lo largo de la cara polar es evidente una distribución específica de residuos cargados.

Las hélices anfipáticas, tal como se definen, son complementarias para la interfaz polar-no polar de los fosfolípidos voluminosos hidratados; estos dominios que asocian lípidos han sido postulados como que interactúan con los fosfolípidos por inmersión parcial de los mismos en la interfaz entre las cadenas acílicas grasas y los grupos de cabeza polares. Jere P. Segrest. Febs letters 1976, 69 (1): 111-114.

El término "péptido" y "proteína" se pueden usar aquí en forma intercambiable. Además los análogos a péptidos de la invención pueden ser péptidos, proteínas o no péptidos, es decir péptidomiméticos. Sin embargo, todos los análogos son preferiblemente moléculas bioactivas.

El término "lípido" tal como se usa aquí incluye, aunque sin limitarse a ellos, los fosfolípidos naturales y sintéticos. Además, los términos "lípido" y "fosfolípido" se pueden usar aquí en forma intercambiable.

4. Breve descripción de las figuras

Figura 1: Cromatografía Superose 6 de HDL preparada por ultracentrifugación de densidad a partir de 200 \mul de suero humano.

Figura 2 (parte inferior): Cromatografía Superose 6 de complejos de (DPPC: péptido 1) (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; ID SEC Nº: 1) preparados según una relación de 1:1 (peso:peso).

Figura 2 (parte superior): Cromatografía Superose 6 de complejos de (DPPC: péptido 1) preparados según una relación de 2:1 (peso:peso).

Figura 3 (parte inferior): Cromatografía Superose 6 de complejos de (DPPC: péptido 1) preparados según una relación de 3:1 (peso:peso).

Figura 3 (parte superior): Cromatografía Superose 6 de complejos de (DPPC: péptido 1) preparados según una relación de 4:1 (peso:peso).

Figura 4 (parte inferior): Cromatografía Superose 6 de complejos de (DPPC: péptido 1) preparados según una relación de 5:1 (peso:peso).

Figura 4 (parte superior): Cromatografía Superose 6 de complejos de (DPPC: péptido 1) preparados según una relación de 7,5:1 (peso:peso).

Figura 5: Cromatografía Superose 6 de complejos de (DPPC: péptido 1) preparados según una relación de 10:1 (peso:peso).

Figura 6: Cromatografía Superose 6 de complejos de péptido 1 etiquetados con C^{14} preparados a Ri = 3:1.

Figura 7: Cromatografía Superose 6 de complejos de péptido 1 etiquetados con C^{14} preparados a Ri = 4:1.

Figura 8: Cromatografía Superose 6 de complejos de péptido 1 etiquetados con C^{14} preparados a R_{i} = 5:1.

5. Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Los péptidos o proteínas helicoidales alfa anfipáticas, proteínas fijadoras de lípidos, péptidos agonísticos ApoA-I, análogos a apoproteínas y similares, que son útiles en la presente invención, pueden ser sintetizados o fabricados usando cualquier método conocido en la técnica. Se pueden hacer preparaciones de péptidos estables que tienen una larga vida de conservación por liofilización de los péptidos -bien para preparar graneles para reformulación, o bien para preparar partes alícuotas individuales o unidades de dosificación que pueden ser reconstituidas por rehidratación con agua esterilizada o una solución tampón estéril apropiada antes de ser administrados a un individuo.

Según conoce el inventor, la invención es el primer caso de un método para la coliofilización de un péptido o análogo a péptido helicoidal alfa anfipático con un lípido para formar una mezcla que se puede reconstituir en un complejo péptido/lípido estéril.

En algunas realizaciones, puede ser preferible formular y administrar el(los) análogo(s) a ApoA-I incluyendo, pero sin estar limitado a ellos, agonísticos ApoA-I, en un complejo péptido-lípido. Esta aproximación tiene varias ventajas, puesto que el complejo tendría una vida media aumentada en su circulación, particularmente cuando el complejo tiene un tamaño y una densidad similares a las proteínas de la clase HDL, especialmente las poblaciones HDL pre-beta. La clase HDL de lipoproteínas se puede dividir en cierto número de subclases en base a características tales como tamaño, densidad y movilidad electroforética. Algunos ejemplos en orden de tamaño creciente son HDL pre-beta micelares de diámetro de 50 a 60 Ángstrom, HDL discoidales de tamaño intermedio, es decir, con una masa de 65 kDa (aproximadamente 70 Ángstrom), HDL_{3} o HDL_{2} esféricas de diámetro comprendido entre 90 y 120 Ángstrom. (J. Kane, 1996 en V. Fuster, R. Ross y E. Topol (eds.) Arteriosclerosis y Enfermedad de la Arteria Coronaria, p. 99; A. Tall y J. Breslow, Ibid., p. 106; Barrans y otros Biochemica et Biophysica Acta 1300, p. 73-85; y Flelding y otros, 1996, J. Lipid Res 36, p. 211-228). Sin embargo, según la invención, también se pueden formar complejos péptido/lípido de tamaño menor o mayor que las HDL.

Los complejos péptido/lípido de la presente invención se pueden preparar convenientemente como preparaciones estables que tienen una larga vida de conservación, por el procedimiento de coliofilización descrito a continuación. Se pueden usar los complejos péptido/lípido para preparar material de drogas a granel destinado a su reformulación farmacéutica, o para preparar partes alícuotas individuales o unidades de dosificación que pueden ser reconstituidas por rehidratación con agua estéril o una solución tampón apropiada previamente a su administración a un individuo.

Los solicitantes han desarrollado un método simple para preparar complejos de péptidos o proteínas-(fosfo)lípidos que tengan características similares a las HDL. Se puede usar este método para preparar los complejos péptido ApoA-I-lípido y tiene las ventajas siguientes: (1) La mayoría o todos los ingredientes incluidos se usan para formar los complejos diseñados, evitando de esta manera restos de material de partida, lo cual es común en los otros métodos. (2) Se forman compuestos liofilizados, los cuales son muy estables durante el almacenamiento. Los complejos resultantes pueden ser reconstituidos inmediatamente antes del uso. (3) Los complejos resultantes habitualmente no requieren una purificación adicional después de la formación o antes del uso. (4) Se evitan compuestos tóxicos incluyendo detergentes tales como colatos. Además, se puede hacer fácilmente a escala el método de producción y es adecuado para la fabricación GMP (es decir, en un entorno libre de endotoxinas).

De acuerdo con el método preferido, el péptido y lípido son combinados en un sistema disolvente que puede disolver cada ingrediente. Con esta finalidad, se deben seleccionar cuidadosamente pares de disolventes para asegurar la cosolubilidad tanto del péptido anfipático como del lípido hidrófobo. En una realización, la(s) proteína(s) o péptido(s) a incorporar en las partículas pueden ser disueltos en un disolvente acuoso u orgánico o mezcla de disolventes (disolvente 1). El componente (fosfo)lípido es disuelto en un disolvente o mezcla de disolventes acuoso u orgánico (disolvente 2) que es miscible con el disolvente 1, y se combinan las dos soluciones. Alternativamente, el componente (fosfo)lípido es disuelto directamente en la solución de péptido (proteína). Alternativamente, se puede incorporar el péptido y el lípido a un sistema codisolvente, es decir, una mezcla de disolventes miscibles. Dependiendo de las propiedades de fijación de lípidos del péptido o proteína, los expertos en la técnica reconocerán que puede ser necesaria la solubilización mejorada o incluso completa (y/o la mezcla mejorada) antes de la liofilización; de esta manera, los disolventes se pueden elegir en consecuencia.

Se determina primero empíricamente una proporción adecuada de péptido (proteína) a lípidos de forma que el complejo resultante posea las propiedades físicas y químicas apropiadas, lo cual quiere decir habitualmente pero no siempre tamaños similares a las HDL_{2} o HDL_{3}. La relación molar de lípido a proteína/péptido debería estar en el intervalo de unos 2 a unos 200, y preferiblemente de 5 a 50, dependiendo del tipo de complejos deseado. Ejemplos de tales clases de tamaños de complejos péptido/lípido o proteína/lípido incluyen, sin limitarse sólo a ellas, partículas micelares o discoidales (habitualmente más pequeñas que las HDL_{3} o HDL_{2})partículas esféricas de tamaño similar a las HDL_{2} o HDL_{3} y complejos de gran tamaño que son mayores que las HDL_{2}. Las HDL usadas aquí como norma durante la cromatografía (Figura 1) son principalmente HDL_{2} maduras esféricas. Las HDL pre-\beta1 son complejos micelares de apolipoproteínas y pocas moléculas de fosfolípidos. Las HDL pre-\beta2 son complejos discoidales de apolipoproteínas y pocas moléculas de fosfolípidos. Cuantos más lípidos (triglicéridos, colesterol, fosfolípidos) se incorporan, mayor resultará la HDL y su forma resulta más modificada. HDL pre-\beta1 (complejo micelar) \rightarrow HDL pre-\beta2 (complejo discoidal) \rightarrow HDL3 (complejo esférico) \rightarrow HDL2 (complejo esférico).

Una vez se ha elegido el disolvente y se han incorporado el péptido y el lípido, la mezcla resultante se congela y liofiliza hasta su sequedad; a veces se añade un disolvente adicional a la mezcla para facilitar la liofilización. El producto liofilizado puede ser almacenado durante largos periodos y permanecerá estable.

En los ejemplos de trabajo descritos a continuación, el péptido PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (Nº ID SEC.: 1) y (fosfo)lípido se disolvieron por separado en metanol, se combinaron y posteriormente se mezclaron con xileno antes de la liofilización. El péptido y el lípido pueden ser ambos añadidos a una mezcla de los dos disolventes. Alternativamente, se puede mezclar una solución del péptido disuelto en metanol con una solución de lípido disuelto en xileno. Se deberían tomar precauciones para evitar la insolubilización por salado del péptido. La solución resultante, que contiene el péptido y el lípido codisueltos en metanol/xileno es liofilizada para formar un polvo.

Se puede reconstituir el producto liofilizado a fin de obtener una solución o suspensión del complejo péptido-lípido. Con esta finalidad, el polvo liofilizado es rehidratado con una solución acuosa hasta alcanzar un volumen adecuado (a menudo aproximadamente 5 mg de péptido/ml. Lo cual resulta conveniente para una inyección intravenosa).

En una realización preferida, el polvo liofilizado es rehidratado con una solución salina tampón al fosfato o salina fisiológica. La mezcla puede tener que ser agitada o sometida a vórtice para facilitar su rehidratación, y en la mayoría de los casos, la etapa de reconstitución debería ser realizada a una temperatura igual o mayor a la temperatura de la fase de transición (Tm) del componente lípido de los complejos. Al cabo de unos minutos, se obtiene una solución de complejos lípido-proteína reconstituidos (una solución transparente cuando los complejos son pequeños).

Una parte alícuota de la preparación reconstituida resultante puede ser caracterizada para confirmar que los complejos de la preparación tienen una distribución de tamaño deseable, por ejemplo, la distribución de tamaño de la HDL. También se puede utilizar con esta finalidad cromatografía de filtración de gel. En los ejemplos de trabajo descritos a continuación, se utilizó un sistema de cromatografía Pharmacia Superose 6 FPLC de filtración de gel. El eluyente usado contiene 150 mM de NaCl en agua desionizada. Un volumen de muestra típico es de 20 a 200 microlitros de complejos que contienen 5 mg de péptido/ml. El caudal de la columna es de 0,5 ml/min. Se usan como patrones para calibrar la columna una serie de proteínas de peso molecular y diámetro de Stokes conocidos así como HDL humana. Los complejos de proteínas y de lipoproteínas son supervisados por absorbencia o dispersión de luz de una longitud de onda de 254 o 280 nm.

Los disolventes que pueden ser utilizados según el método de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, disolventes orgánicos no polares, polares, apróticos y próticos y análogos tales como etanol, metanol, ciclohexano, 1-butanol, alcohol isopropílico, xileno, THF, éter, cloruro de metileno benceno y cloroformo. La invención incluye también el uso de mezclas de disolventes así como disolventes únicos. Además, antes de la utilización dentro de los métodos presentes, los disolventes orgánicos pueden ser secados para eliminar el agua; sin embargo, se pueden usar disolventes hidratados o agua con ciertos lípidos, péptidos o proteínas. En otras palabras, el agua puede ser un disolvente adecuado, o se pueden utilizar disolventes hidratados o mezclas de disolventes hidratados o de disolventes orgánicos con agua; sin embargo, si se usa agua, debe ser exenta de detergentes. Como se mencionó anteriormente, los disolventes son preferiblemente de la calidad más pura (a fin de evitar la concentración de impurezas después de la liofilización), y los disolventes deberían estar libres de sales y libres de partículas. Sin embargo, los disolventes no tienen que ser estériles, puesto que el producto resultante puede ser esterilizado antes, durante o después de la liofilización, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica farmacéutica, tales como los descritos en Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª y 18ª Eds., Mack Publishing Co. Easton, Pennsylvania (1980 y 1990), incorporados aquí a título de referencia en su totalidad, y en el United States Pharmacopeia National Formulary (USP/NP) XVI, incorporado aquí a título de referencia en su totalidad.

Los lípidos que se pueden usar de acuerdo con el método de la presente composición incluyen, pero sin limitarse a ellos, lípidos naturales y sintetizados (sintéticos) y fosfolípidos, incluyendo fosfolípidos de pequeña cadena alquílica, fosfatidilcolina de huevo, fosfatidilcolina de soja, dipalmitoil-fosfatidil-colina, dimiristoil-fosfatidil-colina, distearoil-fosfatidil-colina, 1-miristoil-2-palmitoil-fosfatidil-colina, 1-palmitoil, 2-miristoil-fosfatidil-colina, 1-palmitoil, 2-estearoil-fosfatidil-colina, 1-estearoil-2-palmitoil-fosfatidil-colina, dioleoil-fosfatidil-colina, dioleoil-fosfatidil-etanolamina, dilauroil-fosfatidil-glicerol, fosfatidil-colina, fosfatidil-serina, fosfatidil-etanolamina, fosfatidil-inositol, esfingomielina, esfingolípidos, fosfatidil-glicerol, difosfatidil-glicerol, dimiristoil-fosfatidil-glicerol, dipalmitoil-fosfatidil-glicerol, diestearoil-fosfatidil-glicerol, dioleoil-fosfatidil-glicerol, ácido dimiristoil-fosfatídico, ácido dipalmitoil-fosfatídico, dimiristoil-fosfatidil-etanol-amina, dipalmitoil-fosfatidil-etanol-amina, dimiristoil-fosfatidil-serina, dipalmitoil-fosfatidil-serina, fosfatidil-serina del cerebro, esfingomielina del cerebro, dipalmitoil-esfingomielina, diestearoil-esfingomielina, ácido fosfatídico, galactocerebrósidos, gangliósidos, cerebrósidos, dilauril-fosfatidil-colina, (1,3)-D-manosil-(1,3)-Diglicérido, aminofenilglicósido, 3-colesteril-6'-(glicosiltio)hexiléter y colesterol y sus derivados.

Los péptidos que son adecuados para su uso con la presente invención incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los descritos en las tres solicitudes pendientes conjuntamente US Nº de Serie 08/940.095 registrada el 29 de septiembre de 1997, actualmente patente Nº 6.004.925, US Nº de Serie 08/940.096 registrada el 29 de septiembre de 1997, actualmente patente Nº 6.046.166, y US Nº de Serie 08/940.093 registrada el 29 de septiembre de 1997, actualmente patente Nº 6.037.323.

Es preferible, aunque no necesario en cada caso, que los precipitados sean disueltos o eliminados antes de mezclar o agitar las soluciones de lípido y péptido o antes de la liofilización.

El método puede ser utilizado para la producción a gran escala de complejos de péptido/lípido, complejos anfipáticos de péptido/(fosfo)lípido, complejos de proteína fijadora de lípido/(fosfo)lípido y/o complejos de análogo a ApoA1 péptido/(fosfo)lípido. Se puede obtener el producto liofilizado para preparaciones a granel, o alternativamente, se puede distribuir en porciones la solución de péptido/lípido mezclada en pequeños envases (por ejemplo, unidades de una sola dosis) antes de la liofilización, y las unidades más pequeñas de este tipo pueden ser preparadas en formas estériles de dosificación única.

Las composiciones secadas al vacío de la presente invención pueden ser provistas en formas de envase de dosis única o múltiple al llenar asépticamente tales envases con la solución estéril secada previamente al vacío hasta un contenido prescrito, preparando las composiciones secadas al vacío deseadas; y cerrando herméticamente a continuación el envase de dosis única o múltiple. Se pretende que estos envases llenados permitan una rápida disolución de la composición secada al realizar la reconstitución con diluyentes estériles apropiados in situ, dando una solución estéril apropiada de la concentración deseada. Tal como se usa aquí, el término "envases adecuados" significa un envase capaz de mantener un entorno estéril, tal como un vial, capaz de suministrar un producto secado al vacío sellado herméticamente por un medio de retención. Adicionalmente, envases adecuados implica un apropiado tamaño, considerando el volumen de la solución a conservar al reconstituir la composición secada al vacío; y el material apropiado del envase, generalmente vidrio de Tipo I. Los medios de retención empleados, por ejemplo, cierres de goma estéril o equivalentes, se deberían entender tales que proporcionen el cierre hermético antes mencionado, pero que permitan también la entrada con la finalidad de introducción de un diluyente, por ejemplo agua estéril para inyecciones, USP, soluciones salina normal, USP o de dextrosa al 5% en agua, USP, para la reconstitución de la solución deseada. Son bien conocidos éstos y otros aspectos de la adecuación de los envases para productos farmacéuticos tales como los de la actual invención para los expertos en la práctica de las técnicas farmacéuticas. En realizaciones específicas, los tamaños de las dosis unidad de producto pueden estar en el intervalo de 10 mg a 2 g de péptido, preferiblemente en el intervalo de unos 100 mg a 1 g y una concentración después de la reconstitución de unos 1 a 50 mg/ml, preferiblemente de unos 2 a 25 mg/ml.

El método de la invención permite la preparación de complejos de proteína o péptido/lípido para administración parenteral, incluyendo inyecciones intravenosas, intraperitoneales, subcutáneas, intramusculares y de píldoras gruesas a animales o humanos, o para administración oral, rectal, mucosal (por ejemplo, cavidad oral) o tópica a animales o humanos o para la experimentación in vitro.

El polvo liofilizado preparado por el método de la invención puede ser rehidratado inmediatamente antes de la inyección, o alternativamente, se puede administrar directamente. El polvo liofilizado incluye, aunque sin limitarse a ello lípidos y péptidos que son capaces de formar complejos en forma de vesículas, liposomas partículas que incluyen partículas esféricas y discoidales, micelas y análogos. A fin de reconstituir o rehidratar el polvo liofilizado se escoge una solución que depende del uso final deseado. Para uso farmacéutico se puede usar cualquier solución estéril. Además, son preferidas soluciones tampones para determinados usos y éstas incluyen, aunque sin limitares a ellas, fosfato, citrato, tris, barbital, acetato, glicerina HCl, succinato, cacodilato, ácido bórico-bórax, amediol y carbonato.

El polvo liofilizado de la presente invención puede ser formado usando cualquier método de liofilización conocido en la técnica, incluyendo, aunque sin limitarse a él, el secado por congelación, en el cual la solución que contiene péptido/lípido se somete a la congelación seguida de evaporación a presión reducida.

El método puede ser también adecuado para la conservación de compuestos que podrían ser en caso contrario inestables o insolubles en la ausencia de lípidos.

Se puede usar el método para la formulación de productos para el tratamiento o prevención de enfermedades humanas, incluyendo aplicaciones tales como la presentación conjunta de antígenos en vacunas, tratamiento o prevención de disipoproteínemias, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, HDL bajo, y deficiencia de apolipoproteína A-1, enfermedades cardiovasculares tales como arteriosclerosis, choque séptico o enfermedades infecciosas.

Se puede usar el método para la preparación de complejos que podrían ser utilizados como portadores de drogas, como vectores (para proporcionar drogas, DNA, genes), por ejemplo al hígado o a células extrahepáticas, o como limpiadores para atrapar toxinas (por ejemplo, pesticidas, LPS, etc.). alternativamente, el método puede ser usado para preparar complejos para sistemas de ensayos in vitro o para su uso en la tecnología de imágenes.

En realizaciones específicas, se puede usar el método para la preparación de complejos análogos a ApoA-I (incluyendo los agonistas, pero sin limitarse a ellos) que pueden ser utilizados en ensayos in vitro y como marcadores de las poblaciones y subpoblaciones de HDL. En otras realizaciones específicas, se pueden usar los complejos agonistas de ApoA-I para inmunoensayos o para la tecnología de imágenes (por ejemplo, escaneos CAT, escaneos MRI).

Los ejemplos siguientes están destinados a ser ilustrativos de la presente invención y no se deberían considerar en ningún caso como una limitación de la misma.

6. Ejemplo

Preparación de complejo péptido-lípido por la vía de la coliofilización

Para preparar complejos péptido-lípido se utilizó el siguiente protocolo.

Se disolvió el Péptido 1 (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; Nº ID SEC: 1) (22,4 mg) en metanol a una concentración de 3,5 mg/ml por incubación durante varios minutos y mezclado por vórtice intermitentemente. Se añadió a esta solución dipalmitoil-fosfatidil-colina (DPPC) en metanol (solución madre 100 mg/ml) de tal manera que la relación final de DPPC/péptido fue de 2,5:1(peso/peso). Esta solución se mezcló produciendo vórtice. Se añadió xileno a la solución hasta una concentración final del 36%. Se retiraron partes alícuotas de la solución resultante para su análisis posterior por cromatografía de filtración de gel. Las soluciones fueron congeladas en nitrógeno líquido y liofilizadas hasta la sequedad por vacío. Una parte alícuota que contenía 20 mg de péptido (Nº ID SEC.: 1) y 50 mg de DPPC fue rehidratada en una solución salina estéril (0,9% NaCl), mezclada y calentada a 41ºC durante varios minutos hasta que resultó una solución clara de complejos péptido-fosfolípido reconstituidos.

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6.1 Ejemplo

Filtración de gel y utilización de fosfolípido 6.1.1 Materiales y métodos

Con la finalidad de ensayar las condiciones para la preparación de complejos es conveniente a menudo preparar pequeñas cantidades de complejos para caracterización. Estas preparaciones contenían un mg de péptido y se prepararon como sigue: Se disolvió un mg de péptido 1 (Nº ID SEC.: 1) en 250 \mul de metanol grado HPLC (Perkin Elmer) en un vial de vidrio transparente de 1,0 ml con tapón (Waters #WAT025054). La disolución del péptido fue ayudada por la formación ocasional de vórtice a lo largo de un periodo de 10 minutos a la temperatura ambiente. Al cabo de este tiempo, todavía se podía ver una pequeña cantidad de partículas no disueltas, pero esto no afectó adversamente a los resultados. A esta mezcla se añadió una parte alícuota que contenía cada valor de 1, 2, 3, 4, 5, 7,5, 10 ó 15 mg de DPPC (Avanti Polar Lipids, Pureza del 99%, producto #850355) procedente de una solución madre en metanol. Se llevó el volumen de la mezcla a 400 \mul por adición de metanol y posteriormente la mezcla se sometió a vórtice intermitentemente durante un periodo de 10 minutos a la temperatura ambiente. En este momento, se podía ver muy poco material no disuelto en los tubos. Se añadió a cada tubo 200 \mul de xileno /Sigma-Aldrich pureza del 99%, grado HPLC) y se sometieron los tubos a vórtice durante 10 segundos cada uno. Se pincharon dos pequeños orificios en las partes superiores de cada tubo con una aguja de jeringa de calibre 20; se congelaron los tubos durante 15 segundos cada uno en nitrógeno líquido y se liofilizaron los tubos de un día para otro sometidos a vacío. Se añadió a cada tubo 200 mg de una solución de NaCl al 0,9%. Se sometieron los tubos a vórtice durante 20 segundos cada uno. En este momento, las soluciones de los tubos presentaban un aspecto lechoso. A continuación los tubos fueron incubados en un baño de agua durante 30 minutos a 41ºC. Las soluciones en todos los tubos se hicieron transparentes (es decir, similares al agua en su apariencia) excepto en el tubo que contenía 15 mg de DPPC, que permanecía lechoso.

A fin de determinar si todos los fosfolípidos que se usaron realmente en las preparaciones de complejos aparecían realmente en las fracciones de columna correspondientes a los picos de absorbencia del cromatograma, se recogió eluato de la columna de los complejos péptido-lípido reconstituidos en fracciones de uno o dos ml y las fracciones fueron ensayadas enzimáticamente, para determinar el contenido de fosfolípidos con el BioMerieux Phospholipides Enzymatique PAP 150 kit (# 61491) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Las preparaciones de complejos se pueden realizar también a una escala mayor. Anteriormente se informa de un ejemplo de preparación de este tipo. Estos complejos se utilizaron para experimentos in vivo.

4. Resultados de la caracterización de complejos

Figura 1: Cromatografía Superose 6 de HDL_{2} madura preparada por ultracentrifugación de densidad a partir de 200 \mul de suero humano. El cromatógrafo muestra absorbencia a 254 nm. Volumen de elución = 14,8 ml, correspondiente a un diámetro de Stokes de 108 Ángstrom (Véase Tabla 1).

Figura 2 (parte inferior): Cromatografía Superose 6 de complejos de DPPC: péptido 1 preparados según una relación de incubación (Ri, definida como la relación de los fosfolípidos totales a los péptidos totales en la mezcla inicial) de 1:1 (peso:peso) como se describe anteriormente (preparación a pequeña escala). Volúmenes de elución de los picos de absorbencia = 16,2 ml y 18,1 ml, correspondientes a partículas con un diámetro de Stokes de 74 y 182 Ángstrom, que son más pequeñas que la HDL. El 87% del fosfolípido aplicado a la columna fue recuperado en las fracciones que contenían los picos de absorbencia (véase Tabla 1).

Figura 2 (parte superior): Cromatografía Superose 6 de complejos de DPPC: péptido 1 preparados según una Ri de 2:1 (peso:peso) como se describe anteriormente. Volumen de elución del pico de absorbencia = 16,4 ml (77 Ángstrom), correspondiente a partículas que son más pequeñas que la HDL. El 70% del fosfolípido aplicado a la columna fue recuperado en las fracciones que contenían el pico de absorbencia (véase Tabla 1).

Figura 3 (parte inferior): Cromatografía Superose 6 de complejos de DPPC: péptido 1 preparados según una Ri de 3:1 (peso:peso) como se describe anteriormente. Volumen de elución del pico de absorbencia = 16,0 ml (80 Ángstrom), correspondiente a partículas que son más pequeñas que la HDL. El 79% del fosfolípido aplicado a la columna fue recuperado en las fracciones que contenían el pico de absorbencia (véase Tabla 1).

Figura 3 (parte superior): Cromatografía Superose 6 de complejos de DPPC: péptido 1 preparados según una Ri de 4:1 (peso:peso) como se describe anteriormente. Volumen de elución del pico de absorbencia = 15,7 ml (90 Ángstrom), correspondiente a partículas que son más pequeñas que la HDL. El 106% del fosfolípido aplicado a la columna fue recuperado en las fracciones que contenían el pico de absorbencia (véase Tabla 1).

Figura 4 (parte inferior): Cromatografía Superose 6 de complejos de DPPC: péptido 1 preparados según una Ri de 5:1 (peso:peso) como se describe anteriormente. Volumen de elución del pico de absorbencia = 15,1 ml (104 Ángstrom), correspondiente a partículas que son más pequeñas que la HDL. El 103% del fosfolípido aplicado a la columna fue recuperado en las fracciones que contenían el pico de absorbencia (véase Tabla 1).

Figura 4 (parte superior): Cromatografía Superose 6 de complejos de DPPC: péptido 1 preparados según una Ri de 7,5:1 (peso:peso) como se describe anteriormente. Volumen de elución del pico de absorbencia = 13,6 ml (134 Ángstrom), correspondiente a partículas que son mayores que la HDL. El 92% del fosfolípido aplicado a la columna fue recuperado en las fracciones que contenían los picos de absorbencia (véase Tabla 1).

Figura 5: Cromatografía Superose 6 de complejos de DPPC: péptido 1 preparados según una relación de 10:1 (peso:peso) como se describe anteriormente. Volumen de elución del pico de absorbencia = 13,4 ml (138 Ángstrom), correspondiente nuevamente a partículas que son mayores que la HDL. El 103% del fosfolípido aplicado a la columna fue recuperado en las fracciones que contenían los picos de absorbencia (véase Tabla 1).

La muestra que contenía los complejos con 15:1 DPPC:péptido 1 (peso:peso) no se sometió a la cromatografía Superose 6 porque era túrbida, sugiriendo la presencia de grandes partículas.

Para cada uno de los experimentos anteriores, no se observó una presencia significativa de fosfolípidos en ninguna fracción distinta de las que contenían el material eluyente con los picos de absorbencia (Véase Figs. 2-8). Esto sugiere que virtualmente todos los fosfolípidos (dentro del margen de error experimental del ensayo) estaban incorporados en los dos complejos. El experimento demuestra que al variar la relación inicial de fosfolípidos a péptidos, se pueden formar complejos homogéneos de diversos tamaños (menores o mayores que la HDL).

6.2 Caracterización de complejos usando péptido 1 etiquetado en C^{14}

Se prepararon complejos péptido-fosfolípido conteniendo péptido 1 etiquetado en C^{14}(actividad específica de 159.000 DPM/mg de péptido en peso, asumiendo un contenido de péptidos del 50%) por coliofilización, tal como se describió anteriormente. Las preparaciones contenían cada una 1 mg de péptido y 3, 4 ó 5 mg de DPPC en peso. Después de reconstituir los complejos en 200 \mul con NaCl al 0,9%, se aplicaron 20 \mul (100 \mug) de complejos a la columna Pharmacia Superose 6 usando NaCl al 0,9% como la fase líquida a un caudal de 0,5 ml/min. Al cabo de un intervalo de 5 ml (volumen vacío de columna = 7,7 ml), se recogieron fracciones de 1 ml. Se ensayaron partes alícuotas que contenían 20 \mul de las fracciones para determinar el contenido de fosfolípidos usando el ensayo enzimático de BioMerieux. El remanente de cada fracción se contó durante 3 minutos en un contador de centelleo líquido Wallach (Pharmacia) usando el programa Easy Count (Cuenta Fácil). En las Figs. 6-8 se muestran los resultados de estos análisis. Puede observarse que la inmensa mayoría tanto de los fosfolípidos como de los péptidos se recuperaron juntos en unas pocas fracciones con picos de aproximadamente 16, 16 y 15 para complejos preparados a relaciones de DPPC:péptido de 3,1, 4,1 y 5:1, respectivamente. Los perfiles de absorbencia UV para estas muestras indican que los complejos eluyen desde la columna a volúmenes de 15,1, 14,7 y 14,4 ml para complejos preparados a relaciones de DPPC:péptido de 3,1, 4,1 y 5:1, respectivamente (el volumen muerto del tubo entre el colector de fracción y la célula de flujo UV es de 1,3 ml, lo cual explica una ligera discrepancia entre los volúmenes de elución tal como se miden por el ensayo de radiactividad/fosfolípidos y la absorbencia UV). Los volúmenes de elución corresponden a diámetro de Stokes de 106, 114 y 120 Ángstrom, para los complejos de Ri 3:1, 4:1 y 5:1, respectivamente.

TABLA 1

Relación	Volumen de elución	Tamaño relativo de las	% de fosfolípido aplicado en
DPPC:Péptido 1		partículas*	el pico de absorbencia
HDL	14,9	-	-
1:1	16,2 y 18,1	Menor	87%
2:1	16,4	Menor	70%
3:1	16,0	Menor	79%
4:1	15,7	Menor	106%
5:1	15,1	Menor	103%
7,5:1	13,6	Mayor	92%
10:1	13,4	Mayor	103%
15:1	NR**	NR	NR
*Relativo al tamaño de las partículas HDL
** NR, No realizado

Claims

1. Un método para preparar un producto péptido/lípido liofilizado que consiste en liofilizar una solución solubilizada que comprende un péptido o análogo a péptido capaz de adoptar una conformación anfipática y un lípido, en el que dicho lípido es disuelto en dicha solución, sin ayuda de un detergente, y en el que dicho producto liofilizado puede ser rehidratado para formar un complejo péptido/lípido.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho péptido es una proteína.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho péptido es una proteína fijadora de lípidos.

4. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho análogo a péptido es un análogo de ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III o ApoE.

5. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho péptido es un análogo a ApoA-I.

6. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho lípido es un lípido natural, un lípido sintético o mezclas de los mismos.

7. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho lípido es un lípido saturado, un lípido no saturado o mezclas de los mismos.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que dicho lípido se selecciona del grupo que consiste en fosfolípidos de éter, fosfolípidos de cadena corta, colesterol, derivados del colesterol, fosfatidil-colinas, fosfatidil-etanolaminas, fosfatidil-serinas, fosfatidil-inositoles, esfingolípidos, fosfatidil-gliceroles, gangliósidos y cerebrósidos.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que dicho lípido se selecciona del grupo que consiste en fosfatidil-colina de huevo, fosfatidil-colina de soja, dipalmitoil-fosfatidil-colina, dimiristoil-fosfatidil-colina, diestearoil-fosfatidil-colina, 1-miristoil-2-palmitoil-fosfatidil-colina, 1-palmitoil-2-miristoil-fosfatidil-colina, 1-palmitoil-2-estearoil-fosfatidil-colina, 1-estearoil-2-palmitoil-fosfatidil-colina, dioleoil-fosfatidil-colina, dioleo-fosfatidil-etanolamina, dilauroil-fosfatidil-glicerol, difosfatidil-glicerol, dimiristoil-fosfatidil-glicerol, dipalmitoil-fosfatidil-glicerol, diestearoil-fosfatidil-glicerol, dioleoil-fosfatidil-glicerol, ácido dimiristoil-fosfatídico, ácido dipalmitoil-fosfatídico, dimiristoil-fosfatidil-etanolamina, dipalmitoil-fosfatidil-etanolamina, dimiristoil-fosfatidil-serina, dipalmitoil-fosfatidil-serina, esfingomielina, dipalmitoil-esfingomielina, diestearoil-esfingomielina, ácido fosfatídico, galactocerebrósidos, dilauril-fosfatidil-colina, (1,3)-D-manosil-(1,3)-diglicérido, glicolípidos de aminofenilglicósido 3-colesteril-6'-(glicosiltio)hexiléter y mezclas de los mismos.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que dicho lípido es un glicolípido de 3-colesteril-6'-(glicosiltio)hexiléter.

11. Un método según la reivindicación 1, en el que la relación molar lípido:péptido o la relación molar lípido:análogo a péptido es de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 200:1.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que la relación molar lípido:péptido o la relación molar lípido:análogo a péptido es de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 50:1.

13. Un método según la reivindicación 12, en el que la relación molar lípido:péptido o la relación molar lípido:análogo a péptido es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 50:1.

14. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha solución se hace usando un disolvente orgánico.

15. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho producto liofilizado es una formulación farmacéutica.

16. Un método según la reivindicación 15, que comprende además cargar partes alícuotas de dicha solución en envases individuales antes de la liofilización para formar una formulación farmacéutica que tiene forma de una dosis unitaria simple.

17. Un método según la reivindicación 16, que comprende además esterilizar dichoproducto antes de la liofilización, durante la misma o después de la misma.

18. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que la solución solubilizada se forma:

(i): solubilizando al menos un péptido anfipático o un análogo a péptido anfipático en un primer disolvente para formar una primera solución;

(ii): solubilizando al menos un lípido en un segundo disolvente, sin la ayuda de detergente, para formar una segunda solución donde dicha segunda solución es miscible con dicha primera solución; y

(iii): combinando dicha primera solución con dicha segunda solución para formar la solución solubilizada de péptido/lípido.

19. Un método según la reivindicación 18, que comprende además rehidratar el producto péptido/lípido liofilizado para formar un complejo péptido/lípido solubilizado.

20. Un método según la reivindicación 18, en el que el producto péptido/lípido liofilizado es un complejo péptido/lípido deshidratado.

21. Un método según la reivindicación 18, que comprende además rehidratar el complejo péptido/lípido deshidratado para formar un complejo péptido/lípido solubilizado.

22. Un método según la reivindicación 18, en el cual el primer y el segundo disolventes son los mismos.

23. Un método según la reivindicación 18, en el cual dicho primer disolvente se selecciona del grupo que consiste en agua, metanol, 1-butanol y mezclas de los mismos.

24. Un método según la reivindicación 18, en el cual dicho segundo disolvente se selecciona del grupo que consiste en xileno, benceno, metanol, cloroformo y mezclas de los mismos.

25. Un complejo péptido/lípido obtenible por cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

26. Un complejo péptido/lípido según la reivindicación 25, que es aproximadamente igual en tamaño a las lipoproteínas de alta densidad.

27. Un complejo péptido/lípido según la reivindicación 25, en el que dicho complejo es estéril.

28. Un complejo péptido/lípido según la reivindicación 25, en el que dicho complejo es una formulación farmacéutica estéril que es una forma de dosis unitaria.