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KR100559096B1 - Ｈｃｖ 피막 단백질 입자 및 그의 백신접종용 용도 - Google Patents

Ｈｃｖ 피막 단백질 입자 및 그의 백신접종용 용도 Download PDF

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KR100559096B1
KR100559096B1 KR1020007014761A KR20007014761A KR100559096B1 KR 100559096 B1 KR100559096 B1 KR 100559096B1 KR 1020007014761 A KR1020007014761 A KR 1020007014761A KR 20007014761 A KR20007014761 A KR 20007014761A KR 100559096 B1 KR100559096 B1 KR 100559096B1
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Abstract

본 발명은 HCV 피막 단백질이 만성 HCV-감염 침팬지에서 유익한 면역 반응을 유발한다는 발견을 기초로 한다. 면역화는 바람직하게는 계면활성제-보조 방법으로 제조되는 입자의 형태로 HCV 피막 단백질을 사용하여 수행될 수 있다. 피막 단백질은 만성 HCV 보유자에 상기와 같이 주어질때, 매우 높은 면역원성이 있고, 세포성 및 체액성 면역 반응 모두를 자극시킨다.

Description

ＨＣＶ 피막 단백질 입자 및 그의 백신접종용 용도{PARTICLES OF HCV ENVELOPE PROTEINS: USE FOR VACCINATION}
본 발명은 HCV 의 피막 단백질이 이종 아형 1a 또는 아형 1b HCV 주로 만성감염된 침팬지에서 유익한 면역 반응을 유발한다는 발견을 기초로 한다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 피막 단백질이 높은 면역원성이 있고, 세포성 및 체액성 면역반응 둘다의 자극을 초래한다는 발견에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 알킬화에 의한 시스테인의 블로킹이 보다 더욱 면역원성 단백질을 형성한다는 발견에 관한 것이다. 덧붙여, 본 발명의 피막 단백질은 높은 면역원성 및 면역반응성을 나타내는 입자와 결합될 수 있다. 또한, 상기 입자는 다른 단백질과 결합될 수 있다.
C 형 간염 바이러스(HCV) 감염은 선진국 및 후진국에서 주요한 건강 문제이다. 세계 인구의 약 1 내지 5 %가 상기 바이러스에 의해 감염된다고 측정된다. HCV 감염은 수혈연관 간염의 가장 중요한 원인으로 여겨지고, 빈번하게 만성 간 손상으로 진행한다. 더욱이, 간세포성 암종의 유발에 관련되어 있다는 증거가 있다. 결과적으로 믿을만한 진단 방법 및 효과적인 치료제에 대한 요구가 높다. 또한 HCV-감염된 혈액 산물의 민감하고, 특이적인 선별방법 및 HCV를 배양하는 개선된 방법이 요구된다.
HCV 는 3 이상의 구조 단백질 및 6개의 비구조 단백질을 코딩하는 약 9,600 염기의 양성 가닥 RNA 바이러스이다. 서열 상동성을 기초로, 구조 단백질이 기능적으로 1 개의 단일 코어 단백질 및 2 개의 피막 단백질, E1 및 E2 로 구분된다. E1 단백질은 192 아미노산으로 구성되고, HCV 유전자형 의존성 5 내지 6 N-글리코실화 부위를 포함한다. E2 단백질은 363 내지 370 아미노산으로 구성되고, HCV 유전자형 의존성 9-11 N-글리코실화 부위를 포함한다(Major and Feinstone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997). E1 단백질은 다양한 가변 영역을 포함하는 반면(Maertens and Stuyver, 1997), E2 단백질은 3개의 고가변(hypervariable) 부위를 포함하고, 그중 주요 부위는 단백질의 N-말단에 위치한다(Maertens and Stuyver, 1997). 후자 피막 단백질은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 곤충 세포, 효모 세포 및 포유동물 세포에서 재조합 기술에 의해 생산되어 왔다. 더 고등한 진핵생물, 특히 포유동물 세포 배양에서의 발현계의 사용은 환자 샘플에서 항체에 의해 효과적으로 인식되는 피막 단백질을 형성한다(Maertens 등, 1994).
E1 피막 단백질은 고유의 폴딩(folding) 상태에 도달하기 위해 E2 피막 단백질을 필요로 한다고 시사되었다(Deleersnyder 등, 1997). 부가하여, E1 및 E2 는 바이러스 피막의 기본 단위를 형성할 수 있는 이종이량체를 형성한다고 시사되었다(Yi 등, 1997). WO 98/21338(Liang 등)에서, 이러한 예측이 코어(Core) 및 P7 뿐만 아니라, E1 및 E2로 구성되는 HCV 입자를 구축하는 데에 사용되었다. 바꾸어 말하면, E1 및 E2의 별도로의 면역화 및 다른 목적으로의 사용은 종래 기술에서 제시되지 않았다. 그러나, Houghton(1997) 은 3마리의 만성 HCV 감염 침팬지의 재조합 gpE1E2(4 x 25 ㎍)로 반복된 면역화는 유의적인 면역 반응을 유발하지 않는다고 보고하였다. 본 출원의 발명자들은 만성 C 형 간염의 환자에서의 항-피막 면역 반응의 유발은 더 높은 수준의 상기 항체가 인터페론 요법에 대한 양호한 반응과 상호관련이 있는 것으로 간주되고, 그러므로 환자가 바이러스를 일소하게 할 수 있기 때문에, 환자에게 바람직하고 유익할 것이라고 추론하였다(PCT/EP 95/03031, Maertens 등). 본 발명의 발명자들은 또한 만성 HCV 보유자에서 E1에 대한 항체 수준이 모든 HCV 항체 중 가장 낮은 것에 속하기 때문에, 상기 항체 수준, 및 가능하게는 세포성 반응을 증가시켜 숙주에 의해 감염의 조절 또는 심지어 일소를 유발하는 것이 유익할 것이라 추론하였다. 또한 E1에 대한 더 높은 수준의 세포성 면역은 인터페론 요법에 대한 양호한 반응과 상호관련있는 것으로 여겨진다(Leroux-Roels 등, 1996).
인터페론 요법과 관계에서 항-E1 면역성의 중요성 이외에, HCV 게놈의 일부 다른 부분이 감염을 조절할 수 있는 특이적 면역 반응을 유발하는 데에 중요할 것이라는 다른 지시가 지적된다. 또한, 코어 단백질의 C-말단부위에 대한 T-세포 반응성은 인터페론 요법에 반응하는 환자에서 더욱 빈번하게 관찰되었다(Leroux-Roels 등, 1996). NS4B 단백질을 중화시킬 수 있는 항체는 환자에서 간 이식후 HCV를 일소하는 것으로 입증되었다(Villa 등, 1998). 또한, NS3에서, 급성기 동안 HCV를 일소하는 것과 상호관련되는 것으로 여겨지는 여러 T-세포 에피토프(Epitope)가 유전지도화되었다(참조:PCT/EP 94/03555, Leroux-Roels 등; Leroux-Roels 등, 1996; Rehermann 등, 1996 및 1997; Diepolder 등, 1995 및 1997). 또한, E1 항체와 같이 NS5A에 대한 항체는 비반응자에 비해 장기간 반응자(LTR)에서 인터페론-알파 요법 전 기본선에서 더 높은 수준을 나타낸다.
현재, HCV에 대한 치료용 백신접종이 성공적이지 않다. 또한, 예방 백신접종이 HCV 동종 주에 대해서만 효과적으로 나타났다(Choo 등, 1994). 본 발명은 HCV 피막 항원의 투여가 이종 아형 1a 또는 이종 아형 1b 의 감염 모두에서 이종 주 또는 단리체로 감염된 개체에서 만성 활성 간염의 상태를 상당히 개선시킬 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 사실, 6 복용량의 50 ㎍ E1s(즉, aa 192∼326 E1)가 투여된 만성 감염된 침팬지는 놀랍게도 격렬한 체액성 및 세포성 면역 반응을 나타냈고, 이는 후자의 백신접종 전에는 만성 감염의 전 기간에 걸쳐 상승하지 않았었다. 더욱이, 바이러스 항원은 2 내지 5 개월의 기간 동안에는 탐지되지 않았고, 백신접종후 5 개월 이상 동안 탐지되지 않았다. 혈청내 HCV-RNA 역가(titer)가 감소되지 않았지만, 혈청 내 간 효소 수준은 정상화의 명확한 경향을 나타냈다. 가장 중요하게는, 두 백신에서 모두 간이 조직학적으로 상당히 개선되었다. 본 발명은 또한 소수성 앵커(anchor)없이 단일 HCV 단백질로 발현되는, 백신접종에 사용되는 E1 단백질이 안정한 입자를 형성한다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 또한 비연관 에피토프에 대한 면역 반응의 유발을 피하기 위해, 백신접종에 사용되는 E1 단백질이 만성 보유자로부터 단일 혈청 샘플로부터 유래되는 개별 클론의 공통 서열로서 구성되었다는 것이 주목된다. 덧붙여, 본 출원은 상기 항-E1 반응의 유발이 숙주내에 존재하는 감염 유전자형 외의 다른 유전자형의 항원을 사용함으로써 증가될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 더욱이, 본 출원은 예를 들면, N-(요오도에틸)-트리플루오로아세트아미드, 에틸렌이민 또는 요오도아세트아미드와 같은 활성 할로겐에 의해 HCV 피막 단백질의 시스테인이 알킬화될 때, 상기 기재된 올리고머 입자는 훨씬 더 높은 면역원성을 나타낸다는 발견에 관한 것이다. 최종적으로, 본 발명은 또한 상기 기재된 올리고머 입자에서 임의의 다른 천연 아미노산, 바람직하게는 메티오닌, 글루탐산, 글루타민 또는 라이신으로의, HCV 피막 단백질의 시스테인의 돌연변이는 또한 본래 피막 단백질에 비해 더 높은 면역원성을 초래한다는 발견에 관한 것이다.
발명의 목적
HCV에 대한 믿을만한 백신 및 효과적인 치료제를 개발하려는 긴급한 요구가 있다는 것이 문헌으로부터 명확하다. 그러므로, 본 발명은 만성 HCV 보유자에서도(단독으로는 아님), HCV 피막 단백질에 대한 특이적 체액성 및 세포성 면역을 유발할 수 있는 항원 제제를 제공하려는 목적이 있다. 동일한 항원이 면역 반응의 진단용으로 사용될 수 있다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 HCV의 단일 피막 단백질의 안정한 입자로 구성되는, 상기 기재된 항원 제제를 제공하는 목적이 있다. 현재, 명백히 상기 입자 또는 상기 입자를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있지 않다. 더욱이, 당업계에서 상기 안정한 입자 또는 상기 정제된 단일 HCV 피막 단백질을 포함하는 어떠한 항원 제제도 성공적으로 HCV에 대한 (이종성) 예방 또는 치료적 백신으로 사용될 수 없었다. 그러므로, 본 발명은 HCV 항원을 코딩하는 DNA 백신을 제공하는 것에 부가하여, 또한 성공적으로 HCV에 대한 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있는, 안정한 입자를 제공하는 방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 계면활성제-보조 입자 형성 (이후 참고) 을 기초로하는 후자 입자를 제조하는 방법을 제공하려는 목적이 있다. 또한, 본 발명은 상이한 HCV 유전자형으로 수득되는 항원으로 구성되는 입자를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
더욱이, 본 발명은 단백질의 더욱 정확한 폴딩을 일으킬 수 있는, 개별적인 클론으로부터의 공통 서열인 항원을 제공하는 목적이 있다. 이는 비연관 에피토프에 대한 면역의 자극을 피하기 위함이다.
또한, 본 발명은 만성 보유자가 감염되는 HCV 의 유전자형을 기초로 하는, 특히 치료용 백신접종을 위한 항원 제형을 제공하기 위한 목적이 있다. 이런 고려하에, 본 발명은 만성 보유자의 유전자형 또는 아형과 비교하여 상이하거나 또는 동종인 유전자형 또는 아형의 피막 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 부가적인 목적은 다른 화합물과 조합하는 것이 가능한 상기 지시된 항원 또는 DNA 백신을 사용하여 만성 감염 환자를 치료적으로 또는 예방적으로 백신접종하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 HCV 에 대해 인간을 예방적으로 백신접종하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 HCV 피막 단백질의 하나 이상의 시스테인 잔기의, 천연 아미노산, 바람직하게는 메티오닌, 글루탐산, 글루타민 또는 리신으로의 돌연변이로 인한, 우수한 면역원성을 갖는 올리고머 입자를 제공하는 것이다. 이와는 달리, HCV 피막 단백질의 하나 이상의 시스테인 잔기의 알킬화가 수행될 수 있다. 특히, 후자 단백질은 에틸렌이민, N-(요오도에틸)트리플루오로아세트아미드 또는 활성 할로겐에 의해 알킬화될 수 있다. 이러한 면에서, 본 발명은 비-HCV 에피토프를 효율적으로 발현하기 위한 운반체로서 올리고머 입자의 부가적인 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 부가적인 목적은 단독으로 또는 다른 치료와 병용하여, 항-E1 항체, 예를 들면, 항-E1 V2 부위 항체와 같은 항-피막 항체로 급성 또는 만성적으로 감염된 환자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 피막 단백질과 함께 코어(Core), E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, 또는 NS5B와 같은 T-세포 자극 항원을 제공하는 것이다.
본 발명의 모든 목적은 하기에 나타낸 구현예에 의해 만족되는 것으로 간주된다.
표 1은 단일 만성 보유자로부터 수득되는 E1 클론의 서열을 제공하고, 백신의 제조에 사용되는 E1 구축물은 상기 모든 개별적인 클론의 공통 서열이다. V1 ∼ V5, 가변 부위 1 ∼ 5, 불변 영역 4; HR, 소수성 부위; HCV-B con, 클론 및 HCV-J 사이의 가변 위치에서의 공통서열.
표 2는 E1 백신 단백질 및 감염된 침팬지 Phil 및 Ton에서 발견되는 E1 단백질의 서열을 제공한다. Phil의 아형 1b 단리체는 백신 주와 5.92 % 가 상이했다. 백신 및 Ton의 아형 1a 단리체 간의 차이는 20.74 %였다.
표 3은 두 마리의 만성 감염된 침팬지(Ton 및 Phil)에서 치료용 백신접종에 의해 유발된 변화의 도식적 개요를 제공한다. 도 8 및 11에 대해 설명된 바와 같이 분석을 수행하였다. 덧붙여, 조직학 및 염증은 간 생검으로부터 스코어링되었다.
표 4는 B-세포 에피토프의 유전지도화에 사용되는 펩티드의 서열을 제공한다. HR은 V4V5와 중복된다.
표 5는 바이러스 일소와 상호관련된 모든 주요 에피토프를 운반하는 더 짧은 단백질을 제조하기 위한 NS3의 재배열을 나타낸다.
표 6은 만성 HCV 보유자의 혈청과 E1s-아세트아미드 대 E1s-말레이미드의, LIA에서의 반응성을 나타낸다. 단백질은 LIA 막에서 고정되었다. E1s-말레이미드 (비오틴-말레이미드 함유)가 분무전 스트렙트아비딘과 복합되는 반면, E1s-아세트아미드는 LIA 스트립상에 그대로 분무되었다. 항원은 LIA-막에 결합시키고, 스트립은 본질적으로 Zrein 등(1998)에 기재된 바와 같이 가공했다. 상기 항원에 대응되는 인간 항체는 알칼리 포스파타아제와 접합된 인간-항-IgG를 사용하여 가시화되었다. NBT 및 BCIP은 스트립의 색 발현에 사용되었다. 염색은 Zrein 등 (1998) 에 설명된 바와 같이 0.5 내지 4로 스코어링되었다. 상기 검정에 대해 0.5 에 대한 반내림을 사용하여, 양성 샘플(#pos) 및 백분율(%pos)의 수가 표 하단에 언급된다.
도 1은 Maertens 등(PCT/EP95/03031)에 따라 발현되고 정제된 E1s 및 E2s 단백질의 PBS/3% 엠피젠-BB 중의 중복된 크기 배제 크로마토그래피 프로필이다.
도 2는 Maertens 등(PCT/EP95/03031)에 따라 발현되고 정제되고, PBS/0.2 % CHAPS 중의 동일한 SEC 칼럼상에서 또다시 러닝되어, 250∼300 kDa 로의 측정된 겉보기 분자량의 특이적 올리고머 구조가 수득된, E1s 및 E2s 단백질의 중복된 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로필이다. 3% 베타인을 사용하여 유사한 회합도를 수득할 수 있다.
도 3은 Maertens 등(PCT/EP95/03031)에 따라 발현되고 정제되고, 0.2 % CHAPS 또는 3 % 베타인 중에서 두번째 러닝을 수행하여 도 2에 나타낸 특이적 올리고머 구조를 수득하고, 0.05 % CHAPS 중에서 동일한 SEC 칼럼상 세번째 러닝을 수행하여 250 ∼ 300 kDa(E2s) 및 > 600 kDa(E1s) 로 측정된 겉보기 분자량을 갖는 특이적 단독-올리고머 구조로 수득된, E1s 및 E2s 단백질의 중복된 크기 배제 크로마토그래피 프로필이다. 0.1 또는 0.5 % 베타인을 사용하여 유사한 회합도를 수득할 수 있다.
도 4는 PBS/0.05 % CHAPS 중의 E1s의, nm로 관찰된 직경과 관련된 입자의 수를 백분율로서 나타낸 동적 광산란 분석이다.
도 5는 PBS/0.1 % 베타인(상부) 또는 0.5 % 베타인(하부)중에서 E1s의, nm로 관찰된 직경과 관련된 입자의 수를 백분율로서 나타낸 동적 광산란 분석이다.
도 6은 PBS/0.05 % CHAPS 중의 E1s(A) 및 PBS/3% 베타인 중의 E1s (B) 의 EM 염색이다.
도 7은 PBS/0.05 % CHAPS 중의 E1s의 입자의 크기 분포이다.
도 8은 1b 감염된 침팬지(Phil)에서 6 연속 및 3 회 부스팅 면역화(작은 화살표로 나타냄)에 의해 유발된 항-E1 항체의 발생, 및 ALT, HCV RNA, 및 항-E1 항체의 발생이다. 고체상 E1에 결합하는 항-E1 항체가 과산화효소와 접합된 항-인간 IgG 특이적 2차 항혈청을 사용하여 탐지되었다. TMB는 색 발현용 기질로서 사용되었다. 결과를 종말점 역가로서 나타내었다. ALT 수준을 의학적 분석기로 측정하였고, U/l로서 나타내었다. 혈청중의 HCV RNA는 HCV 모니터(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 간에서의 바이러스 부하를, 특이적 단일클론(EP 출원 번호 98870060.5에 기재된 ECACC 승인 번호 98031215)을 사용하여 간 생검에서 염색된 E2 항원 양의 반-정량적측정에 의해 결정하였다.
도 9는 침팬지 Phil에서 E1로의 면역화에 의해 유발된 항체 반응의 에피토프 매핑이다. 다양한 펩티드에 대한 항체의 반응성을, 비오틴화된 펩티드(표 4 참조)가 스트렙트아비딘을 통해 마이크로타이터 플레이트상에서 흡착되는 간접 ELISA에 의해 측정하였다. 특이적 항체가 과산화효소와 접합된 항-인간 IgG 특이적 2차 항혈청을 사용하여 탐지되었다. TMB가 색 발현용 기질로서 사용되었다.
도 10은 침팬지 Phil에서 백신접종 전 및 후의 림프구 증식의 결과이다. 냉동된 PBMC를 해동하고, 상이한 항원으로 3회반복하여 자극하였다. 음성 대조군을 배지만으로 하였고, 콘카나발린 A가 5 ㎍/ml의 농도로 양성 대조군으로 사용되었다. 150 ㎕ 의 총 부피중 2∼4 x 105 세포/웰의 농도로 U-형 96-웰 마이크로타이터플레이트에서 대조군과 함께 또는 1 ㎍/ml의 E1으로 90 시간동안 37 ℃에서 5 % CO2를 함유하는 습윤화된 대기하에 PBMC가, 10 % 열-불활성화된 FCS로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 마지막 18 시간 동안, 세포를 웰당 0.5 μCi(3H) 티미딘으로 펄스를 주었다. 그 다음, 배양물을 유리 섬유 필터상에서 수합하고, 표지 채취량을 측정하였다. 결과를 자극 지수(SI):3 회 반복 측정의, 항원의 평균 cpm/배지만의 평균 cpm 로서 나타내었다.
도 11은 HCV 아형 1 a 감염된 침팬지 Ton에서 6회 연속 및 3회 부스팅 면역화(작은 화살표로 나타냄)에 의해 유발된 항-E1 항체의 발생이다. 혈청중의 ALT, HCV RNA의 발생 및 간에서의 HCV 항원의 측정을 나타낸다. 항-E1 항체는 간접 ELISA 에 의해 측정되었다: 고체상 코팅된 E1에 결합하는 특이적 항체는 과산화효소와 접합된 항-인간 IgG 특이적 2차 항혈청을 사용하여 탐지되었다. TMB는 색 발현에 기질로서 사용되었다. 결과를 종말점 역가로서 나타내었다. ALT 수준을 의학적 분석기로 측정하였고, U/l 로 나타냈다. HCV RNA 는 HCV 모니터(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. E2 항원을 특이적 단일클론(EP 출원 번호 98870060.5에 기재된 ECACC 승인 번호 98031215)을 사용하여 간 생검에서 염색되었다. 반정량적 스코어링을 세포의 대다수에 명확한 양성 염색에 대해 검은색 사각형으로, 세포의 소수에서 명확한 염색에 대해 회색 사각형으로, 탐지되지 않는 염색을 나타내는 생검에 대해 백색 사각형으로 나타냈다. HCV RNA를 작은 검은색 박스로 나타냈다. E2의 염색은 코어 및 E1 염색에 의해 확인될 수 있었다(데이타는 나타내지 않음).
도 12는 Ton에서 E1으로의 면역화에 의해 유발된 항체 반응의 에피토프 매핑이다. 다양한 펩티드에 대한 항체 반응성은 비오틴화된 펩티드(표 4 참조)가 스트렙타비딘을 통해 마이크로타이터플레이트 상에 흡착되는 간접 ELISA 에 의해 측정되었다. 특이적 항체가 과산화효소와 접합된 항-인간 IgG 특이적 2차 항혈청을 사용하여 탐지되었다. TMB가 색 발현에 대한 기질로서 사용되었다.
도 13 은 침팬지 Ton에서 아형 1a 및 아형 1b E1 단백질에 대한 E1 항체 반응 분석이다. 이러한 목적으로, 유전자형 1b 에 대한 것과 동일한 E1의 부분을 발현하는, HCV-H 서열로부터 유래된 E1 유전자형 1a 재조합 백시니아 바이러스가 제조되었다(하기 참조). E1은 RK13 백시니아 바이러스에 감염된 세포로부터의 조 용균물로부터 유래되었다(Maertens 등(PCT/EP95/03031)에 기재된 바와 같이 제조). 항체 반응성이, E1 이 갈란투스 니발리스 아글루티닌(GNA)와 결합한 고-만노스를 통해 마이크로타이터플레이트상에 흡착되는 간접 ELISA에 의해 측정되었다. 특이적 항체를 과산화효소와 접합된 항-인간 IgG 특이적 2차 항혈청을 사용하여 탐지하였다. TMB이 색 발현에 대한 기질로서 사용되었다. 결과를 OD 차이값으로서 나타내었다(흡착된 E1이 있는 웰의 OD에서 흡착된 E1이 없는 웰의 OD를 뺀값).
도 14는 침팬지 Ton의 백신접종 전 및 후 림프구 증식 분석의 결과이다. 냉동된 PBMC를 해동하고, 상이한 항원으로 3회 자극하였다. 음성 대조군은 배지만으로한 반면, 콘카나발린 A를 5 ㎍/ml의 농도로 양성 대조군으로서 사용하였다. 150 ㎕의 총부피 중 2∼4 105 세포/웰의 농도의 PBMC가 대조군과 함께 또는 1 ㎍/ml의 E1 과 함께, 90 시간동안 37 ℃로 5 % CO2를 함유하는 습윤화된 대기중에서 U-형 96-웰 마이트로역가플레이트에서 10 % 열-불활성 FCS로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 마지막 18 시간동안 세포를 웰당 0.5 μCi(3H) 티미딘으로 펄스를 주었다. 그 다음, 배양물을 유리 섬유 필터상에서 수거하여, 표지 채취량을 측정하였다. 결과를 자극 지수(SI): 3 회 반복 측정의, 항원의 평균 cpm/배지만의 평균 cpm 로서 나타내었다.
도 15는 N-말단 고가변 부위가 결실된 E2 단백질의 발현을 수득하기 위해 사용되는 구축물의 유전자지도이다. 구축물 pvHCV-92 및 pvHCV-99는 결실 돌연변이 pvHCV-100 및 pvHCV-101의 구축을 위한 중간 구축물이다.
도 16은 도 15(상기 참조)에서 도식화된 구축물에 상응하는 서열(뉴클레오티드:A; 번역:B)이다.
도 17는 실시예 9에서 기재된 바와 같은 상이한 E1 제제로 면역화 시 마우스에서 수득되는 항체 역가이다. 역가는 ELISA에 의해 측정되었다: 쥐 혈청을 1/20 및 (0.5 log10) 상으로 더 희석하고, 마이크로타이터플레이트상 코팅된 E1s(아세트아미드 또는 말레이미드로 개질)상에서 배양하였다. 세척 후, 결합 항체를 과산화효소와 접합된 항-마우스 IgG 특이적 2차 항혈청을 사용하여 탐지하였다. TMB를 색 발현에 대한 기질로서 사용하였다. 결과를 종말점 역가로 나타내고, 표준 편차를 나타내었다(n=6).
도 18은 마우스에서 상이한 E1s 제제로 면역화에 의해 유발된 항체 반응의 에피토프 매핑이다. 다양한 펩티드에 대한 항체 반응성을 간접 ELISA에 의해 측정하였고, 비오틴화된 펩티드(표 4에 목록됨)가 스트렙타비딘을 통해 마이트로역가플레이트상에 흡착되었다. 쥐 혈청을 1/20으로 희석하고, 특이적 항체를 과산화효소와 접합된 항-마우스-IgG 특이적 2차 항혈청을 사용하여 탐지하였다. TMB가 색 발현의 기질로서 사용되었다.
도 19는 상이한 E1s 제제로 면역화된 마우스의 면역글로불린 이소타이핑 프로필이다. 특이적 Ig 클래스 및 서브클래스 항체가 마이크로타이터플레이트에서 흡착되었다. 1/500 희석된 면역 혈청으로부터 쥐 Ig의 포획후, E1s를 1 ㎍/ml로 항온배양하였다. 형성된 면역복합체를 E1에 대한 다클론 토끼 항혈청으로 더 항온배양하였다. 최종적으로, 토끼 항체를 과산화효소와 접합된 염소-항-토끼 Ig 2차 항혈청을 사용하여 탐지하였다. TMB를 색 발현에 대한 기질로서 사용하였다. 결과를 IgG1에 대해 표준화하였다(즉, IgG1 신호를 각 동물에 대해 1로 간주하고, 다른 이소타입에 대한 모든 결과를 상기 IgG1 결과에 비교하여 나타내었다).
도 20은 침팬지 Phil에서 E1s-아세트아미드로 약 1000 일 정도로 2회의 면역화에 의해 유발된 항체 역가가다. 항-E1 항체를 간접 ELISA에 의해 측정하였다:고체상 E1에 결합한 특이적 항체를 과산화효소와 접합된 항-인간 IgG 특이적 2차 항체 항혈청을 사용하여 탐지하였다. 역가를 유닛/ml로 나타내었고, 이 유닛은 인간 혈청을 기초로한 가계 표준을 나타낸다.
도 21은 침팬지 Ton에서 E1s-아세트아미드로 900 일 정도로 2회의 면역화에 의해 유발된 항체 역가가다. 항-E1 항체는 간접 ELISA에 의해 측정되었다: 고체상 E1에 결합한 특이적 항체가 과산화효소와 접합된 항-인간 IgG 특이적 2차 항혈청을 사용하여 탐지되었다. 역가를 유닛/ml로 나타내었고, 유닛은 인간 혈청을 기초로한 가계 표준을 나타낸다.
도 22는 최종 계면활성제 환원 단계(0.2 내지 0.05 % CHAPS)의 SEC 프로필이다: E1만의 입자 (A), E2만의 입자(B) 또는 E1 및 E2의 동일몰의 혼합물; 혼합된 입자(C). 도면은 또한 E1 만(상부), E2 만(중간) 을 특이적으로 탐지하는 ELISA 및 혼합 입자만이 탐지되는 ELISA(하부)의 OD값의 오버레이를 나타낸다.
도 23은 최종 계면활성제 환원 단계(0.2 내지 0.05 % CHAPS)의 SEC 프로필이다: E1 유전자형 1b 만의 입자(상부), E1 유전자형 4 만의 입자(중간) 또는 E1 유전자형 1b 및 4의 동일몰의 혼합물, 혼합된 입자(하부). 도는 또한 특히 혼합된 입자만이 특이적으로 탐지되는 ELISA의 OD 값의 오버레이를 나타낸다(도 22 참조).
본 명세서에 기재된 본 발명은 미리 출판된 문헌 및 계류중의 출원에서 유래된 것이다. 예로서, 상기 문헌은 과학 논문, 특허 또는 계류중인 출원으로 구성된다. 모든 이러한 출판물 및 출원은 미리 인용되었거나, 또는 본 명세서에서 참고로 포함된다.
본 발명은 HCV 백신접종에 관한 것이다. 최초로, 심한 만성 활성 C 형 간염을 앓는 침팬지의 성공적인 면역요법이 HCV 항원으로의 백신접종에 의해 달성되었다. 백신은 높은 면역 반응을 유발할 뿐만 아니라, 간으로부터 바이러스 항원의 일소, 및 조직학적 활성 및 간 질환의 상당한 개선을 유발하였다. 본 발명은 또한 정제된 단일 HCV 피막 단백질, 특히 올리고머 입자에 관한 것이다. 올리고머 입자는 본질적으로 HCV 피막 단백질로 구성되고, 동적 광산란에 의해 또는 전자 현미경에 의해 측정되는 바와 같이 1 내지 100 nm의 직경을 갖는다. 이러한 고려하에, 입자가 E1 및/또는 E2 단백질에 의해서만, 또는 그들의 부분에 의해 형성될 수 있다는 것이 강조되야 한다(하기 참조). 그러므로, 본 발명의 올리고머 입자는 WO 98/21338에 기재된, 필수적으로 E1 및 E2 및 코어 및 P7으로 구성되는 HCV-유사 입자와 근본적으로 상이하다. 용어 "본질적으로 HCV 피막 단백질로 구성되는 올리고머 입자"는 하나 또는 둘의 E1 및/또는 E2 단량체로 각각 구성되는 것으로 여겨지는 HCV E1 및/또는 E2 피막 단백질의 여러 기본 단위를 포함하는 특이적 성질 및 특이적 형태의 구조로서 본 명세서에서 정의된다. 본 발명의 입자에는 감염성 HCV RNA 게놈이 없다는 것이 명백해야 한다. 본 발명의 입자는 지질, 계면활성제, HCV 코어 단백질, 또는 보조 분자가 함입될 수 있는 피막 단백질의 껍질로 구성되는, 중공일 수 있는 구형 성질의 더욱 고차의 입자일 수 있다. 후자 입자는 또한 예를 들면, 아포리포단백질 B 또는 저밀도 리포단백질과 같은 리포좀 또는 아포리포단백질에 의해, 또는 상기 입자를 특정 기관 또는 조직으로 표적화하는 임의의 수단에 의해 캡슐화될 수 있다. 이러한 경우, 상기 중공 구형의 입자는 "바이러스-유사 입자" 또는 VLP로 종종 언급된다. 이와는 달리, 더욱 고차의 입자는 고체 구형 구조일 수 있고, 완전한 구는 HCV E1 또는 E2 피막 단백질 올리고머로 구성되며, 지질, 계면활성제, HCV 코어 단백질, 또는 보조 분자가 부가적으로 함입될 수 있거나, 또는 차례로 그들 자체가 예를 들면, 아포리포단백질 B, 저말도 리포단백질과 같은 리포좀 또는 아포리포단백질에 의해, 또는 상기 입자를 특정 기관 또는 조직에 표적화하는 임의의 수단, 예를 들면, 아시알로글리코단백질로 캡슐화될 수 있다. 입자는 또한 통상 원형 (이하 참조) 이고, 통상 HCV 피막 단백질의 단일층 이상을 포함하지 않는, (상기 나타낸 중공의 또는 고체 구형 구조와 비교하여) 더 작은 구조로 구성될 수 있다. 상기 더 작은 입자의 전형적인 예는 통상 4 내지 16 의, 더 적은 수의 HCV 피막 단백질로 구성되는, 로제트(rosette) 유사 구조이다. 후자의 특이적인 예로는 8∼10의 E1s 단량체를 명백히 포함하는 본 명세서에 예시된 0.2 % CHAPS 중에서 E1s로 수득되는 더 작은 입자를 포함한다. 상기 로제트-유사 구조는 통상 평면에서 원형, 예를 들면, 바퀴의 형태로 조직화된다. 지질, 계면활성제, HCV 코어 단백질, 또는 보강제(adjuvant) 분자가 부가적으로 함입될 수 있거나, 또는 더 작은 입자가 리포좀 또는, 예를 들면, 아포리포단백질 B 또는 저밀도 리포단백질과 같은 아포리포단백질에 의해, 또는 입자를 특정 기관 또는 조직에 표적화하는 임의의 수단에 의해 캡슐화될 수 있다. 더 작은 입자는 또한 지질, 계면활성제, HCV 코어 단백질, 또는 보강제 분자가 부가적으로 함입되거나, 또는 차례로 리포좀, 또는 예를 들면, 아포리포단백질 B 또는 저밀도 단백질과 같은 아포리포단백질에 의해, 또는 상기 입자를 특정 기관 또는 조직으로 표적화하는 임의의 수단에 의해 캡슐화 될 수 있는 유사한 더 적은 수의 HCV E1 또는 E2 피막 단백질로 구성되는 작은 구형(spherical) 또는 둥근(globular) 구조를 형성할 수 있다. 당업계 공지된 동적 광산란 기술(실시예 부분 참조)에 의해 측정되는 상기 정의된 입자의 크기(즉, 직경)은 통상 1 내지 100 nm, 더욱 바람직하게는 2 내지 70 nm, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 40 nm, 3 내지 20 nm, 5 내지 16 nm, 7 내지 14 nm, 또는 8 내지 12 nm이다.
본 발명은 또한 상기 피막 단백질이 HCV E1, HCV E1s, HCV E2 단백질, 서열번호 13 또는 서열 번호 14, 또는 그들의 부분으로 구성된 군으로부터 선택되는 상기 정의된 올리고머 입자에 관한 것이다. 단백질 HCV E1 및 HCV E2, 및 후자 단백질을 정제하는 방법의 상세한 설명은, PCT/EP 95/03031(Maertens 등)에 잘 기재되어 있으며 특징되어 있고, HCV E1s, 서열 번호 13 또는 서열 번호 14, 또는 그들의 부분은 PCT/EP 95/03031(Maertens 등) 에서 HCV E1 또는 HCV E1s에 대해 기재된 바와 같이 정제될 수 있다. 모든 정의를 포함하여, 후자 문헌의 전체 내용이 본 출원에서 참고로 포함될 수 있다는 것이 강조되야 한다. 단백질 HCV E1s 는 E1의 아미노산 192 내지 326을 나타내고, C-말단 소수성 앵커가 없는 E1 단백질을 나타낸다. 용어 "또는 그들의 부분"은 본 발명의 입자의 부분인, 면역원성이 있으며, 본원에 기재된 단백질의 임의의 부분을 의미한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 HCV 피막 단백질의 하나 이상의 시스테인 잔기가 알킬화, 바람직하게는 예를 들면, 활성 할로겐, 에틸렌이민 또는 N-(요오도에틸)트리플루오로아세트아미드와 같은 알킬화제에 의해 알킬화되는 본 명세서에서 기재된 올리고머 입자에 관한 것이다. 이러한 면에서, 시스테인의 알킬화는 황 원자상 수소가 (CH2)nR[식중, n은 0,1,2,3 또는 4이고, R=H, COOH, NH2, CONH2, 페닐, 또는 그들의 유도체이다]으로 치환된 시스테인을 언급하는 것으로 이해된다. 알킬화는 예를 들면, 활성 할로겐 X(CH2)nR[식중, X는 I, Br, Cl 또는 F와 같은 할로겐이다]과 같은 당업계 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 활성 할로겐의 예로는 메틸요오다이드, 요오도아세트산, 요오도아세트아미드, 및 2-브로모에틸아민이다. 알킬화의 다른 방법은 둘 다 H를 -CH2-CH2-NH2(Hermanson, 1996)로 치환을 초래하는 에틸렌이민 또는 N-(요오도에틸)트리플루오로아세트아미드의 사용을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "알킬화제"는 본 명세서에 기재된 알킬화를 수행할 수 있는 화합물을 언급한다. 상기 알킬화는 최종적으로 다른 아미노산을 모방할 수 있는 개질된 시스테인을 초래한다. 에틸렌이민에 의한 알킬화는 트립신에 대한 새로운 절단 부위가 도입되는 방법으로(Hermanson, 1996), 리신과 유사한 구조를 초래한다. 이와 같이, 메틸요오다이드의 사용은 메티오닌 유사 아미노산을 초래하고, 요오도아세테이트 및 요오도아세트아미드의 사용은 각각 글루탐산 및 글루타민 유사 아미노산을 초래한다. 유사하게, 이러한 아미노산은 바람직하게는 시스테인의 직접 돌연변이에서 사용된다. 그러므로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 HCV 피막 단백질의 하나 이상의 시스테인 잔기가 천연 아미노산, 바람직하게는 메티오닌, 글루탐산, 글루타민 또는 리신으로 돌연변이되는, 본 명세서에 기재된 올리고머 입자에 관한 것이다. 용어 "돌연변이된"은 상기 아미노산을 코딩하는 핵산의 부위-지시 돌연변이 유발, 즉 당업계에 주지된 방법, 예를 들면, Sambrook 등(1989)에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 또는 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이 유발을 통한 부위-지시된 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "정제된"은 예를 들면, HCV 피막 단백질 또는 올리고머 입자와 같은 목적하는 성분이 조성물 총 성분의 35 % 이상인 조성물을 나타낸다. 목적하는 성분은 바람직하게는 조성물의 총 성분 분율의 약 40 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 50 % 이상, 보다 더욱 바람직하게는 약 60 % 이상, 보다 더욱 바람직하게는 약 70 % 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 80 % 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 및 가장 바람직하게는 약 98 % 이상이다. 조성물은 예를 들면, 카르보히드레이트, 염, 지질, 용매 등과 같은 다른 화합물을 본 명세서에서 사용된 순도 백분율 측정에 영향없이 함유할 수 있다. "단리된" HCV 올리고머 입자는 35 % 이상의 순도인 HCV 올리고머 입자 조성물을 의미한다. 이러한 고려하에, 본 명세서에서 사용되는 용어 "정제된 단일 HCV 피막 단백질" 은 본질적으로 순수형인 단리된 HCV 피막 단백질을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "본질적으로 정제된 올리고머 입자" 및 "단일 HCV 피막 단백질"은 시험관내 진단 방법 및 치료에 사용될 수 있는 HCV 올리고머 입자 또는 단일 HCV 피막 단백질을 나타낸다. 이러한 HCV 올리고머 입자는 실질적으로 세포 단백질, 벡터-유래 단백질 또는 다른 HCV 바이러스 성분이 없다. 통상적으로, 이러한 입자 또는 단백질은 균질(80 %, 바람직하게는 85 %, 더욱 바람직하게는 90 %, 더욱 바람직하게는 95 %, 더욱 바람직하게는 97 %, 더욱 바람직하게는 98 %, 더욱 바람직하게는 99 %, 보다 더욱 바람직하게는 99.5 % 이상의 순수한, 가장 바람직하게는 오염된 단백질이 SDS-PAGE 및 은 염색과 같은 통상적인 방법에 의해 탐지되지 않게)하게 정제된다.
본 발명은 또한 상기 정의된 올리고머 입자에 관한 것으로서, 여기서 상기 피막 단백질은 HCV E1, HCV E1s, HCV E2, 서열 번호 13 및/또는 서열번호 14, 또는 그것의 일부의 임의의 혼합물도 가능한데, 예컨대 본 발명의 입자는 실질적으로 HCV E1- 및 HCV E2 단백질, HCV E1- 및 HCV E1s 단백질, HCV E1s- 및 HCV E2 단백질, 그리고 HCV E1-, HCV E1s- 및 HCV E2 단백질로 구성될 수 있다. 나아가, 본 발명은 또한 상기 정의된 올리고머 입자에 관한 것으로서 여기서 상기 단백질은 상이한 HCV 주(strains), 아형(subtypes) 또는 유전자형(genotypes) 유래이며, 예컨대 상기 단백질은 유전자형 1b 및 유전자형 4 유래이거나, 또는 HCV 하나의 주 또는 유전자형, 및 HCV 의 하나 이상의 다른 주 또는 유전자형에서 유래한 HCV 피막 단백질로 구성된 혼합물이다. 상이한 HCV 주 또는 유전자형은 Maertens 등에게 허여된 PCT/EP95/04155 에 잘 정의되어 있고 특정되어 있다. 모든 정의를 포함하여 후자의 문건의 전 내용은 본 출원에 있어서 참고로서 통합된다는 것을 다시한번 강조한다. 따라서, 본 발명은 당업계에 공지된 여하한 HCV 주 또는 유전자형으로부터 비롯한 피막 단백질을 포함하는 올리고머 입자 또는 당업계에 공지된 여하한 HCV 주 또는 유전자형으로부터 비롯한 단백질의 혼합물을 포함하는 입자에 관한 것이다. 이와 관련하여 본 발명은 또한 하기 실시예 (더 참조할 것) 에서 제시하듯이 개별 클론에서 비롯된 공통 서열에 관한 것이다.
나아가 본 발명은 상기 올리고머 입자의 제조 방법 뿐만 아니라 그 방법으로 얻을 수 있는 여기서 기술된 올리고머 입자에 관한 것이다. 상기 방법은 다음 단계로 특정된다:
(I) 임의로 제 1 계면활성제를 사용하는 것을 포함할 수 있는, HCV 피막 단백질의 정제 단계. 본질적으로, (I) 단계의 정제과정은 Maertens 등에게 허여된 PCT EP 95/03031 집중적으로 기술되어 있다. 중요하게도 본 발명에 따르면 PCT EP 95/03031 에 기술된 정제과정에서 예컨대 NEM-비오틴을 사용하는 차단단계가 본 발명에 기술된, 바람직하게는 요오드아세트아미드를 사용하는 알킬화 단계와 함께 수행된다. 더욱이, (I) 단계의 정제과정은 디술피드 결합 절단제의 사용을 포함할 수 있고, 알킬화제의 사용도 포함할 수 있다. 최종적으로 (I) 단계의 과정으로 용액내에 정제된 HCV 피막 단백질을 수득한다.
(II) 상기 정제된 HCV 피막 단백질 용액을 계면활성제나 염으로 대체하여 올리고머 입자를 형성하는 단계.
(III) (II) 단계의 계면활성제나 염의 농도를 추가적으로 감소시키는 것을 포함할 수 있는, 상기 올리고머 입자를 회수 또는 정제하는 단계. 이것은 상기 대체 단계 이후 형성된 상기 올리고머 입자의 형성 및 안정화를 추가적으로 지원한다.
더욱 바람직하게는, 본 발명은 상기 입자의 제조 방법 뿐만 아니라, 여기서 정의된 올리고머 입자에 관한 것인데, 여기서 상기한 임의의 제 1 계면활성제는 엠피젠-BB (Empigen-BB) 이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 상기 입자의 제조 방법 뿐만 아니라, 여기서 정의된 올리고머 입자에 관한 것인데, 여기서 (II) 단계의 계면활성제는 CHAPS, 옥틸글루카시드 또는 Tween, 더욱 바람직하게는 Tween-20 또는 Tween-80, 또는 기타 여하한 계면활성제이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 상기 입자의 제조 방법 뿐만 아니라, 여기서 정의된 올리고머 입자에 관한 것인데, 여기서 상기 염은 베타인이다. 훨씬 더 바람직하게는, 본 발명은 상기 입자의 제조 방법 뿐만 아니라, 여기서 정의된 올리고머 입자에 관한 것인데, 여기서 상기 엠피젠-BB (Empigen-BB) 는 1 % 내지 10 % 의 농도로 사용하며, 상기 CHAPS 또는 Tween 은 0.01 % 내지 10 % 의 농도로 사용하며, 상기 베타인은 0.01 % 내지 10 % 의 농도로 사용한다. 훨씬 더 바람직하게는, 본 발명은 상기 입자의 제조 방법 뿐만 아니라, 상기 정의된 올리고머 입자에 관한 것인데, 여기서 상기 엠피젠-BB는 3 % 의 농도로 사용하고 상기 CHAPS 또는 베타인은 0.2 % 또는 0.3 % 의 농도로 각각 사용하고 그 후에 완충액을 교환하며 상기 CHAPS 또는 베타인은 0.05 % 또는 0.1-0.5 % 의 농도로 각각 사용한다. 상기 방법에서 사용되는 모든 백분율은 중량/부피로 주어짐을 알아야 한다. 상기 방법 (PCT/EP95/03031 및 본 출원의 실시예 부분을 또한 참조할 것) 은 본 발명의 입자의 제조 방법의 일예인 것을 명확히 하고자 한다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 본 발명의 올리고머 입자 제조에 사용할 수 있는 당업계의 여하한 공지의 방법, 예컨대 PCT/EP95/03031 및 실시예 부분(하기 참조)에 기술된 대로 환원제를 생략하고, 대신에 시스테인 가교를 환원시키기 위해 소포체 내에 최적의 산화환원 상태를 가지는 숙주세포를 사용하는 것에 관한 것이다. 추가적으로, 베타인 유도체 예컨대 술포베타인 뿐만 아니라, 알킬 베타인 전부, 예컨대 Cn 꼬리 (n= 1 내지 20 의 양의 정수) 를 가진 알킬베타인을 사용할 수 있음을 명확히 하고자 한다.
정제된 HCV 항원 백신으로, 심한 만성 활성 C 형 간염을 앓고 있는 침팬지에 대해 성공적인 면역치료가 최초로 달성되었으므로, 본 발명은 정제된 단일 HCV 피막 단백질, 특히 E1 또는 E1s 에 또한 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 단일 HCV 피막 단백질을 포함하는 조성물 및 HCV 백신으로서의 그의 용도, 또는 HCV 백신의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
무관한 에피토프에 대한 면역 반응의 유발을 회피하기 위해, 바람직하게는 백신용 HCV 피막 단백질을 개별 아형, 주, 또는 클론의 공통 서열로서 구축하였다. 따라서, 본 발명은 또한 백신용이나 진단용 HCV 항원 (펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드의 여하한 형태로서) 의 용도에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 본원에 정의된 대로 올리고머 입자 및 그것의 용도에 관한 것으로서, 여기서 HCV 피막 단백질은 단리체 내 유사종 변이에 기초한 공통 서열 (단리체 공통 서열) 로 코드되어 있는 것이거나 하나의 아형 (아형 공통 서열), 형 또는 종 (형 또는 종 공통 서열), 또는 완전 HCV 속 (속 공통 서열) 내 상이한 단리체의 공통 서열로 코드되어 있는 것이다. 결론적으로, 이러한 공통 HCV 피막 단백질의 아미노산 서열은 단리체-, 아종-, 주- 또는 속 공통 서열로부터 비롯한 공통 서열이다. "공통 서열" 란 용어의 함축적 의미는 특히 마에텐 및 스투이버 (Maertens & Stuyver, 1997) 의 문헌 및 거기서 사용한 참조자료에 언급된다.
본 발명의 올리고머 입자는 지극히 효율적으로 에피토프를 제시한다(하기 참조). 그러므로, 올리고머 입자는 에피토프가 능숙한 면역 반응을 이끌어 내게끔 에피토프를 제시하는 수단이다. 이러한 상황에서, 여기서 정의된 HCV 피막 단백질이 HCV 에피토프를 배타적으로 함유할 필요는 없는 것으로 이해된다. 올리고머 입자를 형성하는 HCV 피막 단백질은 HCV 로부터만 비롯된 에피토프를 함유할 수 있고, 외재성 샘플 예컨대, HBV 또는 HIV 로부터 비롯된 에피토프를 함유할 수 있다. 다시 말하면, HCV 피막 단백질 골격을 가진 올리고머 입자는 운반체로 사용되어 HCV 에피토프에 추가하여 비-HCV 에피토프를 제시할 수 있다. 따라서, 본 발명은 비-HCV 에피토프를 포함할 수 있으며, 여기서 정의되나 HCV 에피토프를 가지지 않을 수 있는 올리고머 입자 및 그의 적용 및 그의 제조를 또한 포함한다. 여기서 사용되는 "외재성 샘플" 이라는 용어는 살아있건 아니건 면역 반응을 이끌어 낼 수 있는 여하한 샘플을 말하며, 숙주에 대해 내재성이 아니고 HCV 가 아니다. 구체적으로, 후자의 용어는 병원성 샘플, 알러젠 및 합텐으로 구성되는 군을 말한다. 병원성 샘플은 프리온, 바이러스, 원핵생물 및 진핵생물을 포함한다. 더욱 구체적으로, 바이러스는 특히 HBV, HIV, 또는 헤르페스 바이러스를 포함하지만, HCV 는 아니다. 알러젠은 숙주가 그 알러젠에 노출시 숙주 내에서 그 자체의 면역 반응을 유발할 수 있는 물질 또는 분자를 포함한다. 합텐은 면역 반응을 유발할 수 있다는 점에서 알러젠과 유사하게 행동하지만 알러젠과 대조적으로, 합텐은 담체 분자를 필요로 한다.
본 발명은 또한 상기 정의된 올리고머 입자를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 더욱 특별하게는 본 발명은 백신 조성물에 관한 것이다. "백신 조성물"이란 용어는 부분적이거나 완전한 것을 무론하고 HCV 에 대해 보호작용을 이끌어 낼 수 있는 면역유발성 조성물에 관한 것이다. 따라서, 그것은 HCV 펩티드, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. HCV 에 대한 보호작용은 특히 인간에 대한 것이나, 또한 비인간 영장류, 트리메라 쥐 (자우버만 등, Zauberman et al., 1999), 또는 기타 포유류에 대한 것이다.
본 발명의 입자는 비오틴화 형태 (WO 93/18054 에 설명한 대로임) 및/또는 뉴트랄라이트 아비딘(Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA) 와 복합화되어 사용할 수 있다. "백신 조성물"은 활성 물질에 추가하여, 그 스스로는 그 조성물을 받아들이는 개인에게 유해한 항체의 생성을 유발하거나 보호작용을 이끌어 내지 못하는, 적절한 부형제 (excipient), 희석제, 담체 및/또는 보강제를 포함한다는 것을 또한 주목하여야 한다. 적합한 담체는 전형적으로 크고 서서히 대사되는 거대분자 예컨대 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 aa's, aa 공중합체 및 비활성 바이러스 입자들이다. 그러한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 조성물의 효율성을 높이기 위한 바람직한 보강제는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: WO 93/19780 에 기술된 3-0-탈아실화 모노인지질 A 와 조합된 알루미늄, 알루미늄 히드록시드, WO 93/24148 에 기술된 알루미늄 포스페이트, 미국 특허 제 4,606,918 호에 기술된 N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민, N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타밀-L-알라닌2-(1'2'디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)에틸아민 및 모노인지질 A, 탈독소화 엔도톡신, 트레할로스-6,6-디마이콜레이트 및 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS) 을 2 % 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 중에 함유하는 RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, USA) . MPL, TDM 또는 CWS 세 성분 중 어느 것도 단독으로 또는 2 개씩 조합하여 사용할 수 있다. 추가적으로, 예컨대 QS21 및 3-de-O-아세틸화 모노인지질 A 간의 조합물 (WO94/00153), 또는 MF-59 (Chiron), 또는 폴리[디(카르복실아토페녹시)포스파젠] 기재 보강제 (Virus Research Institute), 또는 블록공중합체 기재 보강제 예컨대 옵티박스 (Optivax, Vaxcel, Cythx)나 인슐린-기재 보강제, 예컨대 알감뮬린 및 감마이뉼린 (Algammulin and GammaInulin, Anutech), 불완전 프로인트 보강제 (IFA) 나 저브 프레퍼레이션 (Gerbu preparation, Gerbu Biotechnik) 같은 보강제 뿐만 아니라, 스티뮬론 (Stimulon, Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA) 또는 SAF-1 (Syntex) 과 같은 보강제를 사용할 수 있다. 완전 프로인트 보강제 (CFA) 또한 비-인간에 적용 및 연구 목적으로 사용할 수 있음을 알아야 한다. "백신 조성물" 은 추가적으로 부형제 및 희석제를 함유하는데, 이는 본래부터 무독성 및 비-치료적인 것으로서 예를 들면 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올, 습화제나 유화제, pH 완충물질, 보존제 등이다. 전형적으로, 백신 조성물은 주사할 수 있도록 액체 용액이나 현탁액으로 제조된다. 주사에 앞서 액체 운반체(vehicle) 중 용액화나 현탁화에 적합한 고형을 또한 제조할 수 있다. 그 제형은 또한 보강제의 효과를 높이기 위해 리포좀 내에 캡슐화하거나 유화할 수 있다. 폴리펩티드를 사포닌 예컨대 Quil A (ISCOMS) 와 함께 면역 자극 복합체에 또한 통합시킬 수 있다. 백신 조성물은 임의의 상기 성분 뿐만 아니라 면역학적 유효량으로 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. "면역학적 유효량" 이란 그 양이 단독 투여량으로 또는 시간 간격을 두고 연속 투여하는 화합물의 일부로서 개인에게 투여시 예방이나 치료에 효과적인 경우를 의미한다. 이 양은 치료를 받을 개인의 건강 및 육체적인 상태, 치료를 받을 개인의 분류군 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 영장류, 등), 효과적인 면역 반응을 개시하는 개인의 면역계의 능력 (capacity), 바라는 보호작용의 정도, 백신의 제형, 치료하는 의사의 평가, 감염중인 HCV 의 주(strain) 및 기타 관련 요소에 따라 가변적이다. 그 양은 일상적인 시행을 거쳐서 결정할 수 있는, 상대적으로 넓은 범위 내로 귀착된다고 예상된다. 통상적으로, 그 양은 0.01 내지 1000 μg /투여, 특히 0.1 내지 100 μg /투여로 가변적이다. 그 백신 조성물은 전형적으로는 주사, 예컨대 피하 또는 근육내 주사와 같이 통상적으로 비경구 투여된다. 기타 투여 방법에 적합한 추가적 제형은 경구용 제형 및 좌약을 포함한다. 투여시 한번의 투여 계획 또는 여러 번의 투여 계획으로 할 수 있다. 백신은 다른 면역조절제와 결합하여 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 예방을 위한 항 HCV 면역 유발용으로 여기서 정의된 올리고머 입자의 용도에 관한 것이다. 백신은 또한 상기 지적한 바대로 개인의 처리용으로도 유용하다는 것을 주목하여야 하며, 이 경우 "치료용 백신"으로 부른다.
본 발명은 또한 상기 정의한 조성물에 관한 것으로서 이는 또한 HCV 코어, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및/또는 NS5B 단백질, 또는 그것의 부분을 포함하는 것이다. E1, E2, 및/또는 E1E2 입자는 예컨대 T 세포 자극 항원 예를 들면, 코어, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및/또는 NS5B 같은 것과 조합할 수 있다. 특히, 본 발명은 상기 정의한 조성물에 관한 것으로서 여기서 언급된 NS3 단백질, 또는 그의 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 (실시예 부분을 더 참조할 것) 로 주어지는 아미노산 서열을 가지는 것이다.
NS3 단백질의 정제는 바람직하게는 시스테인 잔기의 가역적 개질을 포함하며, 더욱 바람직하게는 시스테인의 술폰화를 포함한다. 술폰화를 포함하는 그러한 가역적 개질을 얻기 위한 방법은 Maertens 등의 문헌 (PCT/EP99/02547) 에 NS3 단백질 용으로 기술되어 있다. 모든 정의를 포함하여, 후자의 문건의 전 내용은 참고로서 본 출원에 통합된다는 것을 강조한다.
본 발명은 또한 상기 정의한 올리고머 입자 또는 상기 정의한 조성물의 HCV 백신 조성물 제조용 용도에 관한 것이라는 것은 상기한 바로부터 명백하다. 특히, 본 발명은 만성 HCV 보유자 내 항 HCV 면역 유발용으로 여기서 정의한 올리고머 입자의 용도에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 여타 치료 예컨대 HCV 처치용 소약물 예컨대 리바비린의 투여와 조합하거나 또는 하지 않는 공지된 인터페론 요법에 앞서서, 동시에 또는 그 이후에 만성 HCV 보유자 내 항 HCV 면역 유발용으로 여기서 정의한 올리고머 입자의 용도에 관한 것이다. 그러한 조성물은 간 이식 전후에, 또는 예컨대 창상과 같은 추정 감염 이후에 또한 사용할 수 있다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 단일 HCV 피막 단백질이나 올리고머 입자를 함유하여 생물학적 샘플 내에 존재하는 HCV 항체를 검출하는 키트에 관한 것이다. 여기서 사용하는 "생물학적 샘플"이란 용어는 개인으로부터 단리한 조직이나 체액 샘플을 말하는데, 예컨대 혈청, 플라즈마, 림프액, 외피, 호흡장기, 및 요생식기, 난자, 눈물, 타액, 모유, 혈액세포, 종양, 기관, 소화액, 점액, 척추액, 외분비 예컨대, 배설물, 뇨, 정자, 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 것들이다. 본 발명의 올리고머 입자 및 단일 HCV 피막 단백질은 매우 면역 유발성이고, 체액성 및 세포성 면역 반응 둘다를 자극하므로, 본 발명은 또한 HCV 관련 T 세포 반응 검출용 키트에 관한 것인데, 이는 본 발명의 올리고머 입자 또는 정제한 단일 HCV 피막 단백질을 포함하는 것이다. HCV T 세포 응답은 예를 들면 실시예 부분에 기술된 대로, 또는 레록스-롤스 등(Leroux-Roels et al.) 에게 허여된 PCT/EP 94/03555 에 기술된 대로 측정할 수 있다. 모든 정의를 포함하여, 이 문건의 전 내용은 참고로서 본 출원에 통합된다는 것을 강조한다.
본 발명은 또한 HCV 감염에 대한 처치 및 예방용 특이적 HCV 면역글로불린의 용도에 관한 것이라는 것을 명백히 하고자 한다. 충분한 양의 HCV 항체, 특히 HCV 피막 항체는 C 형 간염의 개선을 유발한다는 것을 여기서 최초로 밝힌다. 또한, 충분한 양의 항체는 순환하는 바이러스에 결합할 수 있고, Ab-복합 바이러스가 존재시 간에서 HCV 항원의 소멸, 및 간 질환의 개선이 동시에 발생한다는 것을 여기서 최초로 밝힌다. HCV 피막 항체는 HCV-감염된 혈액의 풀 (pools) 이나 HCV 백신 피주사자로부터 얻은 혈액에서 정제한 후, 주사로 수동적으로 전달하거나 백신으로 유발할 수 있다. 따라서, 본 발명은 나아가 특이적 항체에 관한 것인데, 이는 상기 올리고머 입자에 대해 또는 상기 조성물에 대해, 또는 단일 HCV 피막 단백질에 대해 생성되는 것이다. 특히, 본 발명은 HCV 항원 검출용 상기 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 여기서 사용하는 "특이적 항체" 라는 용어는 본 발명에서 개시된 올리고머 입자에 특이적 에피토프에 대해 발생한 항체를 말한다. 다시 말해, 특이적 항체는 올리고머 입자의 형성에서 비롯되고 올리고머 입자 상에만 있는 에피토프에 대해 발생한 것이다. 더욱이, HCV 펩티드를 생산하는 것으로 알려진 다양한 과정이 있다. 이러한 과정은 에피토프를 제시할 수 있는 HCV 펩티드를 유발할 것이다. HCV 펩티드는 이러한 다양하고도 상이한 과정으로 얻어지는데, 유사한 에피토프를 제시할 수 있음을 추론할 수 있다. 유사한 에피토프는 상이한 생산 또는 정제 과정에서 비롯된 에피토프이지만 하나의 동일한 항체가 인식할 수 있는 것이다. 그러나, 본 발명의 올리고머 입자는 극히 효율적으로 에피토프를 제시한다. 결국, 올리고머 입자 상의 에피토프는 매우 면역유발성이 높다. 그러므로, 본 발명은 또한 올리고머 입자 상 에피토프에 관한 것인데, 이 에피토프는 본 발명에 따라 생산되지 않는, 즉 계면활성제-보조 입자 형성으로 생산되지 않는 HCV-펩티드 상 에피토프보다 적어도 10배, 바람직하게는 20배 이상, 바람직하게는 50배 이상, 바람직하게는 100배 이상, 바람직하게는 500배 이상, 그리고 가장 바람직하게는 1000배 이상 더 면역유발성이다. 상기 면역유발성은 예컨대, 여하한 방법으로 생산된 펩티드의 비교할 만한 양을 투여함으로써 포유류를 면역화하여 검출하고 비교할 수 있음을 당업자는 인식할 것이다. 더욱이, "특이적 항체" 라는 용어는 또한 정제된 단일 HCV 피막 단백질에 대해 유발된 항체를 말한다. 여기서 사용하는 용어 "항체" 는 다클론성 또는 단일클론성 항체를 말한다. "단일클론성 항체" 라는 용어는 동종의 항체 집단 (homogeneous antibody population) 을 가진 항체 조성물을 말한다. "항체" 라는 용어는 종이나 항체의 근원에 관한 제한이 없고, 그것이 만들어지는 방식에 의해 제한되지 않는다. 추가로, "항체" 라는 용어는 또한 인간화 항체 (humanized antibodies) 를 말하는 것으로서 이는 적어도 면역글로불린의 골격 영역의 적어도 한 부분이 인간 면역글로불린 서열 및 예컨대 미국 특허 제 4,946,778 호에 기술된 단일 사슬 항체 내지 항체 단편, 예컨대 Fab, F'(ab)2, Fv, 및 모 항체의 특이성 및 항체 결합 기능을 보유한 다른 단편으로부터 비롯된 것이다.
더욱이, 본 발명은 또한 항 HCV 피막 단백질 항체를 검출하기 위한 상기 조성물, 또는 상기 올리고머 입자의 용도를 특징으로 한다. 여기서 사용하는 용어 "검출하기" 는 검출용으로 적합한 당업계에 공지된 여하한 검정법을 말한다. 특히, 그 용어는 WO 96/13590 에 기술된 여하한 면역분석법을 말한다.
"펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 본 발명에서 호환적으로 사용한다. "폴리펩티드" 는 아미노산의 중합체 (아미노산 서열) 를 말하며 분자의 특정 길이를 언급하는 것은 아니다. 따라서, 올리고펩티드는 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 펩티드모사체는 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어에서 본래의 것으로 이해한다.
또한, 본 발명은 항 HCV 면역 유발용으로 여기서 기술하는 올리고머 입자의 용도에 관한 것으로서 상기 올리고머 입자가 시간 간격을 두고 연속 투여하는 화합물의 일부로 사용되는 것을 특징으로 한다. 이와 관련하여, "시간 간격을 두고 연속 투여하는 화합물" 이라는 용어는 면역 응답을 이끌어 내기 위한 화합물을 개인에게 시간 간격을 두고 투여하는 것을 말하는 것으로 이해하여야 한다. 후자의 화합물은 임의의 하기 화합물을 포함할 수 있다: 올리고머 입자, HCV DNA 백신 조성물, HCV 폴리펩티드.
이러한 점에서, 상기 연속 투여는 임의의 하기 투여를 포함한다:
(I) 시간 간격을 둔 HCV 항원, 예컨대 올리고머 입자의 투여, 또는
(II) 교대하는 시간 간격의 경우를 포함하여, 동시 또는 상이한 시간 간격을 둔, HCV DNA 백신 조성물과 조합한 올리고머 입자와 같은, 상기 올리고머 입자와 조합된 상기 HCV DNA 백신 조성물과 같은 HCV 항원의 투여, 또는
(III) 시간 간격을 둔, 다른 HCV 펩티드와 조합가능한 (I) 이나 (II) 의 투여.
이와 관련하여, HCV DNA 백신 조성물은 E1-, E2-, E1/E2-펩티드, E1s 펩티드, 서열 번호 13, 서열 번호 14, NS3 펩티드, 기타 HCV 펩티드 또는 상기 펩티드의 부분을 포함하는, HCV 피막 단백질 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다는 것을 명백히 하고자 한다. 더욱이, 상기 HCV 펩티드는 E1-, E2-, E1/E2-펩티드, E1s 펩티드, 서열 번호 13, 서열 번호 14, NS3 펩티드, 기타 HCV 펩티드 또는 이들의 일부를 포함하는, HCV 피막 펩티드를 포함한다는 것을 이해하여야 한다. "기타 HCV 펩티드" 라는 용어는 상기 HCV 펩티드가 E1, E2, E1s, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 또는 NS3 가 아닌 것을 조건으로 여하한 HCV 펩티드 또는 그의 단편을 말한다. 상기 구상 중 II 항목에 있어서, HCV DNA 백신 조성물은 바람직하게는 HCV 피막 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 구상 중 II 항목에 있어서, HCV DNA 백신 조성물은 더욱 바람직하게는 HCV-NS3 DNA 백신 조성물과의 조합이 가능한, HCV 피막 펩티드를 코딩하는 핵산으로 구성되어 있다. 이와 관련하여, HCV DNA 백신 조성물은 전사 조절 요소에 작동가능하도록 연결된, 상기 HCV 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 포함한다는 것을 명백히 하고자 한다. 여기서 사용하는 "플라스미드 벡터" 는 그것이 연결되어 있는 다른 핵산 분자를 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 바람직한 벡터는 자가복제 및/또는 그것에 연결된 핵산의 발현이 가능한 것이다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는, 이에 제한되지는 않으나, 환형 이중쇄 DNA 고리로서 이는 그 벡터 형태 내에서 염색체에 결합되어 있지 않다. 여기서 사용하는 "폴리뉴클레오티드 서열" 은 데옥시리보핵산 (DNA), 및 적절한 경우에는 리보핵산 (RNA) 와 같은 폴리뉴클레오티드를 말한다. 그 용어는 균등물로서 뉴클레오티드 유사체, 및 단일쇄 (센스 혹은 안티센스) 및 이중쇄 폴리뉴클레오티드로부터 만들어진 RNA 나 DNA 유사체를 포함하는 것으로 또한 이해하여야 한다. 여기서 사용하는 용어 "전사 조절 요소"는 살아있는 척추동물 세포에 도입시 세포 기관이 그 폴리뉴클레오티드에 코드되어 있는 번역 산물을 생산할 수 있도록 하는 필수 조절 요소를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. "작동가능하도록 연결된" 이란 용어는 성분이 자기의 통상적 기능을 수행할 수 있도록 배열된 병치 형태를 말한다. 따라서, 작동가능하도록 뉴클레오티드 서열에 연결된 전사 조절 요소는 상기 뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있는 것이다. 당업자는 상이한 전사 프로모터, 터미네이터, 담체 벡터 또는 특이적 유전자 서열들이 성공적으로 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 HCV 항체 검출용 면역분석법에 관한 것으로서 이 면역분석법은 하기 단계를 포함한다: (1) 여기에 정의된 올리고머 입자나 정제된 단일 HCV 피막 단백질, 또는 그것의 기능적 균등물의 공급 단계, (2) 항체-항원 복합체의 형성을 허락하는 조건하에, 상기 올리고머 입자 또는 상기 HCV 피막 단백질과 함께 생물학적 샘플을 항온배양하는 단계, (3) 상기 올리고머 입자 또는 상기 HCV 피막 단백질을 함유하는 상기 항체-항원 복합체가 형성되는 여부를 결정하는 단계.
본 발명을 이제 하기 실시예들을 참고로 설명하는바 이는 특별히 유리한 구체예를 보여준다. 그러나, 이러한 구체화는 단지 예시일 뿐이며 어떠한 경우에도 발명을 한정하는 것으로 해석할 수 없다.
실시예 1: HCV E1 단백질의 발현, 정제, 및 계면활성제-보조 단독-올리고머화.
Maertens 등의 문헌(PCT/EP 95/03031)에 기술된 프로토콜에 따라 재조합 백시니아 바이러스 pvHCV-11A를 사용하여 RK13 세포로부터 HCV E1s 단백질 (아미노산 192-326)을 발현시키고 정제하였다. 또한, E1 단독-이량체에 상응하는 겉보기 분자량 (약 60 kDa; 도 1)을 나타내는 3 % 엠피젠-BB 내의 정제된 E1 단백질을 풀링(pooling)하고, 풀링된 단편을 다시 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 다시 적용시키고 (PCT/EP 95/03031에 따라) 0.2 % CHAPS 또는 3 % 베타인의 존재 하에 작동시켰다. 놀랍게도, E1s 단백질에는 막 고착 영역이 없음에도 불구하고, 겉보기 분자량이 260-280 kDa인 특수하게 결합된 E1 단독-올리고머의 균질 집단이 두 계면활성제로 수득될 수 있었다 (도 2). 이같은 단독-올리고머성 구조물은 약 9 개의 Els 단량체를 함유할 수 있다. 올리고머의 모양이 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 이의 겉보기 분자량에 영향을 강하게 미칠 수 있으므로 E1 단량체의 수가 대략의 추정이라는 것이 명백하여야 한다. 0.02 % CHAPS로부터 0.05 % CHAPS로 바꾸고 동일한 절차를 반복함으로써 겉보기 분자량이 컬럼의 분해능 초과로 더 이동하였고 (컬럼의 공극, >600 kDa, 도3), 이것은 입자의 형성을 시사한다. 3 % 베타인에서 0.1 % 베타인으로 바꿈으로써, 유사한 양태를 나타내는 E1s 올리고머의 집단이 수득되었다 (데이타 나타내지 않음). 유사한 계면활성제-보조 올리고머화를 이룰 수 있는 다른 계면활성제를 선택할 수 있다. 입자 형성에 이르는 올리고머화는 Tween-20 또는 Tween-80 또는 옥틸글루카시드를 사용하여 유사한 결과를 수득할 수 있으므로 CHAPS 또는 베타인에 독특한 것이 아니다. 또한, 더욱 큰 입자가 생성되도록 할 수 있는 계면활성제의 추가적인 제거가 가능할 수 있다. 따라서, 입자의 수득을 위해 계면활성제의 존재가 더이상 필요하지 않을 수 있다. 어떠한 계면활성제도 없이, 예를 들어 SCC에 의해 입자를 수득할 수 있다. 주목할만 하게, E1 단량체는 약 31 kDa인 반면, E2 단량체는 약 70 kDa이다. 그러나, 이러한 값은 단백질의 글리코실화 상태에 따라 다를 수 있다.
실시예 2: 동적 광산란에 의한 E1의 고차 올리고머성 구조물의 분석
입자가 생성된 예상 밖의 결과를 확실하게 하기 위해, 실시예 1에 따라 제조된 0.05 % CHAPS 및 0.1 % 베타인 내의 및 0.5 % 베타인 내의 제제를 희석하여 제조되는 0.1 % 베타인 내의 E1s 제제를 동적 광산란 (DLS)에 의해 분석하였다.
동적 광산란 기술은 브라운 운동을 측정하고 이것을 입자의 크기와 관련시킨다. 입자가 클수록, 브라운 운동이 느려진다. 브라운 운동의 속도는 확산 계수 (일반적으로 기호 D로 주어짐)로서 공지된 특성에 의해 정의된다. 입자의 크기는 Stokes-Einstein 식: d(H)=kT/3πηD [식중 d(H)는 유체역학적 직경이고, k는 볼츠만 상수이고, T는 절대온도이며, η는 점도이다]를 사용하여 확산 계수로부터 계산된다. 주목할만 하게, 측정된 직경은 입자가 유체 내에서 어떻게 확산되는지를 가리키는 값이다. 따라서, 이것은 유체역학적 직경으로 일컬어진다. 확산 계수는 자체상관 함수 (시간의 흐름에 따른 빛의 강도 변동의 변화)로부터 유도된다. 기구는 컴퓨터-제어 상관계를 사용하여 자체상관 함수 강도를 자동적으로 계산한다.
크기 분포를 측정하기 위해, 상기 자체상관 함수를 수정하여 선형 커브를 수득하고 기구에 크기 분포 분석용 컴퓨터 프로그램을 장착한다. 그러나, 이 기술은 다각도 레이저 광산란 (multi angle laser light scattering: MALLS)으로 불리는 기술과 유사한 제한된 가정을 지니고, 어느 방법도 절대적인 데이타를 산출하는 것으로 간주될 수 없다. DLS로부터의 크기 분포 결과는 분포의 실제 표현보다는 다분산도의 반-정량적 지표로 해석되어야 한다.
E1s 입자를 함유하는 샘플 (80-400 ㎍ Els/㎖ PBS-0.05 % CHAPS, 0.1 % 또는 0.5 % 베타인)을 10mW HeNe Laser (PolymerLaps)가 장착된 LSP 3.53 DLS 기구의 측정 세포 내에 피펫팅하였다. 분석에서 판독된 정보를 도 4 (0.05 % CHAPS 내의 E1s) 및 도 5 (0.1 % 또는 0.5 % 베타인 내의 E1s)에 나타냈다.
실제로 이러한 분석은 수득된 E1s 구조물이 구형이고 단순분산 입자라는 예상밖의 결과를 확실하게 한다. PBS/0.1 % 베타인 내의 E1s 입자의 평균 크기 분포는 21.3 ±4 ㎚이고, PBS/0.5 % 베타인 내의 E1s 입자의 평균 크기 분포는 27.9 ±5 ㎚인 반면, PBS/0.05 % CHAPS 내의 E1 입자의 직경은 12.5였다.
실시예 3: 전자 현미경에 의한 크기 및 모양 분석
10 ㎕의 E1s (PBS/0.05 % CHAPS 내의 226 ㎍/㎖; 및 PBS 3 % 베타인 내의 143 ㎍/㎖)을 안정화된 포름바르 그리드 탄소 상의 1 % 우라닐 아세테이트로의 표준 음성 염색으로 가시화시켰다. 샘플을 30 초 동안 적용한 후, 5 초 동안의 염색 및 사진촬영 (도 6) 전에 dH2O로 세정하였다.
통계적 분석으로 하기의 결과가 수득되었다: CHAPS 내의 E1s 입자의 평균 직경은 8.7 ±0.27 nm (범위 4.3-29.0; 95 % CI 5.4)이고 베타인 내의 E1s 입자의 평균 직경은 9.7 ±0.55 nm (범위 4.3-40.5; 95 % CI 11.0)로 덜 균일하였다. 놀랍게도, 처음에 SEC로 분석했을 때 MW가 250-300 kDa이었던 3 % 베타인 제제는 처음에 SEC로 분석했을 때 MW가 >600 kDa이었던 0.05 % CHAPS 제제보다 더 큰 입자를 보였다. 따라서, 3 % 베타인에 의해 수득된 E1s 의 중간의 단독-올리고머성 형태가 시간이 흐르면서 더욱 고차인 입자를 형성할 수 있다고 가정하였다. 이러한 놀라운 효과는 더욱 고차인 입자를 수득할 수 있는 가능성을 암시한다. 입자의 크기 분포(도 7)는 비록 더 큰 크기의 입자로 꼬리가 늘어지는 것이 관찰되지만 (0.05 % CHAPS에 대해 29 nm까지) CHAPS 제제가 단순분산이라는 것을 나타낸다. DLS 분석에서는 더 큰 구조가 과대평가되므로, 이러한 더 큰 입자의 존재는, 비록 수적으로는 적지만, DLS 분석에서 수득되는 더 큰 직경 (실시예 2)을 설명할 수 있다. 직경에서의 차이는 DLS가 운동 중인 입자를 측정하는 반면 전자 현미경은 정적인 입자를 측정한다는 사실에 의해서도 설명될 수 있다. 하기의 실시예에서 나타나듯이 이러한 제제들의 면역원성은 전체 제제로 인한 것이고 평균적이거나, 더 작거나, 더 큰 입자 또는 이들의 혼합물로 인한 것일 수 있다는 것이 명백해야 한다.
실시예 4: HCV 아형 1b 에 만성적으로 감염된 침팬치의 면역화
13 년 (면역화 전 5015 일) 동안 HCV 아형 1b 주에 이미 감염된 침팬치 (Phil) 를, 아미노산 수준의 95.1 % 의 동일성 (표 2 참조) 을 갖는 유전자형 1b 의 다른 주로부터 유래되고 실시예 1-3 에서 기술된 것처럼 제조된 E1 (aa 192-326) 으로 백신접종하였다. 침팬치는 제조자의 프로토콜 (Ribi Inc. Hamilton, MT) 에 따라 RIBI R-730 (MPLA+TDM+CWS) 와 혼합된 PBS/0.05 % CHAPS 중 각각 50 ㎍ 의 E1 으로 총 6 회의 근육내 면역화를 받았다. 6 회의 면역화는 3 주 간격의 3 회 주입을 2 번의 연속으로 행하였고 두 연속 간에는 6 주의 시간 간격을 두었다. 면역화 전 150 일부터 시작하여, 면역화 기간 동안 및 면역화 후 1 년 까지 (하기 참조) 침팬치를 HCV 유발 질병의 활성을 나타내는 각종 파라미터로 계속 측정하였다. 이 파라미터는 혈액화학, ALT, AST, 감마GT, 혈액화학, 혈청 중 바이러스 부하, 간 중 바이러스 부하 및 간 조직학을 포함한다. 덧붙여, 면역화에 대한 면역 응답을 체액성 및 세포성 수준 모두에서 측정하였다. 이 기간 동안 침팬치를 행동, 임상 징후, 체중, 체온 및 국부 반응 (발적, 종창(腫脹), 경화) 과 같은 면역화의 임의 역효과에 대해 또한 측정하였다. 그 효과는 발견되지 않았다.
명백히, E1 에 대한 항체의 수준이 최고에 도달하자마자, ALT (및 특히 감마GT, 데이타는 나타내지 않음) 수준이 떨어졌다 (도 8). 항체 수준이 감소되기 시작하자마자 ALT 가 다소 빠르게 되돌아 왔지만, 항-E1 이 발견 가능한 채로 남아 있는 한 감마GT 는 더 낮은 수준을 유지한다.
항-E1 이 발견 가능하고 E2 항원이 이 항체의 소실 후 곧바로 되돌아오는 기간 동안 간 중 E2 항원은 거의 발견 불가능한 수준까지 감소한다. 간에서 발견 불가능한 코어 및 E2 항원과 함께, 간의 염증은 현저하게 감소한다 (표 3 참조). 이것은, 백신이 아마도 그의 주요 표적 기관, 즉 간으로부터의 바이러스 항원을 적어도 부분적으로 일소함으로써 간 손상의 복원을 유발한다는 주요한 증명이다.
바이러스 혈증 수준은, Amplicor HCV Monitor (Roche사 제, 스위스 바젤 소재)로 측정되는 바와 같이, 전체 연구 기간 동안 혈청에서 거의 변하지 않은 채 남아있었다.
더 상세한 체액성 반응 분석에 의하면, 최대 종말점 역가는 14.5 x 103 (6번째의 면역화 후)에 이르고, 상기 역가는 면역화 1년 후 검출될 수 없을 정도로 저하되었다 (도 8). 도 9는, B-세포에 의해 인식되며, 펩티드에 의해 모방될 수 있는 주 에피토프가 E2 (펩티드 V1V2 및 V2V3, 사용되는 펩티드에 대한 상세한 설명은 표 4를 참고하기 바람)의 N-말단 영역에 위치함을 보여준다. 재조합 E1에 대한 반응성이 크고 오래 지속되기 때문에, 상기 펩티드를 인식하는 항체는 E1에 대한 전체 항체 집단의 단지 일부만을 나타낸다는 것을 상기 도면으로부터 또한 추정할 수 있다. 나머지 부분은 펩티드에 의해 모방될 수 없는 에피토프, 즉 불연속 에피토프에 대한 것이다. 이러한 에피토프는 완전한 E1 분자 또는 심지어 단지 입자와 유사한 구조 상에만 존재한다. E1에 대한 이러한 면역 반응은, 적어도 자연적인 감염 과정 동안 항-E1 항체가 생성된 침팬지 (van Doorn 등, 1996), 및 사람 만성 HCV 보유자 (Maertens 등에게 허여된 WO96/13590)에서 통상 관찰되는 것과 비교하여, 유일무이하다. 상기 환자에 있어서, 항-E1은 부분적으로는 불연속 에피토프에 대한 것이기도 하지만, 큰 비율은 C4 에피토프에 대한 것이고 (환자 혈청의 ±50%), 적은 비율은 V1V2에 대한 것이며 (유전자형에 따라 2 내지 70% 범위), V2V3에 대한 반응성은 단지 예외적으로 기록될 뿐이었다 (Maertens 등, 1997).
T-세포 반응성의 분석에 의하면, 상기 T-세포의 자극 지수가 1 내지 2.5로 상승됨에 따라 면역계의 상기 구획이 백신에 의해 특정 방식으로 자극되어, 후속 기간 동안 약간 상승된 채 유지됨이 나타났다 (도 10). 인터페론 요법에 대한 장기간 응답자에서만 상기 T-세포 반응성이 나타났다 (Leroux-Roels 등에게 허여된 PCT/EP94/03555; Leroux-Roels 등, 1996 참조).
실시예 5: 상이한 아형을 사용한 만성 HCV 보유자의 면역화
유전자형 1a로부터의 HCV로 10년에 걸쳐 이미 감염된 (면역화 전 3809일)침팬지 (Ton)에, 아미노산 수준에서 단지 79.3%의 동일성을 가지며 (표 2 참조), 상기 실시예에서 기술된 바와 같이 제조한 유전자형 1b 로부터의 E1 으로 백신접종시켰다. 제조자의 프로토콜 (Ribi Inc. 제품, 미국 MT 해밀턴 소재)에 따라 각각 RIBI R-730과 혼합한 PBS/0.05% CHAPS 중 50 μg의 E1을 침팬지에게 총 6회 근육내 면역화하였다. 6회의 면역화는 3주 간격으로 3회 주사(shot)를 행하는 두 연속 투여(두 연속 투여 간의 시차 간격은 4주임)로 주어졌다. 면역화 250 전에 시작하여, 면역화 동안, 그리고 면역화 후 9개월까지 (하기 참조), 침팬지에 대하여 HCV 유발 질환의 활성에 대한 여러 지시적 파라미터를 연속적으로 모니터링하였다. 상기 파라미터는 혈액 화학, ALT, AST, 감마GT, 혈청 중 바이러스 부하, 간에서의 바이러스 부하 및 간 조직을 포함한다. 또한, 면역화에 대한 면역 응답량을 체액 및 세포 수준 모두에 대하여 모니터링하였다. 상기 기간 동안, 동물에 있어서 면역화의 임의의 역효과, 예를 들어 행동 변화, 임상 징후, 체중, 온도 및 국부 반응 (발적, 종창, 경화)에 대하여 모니터링하였는데, 이러한 효과는 검출되지 않았다.
명확하게도, E1에 대한 항체 수준이 최대에 도달하자 마자 ALT 수준 (및 감마GT 수준, 데이터는 예시되지 않음)이 감소되었다 (도 11). 상기 항체 수준이 감소되기 시작하자마자 ALT 및 감마GT는 제자리로 돌아왔지만, 완전한 후속 기간 동안 ALT 및 감마GT는 낮은 수준에서 유지되었다. ALT 수준은 백신접종 전 기간 (85 ±11 U/l)과 비교하여,백신접종 후 매우 현저하게 감소되었다 (62 ±6 U/l). 조직 손상의 마커가 혈청에서 덜 회수되었기 때문에, 이러한 발견은 백신접종이 간 질환의 개선을 유발하였음을 나타내는 첫번째 징후이다.
E2 항원 수준은 항-E1이 1.0 x 103의 역가 이상으로 유지되는 기간 동안 검출불가능하게 되었지만, E1 항체 수준이 저하되는 시점에서 다시 검출가능해졌다. HCV 항원이 사라짐과 동시에, 간 염증은 온화한 만성 활성 간염으로부터 최소 형태의 만성의 최소 형태로 현저하게 감소하였다 (표 3). 이것은, 백신이 아마도 적어도 부분적으로는 바이러스를 그의 표적 기관인 간으로부터 일소함으로써 간 손상 감소를 유발함을 나타내는 다른 중요한 증거이다.
Amplicor HCV Monitor (Roche제, 스위스 바젤 소재)에 의해 측정되는 바와 같이, 혈청 중 바이러스혈증 수준은 전체 연구 기간 동안 대략 유사한 수준으로 유지되었다. 보다 상세한 체액성 반응 분석에 의하면, 도달되는 최대 종말점 역가는 30 x 103 (6회째의 면역화 후)이며, 상기 역가는 면역화 후 9개월 째에 0.5 x 103으로 감소되었다 (도 11). 도 12는, B-세포에 의해 인식되며, 펩티드에 의해 모방될 수 있는 주 에피토프가 N-말단 영역 (펩티드 V1V2 및 V2V3, 사용되는 펩티드에 대한 상세한 설명은 표 4를 참고하기 바람)에 위치함을 보여준다. 재조합 E1에 대한 반응성이 크고 오래 지속되기 때문에, 상기 펩티드를 인식하는 항체는 E1에 대한 전체 항체 집단의 단지 일부만을 나타낸다는 것을 상기 도면으로부터 또한 추정할 수 있다. 나머지 부분은 펩티드에 의해 모방될 수 없는 에피토프, 즉 불연속 에피토프에 대한 것이다. 이러한 에피토프는 완전한 E1 분자 또는 심지어 단지 입자와 유사한 구조 상에만 존재할 것 같다. E1에 대한 이러한 면역 응답은, 적어도 검출가능한 항-E1을 가지는 사람 만성 HCV 보유자에서 통상 관찰되는 것과 적어도 비교하여 유일무이하다. 상기 환자에 있어서, 항-E1은 부분적으로는 불연속적이지만, 큰 비율은 C4 에피토프에 대한 것이고 (환자 혈청의 50%), 적은 비율은 V1V2에 대한 것이며 (유전자형에 따라 2 내지 70% 범위), V2V3에 대한 반응성은 단지 예외적으로 기록될 뿐이었다 (Maertens 등, 1997). 상기 침팬지가 1a 단리체로 감염되기 때문에, 항체 반응은 E1-1a 항원에 대한 교차-반응성에 대하여도 또한 평가하였다. 도 13으로부터 알 수 있듯이, 이러한 교차 반응성 항체는, 이들이 비록 총 항체 집단의 단지 일부만을 형성하긴 하지만, 실제로 생성된다. 간에서의 바이러스 항원 재출현 및 혈청 중 검출가능한 항-1a E1 항체의 소실의 상관관계는 주목할만하다.
T-세포 반응성의 분석에 의하면, 상기 T-세포의 자극 지수가 0.5 에서 5 로 상승됨에 따라 면역계의 상기 구획이 백신에 의해 특정 방식으로 자극되어, 후속 기간 동안 상승된 채 유지됨이 나타났다 (도 14).
실시예 6: E1을 사용한 HCV 만성 보유자의 재부스팅
실시예 4 및 5 에서 관찰되는 바와 같이, 1b 감염 침팬지에 있어서 E1 항체 역가가 안정적이지 않으며, 시간에 걸쳐 심지어 검출불가능한 수준으로까지 감소되기 때문에, 상기 항체 반응이 추가의 부스팅에 의해 다시 증가할 수 있는지를 조사하였다. 두 침팬지 모두를 3주 간격으로 3회의 연속적인 근육내 면역화로 다시 면역화하였다 (RIBI 보조제와 혼합한 50 μg의 E1). 도 8 및 도 11로부터 판단할 수 있듯이, 항-E1 반응은 실제로 부스팅될 수 있어, 간에서의 바이러스 항원이 검출 한계 미만으로 다시 한번 감소되었다. 혈청 중 바이러스 부하는, 비록 Ton 에서이기는 하지만, 일정하게 유지되었다 (도 11). 1 ml 당 < 105 게놈 당량의 바이러스혈증 수준이 후속 기간 동안 처음으로 측정되었다.
특기할 만한 발견은, 이미 첫번째 연속 투여의 면역화의 경우 그러하였듯이, 아형 1b HCV 주로 감염된 침팬지(Phil)는, 아형 1a HCV 주로 감염된 침팬지보다 더 작은 항-E1 역가로 반응한다는 것이다 (제 1 라운드에서의 Phil 대 Ton 의 최대 역가는 14.5 x 103 대 30 x 103이고, 추가의 부스팅 후, Phil 대 Ton 의 최대 역가는 단지 1.2 x 103 대 40 x 103임). 두 동물 모두에 있어서, 유익한 효과가 유사한 것처럼 보인다 해도, 다른 아형 또는 유전자형으로부터 유래된 E1 단백질로 만성 보유자를 면역화하면, 아마도 감염 아형 또는 유전자형에 의해 유발되며 숙주에 존재하는 기존의 특이적인 면역 억제를 우회하여 더 큰 역가에 도달하기에 특히 유익할 수 있음을 상기 실험으로부터 결론내릴 수 있다. 이와는 달리, 상동적인 세팅 (1b 백신 + 1b 감염)에서 관찰되는 낮은 역가는 바이러스에 대한 항체 벌크의 결합을 나타낼 수 있다. 따라서, 유발 항체는 중화능을 보유할 수 있다.
실시예 7a: 감염의 제어와 서로 연관된 것으로 알려진 주 에피토프를 조합한 NS3 단백질의 구축
급성기 동안, 또는 인터페론 요법에 의한 HCV의 일소에 E1 중의 것 외에 다른 에피토프가 관련되어 있을 수 있다. 상기 여러 에피토프는 NS3 내에 위치한다 (Leroux-Roels 등, 1996; Rehermann 등, 1996 및 1997; Diepolder 등, 1995 및 1997). 주 에피토프 중 두가지는 Rehermann 및 협력자에 의해 지도화된 CTL 에피토프 (아미노산 1073 - 1081), 및 Diepolder 및 협력자에 의해 지도화된 T-세포 (CD4) 에피토프 (아미노산 1248 - 1261)이다. 불행하게도, 상기 에피토프는 NS3 단백질 전체에 분산되어 있다. 적어도 이용가능한 상기 에피토프를 가지기 위하여, 비교적 큰 단백질이 필요할 것이다 (아미노산 1073 - 1454). 이러한 큰 단백질의 제조는 일반적으로 낮은 수율로 이어지며, 백신접종시 중요한 에피토프를 표적으로 하는 작은 부분의 경우에만 반응으로 이어질 수 있다. 따라서, 더 작은 단백질의 제조가 상기 문제의 해결책으로서 더욱 적합하다. 이렇게 하기 위해서는, 일부 에피토프가 더 작은 단백질 내에서 재위치화될 필요가 있다. 존재하는 지식을 이용하여, 즉, HCV 일소와 관련이 없는 다른 CTL 에피토프 (아미노산 1169 - 1177, Rehermann 등, 1996, 1997)를 이용하여, NS3 분자가 아미노산 1166에서 시작하여 아미노산 1468에서 끝나도록 고안하였다 (표 5). 상기 구축물은 이미 Weiner 및 협력자, 그리고 Diepolder 및 협력자에 의해 기술된 에피토프를 포함한다. 영역 1167 내지 1180을 영역 1071 내지 1084의 서열로 돌연변이시킴으로써, 관련성이 없는 CTL 에피토프를, Rehermann 등이 밝혀낸 바이러스 일소와 관련있는 에피토프로 변화시켰다. 구축물을 추가로 변형시켜 번역이 개시되게 하는 1166 위치의 메티오닌을 포함하도록 하였다. 상기 메티오닌은 이. 콜라이에서 절단되는데, 이는 상기 메티오닌에 이어서 알라닌이 존재하기 때문이다. 이러한 방식으로, 천연 NS3에는 존재하지 않는 새로운 에피토프의 도입은 최소로 한정한다. 이와는 달리, 상기 단백질의 발현이 부담스러울 경우, CTL 에피토프는 표 5에 상세하게 나타낸 바와 같이 아미노산 1468의 C-말단에 결합시킬 수 있다.
Maertens 등 (PCT/EP99/02547; 클론 19b; 출발 재료로서 아미노산 1188 - 1468의 HCV를 사용함)이 기술한 바와 같이 HCV NS-3 단편의 코딩 서열을 단리하여 발현시켰다. 19b NS-3 단편에는 존재하지 않는, Rehermann에 의해 기술된 CTL 에피토프를 상기 단편에 융합시켰다. N-말단 및 C-말단 융합체를 구축하였는데, 이는 발현 수준에 대한 융합체의 효과, 단백질 분해에 대한 민감성 및 관능성이 에피토프의 위치에 의해 영향을 받을 수 있기 때문이다.
파지 람다의 좌향 프로모터의 제어 하에서 NS-3 19b 단편을 발현하는 이. 콜라이 발현 플라스미드인 pIGRI2NS-3 플라스미드를 PCR용 주형으로 사용하여, Rehermann CTL 에피토프와 각각 N-말단 및 C-말단에서 융합된 NS3 19b 코딩 서열 (각각 NS-319bTn 및 NS-3 19bTc로 명명)를 pGEM-T (Promega제품) 클로닝 벡터에 먼 저 서브클로닝하여 벡터 pGEM-TNS-319bTn 및 pGEM-TNS-319bTc를 수득하였다. PCR 증폭 서열을 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.
T-세포 에피토프 서열을 NS-3의 N-말단 영역에 융합시키는 경우, NS-3 19b 종결 코돈의 3' 서열에 상동성인 짧은 안티센스 프라이머 및 CTL 에피토프를 보유하는 긴 센스 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머 서열은 하기에 나타내었다.
프라이머 9038(센스)
Figure 112000027799839-pct00001
프라이머 1901(안티센스)
Figure 112000027799839-pct00002
C-말단 융합된 NS-3의 경우, PCR을 NS-3 19b 개시코돈의 서열 5'에 상동성이 있는 짧은 센스 프라이머 및 인-프레임(in-frame) 정지코돈이 뒤따르는 CTL 에피토프를 운반하는 긴 안티센스 프라이머로 수행하였다. 프라이머 서열은 하기 기술되어 있다.
프라이머 1052 (센스)
Figure 112000027799839-pct00003
프라이머 9039(안티센스)
Figure 112000027799839-pct00004
pGEM-T 벡터로 클로닝된 코딩 서열로부터 시작하여, NS-3 19bT 서열을 pIGRI2 이. 콜라이 발현 벡터로 삽입하였다. N-말단 융합된 NS-3 19bT에 대해, NS-3 19bT 코딩 서열을 379 bp NcoI/SnaBI 단편으로서 단리하고, 벡터 pIGRI2NS-3으로부터의 SnaBI/Al1wNI 및 AlwNI/NcoI 단편으로 결찰하여, 벡터 pIGRI2NS-3Tn을 수득하였다. C-말단으로 융합된 NS-3 19bT에 대해, NS-3 19bT 코딩 서열을 585 bp SnaBI/SpeI 단편으로서 단리하였고, SnaBI/SpeI 개방 벡터 pIGRI2NS-3으로 삽입하여, 벡터 pIGRI2N-3Tc를 수득하였다.
이어서, 두 벡터 pIGRI2NS-3Tn 및 pIGRI2Ns-3Tc 가 이. 콜라이 발현 주 MC1061(pAcI)로 형질전환되고, 람다 PL 프로모터 의 온도 유도 후, 발현 수준을 SDS-PAGE 및 다클론성 토끼 항 NS-3 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯 상에서 분석하였다.
NS-3 19bTn 단백질의 아미노산 서열
Figure 112000027799839-pct00005
NS-3 19bTc 단백질의 아미노산 서열
Figure 112000027799839-pct00006
NS-3 19bTn 코딩 부위의 뉴클레오티드 서열
Figure 112000027799839-pct00007
Figure 112000027799839-pct00008
NS-3 19bTc 코딩 부위의 뉴클레오티드 서열
Figure 112000027799839-pct00009
실시예 7b:NS-3 19bTn 및 NS-3 19bTc 단백질의 정제
에르렌메이어(erlenmeyer) 배양으로부터 이. 콜라이 세포 페이스트를 세포 파쇄기(CSL, 모델 B)에 의해 1.4 kbar로 50 mM TRIS, pH 8 중에서 깨었다. 이 용균물을 원심분리에 의해 제거하였다(15000 g, 30 분, 4 ℃). N- 및 C-말단 구축물 NS3 모두 펠렛으로 회수되기 때문에, 상층액을 버렸다. 이 펠렛은 N-말단 구축물이 가용화전 철처한 세척(첫번째 세척은 2 % 사르코실, 0.5 M 구아니디늄클로리드 및 10 mM DTT로 하고, 두번째 및 세번째 세척은 1 % Triton X-100, 0.5 M 구아니디늄 클로리드 및 10 mM EDTA로 함)을 통해 매우 안정한 것으로 드러났다. 이는 C-말단 구축물에 대한 경우가 아니다. 정제는 N-말단 구축물에 대해 더 수행되었다. 세척된 펠렛을 최종적으로 pH 7.2 에서 6 M 구아니디늄클로리드/50 mM Na2HPO4 중에 용해시키고, Maertens 등(PCT/EP99/02547)에 기재된 바와 같이 술폰화하였다. 술폰화된 펠렛을 세파덱스 G25 칼럼상에서 pH 7.5, 6 M 우레아/ 50 mM 트리에탄올아민으로 탈염화하고, 최종적으로 동일한 완충 조성물 중에서 둘의 연속 음이온-교환 크로마토그래피로 정제하였다. 첫번째 음이온-교환을 Hyper DQ(50 ㎛) 칼럼(BioSpra 사, Marlborough, Ma. USA) 상에서 수행하였고, NS3를 0.11 내지 0.19 M 의 NaCl에서 회수하였다. 희석 후, 이 분획을 두번째 Hyper DQ(20 ㎛) 칼럼(BioSpra 사, Marlborough, Ma. USA) 상에서 수행하였고, NS3를 0.125 M NaCl을 함유하는 분획에서 회수하였다. 이러한 분획을 pH 7.5, PBS 중의 6 M 우레아로 탈염하였다. 최종 순도를 SDS-PAGE 후 은 염색을 기초로 > 90 % 임을 측정하였다. EDMAN 분해에 의한 N-말단 서열분석은, 상기 NS53이 손상되지 않은 N-말단을 가지며, 목적하는 에피토프가 정확한 서열내 존재한다는 것을 보여준다. 번역의 개시에 사용되는 메티오닌은 예기한 바와 같이 절단되었음을 확인하였다.
실시예 8: 고가변 부위 I가 없는 E2 단백질의 구축
E2의 HVR I 부위에 대한 면역우세한 상동성 반응이 주목되었다. 상기 반응은 백신 접근이 이종의 셋업(백신 주가 야생 주와 항상 상이함)이기 때문에, 백신 접근에서 거의 사용되지 않을 것이다. 그러므로, 이 부위의 결실은 E2의 더 보존되고, 면역원성이 덜한 부위에 대한 항체를 유도하는 E2 단백질을 갖기 위해 필요할 것이다. 조심스럽게 E2 리더 서열 및 E2 고가변성 부위를 분석함으로써, HVR I 가 없는 E2 단백질의 발현에 가장 이상적인 구축물이 고안되었다. 상기 구축물은 E2 펩티드의 발현이 aa 384 대신 aa 409 위치에서 개시하도록 한다. 리더 서열로서, E1의 C-말단 20 개의 아미노산이 사용되었다. 그러나, 상기 HVR의 설계가 애매모호하기 때문에, 두번째 개조물이 제조되었고(aa 412에서 개시), 이는 또한 올바른 위치에서 절단되는 매우 높은 가능성을 갖는다.
중간 구축물 pvHCV-99(도 15 및 16 참조)
발현 카세트에서, Met364에서 개시하는 E1 리더 시그날 펩티드가 E2-715의 코딩 서열 앞에 존재한다. 그러므로, E1 시그날 펩티드(Met347에서 개시)의 긴 개조물을 갖는 E2-715 HCV 형 1 b에 대한 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 pvHCV-92(도 15)에서, EcoRI 및 NcoI 에서의 이중절단에 의해 결실이 된 후, T4 DNA 중합효소로 5'-돌출부 채움(5'-overhang fill-in) 반응을 하였다. 수득된 블런트 말단을 결찰하여(6621 bp-단편의 재원형화), 더 짧은 E1 리더 시그날 펩티드(Met364에서 개시)를 갖는 동일한 단백질(E2-715)을 코딩하는 플라스미드 pvHCV-99를 수득하였다. pvHCV-99를 ICCG 3635로서 주 목록에 기탁하였다. HCV 또는 다양한 길이의 이종 신호 서열이 사용될 수 있음이 명백하다.
플라스미드 pvHCV-100 및 -101은 E2 서열에서 결실, 즉 고가변 부위 I(HVR-I)의 결실을 포함한다. 플라스미드 pvHCV-100에서, 아미노산 384(His)-408(Ala)이 결실되고, 플라스미드 pvHCV-101 에서는 아미노산 384(His)-411(Ile)이 결실되었다.
pvHCV-100 구축
pvHCV-100의 구축에 대해, 두개의 올리고뉴클레오티드가 고안되었다:
HCV-pr 409[8749]:
Figure 112000027799839-pct00010
HCV-pr 408[8750]:
Figure 112000027799839-pct00011
Gpt-pr[3757] 및 HCV-pr 408 [8750]으로 pvHCV-99 주형의 PCR 증폭(95 ℃, 5분 변성, 및 각각 55 ℃에서 어닐링, 72 ℃에서 중합화, 및 95 ℃, 1분간 변성으로 구성되는 증폭 30 회 반복, 72 ℃에서 10 분간 신장)은 221 bp 단편을 생성하고, HCV-pr 409 [8749] 및 TKr-pr [3756]으로의 증폭은 1006 bp의 단편을 생성한다. 양 PCR 단편은 서로 19 뉴클레오티드가 겹쳐진다. 이러한 두 단편은 수합하고, Gpt-pr[3757] 및 TKr-pr [3756] 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭된다. 생성된 1200 bp 단편은 EcoRI 및 HinDⅢ로 절단되고, EcoRI/HinDⅢ로 절단된 pgsATA18[ICCG 1998] 벡터(5558 bp)로 결찰시켰다. 상기 구축물, pvHCV-100은 제한 및 서열 분석으로 분석되었고, ICCG 3636으로서 주 목록에 기탁되었다.
pvHCV-101 구축
pvHCV-101의 구축에 대한, 두개의 올리고뉴클레오티드가 고안되었다.
HCV-pr411 [8747]:
Figure 112000027799839-pct00012
HCV-pr 410 [8748]:
Figure 112000027799839-pct00013
Gpt-pr [3757] 및 HCV-pr 410 [8748] 을 사용한 pvHCV-99 주형의 PCR 증폭은 221 bp 단편을 생성하였고, HCV-pr 411 [8747] 및 TKr-pr [3756] 을 사용한 PCR 증폭은 997 bp 단편을 생성하였다. 양 PCR 단편은 서로 19 뉴클레오티드가 겹쳐졌다. 이러한 두 단편을 수합하고, Gpt-pr [3757] 및 TKr-pr [3756] 을 사용하여 PCR 로 증폭하였다. 생성된 1200 bp 단편을 EcoRI 및 HinDⅢ로 절단하고, EcoRI/HinDⅢ로 절단한 pgsATA18[ICCG 1998] 벡터(5558 bp)과 결찰시켰다. 상기 구축물 pvHCV-101은 제한 및 서열 분석에 의해 분석되었고, ICCG 3637으로서 주 목록에 기탁되었다.
모든 플라스미드를 서열 분석으로 확인하였고, 이노제네틱스 주 목록에 기탁하였다. 각 플라스미드에 대해 두개의 미니-DNA 제제(PLASmix)를 살균 조건하에 제조하였고, 풀링하였다. DNA 농도를 측정하고, QA를 제한 분석에 의해 수행하였다. 정제된 DNA를 Maertens 등(PCT/EP95/03031)에 의해 기재된 바와 같이 재조합 백시니아 바이러스를 발생시키는 데에 사용하였다. 그러나, 재조합 바이러스 vvHCV-100 및 vvHCV-101 은 WHO 인증 베로(Vero) 세포 상에서 발생되었다. 2회의 프라크 정제 후, 발현 생성물을 Maertens 등(PCT/EP95/03031)에 기재된 바와 같은 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. 단백질은 vvHCV-100에 대해 분자량 69 및 37 kDa 으로, 및 vvHCV-101에 대해 분자량 68 및 35 kDa 으로 측정된 특이적 항-E2 단일클론 항체에 의해 가시화되었다(이노제네틱스 N.V., Zwijnaarde, Belgium 에서 발명자들로부터 수득될 수 있는 IGH 212). 상기 분자량은 PNGaseF 를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 앞서 샘플의 처리에 의해 확인되는, 글리코실화 및 비글리코실화 E2-단백질의 존재를 나타낸다. 상기 처리로 vvHCV-100 및 vvHCV-101 에 대해 각각 37 kDa 및 35 kDa의 오직 단일인 단백질의 탐지를 수득한다.
pvHCV-100으로부터 유래된 성숙 E2의 아미노산 서열
Figure 112000027799839-pct00014
pvHCV-101으로부터 유래된 성숙 E2의 아미노산 서열
Figure 112000027799839-pct00015
실시예 9: 더 개선된 면역원성을 갖는 E1 입자
실시예 1에서 제시된 바와 같이, E1s 단백질을 PCT/EP 95/03031(Maertens 등)에 기재된 바와 같은 프로토콜에 따라 정제하였다. 상기 프로토콜은 말레이미드 유도체(N-에틸 말레이미드 및 비오틴-말레이미드, 모두 Sigma 사)를 사용하는 시스테인(유리 시스테인 및 DTT를 사용하여 시스테인 가교를 환원한 후의 분자간 가교로 연결된 시스테인)의 공유 개질을 포함한다. 대안적인 말레이미드 차단 방법으로서, 활성 할로겐이 또한 평가되었다. 상기 화합물, 즉 활성 할로겐은 알킬화에 의해 유리 시스테인을 차단한다. 예로서, 활성 할로겐(요오도아세트아미드, Merck)가 평가되었다. 말레이미드 화합물 대신, 요오도아세테미드를 사용한 것을 제외하고는 Maertens 등(PCT/EP 95/03031)에 기재된 바와 같이 정제되었다. 상기 과정에 의해 수득된 E1s 단백질은 완전 정제 과정 전반에서 말레이미드-블로킹된 단백질과 유사하게 행동하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 계면활성제 농도의 0.05 % CHAPS로의 최종 하강 또는 0.5 % 베타인으로 전환시, DLS에 의해 측정되는 바와 유사한 입자가 수득되었다. 그러나, 아세트아미드-개질된 E1s로 마우스의 면역화시 놀라운 효과가 발견되었다.
총 3 군의 6 마리의 마우스에서, 각각을 3 주 간격으로 100 ㎍/ml PBS로 각 주입이 5 ㎍ E1s로 구성되는 3회 주입을 사용하여 E1s로 면역화하였고, 동일 부피의 RIBI 보강제와 혼합하였다(R-700). 제 1 군에 0.05 % CHAPS에서 제형화된 E1-말레이미드를 주었고, 제 2 군에 0.05 % CHAPS에서 제형화된 E1-아세트아미드를 주었고, 제 3 군에 0.12 % 베타인에서 제형화된 E1-아세트아미드를 주었다. 최종적으로, 모든 마우스에서 세번째 면역화 후 10일째에 채혈했다. 개별적으로 각 동물에 대한 종말점 역가(배경값보다 2배 높은 OD를 초래하는 혈청의 희석으로 정의됨)를 E1-말레이미드 및 E1-아세트아미드 모두에 대해 측정하였다. 도 17은 평균과 표준편차로 나타낸 이러한 종말점 역가를 나타낸다. 항체는 E1-아세트아미드 및 E1-말레이미드 모두에 대해 반응성이 있기 때문에, E1-말레이미드를 받은 마우스는 말레이미드-함유 에피토프를 인식할 수 있는 항체 반응만을 증가시켰고(E1-아세트아미드에 대한 반응성이 전혀 없음), E1-아세트아미드를 받은 마우스는 명확하게 E1-에피토프에 대한 항체 반응를 증가시켰다. 이는 부가적인 실험에서 설명되었으며, E1의 특이적 부위에 대한 항체가 아세트아미드로도 말레이미드로도 개질되지 않은 펩티드를 사용하여 결정되었다. 도 18에 나타낸 바와 같이 결과는 E1-아세트아미드(CHAPS 및 베타인 제형화됨)로 면역화된 마우스가 펩티드 V1V2, V2V3, V3V4, V5C4, C4V6을 인식할 수 있는 항체 반응을 증가시킴을 설명한다. V6가 E1s의 부분이 아니기 때문에, 항체가 C4, V3(V4V5가 양성이 아닌 반면, V3V4 는 양성) 및 V1V2에 대해 상승되었다는 결론을 내릴 수 있다. E1s-말레이미드로 면역화된 마우스가 V1V2 및 V2V3에 대한 매우 낮은 반응만을 증가시킨다. 이는 말레이미드-E1s에 대한 상기 마우스 항체에 대해 측정된 상당히 높은 역가는 주로 말레이미드-의존성 에피토프에 대해 대응한다는 사실을 한번더 강조한다. 덧붙여, 유발된 항체의 실제양이 IgG2(a+b) 아형이기 때문에, E1s-아세트아미드 유발 반응은 부분적으로 Th1 형이라는 것을 입증할 수 있다. IgG2의 양은 CHAPS 제형에 비해 베타인 제형이 훨씬 더 높다(도 19). 상기 결과로부터 하나 이상의 시스테인(그러나 잠재적으로 하나 보다 많은 시스테인)이 알킬화된 HCV 피막 단백질이 상당한 면역원성 단백질이라고 결론내려진다.
결과적으로, 베타인에서 제형화된 아세트아미드-개질된 E1은 또한 침팬지 Phil 및 Ton 의 재부스팅에 또한 사용될 수 있다. 두 침팬지는 3 주 간격으로 모두 2회 연속 근육내 면역화로 다시 면역화되었다(실시예 4 및 5와 같이 RIBI 보강제와 혼합된 E1 50 ㎍). 도 20 및 21로부터 판단할 수 있는 바와 같이, 항-E1 반응이 재부스팅될 수 있었으며, 2회 주입후 앞선 면역화에서 수득된 것보다 더 높은 수준까지였다. 이 적정은 표준에 대해 수행되었고, 3명의 인간 고 역가 항 E1 혈청의 혼합물이다(만성 HCV 보유자로부터 수득됨). 상기 혈청의 항-E1 역가는 1 유닛/ml 로서 정의된다. 침팬지 Phil에서(도 20), 인간 보유자에서보다 2배 높은 역가가 2회 면역화 후에만 유발되었다. 침팬지 Ton에서(도 21), 140 배까지 높은 역가가 유발되었다. 이는 상기 E1-입자의 높은 면역원성을 다시 강조한다.
실시예 10 : 알킬화된 E1 은 진단용으로 우수한 질을 갖는다.
실시예 9에 기재된 E1s-아세트아미드는 인간 만성 HCV 보유자로부터 혈청 샘플에서의 항-E1 항체의 탐지에 대해 항원으로 평가되었다. 예로서, 상기 항원은 LIA-막에 결합되어 있고, 스트립을 Zrein 등(1988)에 기재된 바와 같이 본질적으로 가공하였다. "가성(false)" 양성을 배제하기 위해 검정에 사용될 수 있는 E1 항원의 최적 농도를 결정하기 위해, 72 명의 혈액 공여자로부터의 혈청 샘플을 먼저 측정하였다. E1s-말레이미드에 대해, 이 농도는 8 ㎍/ml로 확인되었고, E1s-아세트아미드에 대해 50 ㎍/ml 까지의 농도가 가성 양성 결과를 초래하지 않았다(0.5를 넘어 상대색 (relative color) 염색을 나타내는 샘플은 없음). E1s-말레이미드 및 E1s-아세트아미드에 대해 각각 8 및 50 ㎍/ml을 사용하여, HCV 만성 보유자의 24 혈청은 E1s에 대한 항체에 대해 선별되었다. 표 6 에서, E1s-아세트아미드가 더 많은 샘플 스코어링을 양성으로 하였다 (E1s-말레이미드에 대해 67 % 대 38 %). E1s-말레이미드에 양성으로만 스코어링되는 샘플은 발견되지 않았다. E1s-말레이미드 및 E1s-아세트아미드 모두에 양성으로 스코어링되는 샘플에 대해, 후자에 대한 반응성이 더 높다. 이러한 예로부터 알킬화된 HCV의 피막 단백질이 말레이미드로 개질된 피막 단백질보다 인간 항체를 탐지하기 위한 더욱 양호한 항원이라는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 11: E1 및 E2를 포함하는 혼합 입자의 제조
말레이미드-개질이 요오도아세트아미드를 사용하는 알킬화로 대체된 것을 제외하고는, Maertens 등(PCT/EP95/03031)에 기재된 바와 같이 E1s 및 E2s (vvHCV-44) 가 제조되고, 정제되었다. 3 % 엠피젠(empigen) 단독 또는 동일몰의 혼합물 중에서 E1s 및 E2s이 PBS/0.2 % CHAPS 중에 평형화된 수퍼덱스-200 PC 3.2/30 칼럼상에 주입되었다. 상기 칼럼은 Pharmacia LKB(Sweden)으로부터 SMARTTM HPLC 장치와 사용하도록 고안되었다. 분획은 3 개의 상이한 샌드위치 ELISAs에 의해 선별되었다. 이러한 ELISAs에 대해, E1-(IGH 207) 및 E2-(IGH223) 특이적 단일클론은 2 ㎍/ml로 코팅되었다. 겔 여과의 분획을 1/2500 희석으로 항온배양하였다. 비오틴으로 접합된 2 개의 다른 E1(IGH 200) 및 E2(IGH 212) 단일 클론을 결합된 항원의 탐지를 위해 사용하였다. 스트렙타비딘-HRP/TMB 시스템을 사용하여 결합된 비오틴을 450 nm에서 측정되는 황색으로 발현시켰다.
ELISA 시스템이 동종(항-E1 코팅/항-E1 탐지 또는 항-E2 코팅/항-E2 탐지) 및 이종(항-E1 코팅/항-E2 탐지) 셋업에서 사용되었다. 후자는 이론적으로 E1 및 E2가 혼입된 입자만을 탐지한다. 반응성 구획을 풀링하고, 10 kDa 필터상에 농축하고, PBS/0.05 % CHAPS 중에서 다시 수퍼덱스 200상에서 다시 크로마토그래피되었다. 모든 분획을 상이한 ELISA 셋업을 사용하여 반응성을 시험하였다. 도 22으로부터 판단할 수 있듯이, E2 를 E1 에 첨가하는 것은, E1 단독 첨가에 비해 체류시간에서 주요한 변경을 나타내지 않아, 입자가 사실상 여전히 존재하는 것을 나타낸다. 상기 입자는 상기 셋업에서만 이종 ELISA 스코어링이 양성이기 때문에, E1 및 E2 모두를 포함한다.
실시예 12 : 2개의 상이한 유전자형으로부터 E1을 포함하는 혼합된 입자의 제조
유전자형 1b에 대해, 말레이미드-개질이 요오도아세트아미드를 사용하는 알킬화로 대체된 것을 제외하고는, Maertens 등(PCT/EP95/03031)에 기재된 바와 같이 유전자형 1b 및 유전자형 4(vvHCV-72)의 E1s가 제조되고 정제되었다. 3 % 엠피젠 단독 또는 동일몰의 혼합물 중의 E1s-1b 및 E1s-4를 PBS/0.2 % CHAPS 중에 평형화된 수퍼덱스-200 PC 3.2/30 칼럼상에 주입하였다. 상기 칼럼은 Pharmacia LKB(Sweden)으로부터의 SMARTTM HPLC 장치와 사용하도록 고안되었다. 주요 단백질 포함 분획을 풀링하고, 10 kDa 필터상에 농축하고, 다시 PBS/0.05 % CHAPS 중의 수퍼덱스-200상에 크로마토그래피하였다. 두 유전자형으로부터 E1 만을 포함하는 입자를 탐지하는 ELISA 셋업을 사용하여 상기 모든 분획의 반응성을 시험하였다. 상기 ELISA에 대해 스트렙타비딘을 2㎍/ml로 코팅하였다. 겔 여과의 분획을 1/2500 로 희석하여 항온배양하였다. 유전자형 1 및 10으로부터 E1 만을 인식하는 E1 단일클론 항체(IGH 200)를 결합된 항원을 탐지하는 데에 사용하였다. 염소-항-마우스-HRP/TMB 시스템을 450 nm에서 측정되는 황색으로 분석의 발현에 사용하였다. 도 23으로부터 판단할 수 있는 바와 같이, E1-4 를 E1-1b 에 첨가한 것에서는, 단백질의 체류 시간에 주요한 변화를 초래하지 않아, 이는 입자들이 여전히 실제 존재한다는 것을 나타낸다. 상기 셋업에서만 ELISA 스코어링이 양성이기 때문에, 이러한 입자는 E1 단백질 둘다, 즉 유전자형 1b 및 유전자형 4의 E1s 를 포함한다.
참고문헌
Figure 112000027799839-pct00016
Figure 112000027799839-pct00017
Figure 112000027799839-pct00018
Figure 112004061468564-pct00019
*완전 보존된 E1s 의 aa 192 내지 326 사이 위치는 나타내지 않음.
Figure 112004061468564-pct00064
치료 백신접종에 의해 유발된 변화(6 x 50 ㎍ E1s)
Ton(아형 1a) Phil(아형 1b)
전 후 전 후
혈청 E1Ab 역가 HCV RNA 역가(105) ALT(IU) 0 2 ∼ 3 85 ±11 30000 변화없음 62 ±6 0 2 ∼ 4 44 ± 4 14500 변화없음 37 ±6
간 항원 염색 조직학 간문맥 염증 소엽 간염 경계 간염 조직학적 활성 강한 양성 CAH 약함 중간 + 4 음성 CPH 없음 미미함 - 1∼2 강한 양성 CAH 중함 중함 + 6∼8 음성 CPH 중간 중간 - 2∼3
Figure 112002030407909-pct00021
Figure 112004061468564-pct00065
Figure 112004061468564-pct00066

Claims (59)

  1. 본질적으로 정제된 HCV E1 단백질, HCV E2 단백질 및 그의 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCV 피막 단백질로 구성되고, 5 내지 100 nm의 직경을 갖는 올리고머 입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 5 내지 40 nm의 직경을 갖는 올리고머 입자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, HCV 피막 단백질의 아미노산 서열이 HCV 단리체, HCV 아형, HCV 주, 또는 HCV 속-공통 서열로부터 유래되는 공통 서열인 올리고머 입자.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피막 단백질의 하나 이상의 시스테인 잔기가 알킬화된 올리고머 입자.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 피막 단백질의 하나 이상의 시스테인 잔기가 알킬화제로 알킬화된 올리고머 입자.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 알킬화제가 에틸렌이민, N-(요오도에틸)트리플루오로아세트아미드이거나, 또는 X 가 할로겐이며, R 이 H, COOH, NH2, CONH2, 페닐 또는 이들의 유도체이며, n 이 0, 1, 2, 3 또는 4 인 활성 할로겐 X-(CH2)n-R 인 올리고머 입자.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피막 단백질의 하나 이상의 시스테인 잔기가 천연 아미노산으로 돌연변이된 올리고머 입자.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피막 단백질이 HCV E1 단백질 또는 그의 부분인 올리고머 입자.
  9. 삭제
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피막 단백질이 HCV E2 단백질 또는 그의 부분인 올리고머 입자.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피막 단백질이 서열 번호 13, 서열 번호 14, 또는 그의 부분으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 올리고머 입자.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피막 단백질이 HCV 단리체 뉴클레오티드 공통 서열, HCV 아형 뉴클레오티드 공통 서열, HCV 종 뉴클레오티드 공통 서열, 또는 HCV 속 뉴클레오티드 공통 서열, 또는 그들의 부분에 의해 코딩되는 올리고머 입자.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피막 단백질이 HCV E1 단백질, HCV E1s 단백질, HCV E2 단백질 또는 그의 부분으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혼합물인 올리고머 입자.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 ECV E2 단백질 또는 그의 부분이 서열 번호 13, 또는 서열 번호 14 또는 그의 부분으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 정의되는 올리고머 입자.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피막 단백질 또는 그의 부분이, 상이한 HCV 주, HCV 아형 또는 HCV 유전자형으로부터 유래되는 올리고머 입자.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피막 단백질 또는 그들의 부분이 하나의 HCV 주 또는 HCV 유전자형으로부터의 HCV 피막 단백질 및 하나 이상의 다른 HCV 주 또는 HCV 유전자형으로부터의 HCV 피막 단백질로 구성되는 혼합물인 올리고머 입자.
  17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기 단계를 특징으로 하는 방법에 의해 수득될 수 있는 올리고머 입자:
    (i) 용액중 HCV 피막 단백질을 정제하는 단계,
    (ii) 단계 (i) 에서 정제된 HCV 피막 단백질을 계면활성제 용액 또는 염 용액으로 변환시켜 올리고머 입자를 형성하는 단계,
    (iii) (ii) 에서 생성된 올리고머 입자를 정제하는 단계.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 방법의 상기 단계 (i) 가 제 1 계면활성제를 사용하는 것을 포함하는 올리고머 입자.
  19. 삭제
  20. 제 17 항에 있어서, 단계 (i) 에서 알킬화제를 사용하는 것을 포함하는 올리고머 입자.
  21. 제 17 항에 있어서, 상기 방법의 상기 단계 (iii) 가 단계 (ii) 에서의 계면활성제 또는 염 농도를 더 감소시키는 것을 포함하는 올리고머 입자.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 단계 (i) 에서의 제 1 계면활성제가 엠피젠(Empigen)-BB이고, 단계 (ii) 에서의 계면활성제가 (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판 술포네이트 (CHAPS), 옥틸글루코시드, 트윈(Tween), 또는 임의의 다른 계면활성제이고, 상기 염이 베타인인 올리고머 입자.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 엠피젠-BB 가 1 % 내지 10 %의 농도로 사용되고, 상기 CHAPS 또는 트윈이 0.01 % 내지 10 %의 농도로 사용되며, 상기 베타인이 0.01 % 내지 10 %의 농도로 사용되는 올리고머 입자.
  24. 하기의 단계를 특징으로 하는 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자의 제조 방법:
    (i) 용액중 HCV 피막 단백질을 정제하는 단계,
    (ii) 단계 (i) 에서 정제된 HCV 피막 단백질을 계면활성제 용액 또는 염 용액으로 변환시켜 올리고머 입자를 형성하는 단계,
    (iii) 단계 (ii) 에서 생성된 올리고머 입자를 정제하는 단계.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (i) 이 제 1 계면활성제를 사용하는 것을 포함하는 방법.
  26. 삭제
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (i) 이 알킬화제를 사용하는 것을 포함하는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (iii) 이 단계 (ii) 에서의 계면활성제 또는 염 농도를 더 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, 상기 단계 (i) 에서의 제 1 계면활성제가 엠피젠(Empigen)-BB이고, 단계 (ii) 에서의 계면활성제가 CHAPS, 옥틸글루카시드, 트윈(Tween), 또는 임의의 다른 계면활성제이고, 상기 염이 베타인인 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 엠피젠-BB 가 1 % 내지 10 %의 농도로 사용되고, 상기 CHAPS 또는 트윈이 0.01 % 내지 10 %의 농도로 사용되며, 상기 베타인이 0.01 % 내지 10 %의 농도로 사용되는 방법.
  31. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자를 함유하는 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서, HCV 코어, P7, E1, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B 단백질, 또는 그들의 부분으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 함유하는 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 NS3 단백질 또는 그의 부분이 서열 번호 1 로 주어진 아미노산 서열 또는 그의 부분 또는 서열 번호 2 로 주어진 아미노산 서열 또는 그의 부분을 갖는 조성물.
  34. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자를 사용하는 HCV 백신 조성물의 제조 방법.
  35. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자를 사용하는, 만성 HCV 보유자에서 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 의약의 제조 방법.
  36. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자를 사용하는, 만성 HCV 보유자에서 기타 요법 전, 동시 또는 후에 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 의약의 제조 방법.
  37. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자를 사용하는, HCV-감염 개체에서 간 이식 전 또는 후, 또는 추정되는 감염 후 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 의약의 제조 방법.
  38. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자를 사용하는, HCV에 대한 면역을 예방적으로 유발하기 위한 의약의 제조 방법.
  39. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자를 사용하는 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 의약의 제조 방법으로서, 상기 올리고머 입자가 시간 간격을 두고 연속 투여하는 화합물의 일부로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, HCV 백신으로서 사용되기 위한 올리고머 입자.
  41. 제 31 항에 있어서, HCV 백신으로서 사용되기 위한 조성물.
  42. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 만성 HCV 보유자에서 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 올리고머 입자.
  43. 제 31 항에 있어서, 만성 HCV 보유자에서 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 조성물.
  44. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 기타 요법 전, 동시, 또는 후에 만성 HCV 보유자에서 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 올리고머 입자.
  45. 제 31 항에 있어서, 기타 요법 전, 동시, 또는 후에 만성 HCV 보유자에서 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 조성물.
  46. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, HCV-감염 개체에서 간 이식 전 또는 후, 또는 추정되는 감염 후 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 올리고머 입자.
  47. 제 31 항에 있어서, HCV-감염 개체에서 간 이식 전 또는 후, 또는 추정되는 감염 후 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 조성물.
  48. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, HCV에 대한 면역을 예방적으로 유발하기 위한 올리고머 입자.
  49. 제 31 항에 있어서, HCV에 대한 면역을 예방적으로 유발하기 위한 조성물.
  50. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 올리고머 입자가 시간 간격을 두고 연속 투여하는 화합물의 일부인 것을 특징으로 하는, HCV 에 대한 면역을 유발하기 위한 올리고머 입자.
  51. 제 31 항에 있어서, 상기 올리고머 입자가 시간 간격을 두고 연속 투여하는 화합물의 일부인 것을 특징으로 하는 HCV 에 대한 면역을 유발하기 위한 조성물.
  52. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자에 대해 생성된 특이적인 항체.
  53. 제 52 항에 따른 특이적인 항체를 사용하는, HCV 감염의 치료 또는 예방용 의약의 제조 방법.
  54. 제 52 항에 따른 특이적인 항체를 포함하는, HCV 항원을 탐지하기 위한 키트.
  55. 적합한 보관 용기에 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자를 포함하는, 생물학적 샘플에 존재하는 HCV 항체를 탐지하기 위한 키트.
  56. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자를 포함하는, HCV 관련 T 세포 반응을 탐지하기 위한 키트.
  57. 하기 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 HCV 에 대한 항체를 탐지하기 위한 면역분석:
    (i) 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고머 입자, 또는 그의 부분을 제공하는 단계,
    (ii) 상기 올리고머 입자 및 상기 HCV 에 대한 항체 간의 복합체의 형성을 허용하는 조건하에, 단계 (i) 에서의 올리고머 입자와 함께 생물학적 샘플을 항온배양하는 단계,
    (iii) 단계 (ii) 에서 상기 복합체가 형성되는지의 여부 및 이로부터의 상기 생물학적 샘플에서 HCV 에 대한 항체의 존재를 결정하는 단계.
  58. 제 7 항에 있어서, 천연 아미노산이 메티오닌, 글루탐산, 글루타민 및 라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고머 입자.
  59. 제 8 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 피막 단백질이 HCV E1s, HCV E2s 또는 HCV E2 델타 HVRI 단백질인 올리고머 입자.
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040185061A1 (en) * 1994-07-29 2004-09-23 Innogenetics N.V. Redox reversible HCV proteins with native-like conformation
US7108855B2 (en) 1998-06-24 2006-09-19 Innogenetics N.V. Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use
DK1090033T4 (da) * 1998-06-24 2008-03-31 Innogenetics Nv Partikler af HCV-kappeproteiner: Anvendelse til vaccination
AU7877900A (en) * 1999-10-13 2001-04-23 Chiron Corporation Method of obtaining cellular immune responses from proteins
US8568742B2 (en) 2000-06-08 2013-10-29 Valneva Austria Gmbh Methods and compositions involving immunostimulatory oligodeoxynucleotides
AU2001273385B2 (en) * 2000-09-08 2005-04-07 Gryphon Therapeutics, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
AU2001292667A1 (en) * 2000-09-13 2002-03-26 Hawaii Biotechnology Group, Inc. Immunogenic composition of hepatitis c and methods of use thereof
US7101561B2 (en) * 2000-12-01 2006-09-05 Innogenetics N.V. Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use
JP4261195B2 (ja) 2001-04-24 2009-04-30 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 酵母のコア−グリコシル化されたｈｃｖエンベロープタンパク質の発現
GB0114629D0 (en) * 2001-06-15 2001-08-08 Pfizer Ltd Method
NZ533396A (en) * 2001-12-18 2005-04-29 Innogenetics N Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use
US20040126395A1 (en) * 2001-12-18 2004-07-01 Geert Maertens Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use
FR2839722A1 (fr) * 2002-05-17 2003-11-21 Bio Merieux Nouvelles compositions peptidiques et leur utilisation notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hepatite c
JP2004085528A (ja) * 2002-07-05 2004-03-18 Kansai Tlo Kk 拡散定数変化による蛋白質の会合検出方法及び装置
EP1852441B1 (en) * 2002-09-24 2012-03-28 The Burnham Institute Agents that modulate EPH receptor activity
WO2004028551A1 (en) 2002-09-24 2004-04-08 The Burnham Institute Novel agents that modulate eph receptor activity
EP1481985A1 (en) * 2003-05-28 2004-12-01 Innogenetics N.V. Modified hepatitis C virus (HCV) NS3 for medical treatment
EP1561470A1 (en) * 2003-06-20 2005-08-10 Innogenetics N.V. HCV vaccines comprising the envelope-1 (E1) protein or the corresponding DNA and at least one antiviral agent
EP1675596A4 (en) * 2003-10-10 2009-01-21 Powderject Vaccines Inc METHOD
WO2006070028A1 (es) * 2004-12-23 2006-07-06 Berthet Francois Xavier Composiciones y procedimientos para detectar infección patógena
GB0500020D0 (en) 2005-01-04 2005-02-09 Novartis Ag Organic compounds
EP1574517A1 (en) * 2004-03-09 2005-09-14 Innogenetics N.V. HCV E1 comprising specific disulfide bridges
WO2006033012A2 (en) * 2004-09-24 2006-03-30 Pfizer Limited Method of screening for modulators of hepatitis c virus infection
DE102004057111A1 (de) 2004-11-26 2006-06-01 Niles-Simmons Industrieanlagen Gmbh Verfahren zum Zwischenbearbeiten von Wellen
WO2006081418A2 (en) 2005-01-27 2006-08-03 The Burnham Institute Ephb receptor-binding peptides
WO2007041432A2 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cross-neutralization of hcv with recombinant proteins
EP2004684A4 (en) * 2006-03-22 2009-05-06 Genimmune N V THE HEPATITIS C-VIRUS NEUTRALIZING ANTIBODIES
RU2329303C2 (ru) * 2006-08-02 2008-07-20 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского Российской академии медицинских наук Моноклональное антитело, иммунореактивное с белком нуклеокапсида (кор) вируса гепатита с-4g5, способ диагностики вгс-инфекции и комбинация моноклональных антител для его осуществления
US20110091495A1 (en) * 2008-04-22 2011-04-21 Rutgers, The State University Of New Jersey Hcv e2 construct compositions and methods
US9758794B2 (en) 2008-04-22 2017-09-12 Rutgers, The State University Of New Jersey HCV E2 construct compositions and methods
JP2012507272A (ja) * 2008-11-05 2012-03-29 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規な方法
BR112013032675A2 (pt) * 2011-06-19 2017-08-08 Vaxine Pty Ltd composição adjuvante de vacina compreendendo partículas de inulina
JP6567824B2 (ja) * 2011-10-12 2019-08-28 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ヒトパピローマウイルスのワクチンおよびその使用方法
RU2510998C2 (ru) * 2012-08-01 2014-04-10 Николай Николаевич Грановский ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ, СОДЕРЖАЩИХ ВСЕ СТРУКТУРНЫЕ АНТИГЕНЫ ВИРУСА ГЕПАТИТА С, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ В ДРОЖЖАХ Hansenula polymorpha
EP3586870A1 (en) 2013-03-12 2020-01-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved vaccines for human papilloma virus and methods for using the same
CA3037813A1 (en) 2016-09-21 2018-03-29 The Governors Of The University Of Alberta Hepatitis c virus immunogenic compositions and methods of use thereof
JP6795468B2 (ja) * 2017-07-14 2020-12-02 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ヒトパピローマウイルスのワクチンおよびその使用方法
JP7075130B2 (ja) * 2019-10-25 2022-05-25 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ヒトパピローマウイルスのワクチンおよびその使用方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4395395A (en) * 1979-05-21 1983-07-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Detection of non-A, non-B hepatitis associated antigen
RU2175657C2 (ru) * 1990-11-08 2001-11-10 Чирон Корпорейшн Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа
US6274148B1 (en) * 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
DE69434295T2 (de) * 1993-11-04 2006-02-16 Innogenetics N.V. Von menschlichen T-Zellen immunodominante Epitopen des Virus der C-Hepatitis
EP1211315A1 (en) 1994-07-29 2002-06-05 Innogenetics N.V. Recombinant vectors for producing HCV envelope proteins
EP0804584B2 (en) * 1994-10-21 2008-07-09 Innogenetics N.V. Sequences of hepatitis c virus genotype 7 and their use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agents
DE69739268D1 (de) * 1996-11-08 2009-04-02 Us Gov Health & Human Serv Herstellung und reinigung von hepatitis c virus-ähnlichen partikeln
TR200202213T2 (tr) * 1998-04-17 2002-11-21 Innogenetics N.V. İndirgeme ajanlarını kullanarak geliştirilen immünodiagnostik tahliller
DK1090033T4 (da) * 1998-06-24 2008-03-31 Innogenetics Nv Partikler af HCV-kappeproteiner: Anvendelse til vaccination

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Publication number Publication date
NZ528952A (en) 2004-09-24
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US20060275323A1 (en) 2006-12-07
RU2247729C2 (ru) 2005-03-10
WO1999067285A1 (en) 1999-12-29
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HUP0102478A3 (en) 2004-10-28
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BR9911397A (pt) 2002-01-15
EP1090033B2 (en) 2007-12-19
DE69922958T2 (de) 2006-03-30
HK1037639A1 (en) 2002-02-15

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