ES2237115T3

ES2237115T3 - Particulas de proteinas de la envoltura del hcv: uso para la vacunacion.

Info

Publication number: ES2237115T3
Application number: ES99929306T
Authority: ES
Inventors: Erik Depla; Geert Maertens; Alfons Bosman; Frans Van Wijnendaele
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-23
Publication date: 2005-07-16
Anticipated expiration: 2019-06-23
Also published as: AU4615299A; DK1090033T3; DE69922958T2; JP2002518037A; PT1090033E; US20060275323A1; PL201679B1; EP1090033B2; EP1090033A1; CA2330526A1; ES2237115T5; DE69922958T3; EP1090033B1; AU765940B2; HK1037639A1; ATE286067T1; KR100559096B1; TR200003843T2; HUP0102478A3; NZ528952A

Abstract

Una partícula oligomérica que consiste de proteínas purificadas de la envoltura del HCV y que tiene un diámetro de 5 a 100 nanómetros, donde al menos un residuo cisteína de dicha proteína de la envoltura es alquilatado.

Description

Partículas de proteínas de la envoltura del HCV: Uso para la vacunación

Campo de la invención

La presente invención está basada en el hallazgo de que las proteínas de la envoltura del HCV inducen una respuesta inmune beneficiosa en chimpancés que están crónicamente infectados con cepas del HCV heterólogas del subtipo 1a o del subtipo 1b. Más específicamente, la presente invención se relaciona con el hallazgo de que las proteínas de la envoltura son altamente inmunogénicas y como resultado estimulan tanto la respuesta inmune humoral como la respuesta celular. Además la presente invención se relaciona con el hallazgo de que el bloqueo de las cisteínas por alquilación da como resultado proteínas aún más inmunogénicas. En adición, las proteínas de la envoltura de la presente invención pueden ser incorporadas en partículas las cuales despliegan una alta inmunogenicidad e inmuno-reactividad. Fue adicionalmente demostrado que tales partículas pueden incorporar otras proteínas.

Antecedentes de la invención

La infección por el virus de la hepatitis C (HCV) es un problema importante de salud tanto en los países desarrollados como en vías de desarrollo. Se estima que alrededor del 1 al 5% de la población del mundo está afectada por el virus. La infección por el HCV aparece como la causa más importante de la hepatitis asociada a transfusiones y frecuentemente evoluciona a daño crónico del hígado. Además, existe evidencia que implica el HCV en la inducción del carcinoma hepatocelular. Consecuentemente, la demanda de métodos de diagnósticos confiables y de agentes terapéuticos efectivos es alta. También se necesitan métodos específicos y efectivos de tamizado de los productos sanguíneos contaminados con el HCV y métodos de cultivo del HCV mejorados.

El HCV es un virus de ARN de filamento positivo de aproximadamente 9,600 bases que codifica al menos tres proteínas estructurales y seis no estructurales. Basado en la homología de secuencia, las proteínas estructurales han sido funcionalmente asignadas como una proteína de núcleo individual y dos proteínas de la envoltura: E1 y E2. La proteína E1 consiste de 192 amino ácidos y contiene de 5 a 6 sitios de N-glicosilación, dependiendo del genotipo del HCV. La proteína E2 consiste de 363 a 370 amino ácidos y contiene de 9 a 11 sitios de N-glicosilación, dependiendo del genotipo del HCV (para revisión ver: Major y Feinstone, 1997; Maertens y Stuyver, 1997). La proteína E1 contiene varios dominios variables (Maertens and Stuyver, 1997), mientras la proteína E2 contiene tres dominios hipervariables, de los cuales el dominio principal está localizado en el terminal N de la proteína (Maertens and Stuyver, 1997). Estas últimas proteínas de la envoltura han sido producidas por técnicas recombinantes en Eschericha Coli, células de insectos, células de levadura y células de mamíferos. El uso de un sistema de expresión en cultivo de células eucariotas superiores y especialmente células de mamíferos conduce a las proteínas de la envoltura que son efectivamente reconocidas por anticuerpos en muestras de pacientes (Maertens y otros, 1994).

Se ha sugerido que la proteína de la envoltura E1 necesita que la proteína de la envoltura E2 alcance un estado de plegado apropiado (Deleersnyder y otros, 1997). En adición, se ha sugerido que E1 y E2 formen heterodímeros los cuales pueden formar la unidad básica de la envoltura viral (Yi y otros, 1997). En WO 98/21338 de Liang y otros, estas presunciones han sido usadas para construir partículas del HCV, las cuales consisten de E1 y E2, así como Core y P7. En otras palabras, el uso de E1 y E2 separadamente para inmunización y otros propósitos no está sugerido en el estado del arte. Pero, Houghton (1997) reportó que inmunizaciones repetidas con gpE1E2 (4 x 25 \mug) recombinante de 3 chimpancés crónicamente infectados con el HCV no indujeron una respuesta inmune significativa. Los inventores de la presente solicitud razonaron que la inducción de una respuesta inmune anti-envoltura en pacientes con hepatitis C crónica sería verdaderamente deseable y beneficioso para el paciente, ya que niveles más altos de tales anticuerpos parecen correlacionarse con una buena respuesta a la terapia con interferón, y puede por lo tanto ayudar al paciente a aclarar el virus (PCT/EP 95/03031 de Maertens y otros). Los inventores de la presente invención además razonaron que, como los niveles de anticuerpos contra E1 en portadores crónicos del HCV están dentro de los más bajos de todos los anticuerpos del HCV, pudiera ser beneficioso incrementar estos niveles de anticuerpos, y posiblemente la respuesta celular, para inducir control o incluso aclaramiento de la infección por el hospedero. También altos niveles de inmunidad celular contra E1 parecen correlacionarse con una buena respuesta hacia la terapia con interferón (Leroux-Roels y otros, 1996).

Además de la importancia de la inmunidad anti-E1 en relación con la terapia con interferón, otras indicaciones apuntan que algunas otras partes del genoma del HCV pueden ser importantes para inducir una respuesta inmune específica la cual puede permitir el control de la infección. También la reactividad de células T contra la región terminal C de la proteína de núcleo ha sido observada más frecuentemente en pacientes que responden a la terapia con interferón (Leroux-Roels y otros, 1996). Anticuerpos potencialmente neutralizantes contra la proteína NS4B fueron demostrados en pacientes que aclaran el HCV después de un trasplante de hígado (Villa y otros, 1998). También dentro del NS3 varios epítopos de células T han sido mapeados los que parecen correlacionar con el aclaramiento del HCV durante la fase aguda (ver: PCT/EP 94/03555 de Leroux-Roels y otros; Leroux-Roels y otros, 1996; Rehermann y otros, 1996 y 1997; Diepolder y otros, 1995 y 1997). Además, anticuerpos NS5A, como los anticuerpos E1, muestran niveles más altos en vaselina antes de la terapia con interferón alfa en los respondedores a largo plazo (LTR) en comparación con los no respondedores.

En el presente, la vacunación terapéutica contra el HCV no ha sido exitosa. También la vacunación profiláctica ha mostrado solamente ser efectiva contra una cepa homóloga del HCV (Chuoo y otros, 1994). La presente invención se relaciona con el hallazgo sorprendente de que la administración de un antígeno de la envoltura del HCV puede dramáticamente mejorar el estado de la hepatitis activa crónica en individuos infectados con un aislado o cepa heteróloga, tanto en una infección del subtipo 1a heteróloga o del subtipo 1b heteróloga. Verdaderamente, los chimpancés crónicamente infectados que fueron administrados con seis dosis de 50 \mug de E1s (o sea aa 192-326 de E1) sorprendentemente mostraron respuestas inmune humoral y celular vigorosas, las cuales no habían sido montadas durante todo el período de la infección crónica antes de la última vacunación. Además, el antígeno viral se hace indetectable en el hígado durante un período de 2 a 5 meses y se mantiene indetectable por al menos cinco meses posterior a la vacunación. Aunque los títulos ARN-HCV en los sueros no decrecieron, los niveles de enzima del hígado en el suero mostraron una clara tendencia a normalizarse. De manera más importante, la histología del hígado mejoró dramáticamente en ambas vacunas. La presente invención además se relaciona con el hallazgo sorprendente de que la proteína E1 usada para vacunación, que fue expresada como una proteína individual del HCV sin su anclaje hidrofóbico, forma partículas estables. Debe también notarse que para evitar la inducción de una respuesta inmune contra epítopos no relevantes, la proteína E1 usada para vacunación fue construida como una secuencia de consenso de clones individuales derivados de una muestra de sueros simples de un portador crónico. En adición, la presente solicitud se relaciona con el hallazgo de que la inducción de tales respuestas anti-E1 pueden ser incrementadas usando antígenos de un genotipo diferente que aquellos de la infección presentes en el hospedero. Además, la presente solicitud se relaciona con el hallazgo de que cuando las cisteínas de las proteínas de la envoltura del HCV son alquilatadas, por ejemplo por medio de N-(iodoetil)-trifluoroacetamida, etilenimina o halógenos activos, tal como iodoacetamida, las partículas oligoméricas como se describió anteriormente despliegan una inmunogenicidad aún más alta. Finalmente la presente invención se relaciona también con el hallazgo de que la mutación de las cisteínas de las proteínas de la envoltura del HCV a cualquier otro amino ácido que existe de manera natural, preferentemente a metionina, ácido glutámico, glutamina o lisina, en las partículas oligoméricas como se describió anteriormente da como resultado una inmunogenicidad más alta, en comparación con las proteínas de la envoltura originales.

Objetivos de la invención

Está claro a partir de la literatura que existe una necesidad urgente de desarrollar vacunas confiables y agentes terapéuticos efectivos para el HCV. Por lo tanto la presente invención está dirigida a proporcionar una preparación antígena, la cual es capaz de inducir inmunidad celular y humoral específica a las proteínas de la envoltura del HCV, incluso (pero no solamente) en portadores crónicos del HCV. Los mismos antígenos pueden ser usados para el diagnóstico de la respuesta inmune.

Más específicamente, la presente invención está dirigida a proporcionar una preparación antígena como la definida anteriormente que consiste de partículas estables de proteínas de la envoltura individual del HCV. Debe estar claro que, en el presente, tales partículas, o el método de preparación de tales partículas, no son conocidos en el arte. Además, no existe ninguna indicación en el arte de que alguna preparación antígena, que incluya tales partículas estables pueda ser usada exitosamente como una vacuna terapéutica o profiláctica (heteróloga) contra el HCV. De está forma la presente invención también está dirigida a proporcionar un método para producir partículas estables, las cuales pueden ser usadas exitosamente como un agente terapéutico o profiláctico contra el HCV, en adición a proporcionar vacunas de ADN que codifican antígenos del HCV. Más específicamente, la presente invención está dirigida a proporcionar un método para producir estas últimas partículas basado en la formación de partículas asistidas con detergentes (ver posteriormente). Además, la presente invención está dirigida a proporcionar métodos para preparar partículas que consisten en antígenos obtenidos de diferentes genotipos del HCV.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método para tratar o para vacunar terapéuticamente pacientes infectados crónicamente usando las vacunas de antígenos indicadas anteriormente, posiblemente en combinación con otros compuestos. La presente invención está dirigida a proporcionar un método para vacunar profilácticamente a humanos contra el HCV.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar partículas oligoméricas las cuales tienen una inmunogenicidad superior, debido a la alquilación de al menos un residuo cisteína de la proteína de la envoltura del HCV. En particular ésta última proteína puede ser alquilatada por medio de etilenimina, N-(iodoetil)trifluoroacetamida o halógenos activos. En este aspecto, la presente invención está dirigida a proporcionar el uso adicional de partículas oligoméricas como vehículos para presentar eficientemente epítopos no HCV.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un antígeno que estimule las células T.

Todos los objetivos de la presente invención son considerados que han sido satisfechos por las realizaciones como las establecidas a continuación.

Breve descripción de las tablas y dibujos

La tabla 1 proporciona secuencias de clones de E1 obtenidos a partir de un portador crónico simple, la construcción de E1 usada para la producción de una vacuna es el consenso de todos estos clones individuales. V1-V5, regiones variable 1-5; C4, dominio constante 4; RH, región hidrofóbica; HCV-B con, secuencia de consenso en posiciones que son variables entre los clones y HCV-J.

La tabla 2 proporciona secuencias de la proteína vacuna E1 y de la proteína E1 como fue encontrada en los chimpancés infectados Phil y Ton. El subtipo 1b aislado de Phil difirió en 5.92% de la cepa de la vacuna. La diferencia entre la vacuna y el subtipo 1a aislado de Ton fue de 20.74%.

La tabla 3 proporciona un panorámica esquemática de los cambios inducidos por la vacunación terapéutica en dos chimpancés crónicamente infectados (Ton y Phil). El análisis fue ejecutado como es explicado por las figuras 8 y 11. En adición, la histología y la inflamación fueron registradas a partir de las biopsias del hígado.

La tabla 4 proporciona secuencias de péptidos usados para mapear los epítopos de células B. Note que RH es solapada con V4V5.

La tabla 5 muestra la re-disposición de NS3 para hacer una proteína más corta que porte todos los epítopos principales que correlacionan con el aclaramiento viral.

La tabla 6 muestra la reactividad en LIA de la E1s-acetamida contra la E1s-maleimida con suero de portadores crónicos del HCV. Las proteínas fueron inmovilizadas sobre las membranas LIA, la E1s-acetamida fue rociada como tal sobre las bandas LIA mientras la E1s-maleimida (que contiene también biotina-maleimida) fue acomplejada con estreptavidina antes del rociado. Los antígenos fueron enlazados a las membranas LIA, y las bandas fueron procesadas esencialmente como se describe en Zrein y otros (1998). Los anticuerpos humanos dirigidos contra estos antígenos fueron visualizados usando un anti-IgG humano conjugado con fosfatasa alcalina. El NBT y BCIP fueron usados para el desarrollo del color de las bandas. El teñido fue registrado desde 0.5 a 4, como se explica en Zrein y otros (1998). Usando un valor extremo para este ensayo de 0.5 el número de muestras positivas (# pos) y el porcentaje (% pos) es mencionado en la parte inferior de la tabla.

Figura 1. Perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño sobrepuestos en PBS/Empigen-BB al 3% de las proteínas E1s y E2s expresadas y purificadas de acuerdo a Maertens y otros (PCT/EP95/03031).

Figura 2. Perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) sobrepuestos de las proteínas E1s y E2s expresadas y purificadas de acuerdo a Maertens y otros (PCT/EP95/03031), y sometidas a otra corrida en la misma columna SEC en PBS/ CHAPS al 0.2%, para obtener estructuras oligoméricas específicas de un peso molecular aparente estimado de 250-300 kDa. Similares grados de asociación pueden ser obtenidos usando 3% de betaína.

Figura 3. Perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño sobrepuestos de las proteínas E1s y E2s expresadas y purificadas de acuerdo a Maertens y otros (PCT/EP95/03031), sometidas a un segunda corrida en CHAPS al 0.2% o betaína al 3%, para obtener estructuras oligoméricas específicas como se muestra en la Figura 2, y sometidas a una tercera corrida en la misma columna de SEC en CHAPS al 0.05%, para obtener estructuras homo-oligoméricas específicas con un peso molecular aparente estimado de 250-300 kDa (E2s) y > 600 kDa (E1s). Similares grados de asociación pueden ser obtenidos usando betaína al 0.1 o 0.5%.

Figura 4 Análisis por dispersión de luz dinámica, expresado como porcentaje del número de partículas en relación al diámetro observado en nm, de E1s en PBS/CHAPS al 0.05%.

Figura 5 Análisis por dispersión de luz dinámica, expresado como porcentaje del número de partículas en relación al diámetro observado en nm, de E1s en PBS/betaína al 0.1% (arriba) o betaína al 0.5% (abajo).

Figura 6 Teñido EM de (A) E1s en PBS/CHAPS al 0.05% y (B) E1s en PBS/betaína al 3%.

Figura 7 Distribución de los tamaños de las partículas de E1s en PBS/CHAPS al 0.05%.

Figura 8 Evolución de anticuerpos anti-E1 inducidos por seis inmunizaciones consecutivas y 3 dosis suplementarias (indicadas por las flechas pequeñas) en un chimpancé infectado con el subtipo 1b (Phil), y la evolución de ALT, ARN HCV, y anticuerpos anti-E1. Los anticuerpos anti-E1 que se unen a la fase sólida de E1 fueron detectados usando un antisuero secundario específico de anti-IgG humana conjugado con peroxidasa. El TMB fue usado como sustrato para el desarrollo del color. Los resultados son expresados como títulos del punto final. Los niveles de ALT fueron determinados con un analizador clínico y son expresados como U/I. El ARN HCV en suero fue determinado usando un Monitor del HCV (Roche, Basel, Suiza). La carga viral en el hígado fue determinada por determinación semi-cuantitativa de la cantidad de antígeno de E2 teñido en la biopsia del hígado usando un monoclonal específico (ECACC numero de acceso 98031215 como se describe en la solicitud EP No 98870060.5).

Figura 9 Mapeo epitópico de las respuestas del anticuerpo inducidas por la inmunización con E1 en el chimpancé Phil. La reactividad de los anticuerpos hacia varios péptidos fue medida por un ELISA indirecto en el cual los péptidos biotinilados (ver también la Tabla 4) son adsorbidos en las placas de microtítulos por medio de la estreptavidina. Anticuerpos específicos son detectados usando un antisuero secundario específico anti-IgG humana conjugado con peroxidasa. El TMB fue usado como substrato para el desarrollo del color.

Figura 10 Resultados del ensayo de proliferación de linfocitos antes y después de la vacunación en el chimpancé Phil. Los PBMC congelados fueron derretidos y estimulados en triplicado con diferentes antígenos. El control negativo fue el medio solo, mientras la concanavalina A fue usada como control positivo a una concentración de 5 \mug/ml. Los PBMC a una concentración de 2-4 x 10^{5} células/cavidad en un volumen total de 150 \mul fueron cultivados en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS inactivado con calor en placas de microtítulos en forma de U de 96 cavidades junto con los controles o 1 \mug/ml de E1 durante 90h a 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO_{\underline{2}}. Durante las últimas 18 h las células fueron pulsadas con 0.5 \muCi (^{3}H) de timidina por cavidad. Subsiguientemente, los cultivos, fueron cosechados en filtros de fibra de vidrio y la retención de etiqueta fue determinada. Los resultados son expresados como Indices de Estimulación (SI): cpm promedio con antígeno/cpm promedio del medio solo de determinaciones triplicadas.

Figura 11 Evolución de anticuerpos anti-E1 inducidos por seis inmunizaciones consecutivas y 3 dosis suplementarias (indicadas por las flechas pequeñas) en el chimpancé Ton infectado con el subtipo 1a del HCV. La evolución de ALT, ARN HCV en suero y la determinación del antígeno del HCV en el hígado son mostradas. Los anticuerpos anti-E1 fueron determinados por medio de un ELISA indirecto: anticuerpos específicos que se unen a la fase sólida recubierta de E1 son detectados usando antisuero secundario específico de anti-IgG humana conjugado con peroxidasa. El TMB fue usado como sustrato para el desarrollo del color. Los resultados son expresados como títulos del punto final. Los niveles de ALT fueron determinados con un analizador clínico, y son expresados como U/I. El ARN HCV fue determinado usando un Monitor del HCV (Roche, Basel, Suiza). EL antígeno de E2 fue teñido en la biopsia del hígado usando un monoclonal específico (ECACC numero de acceso 98031215 como se describe en la solicitud EP No 98870060.5). El registro semi-cuantitativo es indicado por cuadrados negros para el teñido claramente positivo en la mayoría de las células, por cuadrados grises para el teñido claro en la minoría de las células y por cuadrados blancos para las biopsias que no muestran teñido detectable. El ARN HCV es indicado por recuadros negros pequeños. El teñido de E2 pudiera ser confirmado por teñido de E1 y Core (datos no mostrados).

Figura 12 Mapeo epitópico de la respuesta del anticuerpo inducida por inmunización con E1 en Ton. La reactividad de los anticuerpos hacia varios péptidos fue medida por un ELISA indirecto en el cual los péptidos biotinilados (ver también la Tabla 4) son adsorbidos en las placas de microtítulos por medio de la estreptavidina. Anticuerpos específicos son detectados usando antisuero secundario específico de anti-IgG humana conjugado con peroxidasa. El TMB fue usado como substrato para el desarrollo del color.

Figura 13 Análisis de las respuestas del anticuerpo E1 a las proteínas E1 del subtipo 1a y subtipo 1b en el chimpancé Ton. Para este propósito fue generado un virus vaccinia recombinante de genotipo 1a de E1, derivado de la secuencia HCV-H, que expresa la misma parte de E1 que para el genotipo 1b (vea infra). La E1 fue derivada a partir de lisados crudos de células RK13 infectadas con el virus vaccinia (preparado como se describe en Maertens y otros (PCT/EP95/03031)). La reactividad del anticuerpo fue medida por un ELISA indirecto en el cual E1 fue adsorbida en las placas de microtítulos por medio de alta manosa que se une a la aglutinina de Galanthus nivalis (GNA). Antícuerpos específicos fueron detectados usando antisuero secundario específico de anti-IgG humana conjugado con peroxidasa. El TMB fue usado como substrato para el desarrollo del color. Los resultados son expresados como diferencial OD (OD de la cavidad con E1 adsorbida menos OD de la cavidad sin E1 adsorbida).

Figura 14 Resultados del ensayo de proliferación de linfocitos antes y después de la vacunación en el chimpancé Ton. Los PBMC congelados fueron derretidos y estimulados en triplicado con diferentes antígenos. El control negativo fue el medio solo, mientras la concanavalina A fue usada como control positivo a una concentración de 5 \mug/ml. Los PBMC a una concentración de 2-4 x 10^{5} células/cavidad en un volumen total de 150 \mul fueron cultivadas en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS inactivado con calor en placas de microtítulos en forma de U de 96 cavidades junto con los controles o 1 \mug/ml de E1 durante 90h a 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO_{2}. Durante las últimas 18 h las células fueron pulsadas con 0.5 \muCi (^{3}H) de timidina por cavidad. Subsiguientemente, los cultivos, fueron cosechados en filtros de fibra de vidrio y la retención de etiqueta fue determinada. Los resultados son expresados como Indices de Estimulación (SI): cpm promedio con antígeno/cpm promedio del medio solo de determinaciones triplicadas.

Figura 15 Mapas de construcciones usados para obtener la expresión de una proteína E2 con su región hipervariable de terminal N eliminada. Las construcciones pvHCV-92 y pvHCV-99 son construcciones intermedias usadas para la construcción de los mutantes de eliminación pvHCV-100 y pvHCV-101.

Figura 16 Secuencia (nucléotidos: A; traducción: B) que corresponde con las construcciones representadas en la Figura 15 (ver anteriormente).

Figura 17 Títulos de anticuerpos obtenidos en ratones por inmunización con diferentes preparaciones de E1 como se describe en el ejemplo 9. Los títulos fueron determinados por medio de ELISA: sueros murinos fueron diluidos 1/20 y después en (0.5 log_{10}) e incubados en E1s (tanto acetamida como maleimida modificadas) cubiertas en placas de microtítulos. Después del lavado los anticuerpos de unión son detectados usando un antisuero secundario específico de anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa. El TMB fue usado como substrato para el desarrollo del color. Los resultados son expresados como título del punto final y las derivaciones estándares son mostradas (n=6).

Figura 18 Mapeo epitópico de la respuesta del anticuerpo inducida por inmunización con diferentes preparaciones de E1s en ratones. La reactividad del anticuerpo hacia varios péptidos fue medida por un ELISA indirecto, en el cual los péptidos biotinilados (listados en la Tabla 4) son adsorbidos en las placas de microtítulos por medio de la estreptavidina. Sueros murinos fueron diluidos 1/20 y anticuerpos específicos son detectados usando un antisuero secundario específico de anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa. El TMB fue usado como substrato para el desarrollo del color.

Figura 19 Perfil del isotipo de la inmonuglobulina de ratones inmunizados con diferentes preparaciones de E1s. Anticuerpos de clase y subclase de Ig específica fueron adsorbidos en las placas de microtítulos. Después de capturar la Ig murino fuera del suero inmune diluido 1/500, la E1s fue incubada a 1 \mug/ml. Los complejos inmunes formados fueron adicionalmente incubados con un antisuero de conejo policlonal dirigido contra la E1. Finalmente, los anticuerpos de conejo fueron detectados usando un antisuero secundario de anti-Ig de conejo producido en cabra conjugado con peroxidasa. El TMB fue usado como substrato para el desarrollo del color. Los resultados fueron normalizados para IgG_{1} (o sea la señal IgG_{1} fue considerada como 1 separadamente para cada animal y todos los resultados para los otros isotipos fueron expresados en relación con este resultado IgG_{1}).

Figura 20 Títulos de anticuerpos inducidos por dos inmunizaciones alrededor del día 1000 con E1s-acetamida en el chimpancé Phil. Los anticuerpos anti-E1 fueron determinados por medio de un ELISA indirecto: anticuerpos específicos que se unen a la fase sólida de E1 son detectados usando antisuero secundario específico de IgG anti-humano conjugado con peroxidasa. El título es expresado en unidades/ml, estas unidades se refieren a un estándar propio que está basado en suero humano.

Figura 21 Títulos de anticuerpos inducidos por dos inmunizaciones alrededor del día 900 con E1s-acetamida en el chimpancé Ton. Los anticuerpos anti-E1 fueron determinados por medio de un ELISA indirecto: anticuerpos específicos que se unen a la fase sólida de E1 son detectados usando antisuero secundario específico de IgG anti-humano conjugado con peroxidasa. El título es expresado en unidades/ml, estas unidades se refieren a un estándar propio que está basado en suero humano.

Figura 22 Perfil SEC de la etapa final de reducción del detergente (CHAPS 0.2 a 0.05%): La partícula de E1 sola (A), la partícula de E2 sola (B) o una mezcla equimolar de E1 y E2; partícula mezclada (C). La figura también muestra una superposición de los valores OD de un ELISA que detecta de manera específica solamente E1 (arriba), solamente E2 (medio) y un ELISA que detecta solamente partículas mezcladas (abajo).

Figura 23 Perfil SEC de la etapa final de reducción del detergente (CHAPS 0.2 a 0.05%): La partícula de E1 del genotipo 1b sola (arriba), la partícula de E1 del genotipo 4 sola (medio) o una mezcla equimolar de E1 del genotipo 1b y 4, partícula mezclada (abajo). La figura también muestra una superposición de los valores OD de un ELISA que detecta de manera específica solamente partículas mezcladas (ver también la Figura 22).

Descripción detallada de la invención

La invención aquí descrita gira sobre trabajos publicados anteriormente y solicitudes de patentes pendientes. A modo de ejemplo, tales trabajos consisten en documentos científicos, patentes o solicitudes de patentes pendientes.

La presente invención se relaciona con la vacunación contra el HCV. Por primera vez una inmunoterapia exitosa de chimpancés con hepatitis C activa crónica severa pudo ser lograda por vacunación con un antígeno del HCV. La vacuna no solo induce respuestas inmunes altas, sino también induce el aclaramiento del antígeno viral del hígado, y un mejoramiento considerable de la actividad histológica de la enfermedad del hígado. La presente invención además se relaciona con partículas oligoméricas. Las partículas oligoméricas consisten esencialmente de proteínas de la envoltura del HCV y tienen un diámetro de 5 a 100 nm medido por dispersión de luz dinámica o por microscopía electrónica posiblemente. En este aspecto debe hacerse hincapié que las partículas pueden estar formadas por las proteínas E1 y/o E2 solas, o partes de las mismas (ver arriba). Por lo tanto, las partículas oligoméricas de la presente invención difieren fundamentalmente de las partículas semejantes al HCV descritas en WO 98/21338 las cuales consisten necesariamente de E1 y E2 y Core y P7. Los términos "partículas oligoméricas que consisten esencialmente de proteínas de la envoltura del HCV" son aquí definidos como estructuras de una forma y naturaleza específica que contienen varias unidades básicas de proteínas de la envoltura E1 y/o E2 del HCV, las cuales por su parte se piensa que consisten de uno o dos monómeros E1 y/o E2, respectivamente. Debe estar claro que las partículas de la presente invención son definidas como desprovistas de genomas ARN HCV infeccioso. Las partículas de la presente invención pueden ser partículas de orden superior de naturaleza esférica las cuales pueden estar vacías, que consisten de una capa de proteínas de la envoltura en las cuales lípidos, detergentes, la proteína de núcleo del HCV, o moléculas adyuvantes pueden ser incorporados. Estas últimas partículas pueden ser también encapsuladas por liposomas o apolipoproteínas, tales como, por ejemplo, la apolipoproteína B o lipoproteínas de baja densidad, o por cualquier otro medio de selección de dichas partículas para un órgano específico o tejido. En este caso, tales partículas esféricas vacías son frecuentemente referidas como "partículas semejantes a un virus" o VLPs. Alternativamente, las partículas de orden superior pueden ser estructuras esféricas sólidas, en las cuales la esfera completa consiste de oligómeros de las proteínas de la envoltura E1 o E2 del HCV, en los cuales lípidos, detergentes, la proteína de núcleo del HCV, o moléculas adyuvantes pueden ser adicionalmente incorporados, o los cuales a su vez pueden ser ellos mismos encapsulados por liposomas o apolipoproteínas, tales como, por ejemplo, la apolipoproteína B o lipoproteínas de baja densidad, o por cualquier otro medio de selección de dichas partículas para un órgano específico o tejido, por ejemplo asialoglicoproteínas. Las partículas pueden también consistir de estructuras más pequeñas (en comparación con las estructuras esféricas vacías o sólidas indicadas anteriormente) las cuales son usualmente de forma redonda (ver posteriormente) y las cuales usualmente no contienen más que una capa única de proteínas de la envoltura del HCV. Un ejemplo típico de tales partículas más pequeñas son las estructuras semejantes a una roseta las cuales consisten de un número más pequeño de proteínas de la envoltura del HCV, usualmente entre 4 y 16. Un ejemplo específico de esto último incluye las partículas más pequeñas obtenidas con E1s en CHAPS al 0,2% como se ejemplificó aquí las que aparentemente contienen 8-10 monómeros de E1s. Tales estructuras semejantes a una roseta están usualmente organizadas en un plano y son de forma redonda, por ejemplo en la forma de una rueda. Nuevamente lípidos, detergentes, la proteína de núcleo del HCV, o moléculas adyuvantes pueden ser adicionalmente incorporados o las partículas más pequeñas pueden ser encapsuladas por liposomas o apolipoproteínas, tales como, por ejemplo, la apolipoproteína B o lipoproteínas de baja densidad, o por cualquier otro medio de selección de dichas partículas para un órgano específico o tejido. Las partículas más pequeñas pueden también formar estructuras globales o esféricas pequeñas que consisten de un número más pequeño similar de proteínas de la envoltura E1 o E2 del HCV en las cuales lípidos, detergentes, la proteína de núcleo del HCV, o moléculas adyuvantes pudieran ser adicionalmente incorporados, o las cuales a su vez pueden ser encapsuladas por liposomas o apolipoproteínas, tales como, por ejemplo, la apolipoproteína B o lipoproteínas de baja densidad, o por cualquier otro medio de selección de dichas partículas para un órgano específico o tejido. El tamaño (o sea el diámetro) de las partículas antes definidas, como es medido por las técnicas de dispersión de luz dinámica bien conocidas en el arte (ver posteriormente la sección de los ejemplos), está usualmente entre 5 a 100 nm, más preferiblemente entre 5 a 70 nm, incluso más preferiblemente entre 5 y 40 nm, entre 5 a 20 nm, entre 5 a 16 nm, entre 7 a 14 nm o entre 8 a 12 nm.

La invención además se relaciona con una partícula oligómerica como la definida anteriormente, donde dichas proteínas de la envoltura son seleccionadas del grupo que consiste de las proteínas E1 del HCV, E1s del HCV, E2 del HCV, la SEQ ID No 13 o la SEQ ID No 14 o partes de las mismas. Las proteínas E1 del HCV y E2 del HCV, y una detallada descripción de cómo purificar estas últimas proteínas, son bien descritas y caracterizadas en PCT/EP 95/03031 de Maertens y otros. La E1s del HCV, la SEQ ID No 13 o la SEQ ID No 14, o partes de las mismas, pueden ser purificadas similarmente a como se describe para las E1 del HCV o E1s del HCV en PCT/EP 95/03031 de Maertens y otros. La proteína E1s del HCV se refiere a los amino ácidos 192 a 326 de E1, y representa la proteína E1 sin su anclaje hidrofóbico del terminal C. El término "o parte de las mismas" se refiere a cualquier parte de las proteínas aquí indicadas las cuales son inmunogénicas, una vez que ellas sean parte de la presente invención.

La invención además pertenece a las partículas oligoméricas como las descritas aquí, donde al menos un residuo de cisteína de la proteína de la envoltura del HCV como la descrita anteriormente es alquilatado, preferiblemente alquilatado por medio de agentes de alquilación, tales como, por ejemplo, halógenos activos, etilenimina o N-(iodoetil)trifluoroacetamida. En este aspecto, debe entenderse que la alquilación de las cisteínas se refiere a cisteínas en las cuales el hidrógeno en el átomo de azufre es remplazado por (CH_{2})_{n}R, en la que n es 1,2,3 ó 4 y R=H, COOH, NH_{2}, CONH_{2}, fenil, o cualquier derivado de los mismos. La alquilación puede ser ejecutada por cualquier método conocido en el arte, tales como, por ejemplo, halógenos activos X(CH_{2})_{n}R en los que X es un halógeno tal como I, Br, Cl o F. Ejemplos de halógenos activos son el metilioduro, el ácido iodoácetico, la iodoacetamida, y el 2-bromoetilamina. Otros métodos de alquilación incluyen el uso de la etilenimina o N-(iodoetil)trifluoroacetamida ambos resultantes de la sustitución de H por -CH_{2}-CH_{2}-NH_{2} (Hermanson, 1996). El término "agentes de alquilación" como es usado aquí se refiere a compuestos que son capaces de ejecutar la alquilación como la aquí descrita. Tales alquilaciones finalmente dan como resultado una cisteína modificada, la cual puede semejar otros amino ácidos. La alquilación por una etilenimina da como resultado una estructura que se asemeja a la lisina, de tal manera que nuevos sitios de escisión para la tripsina son introducidos (Hermanson 1996). Similarmente, el uso del metilioduro da como resultado un amino ácido que se asemeja a la metionina, mientras que el uso del iodoacetato y la iodoacetamida da como resultado amino ácidos que se asemejan al ácido glutámico y la glutamina, respectivamente. En analogía, estos amino ácidos son preferiblemente usados en la mutación directa de la cisteína.

El término "purificado" como es aplicado aquí se refiere a una composición donde los componentes deseados, tales como, por ejemplo, las proteínas de la envoltura del HCV o las partículas oligoméricas, comprenden al menos el 35% del total de componentes de la composición. Los componentes deseados preferiblemente comprenden al menos alrededor del 40%, más preferiblemente al menos alrededor del 50%, aún más preferiblemente al menos alrededor del 60%, aún más preferiblemente al menos alrededor del 70%, incluso más preferiblemente al menos alrededor del 80%, incluso más preferiblemente al menos alrededor del 90%, incluso más preferiblemente al menos alrededor del 95%, y lo más preferido al menos alrededor del 98% del total de la fracción componente de la composición. La composición puede contener otros compuestos, tales como, por ejemplo, carbohidratos, sales, lípidos, solventes, y semejantes, sin afectar la determinación del porcentaje de la pureza que es aquí usado. Una partícula oligomérica del HCV "aislada" se entiende como una composición de una partícula oligomérica del HCV que es al menos 35% pura. El término "partículas oligoméricas esencialmente purificadas" como es aquí usado se refiere a partículas oligoméricas del HCV tales que ellas puedan ser usadas para tratamientos terapéuticos y métodos de diagnóstico in vitro. Estas partículas oligoméricas del HCV están sustancialmente libres de proteínas celulares, proteínas derivadas de vectores u otros componentes virales del HCV. Usualmente, estas partículas o proteínas son purificadas hasta la homogeneidad (al menos 80% pura, preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente 95%, más preferiblemente 97%, más preferiblemente 98%, más preferiblemente 99%, incluso más preferiblemente 99,5%, y lo más preferido es que las proteínas contaminantes deben ser indetectables por los métodos convencionales tales como el SDS-PAGE y el teñido en plata).

La presente solicitud también se relaciona con una partícula oligomérica como la definida anteriormente donde dichas proteínas de la envoltura son cualquier mezcla posible de E1 del HCV, E1s del HCV, E2 del HCV, SEQ ID No 13 y/o SEQ ID No 14, o partes de las mismas, tal como, por ejemplo, una partícula de la presente invención puede sustancialmente consistir de proteínas E1 del HCV y E2 del HCV, proteínas E1 del HCV y E1s del HCV, proteínas E1s del HCV y E2 del HCV, y proteínas E1 del HCV, E1s del HCV y E2 del HCV. Además, la presente invención también se relaciona con una partícula oligomérica como la definida anteriormente donde dichas proteínas son derivadas de diferentes cepas del HCV, genotipos o subtipos, tales como, por ejemplo, dichas proteínas son derivadas del genotipo 1b y del genotipo 4, o son una mezcla que consiste en proteínas de la envoltura del HCV de una cepa o genotipo del HCV y al menos otra cepa o genotipo del HCV. Los diferentes genotipos o cepas del HCV son bien definidos y caracterizados en PCT/EP 95/04155 de Maertens y otros. De esta forma, la presente invención se relaciona con partículas oligoméricas que comprenden proteínas de la envoltura derivadas de cualquier genotipo o cepa del HCV conocida en el arte o con partículas que comprenden una mezcla de proteínas derivadas de cualquier genotipo o cepa del HCV conocida en el arte. En este sentido la presente invención también se relaciona con una secuencia de consenso derivada de clones individuales como se ejemplifica más abajo y en la sección de los ejemplos (ver posterior-
mente).

La presente invención además se relaciona con una partícula oligomérica como la aquí descrita obtenible por un método, así como dicho método para producir dicha partícula oligomérica. Dicho método está caracterizado por las siguientes etapas:

(I): Purificar las proteínas de la envoltura del HCV, incluyendo posiblemente el uso de un primer detergente opcionalmente. En esencia, el procedimiento de purificación de la etapa (I) ha sido extensamente descrito en PCT/EP 95/03031 de Maertens y otros. De manera importante, de acuerdo a la presente invención, la etapa de bloqueo en el procedimiento de purificación descrito en PCT/EP 95/03031, por ejemplo con NEM-biotina, es llevado a cabo con una etapa de alquilación como la descrita en la presente solicitud, preferentemente usando iodoacetamida. Además, el proceso de purificación de la etapa (I) puede incluir posiblemente el uso de un agente de escisión del enlace disulfuro, y posiblemente incluye el uso de un agente de alquilación. Finalmente, el procedimiento de la etapa (I) da como resultado proteínas purificadas de la envoltura del HCV en una solución.

(II): Remplazar la solución de dichas proteínas purificadas de la envoltura del HCV con un detergente o una sal, lo que da por resultado la formación de partículas oligoméricas.

(III): Recobrar o purificar dichas partículas oligoméricas, posiblemente incluyendo además reducir la concentración del detergente o la sal de la etapa (II), la cual asiste adicionalmente a la formación y estabilización de dichas partículas oligoméricas, formadas después de dicho reemplazo.

Más preferiblemente, la presente invención se relaciona con una partícula oligomérica como la aquí definida, así como el método para producir dicha partícula, donde dicho primer detergente opcionalmente es Empigen-BB. Más preferiblemente, la presente invención se relaciona con una partícula oligomérica como la aquí definida, así como el método de producir dicha partícula, donde el detergente de la etapa (II) es CHAPS, octilglucósido o Tween, más preferiblemente Tween-20 o Tween-80, u otro detergente cualquiera. Más preferiblemente, la presente invención se relaciona con una partícula oligomérica como la aquí definida, así como el método de producir dicha partícula, donde dicha sal es betaína. Más preferiblemente, la presente invención se relaciona con una partícula oligomérica como la definida anteriormente, así como el método de producir dicha partícula, donde dicho Empigen-BB es usado a una concentración de 1% a 10% y donde dicho CHAPS o Tween es usado a una concentración de 0.01% a 10% o dicha betaína es usada a una concentración de 0.01% a 10%. Incluso más preferiblemente, la presente invención se relaciona con una partícula oligomérica como la definida anteriormente, así como el método de producir dicha partícula, donde dicho Empigen-BB es usado a una concentración de 3% y donde dicho CHAPS o betaína son usados a concentraciones de 0.2% o 0.3%, respectivamente, después de lo cual el buffer es cambiado y dicho CHAPS o betaína son usados a concentraciones de 0.05% 0 0.1-0.5%, respectivamente. Debe entenderse que todos los porcentajes usados en el método antes descrito están dados como peso/volumen. Debe estar claro que el método antes descrito (ver también PCT/EP 95/03031 y la sección de los ejemplos de la presente solicitud) es un ejemplo de cómo producir las partículas de la presente invención. En este aspecto, la presente invención también concierne a cualquier otro método conocido en el arte que pueda ser usado para producir las partículas oligoméricas de la presente invención, tal como, por ejemplo, omitiendo el agente reductor como se describe en PCT/EP 95/03031 y la sección de los ejemplos (infra), y usando en su lugar células hospederas, las cuales tienen un estado de redox optimizado en el Retículo Endoplasmático para reducir los puentes de cisteína. En adición, debe estar claro que un rango completo de alquilobetaínas puede ser usado, tal como, por ejemplo, con una cola C_{n}, en la cual n = un número entero positivo que tiene un rango de 1 a 20, así como betaínas derivativas, tales como, por ejemplo, sulfobetaínas.

Además, la presente invención también se refiere a una partícula oligomérica, como la definida aquí, y el uso de la misma, en la cual la proteína de la envoltura del HCV es codificada por una secuencia de consenso basada en la variabilidad de las quasiespecies dentro de un aislado (secuencia de consenso aislada) o basada en la secuencia de consenso de diferentes aislados dentro de un subtipo (secuencia de consenso del subtipo), tipo o especies (secuencia de consenso de tipo o especies), o el género completo del HCV (secuencia de consenso del género). Consecuentemente, la secuencia de amino ácidos de esta proteína de la envoltura del HCV de consenso es una secuencia de consenso derivada de una secuencia de consenso aislada, de subtipo-, cepa-, o género. Para la connotación del término "consenso" es particularmente referido a Maertens y Stuyver (1997), y a las referencias aquí usadas.

La partícula oligomérica de la presente invención exhibe epítopos extremadamente eficientes (ver infra). Por lo tanto, la partícula oligomérica es un medio para presentar epítopos de tal manera que ellas puedan producir una respuesta inmune eficiente. En este contexto, se comprende que las proteínas de la envoltura del HCV como las definidas aquí no necesitan contener epítopos del HCV exclusivamente. Las proteínas de la envoltura del HCV, que forman las partículas oligoméricas, pueden contener epítopos que son derivados del HCV solamente, y posiblemente contenga epítopos que son derivados de otros agentes exógenos, tales como, por ejemplo, HBV o HIV. En otras palabras, la partícula oligomérica con una esqueleto proteico de la envoltura del HCV, puede ser usada como un vehículo para presentar epítopos no HCV, posiblemente en adición a los epítopos del HCV. Por lo tanto, la presente invención también comprende una partícula oligomérica, como la definida aquí pero posiblemente sin epítopos del HCV, y sus aplicaciones y su manufactura, posiblemente conteniendo epítopos no HCV. El término "agente exógeno" como es usado aquí, se refiere a cualquier agente, tanto vivo o no, capaz de producir una respuesta inmune, y el cual no es endógeno al hospedero, y el cual no es el HCV. Específicamente, este último término se refiere al grupo que consiste de agentes patogénicos, alérgenos y haptenos. Los agentes patogénicos comprenden priones, virus, procariotas y eucariotas. Más específicamente los virus comprenden en particular el HBV, el HTV, o el virus del Herpes, pero no el HCV. Los alérgenos comprenden sustancias o moléculas capaces de provocar una respuesta inmune en un hospedero por sí mismas cuando el hospedero es expuesto a dichos alérgenos. Los haptenos tienen un comportamiento similar a los alérgenos con respecto a su habilidad para provocar una respuesta inmune, pero en contraste a los alérgenos, los haptenos necesitan una molécula portadora.

La presente invención se relaciona con una composición que comprende una partícula oligomérica como la definida anteriormente. Más particularmente la presente invención se relaciona con una composición vacunal. El término "composición vacunal" se relaciona con una composición inmunogénica capaz de producir protección contra el HCV, tanto parcial como completa. Por lo tanto incluye polinucleótidos, proteínas o péptidos del HCV. La protección contra el HCV se refiere en particular a humanos, pero también se refiere a primates no humanos, ratón trimera (Zaubernan y otros, 1999), u otros mamíferos.

Las partículas de la presente invención pueden ser usada como tales, en unaforma biotinilada (como se explica en WO 93/18054) y/o acomplejada a la Neutralite Avidin (Molecular Probes Inc, Eugene, OR, USA). Debe también notarse que "una composición vacunal" comprende, en adición a una sustancia activa, un excipiente, diluente, portador y/o adyuvante apropiado los cuales por sí mismos, no inducen la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición ni producen protección. Portadores apropiados son típicamente macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, amino ácidos poliméricos, copolímeros de amino ácidos y partículas de virus inactivas. Tales portadores son bien conocidos por aquellos versados en el arte. Adyuvantes preferidos para mejorar la efectividad de la composición incluyen, pero no están limitados a ellos: hidróxido de aluminio, aluminio en combinación con el lípido A monofosforil 3-0-deacilatado como se describe en WO 93/19780, fosfato de aluminio como se describe en WO 93/24148, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina como es descrito en la patente U.S. No 4,606,918, N-acetilnonmuramil-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina2-(1'2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) etilamina y RIBI (InmunoChem Research Inc, Hamilton, MT, USA) el cual contiene lípido A monofosforil, endotoxina destoxificada, trehalosa-6,6-dimicolato, y el esqueleto de la pared celular (MPL + TDM + CWS) en una emulsión squalene/Tween 80 al 2%. Cualquiera de los tres componentes MPL, TDM o CWS pueden también ser usados solos o combinados de 2 en 2. Adicionalmente, adyuvantes tal como el Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA) o SAF-1 (Syntex) pueden ser usados, así como adyuvantes tales como las combinaciones entre QS21 y lípido A monofosforil 3-de-O-acetilatado (WO 94/00153), o MF-59 (Chiron), o adyuvantes basados en poli[di(carboxilatofenoxi)fosfaceno] (Virus Research Institute), o adyuvantes basados en bloques de copolímeros tal como Optivax (Vaxcel, Cythx) o adyuvantes basados en inulina, tales como Algammulin y Gammalnulin (Anutech), Adyuvante de Freunds Incompleto (IFA) o preparaciones de Gerbu (Gerbu Biotechnik). Será entendido que el Adyuvante de Freund Completo (CFA) puede ser usado también para aplicaciones no humanas y propósitos de investigación. "Una composición vacunal" además contendrá excipientes y diluentes, los cuales son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos, tales como agua, salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsificantes, sustancias buffer pH, preservativos, y semejantes. Típicamente, una composición vacunal es preparada de manera inyectable, tanto como una solución líquida como una suspensión. Las formas sólidas, apropiadas para su solución en, o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección también pueden ser preparados. La preparación también puede ser emulsificada o encapsuladas en liposomas para mejorar el efecto adyuvante. Los polipéptidos también pueden estar incorporados en Complejos Estimulantes Inmunes junto con saponinas, por ejemplo Quil A (ISCOMS). Las composiciones vacunales comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de polipéptidos de la presente invención, así como cualquier otro de los componentes antes mencionados. "Cantidades inmunológicamente efectiva" significa que la administración de esa cantidad a un individuo, tanto en una dosis única o como parte de una serie, es efectiva para la prevención o el tratamiento. Esta cantidad varía en dependencia de la condición física y la salud del individuo a ser tratado, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado (es decir humano, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para montar una respuesta inmune efectiva, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración del médico sobre el tratamiento, la cepa del HCV que infecta y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un rango relativamente amplio que pueda ser determinado a través de los análisis de rutina. Usualmente, la cantidad variará de 0.01 a 1000 \mug/dosis, más particularmente de 0.1 a 100 \mug/dosis. Las composiciones vacunales son convencionalmente administradas de manera parenteral, típicamente mediante inyección, por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente. Formulaciones adicionales apropiadas para otros métodos de administración incluyen formulaciones orales y supositorios. La dosificación del tratamiento puede ser un programa de dosis simple o un programa de dosis múltiple. La vacuna puede ser administrada conjuntamente con otros agentes inmuno-reguladores. Por lo tanto, la presente invención atañe al uso de una partícula oligomérica como la definida aquí para inducir profilácticamente inmunicidad contra el HCV. Debe ser notado que una vacuna puede ser útil también para el tratamiento de un individuo como se señaló anteriormente, en cuyo caso ésta es llamada una "vacuna terapéutica".

La presente invención se relaciona también con una composición como la definida anteriormente la cual comprende además la proteína core del HCV, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y/o NS5B, o partes de las mismas. Las partículas E1, E2, y/o E1E2, por ejemplo, pueden ser combinadas con antígenos que estimulan las células T, tales como, por ejemplo, core, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y/o NS5B. En particular, la presente invención se relaciona con una composición como la definida anteriormente donde dicha proteína NS3, o partes de la misma, tienen una secuencia amino ácida dada por SEQ ID 1 o SEQ ID 2 (ver posteriormente en la sección de los ejemplos).

La purificación de estas proteínas NS3 incluirá preferentemente una modificación reversible de los residuos de cisteína, e incluso más preferentemente sulfonación de cisteínas. Los métodos para obtener una modificación reversible tal, incluyendo la sulfonación han sido descritos para las proteínas NS3 en Maertens y otros (PCT/EP99/02547).

Está claro de lo anterior que la presente invención también se relaciona con el uso de una partícula oligomérica como la definida anteriormente o una composición como la definida anteriormente para la fabricación de una composición vacunal del HCV. En particular, la presente invención se relaciona con el uso de una partícula oligomérica como la definida aquí para inducir inmunidad contra el HCV en portadores crónicos del HCV. Más en particular, la presente invención se relaciona con el uso de una partícula oligomérica como la definida aquí para inducir inmunidad contra el HCV en portadores crónicos del HCV antes de, simultáneamente a o después de cualquier otra terapia, tal como, por ejemplo, la bien conocida terapia con interferón tanto en combinación o no con la administración de fármacos menores que tratan el HCV, tales como, por ejemplo, ribavirina. Tal composición puede también ser empleada antes o después del transplante de hígado, o después de la infección sospechada, tal como, por ejemplo, daño por pinchazo con aguja. En adición, la presente invención se relaciona con un kit que contiene las partículas oligoméricas de la presente invención para detectar anticuerpos del HCV presentes en una muestra biológica. El término "muestra biológica" como es usado aquí, se refiere a una muestra o tejido o fluido aislado de un individuo, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, suero, plasma, fluido linfático, secciones externas de la piel, tracto respiratorio, intestinal y genitourinario, óvulos, lágrimas, saliva, leche, células de la sangre, tumores, órganos, secreciones gástricas, mucosa, fluido del cordón espinal, secreciones externas tales como, por ejemplo, excremento, orina, esperma, y semejantes. Ya que las partículas oligoméricas y las proteínas de la envoltura individuales del HCV de la presente invención son altamente inmunogénicas, y estimulan tanto la respuesta inmune celular como humoral, la presente invención se relaciona también con un kit para detectar la respuesta de las células T relacionadas con el HCV, que comprende la partícula oligomérica de la presente invención. La respuesta de la célula T al HCV puede ser por ejemplo medida como se describió en la sección de los ejemplos, o como se describió en PCT/EP 94/03555 de Leroux-Roels y otros.

Debe quedar claro que la presente invención también se refiere al uso de inmunoglobulinas del HCV específicas para el tratamiento y prevención de la infección por el HCV. Es demostrado aquí por vez primera que niveles suficientes de anticuerpos del HCV, especialmente los anticuerpos de la envoltura del HCV, inducen mejoría en la enfermedad de la Hepatitis C. También se demostró por primera vez que niveles suficientes de anticuerpos pueden unir virus circulantes, y que la presencia de virus Ab-acomplejados coincide con la desaparición del antígeno del HCV del hígado, y con la mejora de la enfermedad del hígado. Los anticuerpos de la envoltura del HCV pueden ser inducidos por vacunación o pueden ser pasivamente transferidos por inyección después que los anticuerpos han sido purificados de los depósitos de sangre infectada con el HCV o de la sangre obtenida de los vacunados del HCV. Por lo tanto, la presente invención se refiere además a los anticuerpos específicos, generados contra una partícula oligomérica como la descrita anteriormente o contra una composición como la descrita anteriormente. En particular, la presente invención se relaciona con un kit que comprende dichos anticuerpos para detectar antígenos del HCV. El término "anticuerpos específicos", como es usado aquí, se refiere a anticuerpos, los cuales son incrementados contra epítopos que son específicos a la partícula oligomérica como es divulgado en la presente invención. En otras palabras, los anticuerpos específicos son incrementados contra etítopos que resultan de la formación de, y están solamente presentes en las partículas oligoméricas. Además, existen varios procedimientos conocidos para producir péptidos del HCV. Estos procedimientos pudieran dar como resultado péptidos del HCV capaces de presentar epítopos. Es concebible que los péptidos del HCV, obtenidos por estos varios y diferentes procedimientos, sean capaces de presentar epítopos similares. Los epítopos similares son epítopos que resultan de procesos diferentes de producción o purificación pero reconocible por uno y el mismo anticuerpo. Sin embargo, las partículas oligoméricas de la presente invención presentan epítopos extremadamente eficientes. Consecuentemente, los epítopos en las partículas oligoméricas son altamente inmunogénicos. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a los epítopos en las partículas oligoméricas, dichos epítopos son al menos 10 veces, preferentemente al menos 20 veces, preferentemente al menos 50, preferentemente al menos 100 veces, preferentemente al menos 500 veces y más preferentemente al menos 1000 veces más inmunogénicos que los epítopos en los péptidos del HCV, los cuales no son producidos de acuerdo a la presente invención, es decir producidos por la formación de partículas asistidas con detergente. Será apreciado por los expertos que dicha inmunogenicidad puede por ejemplo, ser detectada y por lo tanto comparada inmunizando mamíferos por medio de la administración de cantidades comparables de péptidos, producidos por cualquier método. Además, el término "anticuerpo específico" se refiere también a los anticuerpos que son incrementados contra una proteína purificada de la envoltura individual del HCV. Como es usado aquí, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población de anticuerpos homogénea. El término "anticuerpo" no es limitante con relación a la especie o fuente del anticuerpo, ni se pretende limitar por la manera en la cual es hecho. En adición, el término "anticuerpo" también se refiere a los anticuerpos humanizados en los cuales al menos una porción de las regiones de la estructura de una inmunoglobulina son derivados de las secuencias de la inmunoglobulina humana y anticuerpos de cadena simple, tal como, por ejemplo, es descrito en la patente U.S. Nº 4,946,778, para fragmentos de anticuerpos tales como F_{ab}, F_{(ab)2}, F_{v}, y otros fragmentos los cuales retienen la función de enlace del antígeno y la específicidad del anticuerpo parenteral.

Además, la presente invención también caracteriza el uso de una partícula oligomérica como la descrita anteriormente, o una composición como la descrita anteriormente para detectar anticuerpos contra las proteínas de la envoltura del HCV. Como es usado aquí, el término "para detectar" se refiere a cualquier ensayo conocido en el arte apropiado para la detección. En particular, el término se refiere a cualquier inmunoensayo como es descrito en WO 96/13590.

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" son usados intercambiablemente en la presente invención. "Polipéptido" se refiere a un polímero de amino ácidos (secuencia de amino ácido) y no se refiere a una longitud específica de la molécula. Así, los oligopéptidos están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Debe ser entendido que los peptido-simulados son inherentes a los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína".

También, la presente invención se relaciona con el uso de una partícula oligomérica como es descrita aquí para inducir inmunidad contra el HCV, caracterizada porque dicha partícula oligomérica es usada como parte de una serie cronológica y de compuestos. En este sentido, debe ser entendido que el término "una serie cronológica y de compuestos" se refiere a administrar con intervalos de tiempo a un individuo los compuestos usados para producir una respuesta inmune. Estos últimos compuestos pueden comprender cualquiera de los siguientes componentes: partículas oligoméricas, composición vacunal del ADN HCV, polipéptidos del HCV.

Con respecto a esto, una serie comprende administrar, tanto:

(I): un antígeno del HCV, tal como, por ejemplo, una partícula oligomérica, con intervalos de tiempo, o

(II): un antígeno del HCV, tal como, por ejemplo, una partícula oligomérica en combinación con una composición vacunal del ADN HCV, en la cual dichas partículas y dicha composición vacunal de ADN HCV, puede ser administrada simultáneamente, o en diferentes intervalos de tiempo, incluyendo alternar los intervalos de tiempo, o

(III): tanto (I) o (II), posiblemente en combinación con otros péptidos del HCV, con intervalos de tiempo.

En este sentido, debe quedar claro que una composición vacunal del ADN HCV comprende ácidos nucleicos que codifican para el péptido de la envoltura del HCV, incluyendo los péptidos E1, E2, E1/E2, el péptido E1s, la SEQ ID No 13, la SEQ ID No 14, el péptido NS3, otros péptidos del HCV, o partes de dichos péptidos. Además, debe ser entendido que dichos péptidos del HCV comprenden péptidos de la envoltura del HCV, incluyendo los péptidos E1, E2, E1/E2, el péptido E1s, la SEQ ID No 13, la SEQ ID No 14, el péptido NS3, otros péptidos del HCV, o partes de los mismos. El término "otros péptidos del HCV" se refiere a cualquier péptido del HCV o fragmento de los mismos con la condición de que dicho péptido del HCV no es E1, E2, E1s, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, o NS3. En el punto II del esquema anterior, la composición vacunal de ADN HCV comprende preferiblemente ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la envoltura del HCV. En el punto II del esquema anterior, la composición vacunal de ADN HCV consiste incluso más preferentemente de ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la envoltura del HCV, posiblemente en combinación con una composición vacunal de ADN HCV-NS3. En este sentido, debe quedar claro que una composición vacunal de ADN HCV comprende un vector plásmido que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido del HCV como es descrito anteriormente, unida operablemente a los elementos regulatorios de la transcripción. Como es usado aquí, un "vector plásmido" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido unida. Vectores preferidos son aquellos capaces de expresión y/o replicación autónoma de ácidos nucleicos a los cuales ellos han sido unidos. En general, pero no limitado a estos, los vectores plásmidos son lazos de ADN de filamento doble circular los cuales, en su forma de vector, no están enlazados al cromosoma. Como se usa aquí, una "secuencia polinucleotídica" se refiere a polinucleótidos tales como el ácido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (ARN). El término debe ser entendido también para incluir, como equivalentes, los análogos tanto del ARN como del ADN hechos a partir de nucleótidos análogos, y polinucleótidos de filamento doble y simples (sentido o contra-sentido). Como es usado aquí, el término "elementos regulatorios de la transcripción" se refiere a la secuencia de nucleótido que contiene elementos regulatorios esenciales, de manera que al ser introducidos en una célula de un vertebrado vivo ésta es capaz de dirigir la maquinaria celular para producir productos de traducción codificados por el polinucleótico. El término "unido operablemente" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes son configurados de manera que ejecuten su función usual. Así, los elementos regulatorios de la transcripción unidos operablemente a una secuencia de nucleótido son capaces de efectuar la expresión de dicha secuencia nucleotídica. Aquellos versados en el arte pueden apreciar que diferentes promotores transcripcionales, terminadores, vectores portadores o secuencias de genes específicas pueden ser usadas exitosamente.

Finalmente, la presente invención se relaciona con un inmunoensayo para detectar el anticuerpo del HCV, dicho inmunoensayo comprende: (1) proporcionar la partícula oligomérica como la definida aquí, o un equivalente funcional de la misma, (2) incubar una muestra biológica con dicha partícula oligomérica bajo condiciones que permitan la formación del complejo antígeno-anticuerpo, (3) determinar si dicho complejo antígeno-anticuerpo comprende dicha partícula oligomérica.

La presente invención será ahora ilustrada con referencia a los siguientes ejemplos los cuales divulgan realizaciones particularmente ventajosas. Sin embargo, debe ser notado que estas realizaciones son meramente ilustrativas y no pueden ser construidas como restrictivas en ningún modo.

Ejemplos Ejemplo 1 Expresión, purificación, y homo-oligomerización asistida con detergente de la proteína E1 del HCV

La proteína E1s del HCV (amino ácidos 192-326) fue expresada y purificada a partir de células RK13 usando el virus vaccinia recombinante pvHCV-11A de acuerdo al protocolo descrito en Maertens y otros (PCT/EP 95/03031). En adición, la proteína E1 purificada en Empigen B-B al 3% la cual exhibe un peso molecular aparente correspondiente al homodímero E1 (aproximadamente alrededor de 60 kDa; Figura 1), fue colectada y las fracciones colectadas fueron nuevamente aplicadas a una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (de acuerdo al PCT/EP 95/03031) y corridas en presencia de CHAPS al 0.2% o betaína al 3%. Sorprendentemente, aunque la proteína E1s está desprovista de su región de anclaje de la membrana, una población homogénea de homo-oligómeros de E1 asociados específicamente con un peso molecular aparente de 260-280 kDa pudiera ser obtenida con ambos detergentes (Figura 2). Tal estructura homo-oligomérica pudiera contener un número aproximado de 9 monómeros de E1s. Debe quedar claro que éste último es un estimado aproximado ya que la forma del oligómero puede influenciar drásticamente su peso molecular aparente medido por cromatografía de exclusión de tamaño. Al cambiar de CHAPS al 0.2% a CHAPS al 0.05% y repitiendo el mismo procedimiento, el peso molecular aparente además se desplazó más allá de la resolución de la columna (vacío de la columna, > 600 kDa, Figura 3), sugiriendo la formación de partículas. Cambiar de betaína al 3% a betaína al 0.1% produjo una población de oligómeros de E1s con un comportamiento similar (dato no mostrado). Otros detergentes pudieron ser seleccionados por medio de los cuales pudiera ser lograda la oligomerización asistida con detergente. La oligomerización que conduce a la formación de partículas no es única para los CHAPS o la betaína, ya que resultados similares fueron obtenidos usando Tween-20 o Tween-80, u octilglucósido. Además remociones adicionales del detergente pueden ser posibles las que pueden permitir la generación de partículas incluso más grandes. La presencia del detergente puede, por lo tanto, no ser más necesaria para obtener partículas. Las partículas pueden ser obtenidas por ejemplo por SCC, si ningún detergente. Notablemente, un monómero E1 es aproximadamente de 31 kDa, mientras que un monómero E2 es de aproximadamente 70 kDa. Estos valores, sin embargo, pueden diferir dependiendo del estado de glicosilación de la proteína.

Ejemplo 2 Análisis de las estructuras oligméricas de orden superior de E1s por medio de la dispersión de luz dinámica

Con vistas a confirmar el inesperado resultado de que las partículas han sido creadas, las preparaciones de E1 en CHAPS al 0.05% y betaína al 0.1%, preparadas de acuerdo al ejemplo 1, o en betaína al 0.1%, preparada por dilución de preparaciones en betaína al 0.5%, fueron sometidos al análisis por medio de la dispersión de luz dinámica (DLS).

La técnica de la dispersión de luz dinámica mide el movimiento Bowniano y relaciona esto al tamaño de las partículas. Mientras más grande la partícula, más lento será el movimiento Bowniano. La velocidad del movimiento Bowniano es definida por una propiedad conocida como el coeficiente de difusión (generalmente dado por el símbolo D). El tamaño de la partícula es calculado a partir del coeficiente de difusión usando la ecuación de Stokes-Einstein: d(H)=kT/3\pi\etaD, en la cual d(H) es el diámetro hidrodinámico, k es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta, \eta es la viscosidad. Notablemente, el diámetro medido es un valor que se refiere a cómo una partícula se difunde dentro de un fluido. Por lo tanto, se refiere al diámetro hidrodinámico. El coeficiente de difusión es derivado de una función de auto-correlación (variación de la fluctuación de la intensidad de la luz con el tiempo). El instrumento usa un co-relacionador controlado por computadora para calcular la intensidad de la función de auto-correlación automáticamente.

Para medir las distribuciones del tamaño, la función de auto-correlación anterior es corregida para obtener curvas lineales y el instrumento es equipado con un programa de computadora para análisis de la distribución del tamaño. Sin embargo, la técnica tiene hipótesis restrictivas similares a aquellas de la técnica llamada dispersión de luz láser de ángulo múltiple (MALLS) y ningún método puede ser considerado que produzca datos absolutos. Los resultados de las distribuciones del tamaño a partir de DLS tienen que ser interpretados como indicadores semi-cuantitativos de la poli-dispersidad, y no como una representación verdadera de la distribución.

Muestras que contienen partículas de E1s (80-400 \mug de E1s/ml en PBS-CHAPS al 0.05%, betaína al 0.1% o 0.5%) fueron pipeteadas en la celda de medición de un instrumento DLS LSP 3.53 equipado con un Láser HeNe 10 mW (PolymerLabs). Una lectura del análisis es proporcionada en la Figura 4 (E1s en CHAPS al 0.05%) y la Figura 5 (E1s en betaían al 0.1% o 0.5%).

Estos análisis efectivamente confirmaron el resultado inesperado de que las estructuras de E1s obtenidas fueron partículas monodispersas, esféricas. Las partículas de E1s en PBS/betaína al 0.1% mostraron una distribución del tamaño promedio de 21.3 \pm 4 nm, en PBS/betaína al 0.5%: 27.9 \pm 5 nm, mientras que un diámetro de 12.5 fue obtenido para E1s en PBS/CHAPS al 0.05%.

Ejemplo 3 Análisis de la forma y del tamaño por medio de microscopía electrónica

Diez \mul de E1s (226 \mug/ml en PBS/CHAPS al 0.05%; y 143 \mug/ml en PBS betaína al 3%) fue visualizado con un teñido negativo estándar con 1% de acetato de uranilo sobre rejillas de formvar estabilizadas con carbono. La muestra fue aplicada por 30 segundos y luego enjuagada con dH_{2}O antes del teñido durante 5 segundos y la fotografía
(Figura 6).

Los análisis estadísticos produjeron los siguientes resultados: la partícula de E1s en CHAPS tuvo un diámetro medio de 8.7 \pm 0.27 nm (rango 4.3-29.0; 95% CI 5.4) y que la partícula de E1s en betaína fue menos homogénea con un diámetro medio de 9.7 \pm 0.55 nm (rango 4.3-40.5; 95% CI 11.0). Sorprendentemente, la preparación de betaína al 3%, la cual inicialmente mostró un MW de 250-300 kDa analizada por SEC incluso muestra partículas más grandes que la preparación de CHAPS al 0.05%, la cual inicialmente mostró un MW >600 kDa. Por lo tanto tenemos la hipótesis que las formas homo-oligoméricas intermedias de E1s obtenidas por betaína al 3% pueden haber formado partículas de orden superior con el paso del tiempo. Este efecto sorprendente apunta a otras posibilidades para obtener partículas de orden superior. Una distribución del tamaño de las partículas (Figura 7) muestra que la preparación CHAPS es monodispersa, aunque una prolongación a las partículas de tamaño más grande es observada (hasta 29 nm para CHAPS al 0.05%). Ya que las estructuras más grandes son sobre estimadas en los análisis DLS, la presencia de estas partículas grandes, aunque menores en número, pueden explicar el diámetro más grande obtenido por análisis DLS (ejemplo 2). La diferencia en el diámetro puede ser también explicada por el hecho de que DLS mide una partícula en movimiento, mientras que la microscopía electrónica mide las partículas estáticas. Debe quedar claro que la inmunogenicidad de estas preparaciones como se muestran en los ejemplos a continuación es debida a la integridad de la preparación, y puede ser debida a las partículas mayores, menores o promedios, o a la mezcla de las mismas.

Ejemplo 4 Inmunización de un chimpancé infectado crónicamente con el subtipo 1b del HCV

Un chimpancé (Phil) ya infectado por más de 13 años (5015 días antes de la inmunización) con una cepa del subtipo 1b del HCV fue vacunado con E1 (aa 192-326) que fue derivada de una cepa diferente del genotipo 1b, con 95.1% de identidad en el nivel de amino ácidos (ver también la Tabla 2), y la cual fue preparada como se describió en los ejemplos 1-3. El chimpancé recibió un total de 6 inmunizaciones intramusculares cada una de 50 \mug de E1 en PBS/CHAPS al 0.05% mezclada con RIBI R-730 (MPLA+TDM+CWS) de acuerdo al protocolo del fabricante (Ribi Inc. Hamilton, MT). Las 6 inmunizaciones fueron administradas en dos series de tres dosis con un intervalo de tres semanas y con un período de retardo de 6 semanas entre las dos series. Comenzando 150 días antes de la inmunización, durante el período de inmunización y hasta 1 año post inmunización (pero ver abajo) el chimpancé fue continuamente monitoreado por varios parámetros indicativos de la actividad de la enfermedad inducida por el HCV. Estos parámetros incluyeron la química de la sangre, ALT, AST, gammaGT, carga viral en el suero, carga viral en el hígado, e histología del hígado. En adición, la respuesta inmune a la inmunización fue monitoreada tanto a nivel celular como humoral. Durante este período el animal fue también monitoreado para cualquier efecto adverso a la inmunización, tal como el cambio en el comportamiento, síntomas clínicos, peso corporal, temperatura y reacciones locales (enrojecimiento, hinchazón, dureza) tales efectos no fueron detectados.

Claramente, los niveles de la ALT (y especialmente los de la gammaGT, dato no mostrado) disminuyeron tan pronto como el nivel del anticuerpo contra la E1 alcanzó su máximo (Figura 8). La ALT rebotó bastante rápidamente tan pronto como los niveles del anticuerpo comenzaron a declinar, pero la gammaGT permaneció en un nivel más bajo mientras que el anti-E1 permaneció detectable.

El antígeno E2 en el hígado disminuyó hasta niveles casi indetectables durante el período en el cual el anti-E1 fue detectable y el antígeno E2 rebotó ligeramente después de la desaparición de estos anticuerpos. Junto con Core y el antígeno E2 haciéndose indetectable en el hígado, la inflamación del hígado disminuyó marcadamente (ver también Tabla 3). Esto es una prueba importante de que la vacuna induce a una reducción del daño en el hígado, probablemente aclarando, al menos parcialmente, los antígenos virales de su órgano diana principal, el hígado.

Los niveles de viremia, medidos por el Monitor del HCV Amplicor (Roche, Basel, Suiza), permanecieron aproximadamente sin cambios en el suero durante el período de estudio completo.

Análisis más detallados de la respuesta humoral revelaron que el título del punto final máximo alcanzó 14.5 x 10^{3} (después de la sexta inmunización) y que éste título cayó hasta lo indetectable 1 año post inmunización (Figura 8). La Figura 9 muestra que los epítopos principales, los cuales pueden ser simulados por polipéptidos, reconocidos por las células B están localizados en la región del terminal N de E2 (péptidos V1V2 y V2V3, para detalles sobre los péptidos usados ver la Tabla 4). Ya que la reactividad contra la E1 recombinante es superior y más perdurable, puede también ser deducido de esta figura, que los anticuerpos que reconocen estos péptidos representan solamente parte de la población total de anticuerpos contra la E1. La parte remanente es dirigida contra los epítopos los cuales no pueden ser simulados por los péptidos, es decir los epítopos discontinuos. Tales epítopos están presentes solamente en la molécula E1 completa o incluso solamente en la estructura que semeja a la partícula. Una respuesta inmune tal contra E1 es única, al menos comparada a lo que es normalmente observado en los portadores crónicos humanos del HCV (WO 96/13590 de Maertens y otros) y en chimpancés (van Doom y otros, 1996), quien eleva los anticuerpos anti-E1 en su curso natural de infección. En aquellos pacientes, el anti-E1 está también en parte dirigido a los epítopos discontinuos pero una mayor proporción está dirigida contra el epítopo C4 (\pm50% del suero del paciente), una menor proporción contra V1V2 (fluctuando de 2-70% dependiendo del genotipo), y la reactividad contra V2V3 fue sólo excepcionalmente registrada (Maertens y otros, 1997).

Los análisis de la reactividad de las células T indicaron que también este sector del sistema inmune es estimulado por la vacuna en un modo específico, como un índice de estimulación de la elevación de las células T de 1 a 2.5, y permanece en cierto modo elevado durante el período de seguimiento (Figura 10). Es esta reactividad de la célula T la que es solamente vista en respondedores a largo plazo a la terapia con interferón (ver: PCT/EP 94/03555 de Leroux-Roels y otros; Leroux-Roels y otros, 1996).

Ejemplo 5 Inmunización de un portador del HCV crónico con diferente subtipo

Un chimpancé (Ton) ya infectado por más de 10 años (3809 días antes de la inmunización) con HCV del genotipo 1a fue vacunado con E1 del genotipo 1b, con solamente un 79.3% de identidad en el nivel de amino ácidos (ver también la Tabla 2), y preparado como se describió en los ejemplos previos. El chimpancé recibió un total de 6 inmunizaciones intramusculares de 50 \mug de E1 en PBS/CHAPS al 0.05% cada una mezclada con RIBI R-730 de acuerdo al protocolo de los fabricantes (Ribi Inc. Hamilton, MT). Las 6 inmunizaciones fueron administradas en dos series de tres dosis con un intervalo de tres semanas y con un período de retardo de 4 semanas entre las dos series. Comenzando 250 días antes de la inmunización, durante el período de inmunización y hasta 9 meses (pero ver abajo) post inmunización el chimpancé fue continuamente monitoreado por varios parámetros indicativos de la actividad de la enfermedad inducida por el HCV. Estos parámetros incluyeron la química de la sangre, ALT, AST, gammaGT, carga viral en el suero, carga viral en el hígado, e histología del hígado. En adición, la respuesta inmune a la inmunización fue monitoreada tanto a nivel celular como humoral. Durante este período el animal fue también monitoreado para cualquier efecto adverso a la inmunización, tal como el cambio en el comportamiento, síntomas clínicos, peso corporal, temperatura y reacciones locales (enrojecimiento, hinchazón, dureza). Tales efectos no fueron detectados. Claramente, los niveles de la ALT (y niveles de la gammaGT, datos no mostrados) disminuyeron tan pronto como el nivel del anticuerpo contra la E1 alcanzó su máximo (Figura 11). La ALT y la gammaGT rebotaron tan pronto como los niveles del anticuerpo comenzaron a declinar, pero la ALT y la gammaGT permanecieron en un nivel más bajo durante el siguiente período completo. Los niveles de la ALT fueron incluso significativamente reducidos después de la vacunación (62 \pm 6 U/l) comparado con el período anterior a la vacunación (85 \pm 11 U/l). Ya que menos marcadores de daño al tejido fueron recuperados en el suero, estos hallazgos fueron una primera indicación de que la vacunación indujo una mejora de la enfermedad del hígado.

Los niveles del antígeno E2 se hicieron indetectables en el período en el cual el anti-E1 permaneció por debajo de un título de 1.0 x 10^{3}, pero se hizo detectable otra vez al momento de menores niveles del anticuerpo E1. Junto con la desaparición de los antígenos del HCV, la inflamación del hígado decreció marcadamente de hepatitis activa crónica moderada a formas mínimas de hepatitis persistente crónica (Tabla 3). Esta es otra prueba importante de que la vacuna induce a la reducción del nivel de daño en el hígado, probablemente aclarando, al menos parcialmente, el virus de su órgano diana principal, el hígado.

Los niveles de viremia, medidos por el Monitor del HCV Amplicor (Roche, Basel, Suiza), en el suero permanecieron aproximadamente en niveles similares durante el período de estudio completo. Análisis más detallados de la respuesta humoral revelaron que el título del punto final máximo alcanzado fue 30 x 10^{3} (después de la sexta inmunización) y que este título cayó hasta 0.5 x 10^{3} nueve meses después de la inmunización (Figura 11). La Figura 12 muestra que los epítopos principales, los cuales pueden ser simulados por péptidos, y son reconocidos por las células B, están localizados en la región del terminal N (péptidos V1V2 y V2V3, para detalles sobre los péptidos usados ver la Tabla 4). Ya que la reactividad contra la E1 recombinante es superior y más perdurable, puede también ser deducido de esta figura, que los anticuerpos que reconocen estos péptidos representan solamente parte de la población total de anticuerpos contra la E1. La parte remanente es más probablemente dirigida contra los epítopos los cuales no pueden ser simulados por los péptidos, es decir los epítopos discontinuos. Tales epítopos probablemente están presentes solamente en la molécula E1 completa o incluso solamente en la estructura que semeja a la partícula. Una respuesta inmune tal contra E1 es única, al menos comparada a lo que es normalmente observado en los portadores crónicos humanos del HCV los cuales tienen anti-E1 detectables. En aquellos pacientes, el anti-E1 es en parte también discontinuo, pero una mayor proporción está dirigida contra el epítopo C4 (50% del suero del paciente), una menor proporción contra V1V2 (fluctuando de 2-70% dependiendo del genotipo), y excepcionalmente fue registrada reactividad contra V2V3 (Maertens y otros, 1997). Como este chimpancé es infectado con un aislado 1a, la respuesta del anticuerpo fue también evaluada por reactividad cruzada hacia el antígeno E1-1a. Como puede ser visto en la Figura 13, tales anticuerpos reactivos-cruzados son efectivamente generados, aunque, ellos forman solamente parte de la población total del anticuerpo. Remarcable es la correlación entre la reaparición del antígeno viral en el hígado y la desaparición de los anticuerpos anti-1a-E1 detectables en el suero.

Los análisis de la reactividad de la célula T indicaron que también este sector del sistema inmune es estimulado por la vacuna en un modo específico, ya que el índice de estimulación de estas células T se eleva de 0.5 a 5, y permanece elevado durante el período de seguimiento (Figura 14).

Ejemplo 6 Dosificación suplementaria adicional a los portadores crónicos del HCV con E1

Ya que los títulos del anticuerpo E1 como se observaron en los ejemplos 4 y 5 no fueron estables y declinaron con el tiempo, incluso a niveles indetectables para el chimpancé infectado con el subtipo 1b, fue investigado si esta respuesta al anticuerpo podría ser aumentada nuevamente por dosificación suplementaria adicional. Ambos chimpancés fueron inmunizados otra vez con tres inmunizaciones intramusculares consecutivas con una semana de intervalo (50 \mug de E1 mezclado con adyuvante RIBI). Como puede ser juzgado a partir de las Figuras 8 y 11, la respuesta anti-E1 pudo efectivamente ser reforzada, una vez más el antígeno viral en el hígado disminuyó por debajo del límite de detección. La carga viral en el suero permaneció constante a pesar de que en Ton (Figura 11) un nivel de viremia de < 10^{5} equivalentes de genoma por ml fue medido por primera vez durante el período de seguimiento.

Notable es el hallazgo de que, como fue el caso para la primera serie de inmunizaciones, el chimpancé infectado con la cepa del HCV del subtipo 1b (Phil) responde con títulos de anti-E1 más bajos, que el chimpancé infectado con la cepa del HCV del subtipo 1a (título máximo en la primera ronda 14.5 x 10^{3} contra 30 x 10^{3} para Ton y después de la dosificación suplementaria adicional sólo 1.2 x 10^{3} para Phil contra 40 x 10^{3} para Ton). Aunque para ambos animales el efecto benéfico parece ser similar, podría ser concluido a partir de este experimento que la inmunización de un portador crónico con la proteína E1 derivada de otro subtipo o genotipo puede ser especialmente beneficiosa para alcanzar títulos más altos, tal vez evitando una supresión inmune específica y preexistente que existe en el hospedero e inducida por el genotipo o subtipo infectante. Alternativamente, los títulos más bajos observados en el medio homólogo (vacuna 1b + infección 1b) pueden indicar la unión de la mayor parte de los anticuerpos al virus. Por lo tanto, los anticuerpos inducidos pueden poseer capacidad neutralizante.

Ejemplo 7a Construcción de una proteína NS3 combinando los epítopos principales conocidos para correlacionar con el control de la infección

También otros epítopos además de aquellos en E1 pueden estar vinculados con el aclaramiento del HCV durante la fase aguda o por la terapia con interferón. Varios de estos epítopos están localizados dentro de la NS3 (Leroux-Roels y otros, 1996; Rehermann y otros, 1996 y 1997; Diepolder y otros, 1995 y 1997). Dos de los epítopos principales son el epítopo CTL mapeado por Rehermann y colaboradores (aa 1073-1081), y el epítopo de la célula T (CD4) mapeado por Diepolder y colaboradores (aa 1248-1261). Desafortunadamente, estos epítopos son dispersados por toda la proteína NS3. Para tener al menos aquellos epítopos disponibles, sería necesaria una proteína relativamente grande (aa 1073-1454). Producir una proteína grande tal usualmente trae como resultado un bajo rendimiento, y en la vacunación puede dar como resultado una respuesta que es solo para una pequeña parte dirigida a los epítopos importantes. Por lo tanto, la producción de una proteína más pequeña sería una solución más adecuada a este problema. Para hacer esto, algunos de los epítopos necesitan ser reposicionados dentro de tal proteína más pequeña. Tomando ventaja del conocimiento existente, es decir otro epítopo CTL (aa 1169-1177) que no está vinculado con el aclaramiento del HCV (Rehermann y otros, 1996, 1997), una molécula de NS3 fue designada para comenzar en el aa 1166 y terminar en el aa 1468 (Tabla 5). Esta construcción ya incluye los epítopos descritos por Weiner y colaboradores, y Diepolder y colaboradores. Mutando la región 1167 a 1180 de la secuencia de la región 1071 a 1084, el epítopo CTL no relevante fue cambiado al epítopo que Rehernamm y colaboradores encontraron estar vinculado con el aclaramiento viral. La construcción fue adicionalmente modificada para contener una metionina en la posición 1166 para permitir el inicio de la traducción. Esta metionina puede ser escindida en E. Coli ya que esta es seguida por una alanina. De esta forma, la introducción de nuevos epítopos, que no están presentes en la NS3 natural, está limitado a un mínimo. Alternativamente, si la expresión de esta proteína fuera engorrosa, el epítopo CTL pudiera estar vinculado al terminal C en el aa 1468 como es descrito en detalle en la Tabla 5.

La secuencia de codificación de un fragmento NS-3 del HCV fue aislado y expresado como descrito en Maertens y otros (PCT/EP99/02547; clon 19b; aa 1188-1468 HCV fue usado como material de partida). El epítopo CTL como es descrito por Rehermann, y no presente en el fragmento NS-3 19b fue fusionado a este fragmento. Ambas fusiones del terminal N y terminal C fueron construidas, ya que los efectos de la fusión sobre los niveles de expresión, susceptibilidad a la ruptura proteolítica y funcionalidad pueden ser afectados por la posición del epítopo.

Usando el plásmido plGRl2NS-3, el cual es un plásmido de expresión de la E. Coli que expresa el fragmento 19b NS-3 bajo el control del promotor hacia la izquierda de fago lambda, como un modelo para PCR, secuencias que codifican para 19b NS3, fusionados respectivamente en el terminal N- y C- con el epítopo CTL de Rehermann (llamados NS-319bTn y NS-3 19bTC, respectivamente), fueron primero subclonados en el vector de clonación pGEM-T (Promega) ocasionando los vectores pGEM-TNS-319bTn y pGEM-TNS-319bTc. Las secuencias amplificadas por PCR fueron verificadas por análisis de secuencias de ADN.

En el caso de fusionar la secuencia del epítopo de la célula T a la región del terminal N de la NS-3, el PCR fue llevado a cabo con un cebador sentido largo que porta el epítopo CTL y un cebador antisentido corto homólogo a las secuencias 3' del codón de terminación 19b NS-3. Las secuencias del cebador son descritas abajo.

\newpage

Cebador 9038 (sentido)

5'-GCCATGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGCGGCTGTTTGCAC
CCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGG-3' (SEQ ID NO 5).

Cebador 1901 (antisentido)

5'-TTTTATCAGACCGCTTCTGCG-3' (SEQ ID NO 6).

En el caso del NS-3 fusionado en el terminal C, el PCR fue llevado a cabo con un cebador en el sentido más corto homólogo a las secuencias 5' del codón de iniciación NS-3 19b y un cebador antisentido más largo que porta el epítopo CTL seguido por los codones de terminación en la estructura. Las secuencias de cebadores son descritas abajo.

Cebador 1052 (sentido)

5'-AGCAAACCACCAAGTGGA-3' (SEQ ID NO 7).

Cebador 9039 (antisentido)

5'-CTCTAGACTATTAACCGTGGTAAACGGTCCAGCAAACACCGTTGATGCAGGTCGCCAGGCTGAAGT
CGACTGTCTGG-3' (SEQ ID NO 8).

Comenzando a partir de las secuencias que codifican clonadas en los vectores pGEM-T, las secuencias NS-3 19bT son insertadas en el vector de expresión de la E. Coli plGRl2. Para el NS-3 19bT fusionado en el terminal N, la secuencia que codifica el NS-3 19bT fue aislada como un fragmento 379 bp Ncol/SnaBl y ligada con fragmentos SnaBI/AllwNl y AlwNl/Ncol del vector plGRl2NS-3, dando como resultado el vector plGRl2NS-3Tn. Para el NS-3
19bT fusionado en el terminal C, la secuencia que codifica el NS-3 19bT fue aislada como un fragmento 585 bp SnaBl/Spel e insertada en el vector plGRl2NS-3 abierto SnaBl/Spel, dando como resultado el vector plGRl2NS-3Tc.

Ambos vectores plGRl2NS-3Tn y plGRl2NS-3Tc fueron subsecuentemente transformados a la cepa de expresión de la E. Coli MC1061 (pAcl) y después de la inducción de la temperatura del promotor PL lambda, los niveles de expresión fueron analizados en SDS-PAGE y transferencia Western, usando un suero anti NS-3 de conejo policlonal.

Secuencia de amino ácido de la proteína NS-3 19bTn

1

Secuencia de amino ácido de la proteína NS-3 19bTc

2

\newpage

Secuencia nucleotídica de la región que codifica para NS-3 19bTn

3

Secuencia nucleotídica de la región que codifica para NS-3 19bTc

4

Ejemplo 7b Purificación de las proteínas NS-3 19bTc y NS-3 19bTn

Las células de E. coli de los cultivos en erlenmeyer fueron rotas mediante un destructor de células (CSL, modelo B) a 1.4 kbar en 50 mM TRIS, pH 8. Este lisado fue aclarado por centrifugación (15000 g, 30 min, 4ºC). El sobrenadante fue descargado, ya que para ambas construcciones del terminal N y del terminal C el NS3 fue recuperado en forma de pelota. Esta pelota cambió para ser altamente estable para la construcción del terminal N permitiendo el lavado completo (primer lavado con sarcosil 2%, 0.5 M de cloruro de guanidina y 10 mM DTT, segundo y tercer lavado con Triton X-100 1%, 0.5 M de cloruro de guanidina y 10 mM de EDTA) antes de la solubilización. Este no fue el caso para la construcción del terminal C. La purificación fue luego continuada en la construcción del terminal N. La pelota lavada fue finalmente disuelta en 6 M de cloruro de guanidina/50 mM de Na_{2}HPO_{4}, a pH 7.2 y fue sulfonada como es descrito en Maertens y otros (PCT/EP99/02547). La pelota sulfonada fue primero desalada en una columna Sephade G25 a 6 M Urea/50 mM trietanolamina, pH 7.5, y finalmente purificada por dos cromatografías de intercambio aniónico secuencial en la misma composición buffer. El primer intercambio aniónico fue desarrollado en una columna Hyper DQ (50 \mum) (BioSpra Inc. Marlborough, Ma. USA) y la NS3 fue recuperada entre 0.11 y 0.19 M de NaCl. Después de la disolución, estas fracciones fueron aplicadas a una segunda columna Hyper DQ (20 pm) (BioSpra Inc. Marlborough, Ma. USA) y la NS3 fue recuperada en las fracciones que contienen 0.125 M de NaCl. Estas fracciones fueron desaladas a 6 M Urea en PBS, pH 7.5. La pureza final fue estimada > 90% basada en SDS-PAGE seguida del teñido con plata. El secuenciamiento del terminal N por degradación EDMAN mostró que esta NS3 tiene un terminal N intacto, en el cual el epítopo deseado está presente en la secuencia correcta. Se confirmó también que la metionina usada para el inicio de la traducción fue escindida como se predijo.

Ejemplo 8 Construcción de una proteína E2 sin región I hipervariable

Una respuesta homóloga inmunodominante ha sido notada para la región HVR I de E2. Esta respuesta será de poco uso en una aproximación de vacuna, ya que una aproximación de vacuna es un medio heterólogo (la cepa de la vacuna es siempre diferente de las cepas de campo). Por lo tanto, la supresión de esta región sería necesaria para tener una proteína E2 que induce los anticuerpos contra las regiones de E2 más conservadas, pero menos inmunogénicas. Analizando cuidadosamente la secuencia líder E2 y la región hiper-variable E2 fue diseñada la construcción más ideal para la expresión de una proteína E2 sin HVR I. Esta construcción permite comenzar la expresión de un péptido E2 en la posición aa 409 en vez de aa 384. Como una secuencia líder los 20 amino ácidos del terminal C de E1 fueron usados. Sin embargo, ya que la delineación de esta HVR es ambigua, una segunda versión fue hecha (iniciando en aa 412), la cual también tiene una alta probabilidad de ser escindida en la posición correcta.

Construcción intermedia pvHCV-99 (ver también figura 15 y 16)

En el cassette de expresión, la secuencia de codificación de E2-715 debe estar precedida por un péptido señal líder de E1, iniciando en Met364. Por lo tanto, en el plásmido pvHCV-92 (Figura 15), que contiene la secuencia que codifica para E2-715 del HCV del tipo 1b con la versión larga del péptido señal de E1 (iniciando en Met347), fue realizada una supresión mediante una digestión doble con EcoRI y NcoI, seguida por una reacción completa de los extremos 5'-protuberantes con polimerasa T4 del ADN. La ligadura de los extremos romos obtenidos (recirculación del fragmento-bp 6621), dio como resultado un plásmido pvHCV-99, el cual codifica para la misma proteína (E2-715) con un péptido señal líder de E1 más corto (iniciando en Met364). El pvHCV-99 fue depositado en la lista de la cepa como ICCG 3635. Deber quedar claro que secuencias de señales heterólogas o del HCV de longitud variable pueden ser usadas.

Los plásmidos pvHCV-100 y -101 deben contener una supresión en la secuencia E2, es decir, una supresión de la región I hipervariable (HVR-I). En el plásmido pvHCV-100, los amino ácidos 384(His)-408(Ala) fueron suprimidos, mientras que en el plásmido pvHCV-101 los amino ácidos 384(His)-411(Ile) fueron suprimidos.

Construcción del pvHCV-100

Para la construcción del pvHCV-100, dos oligonucleótidos fueron diseñados:

HCV-pr 409 [8749]

: 5' - CTT TGC CGG CGT CGA CGGGCA GAA AAT CCA GCT CGT AA-3' (SEQ ID NO 9).

HCV-pr 408 [8750]

: 5'- TTA CGA GCT GGA TTT TCT GCC CGTCGA CGCCGG CAA AG-3' (SEQ ID NO 10).

La amplificación PCR (desnaturalización 5 min 95ºC, 30 ciclos de amplificación que consiste en el recocido a 55ºC, polimerización a 72ºC, y desnaturalización a 95ºC durante 1 min cada una, elongación durante 10 min a 72ºC) del modelo pvHCV-99 con Gpt-pr[3757] y HCV-pr 408[8750] dio como resultado un fragmento bp 221, mientras que la amplificación con HCV-pr 409[8749] y TKr-pr[3756] dio como resultado un fragmento bp 1006. Ambos fragmentos PCR se sobrepusieron uno al otro por 19 nucleótidos. Estos dos fragmentos fueron reunidos y amplificados por PCR con los cebadores Gpt-pr[3757] y TKr-pr[3756]. El fragmento bp 1200 resultante fue digerido con EcoRI y HinDIII y ligado en el vector pgsATA18 [ICCG 1998] digerido con EcoRI/HinDIII (5558bp). Esta construcción, pvHCV-100, fue analizada por análisis de secuencia y restricción, y depositado en la lista de la cepa como ICCG 3636.

Construcción del pvHCV-101

Para la construcción del pvHCV-101, dos oligonucleótidos fueron diseñados:

HCV-pr 411 [8747]

: 5'- CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GCT CGT AAA CAC CAA CG-3' (SEQ ID NO 11).

HCV-pr 410 [8748]

: 5'- CGT TGG TGT TTA CGA GCT GCC CGT CGA CGC CGG CAA AG-3' (SEQ ID NO 12).

La amplificación PCR del modelo pvHCV-99 con Gpt-pr[3757] y HCV-pr 410[8748] dio como resultado un fragmento bp 221, mientras que la amplificación con HCV-pr 411[8747] y TKr-pr[3756] dio como resultado un fragmento bp 997. Ambos fragmentos PCR se sobrepusieron uno al otro por 19 nucleótidos. Estos dos fragmentos fueron reunidos y amplificados por PCR con el Gpt-pr[3757] y TKr-pr[3756]. El fragmento bp 1200 resultante fue digerido con EcoRI y HinDIII y ligado en el vector pgsATA18 [ICCG 1998] digerido con EcoRI/HinDIII (5558 bp). Esta construcción, pvHCV-101, fue analizada por análisis de secuencia y restricción, y depositada en la lista de la cepa como ICCG 3637.

Todos los plásmidos fueron chequeados por análisis de secuencia y depositados en la lista de cepas de Innogenetics. Para cada plásmido fueron hechas mini preparaciones de ADN (PLASmix) bajo condiciones estériles y colectadas. La concentración de ADN fue determinada y la QA fue realizada por análisis de restricción. El ADN purificado fue usado para regenerar virus vaccinia recombinante como es descrito en Maertens y otros (PCT/EP95/03031). Los virus recombinantes vvHCV-100 y vvHCV-101 fueron, sin embargo, generados en células Vero certificadas WHO. Después de dos rondas de purificación de la placa el producto de expresión fue analizado por medio del análisis de transferencia Western como es descrito en Maertens y otros (PCT/EP95/03031). Las proteínas fueron visualizadas por un anticuerpo monoclonal anti-E2 específico (IGH 212, el cual puede ser obtenido de los inventores en Innogenetics N.V., Zwijnaarde, Bélgica) de un peso molecular estimado de 69 y 37 kDa para vvHCV-100 y de 68 y 35 kDa para vvHCV-101. Estos pesos moleculares indican la presencia tanto de la proteína E2 glicosilatada como de la proteína E2 no glicosilatada, lo cual fue confirmado por tratamiento de las muestras antes del análisis de transferencia Western con PNGaseF. Este tratamiento da como resultado la detección de una sola proteína individual de 37 kDa y 35 kDa para vvHCV-100 y vvHCV-101, respectivamente.

Secuencia de Amino ácido de la E2 madura, derivada del pvHCV-100

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Secuencia de Amino ácido de la E2 madura, derivada del pvHCV-101

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Ejemplo 9 Una partícula de E1 con inmunogenicidad mejorada adicional

Como se estableció en el ejemplo 1, la proteína E1s fue purificada de acuerdo al protocolo descrito en PCT/EP 95/03031 de Maertens y otros. Este protocolo incluye la modificación covalente de las cisteínas (cisteínas libres y cisteínas involucradas en la formación del puente intermolecular, estas últimas después de la reducción de estos puentes de cisteínas usando DTT) usando derivados de maleimida (N-etil maleimida y biotina-maleimida, ambos obtenidos de Sigma). Como un método alternativo para bloquear la maleimida, fueron también evaluados halógenos activos, estos compuestos, es decir los halógenos activos, bloquean las cisteínas libres por medio de la alquilación. A modo de ejemplo, un halógeno activo (iodoacetamida, Merck) fue evaluado. El mismo protocolo fue usado para purificar E1 como es descrito en Maertens y otros (PCT/EP 95/03031), pero en vez de compuestos maleimida, fue usada la iodoacetamida. La proteína E1s obtenida por este procedimiento se comportó a través del procedimiento completo de purificación de manera similar a las proteínas bloqueadas con maleimida. Debido la disminución final de la concentración del detergente CHAPS a 0.05% o el cambio a betaína al 0.5% como es descrito en el ejemplo 1, fueron obtenidas partículas similares como se determinó por DLS. El efecto sorprendente fue encontrado, sin embargo, en la inmunización de ratones con esta E1s modificada con acetamida.

En total tres series de 6 ratones cada una fueron inmunizados con E1s usando tres inyecciones con un intervalo de tres semanas, cada inyección consistiendo de 5 \mug de E1s en 100 \mug/ml de PBS y mezclado con un volumen igual de adyuvante RIBI (R-700). La primera serie recibió E1-maleimida formulada en CHAPS al 0.05%, una segunda serie recibió E1-acetamida también formulada en CHAPS al 0.05%, mientras que una tercera serie recibió E1-acetamida formulada con betaína al 0.12%. Finalmente, todos los ratones fueron desangrados 10 días después de la tercera inmunización. Los títulos del punto final (definido como la dilución del suero todavía resultante en un OD 2 veces mayor que los valores anteriores) para cada animal individualmente fueron determinados contra E1-maleimida y E1-acetamida. La Figura 17 muestra estos títulos del punto final, presentados como la media con desviaciones estándar. Los ratones que recibieron E1-maleimida montaron solamente una respuesta del anticuerpo la cual es capaz de reconocer los etítopos que contienen maleimida (ninguna reactividad en E1-acetamida), los ratones que recibieron E1-acetamida montaron claramente una respuesta del anticuerpo contra los epítopos verdaderos de E1, ya que los anticuerpos son reactivos tanto contra E1-acetamida como contra E1-maleimida. Esto fue claramente demostrado en un experimento adicional, en el cual los anticuerpos para las regiones específicas de E1 fueron determinados usando péptidos los cuales no fueron ni modificados con acetamida ni con maleimida. Los resultados, como se muestra en la figura 18, demuestran que los ratones inmunizados con E1-acetamida (CHAPS y betaína formuladas) si montan una respuesta del anticuerpo que es capaz de reconocer los péptidos V1V2, V2V3, V3V4, V5C4, C4V6. Como V6 no fue parte de E1s, se puede concluir que los anticuerpos fueron montados contra C4, V3 (V3V4 es positivo mientras que V4V5 no lo es) y V1V2. Los ratones inmunizados con E1s-maleimida montan solo una respuesta muy baja contra los péptidos V1V2 y V2V3. Esto remarcó una vez más el hecho que el título razonablemente alto medido para estos anticuerpos de ratón contra la E1s-maleimida es principalmente dirigido contra los epítopos dependientes de maleimida. En adición, fuimos capaces de probar que la respuesta inducida a la E1s-acetamida es parcialmente del tipo Th1, ya que una cantidad sustancial de los anticuerpos inducidos es del subtipo IgG2(a+b), la cantidad de IgG2 es aún mayor para la formulación de betaína comparada con la formulación de CHAPS (Figura 19). A partir de estos resultados se concluyó que las proteínas de la envoltura del HCV, en las cuales al menos una cisteína (pero potencialmente más de una cisteína) es alquilatada, son proteínas extremadamente inmunogénicas.

Consecuentemente, la E1 modificada con acetamida formulada en betaína fue también usada para la dosificación suplementaria adicional de los chimpancés Phil y Ton. Ambos chimpancés fueron inmunizados nuevamente con dos inmunizaciones intramusculares consecutivas con un intervalo de tiempo de tres semanas (50 \mug de E1 mezclada con adyuvante RIBI como para los ejemplos 4 y 5). Como puede ser juzgado a partir de las Figuras 20 y 21, la respuesta anti-E1 pudo efectivamente ser incrementada otra vez, y esto para niveles más altos que los obtenidos en la inmunizaciones previas después de dos inyecciones. Esta titulación fue realizada contra una estándar, la cual es una mezcla de tres sueros anti-E1 de título alto humano (obtenido de los portadores crónicos del HCV). El título anti-E1 de estos sueros fue definido como una unidad/ml. En el chimpancé Phil (Figura 20), los títulos dos veces tan altos como en los portadores humanos fueron inducidos solamente después de dos inmunizaciones. En el chimpancé Ton (Figura 21), los títulos hasta 140 pliegues más altos fueron inducidos. Esto enfatiza una vez más la alta inmunogenicidad de estas partículas de E1.

Ejemplo 10 La E1 alquilatada tiene cualidades superiores para uso en diagnóstico

La E1s-acetamida como la descrita en el ejemplo 9 fue además evaluada como antígeno para la detección de anticuerpos anti-E1 en muestras de suero para portadores del HCV crónico humano. A modo de ejemplo estos antígenos fueron enlazados a membranas LIA, y las bandas fueron procesadas esencialmente como es descrito en Serrín y otros (1998). Las muestras de suero de 72 donantes de sangre fueron evaluadas primero, para determinar la concentración optima del antígeno E1 que puede ser usada en el ensayo para excluir "falsos" positivos. Para la E1s-maleimida, esta concentración probó ser 8 \mug/ml, mientras que para la E1s-acetamida una concentración hasta 50 \mug/ml no dio resultados positivos falsos (ninguna muestra mostrando una tinción de color relativa por encima de 0.5). Usando 8 y 50 \mug/ml, respectivamente, para la E1s-maleimida y la E1s-acetamida 24 sueros de portadores crónicos del HCV fueron seleccionados para anticuerpos contra E1s. Como se muestra en la Tabla 6, la E1s-acetamida da como resultado claramente más muestras que registran positivo (67% contra 38% para la E1-maleimida). No fue encontrada ninguna muestra que solo registre positivo en la E1s-maleimida. Para las muestras que registran positivo tanto en la E1s-maleimida como en la E1s-acetamida, la reactividad en la última es mayor. A partir de este ejemplo puede ser concluido que las proteínas de la envoltura alquilatada del HCV son mejores antígenos para detectar los anticuerpos humanos que las proteínas de la envoltura modificada con maleimida.

Ejemplo 11 Producción de partículas mezcladas que contienen E1 y E2

La E1s y la E2s (vvHCV-44) fueron producidas y purificadas como se describió en Maertens y otros PCT/EP95/
030301 excepto por el hecho que la modificación de la maleimida fue reemplazada por alquilación usando iodoacetamida. La E1s y la E2s en Empigen solo al 3% o como una mezcla equimolar fueron inyectados sobre una columna Superdex-200 PC 3.2/30 equilibrada en PBS/CHAPS al 0.2%. Esta columna es diseñada para usar con el equipo HPLC SMART™ de Pharmacia LKB (Suecia). Las fracciones fueron seleccionadas por medio de tres sándwich
ELISAs diferentes. Para estos ELISAs los monoclonales específicos, E1-(IGH 207) y E2-(IGH223) fueron recubiertos a 2 \mug/ml. Las fracciones de la filtración en gel fueron incubadas en una dilución 1/2500. Otros dos monoclonales E1 (IGH 200) y E2 (IGH 212), conjugados con biotina fueron usados para la detección del antígeno de enlace. El sistema estreptavidina-HRP/TMB fue usado para desarrollar el enlace biotina hacia un color amarillo el cual fue medido a
450 nm.

Este sistema ELISA fue usado en un medio homólogo (anti-E1 recubrimiento/anti-E1 detección o anti-E2 recubrimiento/anti-E2 detección) y uno heterólogo (anti-E1 recubrimiento/anti-E2 detección). Este último teóricamente sólo detecta partículas en las cuales tanto E1 como E2 están incorporadas. Las fracciones reactivas fueron combinadas, concentradas sobre un filtro 10 kDa, y otra vez cromatografiadas sobre Superdex-200 en PBS/CHAPS al 0.05%. Todas estas fracciones fueron probadas para reactividad usando diferentes montajes ELISA. Como puede ser juzgado a partir de la Figura 22, la adición de E2 a E1 no da como resultado un mayor cambio en el tiempo de retención, comparado con E1 solo, indicando que efectivamente las partículas están todavía presentes. Estas partículas contienen tanto E1 como E2, ya que solamente en este medio el ELISA heterólogo registra positivo.

Ejemplo 12 Producción de partículas mezcladas que contienen E1 de 2 genotipos diferentes

La E1s del genotipo 1b y del genotipo 4 (vvHCV-72) fueron producidas y purificadas como se describe en Maertens y otros, PCT/EP95/030301 excepto por el hecho que la modificación con maleimida fue reemplazada por la alquilación usando iodoacetamida para el genotipo 1b. E1s-1b y Es1-4 en Empingen solo al 3% o como una mezcla equimolar fueron inyectados sobre una columna Superdex-200 PC 3.2/30 equilibrada en PBS/CHAPS al 0.2%. Esta columna es diseñada para usar con el equipo HPLC SMART™ de Pharmacia LKB (Suecia). Las fracciones que están contenidas en la proteína principal fueron combinadas, concentradas sobre un filtro 10 kDa, y otra vez cromatografiadas sobre Superdex-200 en PBS/CHAPS al 0.05%. Todas estas fracciones fueron probadas para reactividad usando un montaje ELISA el cual debe detectar solamente partículas que contienen E1 de ambos genotipos. Para esto estreptavidina ELISA fue recubierto en 2 \mug/ml. Las fracciones de la filtración en gel fueron incubadas en una dilución 1/2500. Un anticuerpo monoclonal E1 (IGH 200) el cual solo reconoce la E1 del genotipo 1 y 10 fue usada para la detección del antígeno de enlace. El sistema cabra-anti-ratón-HRP/TMB fue usado para el desarrollo del ensayo hacia un color amarillo el cual fue medido a 450 nm. Como puede ser juzgado a partir de la Figura 23, la adición de E1-4 a E1-1b no dio como resultado un cambio importante en el tiempo de retención de las proteínas, indicando que las partículas efectivamente están todavía presentes. Estas partículas contienen ambas proteínas E1, es decir la E1s del genotipo 1b y del genotipo 4, ya que solamente en este medio el ELISA registra positivo.

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
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TABLA 6

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Claims

1. Una partícula oligomérica que consiste de proteínas purificadas de la envoltura del HCV y que tiene un diámetro de 5 a 100 nanómetros, donde al menos un residuo cisteína de dicha proteína de la envoltura es alquilatado.

2. Una partícula oligomérica que consiste de una capa de proteínas purificadas de la envoltura del HCV donde al menos un residuo cisteína de dicha proteína de la envoltura es alquilatado o una partícula oligomérica en la cual la esfera completa consiste de proteínas purificadas de la envoltura del HCV donde al menos un residuo cisteína de dicha proteína de la envoltura es alquilatado, dicha partícula teniendo un diámetro de 5 a 100 nanómetros.

3. Una partícula oligomérica de acuerdo a las reivindicaciones 1 ó 2 que tiene un diámetro de 5 a 40 nanómetros.

4. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la cual la secuencia de amino ácidos de la proteína de la envoltura del HCV es una secuencia de consenso derivada de una secuencia de consenso -género del HCV, -cepa del HCV, -subtipo del HCV o -aislado del HCV.

5. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde al menos un residuo cisteína de dicha proteína de la envoltura es alquilatado por medio de un agente de alquilación.

6. Una partícula oligomérica de acuerdo a la reivindicación 5, donde dicho agente de alquilación es etilenimina, N-(iodoetil)trifluoroacetamida o un halógeno activo X-(CH2)n-R donde X es un halógeno, R es H, COOH, NH_{2}, CONH_{2}, fenilo o cualquier derivado de los mismos, y n es 0, 1, 2, 3 ó 4.

7. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dichas proteínas de la envoltura son las proteínas E1 del HCV o partes de las mismas.

8. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dichas proteínas de la envoltura son las proteínas E1s del HCV o partes de las mismas.

9. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dichas proteínas de la envoltura son las proteínas E2 del HCV o partes de las mismas.

10. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dichas proteínas de la envoltura son SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 14, o partes de las mismas.

11. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dichas proteínas de la envoltura son codificadas por una secuencia de consenso de nucleótidos del aislado del HCV, secuencia de consenso de nucleótidos del subtipo del HCV, secuencia de consenso de nucleótidos de especies del HCV o secuencia de consenso de nucleótidos del género del HCV, o partes de las mismas.

12. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dichas proteínas de la envoltura son una mezcla de la proteína E1 del HCV y/o partes de la misma, la proteína E1s del HCV y/o partes de la misma, la proteína E2 del HCV y/o partes de la misma.

13. Una partícula oligomérica de acuerdo a la reivindicación 12, donde dichas proteínas E2 del HCV o partes de las mismas están definidas por la SEQ ID NO: 13 y/o partes de la misma, o por SEQ ID NO: 14 y/o partes de la misma.

14. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde dichas proteínas de la envoltura, o partes de las mismas, son derivadas de diferentes cepas del HCV, subtipos del HCV o genotipos del HCV.

15. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde dichas proteínas de la envoltura, o partes de las mismas, son una mezcla que consiste de proteínas de la envoltura del HCV de una cepa del HCV o genotipo del HCV y proteínas de la envoltura del HCV de al menos otra cepa del HCV o genotipo del HCV.

16. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, obtenible por un método caracterizada por los siguientes pasos:

(i): purificar las proteínas de la envoltura del HCV en una solución que comprende el uso de un agente de alquilación,

(ii): remplazar dicha solución de dichas proteínas purificadas de la envoltura del HCV con un detergente o sal, dando como resultado partículas oligoméricas, y

(iii): purificar las partículas oligoméricas formadas en (ii).

17. Una partícula oligomérica de acuerdo a la reivindicación 16, donde dicho paso (i) de dicho método comprende el uso de un primer detergente.

18. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, donde dicho paso (i) comprende el uso de un agente de escisión de los enlaces disulfuro.

19. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde dicho paso (iii) de dicho método comprende además reducir la concentración del detergente o la sal del paso (ii).

20. Una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde dicho primer detergente del paso (i) es Empigen B-B, donde el detergente del paso (ii) o del paso (iii) es CHAPS, octilglucósido, Tween, o cualquier otro detergente, y donde dicha sal es betaína.

21. Una partícula oligomérica de acuerdo a la reivindicación 20, donde dicho Empigen-BB es usado en una concentración de 1% a 10% y donde dicho CHAPS o Tween es usado en una concentración de 0.01% a 10% o dicha betaína es usada en una concentración de 0.01% a 10%.

22. Método para producir una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por los siguientes pasos:

(ii): remplazar dicha solución de dichas proteínas purificadas de la envoltura del HCV con detergente o sal, dando como resultado partículas oligoméricas, y

(iii): purificar las partículas oligoméricas formadas en (ii).

23. Método de acuerdo a la reivindicación 22, donde dicho paso (i) comprende el uso de un primer detergente.

24. Método de acuerdo a las reivindicaciones 22 o 23, donde dicho paso (i) comprende el uso de un agente de escisión de los enlaces disulfuro.

25. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde dicho paso (iii) de dicho método comprende además reducir la concentración del detergente o la sal del paso (ii).

26. Método para producir una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde dicho primer detergente del paso (i) es Empigen-BB, donde el detergente del paso (ii) o del paso (iii) es CHAPS, octilglucósido, Tween, o cualquier otro detergente, y donde dicha sal es betaína.

27. Método para producir una partícula oligomérica de acuerdo a la reivindicación 26, donde dicho Empigen-BB es usado en una concentración de 1% a 10% y donde dicho CHAPS o Tween es usado en una concentración de 0.01% a 10%, o dicha betaína es usada en una concentración de 0.01% a 10%.

28. Composición que comprende una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

29. Composición de acuerdo a la reivindicación 28, la cual también comprende la proteína core del HCV, P7, E1, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y/o NS5B, o partes de las mismas.

30. Composición de acuerdo a la reivindicación 29, donde dicha proteína NS3, o partes de la misma, tienen una secuencia de amino ácidos dada por SEQ ID NO: 1 o partes de la misma, o dada por SEQ ID NO: 2 o partes de la misma.

31. Composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 la cual es una composición vacunal.

32. Uso de una partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para la fabricación de un medicamento.

33. Uso de la partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para la fabricación de una composición vacunal contra el HCV.

34. Uso de la partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad contra el HCV en portadores crónicos del HCV.

35. Uso de la partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad contra el HCV en portadores crónicos del HCV antes de, simultáneamente a o después de cualquier otra terapia.

36. Uso de la partícula oligomérica de acuerdo a la reivindicación 35, donde dicha otra terapia es terapia con interferón.

37. Uso de la partícula oligomérica de acuerdo a la reivindicación 35, donde dicha otra terapia es terapia con interferón en combinación con fármacos menores.

38. Uso de la partícula oligomérica de acuerdo a la reivindicación 37, donde dichos fármacos menores es ribavirina.

39. Uso de la partícula oligomérica de acuerdo a la reivindicación 35, para la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad contra el HCV en individuos infectados con el HCV antes de o después del transplante de hígado, o después de la infección sospechada.

40. Uso de la partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para la fabricación de un medicamento para inducir profilácticamente inmunidad contra el HCV.

41. Uso de la partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad contra el HCV, caracterizada porque dicha partícula oligomérica es usada como parte de una serie cronológica y de compuestos.

42. Uso de la partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para la fabricación de un medicamento para tratar la infección por el HCV.

43. Uso de acuerdo a la reivindicación 42, donde dicho tratamiento da como resultado:

- aclaramiento de los antígenos virales del HCV del hígado, y/o

- normalización de los niveles de la enzima del hígado en el suero, y/o

- mejora de la histología del hígado, y/o

- mejora de la enfermedad del hígado, y/o

- mejora de la inflamación del hígado.

44. Uso de una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 para la fabricación de un medicamento.

45. Uso de una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 para la fabricación de una vacuna contra el HCV.

46. Uso de una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 para la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad contra el HCV en portadores crónicos del HCV.

47. Uso de una composición de acuerdo a la reivindicación 46 para la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad contra el HCV en portadores crónicos del HCV antes de, simultáneamente a o después de cualquier otra terapia.

48. Uso de acuerdo a la reivindicación 47, donde la otra terapia es terapia con interferón.

49. Uso de acuerdo a la reivindicación 47, donde la otra terapia es terapia con interferón en combinación con fármacos menores.

50. Uso de acuerdo a la reivindicación 49, donde los fármacos menores es ribavirina.

51. Uso de la composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 para la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad contra el HCV en individuos infectados con HCV antes de o después del transplante de hígado, o después de la infección sospechada.

52. Uso de la composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 para la fabricación de un medicamento para profilácticamente inducir inmunidad contra el HCV.

53. Uso de la composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 para la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad contra el HCV, caracterizado porque dicha composición es parte de una serie cronológica y de compuestos.

54. Un anticuerpo específico generado contra la partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

55. Uso de un anticuerpo específico de acuerdo a la reivindicación 54 para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la infección por el HCV.

56. Kit para detectar antígenos del HCV que comprende el anticuerpo específico de acuerdo a la reivindicación 54.

57. Kit para detectar anticuerpos del HCV presentes en una muestra biológica, que comprende la partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en un contenedor apropiado.

58. Kit para detectar la respuesta de las células T relacionadas con el HCV que comprende la partícula oligomérica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

59. Inmunoensayo para detectar anticuerpos contra el HCV en una muestra biológica, dicho inmunoensayo comprendiendo:

(i): proporcionar una partícula oligomérica de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 21,

(ii): incubar dicha muestra biológica con dicha partícula oligomérica de (i) bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre dicha partícula oligomérica y dichos anticuerpos contra el HCV;

(iii): determinar, a partir de (ii), si dicho complejo se ha formado y, de ahí, la presencia de anticuerpos contra el HCV en dicha muestra biológica.