KR100518106B1 - 혈관신생 예방 및 악성종양 치료용 퀴나졸리논-함유 약제학적 조성물 - Google Patents
혈관신생 예방 및 악성종양 치료용 퀴나졸리논-함유 약제학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 활성 성분으로서의 약제학적 유효량의 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 혈관신생 감소용 및 악성종양 치료용 조성물을 제공한다.
화학식 I
위의 화학식 I에서,
n은 1 또는 2이고,
R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R2는 하이드록시, 아세톡시 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이며,
R3은 수소 및 저급 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
Description
본 발명은 퀴나졸리논을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 맥관형성-관련 질환의 치료뿐만 아니라 원발성 종양 성장, 종양 진행 및 전이의 억제를 포함하는 악성종양 치료에 유용한, 퀴나졸리논 유도체를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
악성종양은 종양의 성장 및 확산을 특징으로 한다. 다수의 인자가 상기 질환의 진행에 있어서 중요하다. 이와 같은 인자에는, 종양 세포가 아포프토시스(apoptosis: 예정된 세포 사멸) 메카니즘을 회피하는 능력, 맥관형성, 및 악성종양 세포의 전이 능력이 포함된다. 이들 인자 중 어떤 것은 치료학적 중재에 대한 잠재적 표적이다. 이들 인자 중 2가지 이상의 인자에 영향을 줄 수 있는 치료법이 특히 바람직하다.
맥관형성은 모세 혈관이 사건의 정연한 순서로 성장하는 복잡한 과정이다[참조: J. Folkman 및 M. Klagsbrun, Science, Vol. 235, pp. 442-447 (1987); J. Folkman 및 Y. Shing, J. Biol. Chem., Vol. 267, pp. 10931-10934 (1992)]. 맥관형성은 다음과 같은 악성종양의 발현 및 진행과 관련이 있다. 일단 종양이 생성되면, 종양 세포 집단의 모든 증가는 종양에 집중되어 당해 세포에 산소 및 영양을 공급하는 새로운 모세관의 증가가 전제되어야만 한다[참조: J. Folkman, Perspect. in Biol. and Med., Vol. 29, p. 10-36 (1985); J. Folkman, J. Natl. Cancer Inst., Vol. 82, pp. 4-6 (1989); N. Weidner, et al., Amer. J. Pathol., Vol. 143, pp. 401-409 (1993)]. 따라서, 수반된 맥관형성 프로그램을 활성화시키지 않는 한, 종양은 비교적 무해한 상태로 남아있게 되고, 이들의 원천 조직에 한정될 수 있다. 종양 진행에서 맥관형성-의존성 단계는 모든 병인의 충실성(solid) 종양에 의해 공유되기 때문에, 종양-관련 맥관형성을 억제하는 능력은 암을 제거하기 위한 방법에서 가장 유망한 접근법이다[참조: M.S. O'Reilly, et al., Cell, Vol. 79, pp. 316-328 (1994)].
실험 증거의 실체는 종양 맥관형성이 충실성 종양의 성장 및 전이에 필수적이라는 가설을 뒷받침한다[참조: J. Folkman, ibid. (1989); N. Weidner, et al., ibid. (1993); M.S. O'Reilly, et al., ibid. (1994); N. Weidner, et al., N. Eng. J. Med., Vol. 324, pp. 1-8 (1991)]. 실제로, 대부분의 충실성 종양은 혈관신생의 발생 후까지도 임상적으로 검출가능하지 않고, 이러한 충실성 종양에서의 유도는 1가지 이상의 맥관형성 인자에 의해 매개된다[참조: J. Folkman, ibid. (1987); J. Folkman 및 Y. Shing, ibid. (1992)].
또한, 맥관형성은 관절염, 건선, 당뇨병성 망막증, 만성 염증, 피부경화증, 혈관종, 후수정체 섬유증식증, 혈우병 관절에서의 비정상적인 모세관 증식, 장기화된 월경 및 출혈, 및 여성의 생식계의 다른 질환을 포함하는 다수의 다른 병리학적 진행과정에서 또한 중요하다[참조: J. Folkman, Nature Medicine, Vol. 1, p.27-31, (1995); J.W. Miller, et al., J. Pathol., Vol. 145, pp. 574-584 (1994); A.P. Adamid, et al., Amer. J. Ophthal., Vol. 118, pp. 445-450 (1994); K. Takahashi, et al., J. Clin. Invest., Vol.93, pp. 2357-2364 (1994); D.J. Pcacock, et al., J. Exp. Med., Vol. 175, pp. 1135-1138 (1992); B.J. Nickoloff, et al., Amer. J. Pathol., Vol. 44, pp. 820-828 (1994); J. Folkman, Steroid Hormones and Uterine Bleeding, N.J. Alexander and C. d'Arcangues, Eds., American Association for the Advancement of Science Press, Washington, D.C., U.S.A., pp. 144-158 (1992)].
따라서, 맥관형성 메카니즘을 특이적으로 차단할 수 있는 명백히 신규한 약제가 다수의 상이한 질환을 치료하는 데 의학적으로 유용할 것이다. 맥관형성의 기본적인 메카니즘은 다음과 같다. 간략하게, 새로운 모세관이 소정맥의 측면으로부터 발아하기 시작할 경우, 내피 세포는 기저막을 분해하고, 맥관형성원으로 이동하고, 증식하여, 내강을 형성시키고, 2개의 싹의 첨단을 연결하여 모세관 루프를 생성시키고, 새로운 기저막을 제조한다[참조: J. Folkman, Perspectives in Biology and Medicine, Vol. 29, pp. 1-36 (1985)].
세포외 매트릭스(ECM)의 분해 및 재성형은 맥관형성의 메카니즘에서 필수적인 과정이다. 또한, 콜라겐, 라미닌, 트롬보스폰딘, 피브로넥틴 및 SPARC와 같은 내피세포에 의해 합성된 ECM 성분은 내피세포 성장, 이동 및 형태를 조절하는 기능을 한다[참조: J. Bischoff, Trends Cell Biol., No. 5, pp. 69-74 (1995)]. 발아 및 튜브 형성되는 소 대동맥 내피 세포(BAE)는 I형 콜라겐 및 SPARC를 합성한다. I형 콜라겐은 이동 및 BAE 세포의 조합을 지시할 수 있다[참조: M.L. Iruela-Arispe, et al., Lab. Invest., No. 64, pp. 174-186 (1991)]. 또한, 외인성 I형 콜라겐은 융합성 사람 피부 미소맥관 내피세포에 의한 튜브 형성을 신속하게 촉진시키는 것으로 밝혀졌다[참조: C.J. Jackson 및 K.L. Jenkins, Exp. Cell Res., No. 192, pp. 319-323 (1991)]. 따라서, 형성된 튜브는 내강 공간내에 콜라겐 소섬유를 함유하는데, 이는 내피 세포가 소섬유를 사용하여, 튜브 구조로 포개지고 정렬되는 것을 암시한다.
맥관형성에서의 콜라겐의 역할을 여러 그룹에 의해 조사되었다. 콜라겐 I형 및 IV형의 합성의 대사적 억제는 융모요막(CAM) 검사에 의한 바, 모세관 형성을 방해하였다[참조: Maragoudakis, M.E. et al., Int. J. Radiat. Biol., Vol. 60, 54-9, 1991]. 또한, CAM 상에서 실험적으로 유도된 맥관형성은 다량의 콜라겐의 침착과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 프롤린-유사체인 cis-하이드록시프롤린 존재하에 성장시켰을 경우, 콜라겐 겔내에서 대동맥 이식편으로부터의 내피 세포의 이동은 억제되는데, 이는 다시 한번 정상적인 콜라겐 합성에 대한 필요성을 지시하는 것이다[참조: Nicosia, R.F. et al., In Vitro Cell Dev. Biol., Vol. 27A, 961-6, 1991].
시험관내 연구로, 소 대동맥 내피 세포 BAEC가 발아 맥관형성될 경우, I형 콜라겐 및 칼슘-결합 단백질 SPARC(시스테인이 풍부한 산성의 분비된 단백질)의 공동 발현이 개시된다는 것이 제안된다[참조: Iruela-Arispe, M.L. et al., Arterioscler. Thromb., Vol. 11, p. 805-15, 1991]. 발아 동안 Ⅷ형 콜라겐은 또한 합성되고 국소화되어, 내피색내에서 내피 세포를 증식시킨다. 정상, 종양 및 실험적으로 유도된 맥관형성의 조직학적 연구는 I형 및 Ⅷ형 콜라겐이 내피색 및 튜브에 국소화되어 있다는 증거를 확장하였다[참조: Kittelberger, R. et al., Connect. Tissue Res., Vol. 24, p. 303-18, 1990]. BAEC가 맥관형성 히알루론산(HA) 올리고사카라이드에 노출될 경우, I형 콜라겐 합성이 12시간 이내에 4.5배 상향 조절되고, Ⅷ형 콜라겐 합성도 5.8배 증강된다. I형 콜라겐은 내피 세포 이동을 보조하는 것으로 간주되며, Ⅷ형 콜라겐은 내피 세포 이동 및 튜브 형성에 관여하는 것으로 보인다.
콜라겐 생산에 추가하여, 모세관 혈관을 연장하기 위해서, ECM 성분과 주변 매트릭스 분자간에 상호작용이 일어나서, 새로운 혈관의 ECM 성분의 골격을 제공하여야 한다[참조: Brooks, P.C. et al., Cell, Vol 79, p. 1157-1164, (1994)]. 이와 같은 세포-매트릭스 상호작용의 파괴는 사람 내피 세포에서의 아포프토시스를 유도하였다. 맥관형성성 맥관 세포에서의 발현이 증강된 인테그린 α2β3은 또한 생존 시그날을 촉진시키는 것으로 밝혀졌는데, 이는 상기 인테그린의 억제제가 예정되지 않은 아포프토시스 및 새롭게 형성된 혈관의 붕괴를 유발하기 때문이었다.
맥관형성-관련 질병을 치료하기 위해서, 혈소판 인자 4, 퓨마길린 유도체 AGM 1470, 인터페론 α2a, 트롬보스폰딘, 지혈성 스테로이드 및 안지오스타틴을 포함한, 상기한 맥관형성의 메카니즘의 다수 억제제를 연구하고 있다[참조: J. Folkman, ibid., (1995); M.S. O'Reilly, et al., ibid. (1994); V. Castle, et al., J. Clin. Invest., Vol. 87, pp. 1883-1888; D. Ingber, et al., Nature, Vol. 348, pp. 555-557]. 이와 같이 시험된 선행 기술분야의 모든 화합물은 단점을 가지고 있다. 예를 들면, 엔도스타틴 및 안지오스타틴은 단백질이어서, 이들은 비경구적으로 투여하기 위한 필요조건을 포함한, 단백질의 모든 단점을 가진다. 따라서, 다른 생리학적 기능에 악영향을 주지 않고, 다수의 상이한 경로를 통해 투여할 수 있는, 맥관형성의 기초적인 메카니즘을 선택적으로 차단할 수 있는 비단백질 억제제가 극히 유용하다. 이러한 억제제는 병리학적 과정의 일부로서 맥관형성을 포함하는, 악성종양과 같은 각종 질환을 치료하는 데 유용하다.
위에서 언급한 바와 같이, ECM의 분해 및 재성형은 맥관형성의 메카니즘에 대해 필수적인 과정이다. 이와 같은 과정에는 콜라겐과 같은 다수의 ECM 성분의 합성이 포함된다. 콜라겐 대사의 다수의 조정제를 맥관형성에 미치는 영향에 대해 조사하였다[참조: Nakajima M. et al., Cancer Res., Vol. 9, p. 1698-1706, 1989; Turpeenniemi-Hujanen, T. et al., J. Natl. Cancer Inst., Vol. 75, p. 99-103, 1985; Monteagudo, C. et al., Amer. J. Pathol., Vol. 136, p. 585-592, 1990]. 병아리 배(chick embryo)에서의 성장하고 있는 모세관의 퇴화가 L-아제티딘-2-카복실산, cis-하이드록시프롤린, dL-3,4-데하이드록시프롤린 및 티오프롤린과 같은 프롤린 유사체에 의해 유도되었다. 이들 화합물 및 프로일 하이드록실라제의 억제제인 a,a-디피리딜은 모두 3중 나선 형성을 방해하고 콜라겐 침착을 억제한다. 콜라겐 가교 결합 억제제인 β-아미노-프로피오니트릴은 항-맥관형성 활성을 갖지만, 글리코사미노글리칸 침착 억제제인 β-메틸-d-크실로사이드는 항-맥관형성 활성을 갖지지 않았다[참조: Herron, G.S. et al., J. Biol. Chem., Vol. 261, p. 2814-2818, 1986; Reich, R. et al., Clin. and Exp. Metastasis, Vol. 13, p. 134-140, 1995]. 콜라겐 조절제의 국부적최적 용량과 지혈성 스테로이드 및/또는 헤파린을 공동 투여하면 맥관형성의 억제를 가능하게 하였다.
또한, 종양 자체, 특히 충실성 종양은 종양 성장을 지지하기 위해 맥관형성을 위한 콜라겐의 필요조건 이외에 지속적인 성장 및 진행을 위한 콜라겐 합성 및 침착에 의존한다. 충실성 종양은 2개의 별개이나 서로 의존성인 구획: 악성종양 세포 자체 및 증가된 ECM과 콜라겐 I형 합성에 의해 종양 성장을 지지하는 기질로 구성된다[참조: Folkman, J., Seminars in Cancer Biology, Vol. 3, p. 56-71, 1992]. 기질은 영양소 공급, 기체 교환 및 폐기물 처리를 위해 종양에 의해 요구되는 맥관의 공급을 지지하기 때문에 종양 성장에 있어 필수적이다. 몇몇 경우에는 최고 90%의 대부분의 종양 기질이 간질성 결합 조직으로 구성된다. 이 조직은 콜라겐 I형 및 III형을 포함한 간질성 콜라겐, 피브린, 피브로넥틴, 테나스신, 엘라스틴, 설페이트화 프로테오글리칸과 같은 구조 단백질을 포함한다[참조: Dvorak, H.F., N. Eng. J. Med., Vol. 315, p. 1650-1659, 1986; Yeo, T.K., "Tumor Stroma" in Diagnostic Immunopathology, Ed. by Colvin, R.B. et al., Raven Press, New York, p.985-696]. 콜라겐 형성의 일반적인 억제제를 종양 성장에 미치는 영향에 대해 조사하여, 마우스에서 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌으나, 대단히 독성이어서 장시간 안전하게 투여 할 수 없는 것으로 입증되었다. 따라서, 현재 구입 가능한 콜라겐 합성 및 침착의 억제제는 악성종양의 치료에 적합하지 않다.
또한, 다수의 다른 구입 가능한 콜라겐 합성 및 침착 억제제가 맥관형성 또는 종양 성장에 미치는 영향에 대해 조사되지 않았더라도, 콜라겐 대사 경로에 대해 특이성이 부족하기 때문에 일반적으로 바람직하지 않다. 따라서, 다수의 현재 구입 가능한 약물은 유해한 부작용을 갖는다.
예를 들면, 세포외 매트릭스내로의 콜라겐 분비를 지연시키는 콜치신[참조: D. Kershenobich, et al., N. Engl. J. Med., Vol. 318, p. 1709 (1988)]과 같은 세포독성 약물을 콜라겐-생산 섬유아세포의 증식을 지연시키는 시도로 사용하였다[참조: J.A. Casas, et al., Ann. Rhem. Dis., Vol. 46, p. 763 (1987)]. 다른 약물은 주요 콜라겐 대사 효소의 억제제로서 작용한다[참조: K. Karvonen, et al., J. Biol Chem., Vol. 265, p. 8414 (1990); C.J. Cunliffe, et al., J. Med. Chem., Vol. 35, p. 2652 (1992)]. 그러나, 이들 억제제 중 어느 것도 특이적 유형의 콜라겐의 대사 및 침착에 특이적인 효과를 가지지 않는다. 또한, 이들 약물은 다른 중요한 콜라겐성 분자, 예를 들면, 전형적인 보충 경로에서의 Clq, 신경-근육 접합 종판의 아세틸콜린 에스테라제, 교착소 및 폐 계면활성제 아포프로테인의 생합성을 방해할 수 있다. 이러한 방해 및 특이성의 결여로 잠재적으로 심각한 부작용을 가질 수 있다.
콜라겐 합성을 억제할 수 있는 다른 약물, 예를 들면, 니페디핀 및 페니토인은 다른 단백질의 합성도 억제하여, 콜라겐 생합성 경로를 비특이적으로 차단한다[참조: T. Salo, et al., J. Oral Pathol. Med., Vol. 19, p. 404 (1990)]. 또한, 단백질 합성의 비특이적 억제는 약물을 환자에게 투여할 경우에 부작용을 유발할 수 있기 때문에, 특이성의 결핍은 이들 약물의 임상적 사용을 상당히 감소시킨다.
실제로, 상기한 β-아미노-프로피오니트릴과 같은 콜라겐 가교-결합 억제제를 포함한 임상적으로 이용 가능한 항섬유증 약물도 비특이적이다. 불행하게도, 이러한 콜라렌 가교-결합 억제제의 특이성 결핍은 궁극적으로 장시간 사용후 심각한 부작용을 초래한다. 이러한 부작용은 라트리틱 증후군 및 파괴된 탄성형성증을 포함한다. 파괴된 탄성형성증의 부작용은 또 다른 섬유성 결합 조직 단백질인 엘라스틴의 가교-결합의 파괴의 결과이다. 또한, 이들 약물의 콜라겐 가교-결합 억제 효과는 부차적이어서, 콜라겐은 콜라게나제에 의해 분해되기 전에 우선 과다 생산되어야 한다. 따라서, 콜라겐 자체의 합성의 유형-특이적 억제제가 절실히 필요하다.
이러한 유형-특이적 콜라겐 합성 억제제는 피부 경화증 및 이식편 대 숙주 질환과 같은 특정 섬유증 상태 치료용으로 미국 특허 제5,449,678호에 기재되어 있다. 상기 질환 둘 다 과도한 콜라겐 침착과 관련이 있으며, 이는 할로퓨기논(Halofuginone)에 의해 억제할 수 있다. 이러한 특이적 억제제는 하기 화학식 I의 약제학적 활성 화합물을 약제학적 유효량으로 함유하는 조성물이다.
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위의 화학식 I에서,n은 1 내지 2이며,
R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R2는 하이드록시, 아세톡시 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R3은 수소 및 저급 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
이들 화합물 그룹 중, 할로퓨기논이 이러한 치료에 특히 유효한 것으로 밝혀졌다.
국제 공개특허공보 제96/06616호에는, 또한 이러한 화합물이 맥관 평활근 세포의 증식을 억제함으로써 재협착증을 효과적으로 치료할 수 있다고 기재되어 있다. 재협착증은 평활근 세포 증식 및 맥관 손상에 반응하여 침범된 혈관의 내강내에서의 세포외 매트릭스 축적을 특징으로 한다[참조: Choi et al., Arch. Surg., Vol. 130, p. 257-261 (1995)]. 이러한 평활근 세포 증식의 한 가지 특성은 정상적인 수축성 표현형으로부터의 합성 표현형으로의 표현형 변형이다. I형 콜라겐은 이러한 표현형 변형을 지지하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 할로퓨기논에 의해 차단될 수 있다[참조: Choi et al., Arch. Surg., Vol. 130, p. 257-261 (1995); 국제 공개특허공보 제96/06616호]. 따라서, 할로퓨기논은 I형 콜라겐 합성의 차단에 의한 맥관 손상후 평활근 세포의 비정상적 재분화를 억제할 수 있다. 다른 시험관내 연구는 할로퓨기논이 또한 3T3 섬유아세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 나타낸다[참조: 미국 특허 제5,449,678호].
그러나, 할로퓨기논의 시험관내 작용으로 이의 생체내에서의 효과를 항상 예측할 수 있는 것은 아니다. 예를 들면, 할로퓨기논은 미국 특허 제5,449,678호에서 입증된 바와 같이, 시험관내에서 골 연골세포내의 I형 콜라겐 합성을 억제한다. 그러나, 할로퓨기논으로 처리한 병아리에서는 골 파괴 속도가 증가되었다는 보고가 없는 것으로 보아, 생체내에서는 효과가 나타나지 않음을 지시하였다. 따라서, 생체내에서의 할로퓨기논의 정확한 거동이 시험관내 연구로부터 항상 예측될 수 있는 것은 아니다.
또한, 종양 성장 및 진행과 관련된 생리학적 과정을 억제하거나 차단하는 할로퓨기논 또는 다른 관련된 퀴놀리논의 능력은 선행 기술분야에 공지되어 있지 않다. 할로퓨기논이 I형 콜라겐 합성에 특이적 억제 효과를 가지는 것으로 기재되었더라도, 이러한 억제는 이전에 특히 생체내에서 종양 진행을 지연시키거나 중단시키는 것으로 기재되지는 않았다. 또한, 맥관형성 메카니즘의 특이적 억제는 단독으로는 전형적으로 악성종양의 치료에 임상적으로 사용하지는 않았다.
악성종양의 치료를 위해 가장 임상적으로 이용 가능한 접근법은 증식하고 있는 세포를 활성적으로 사멸시키기 위해 화학요법 또는 방사능 치료법과 같은 세포독성 치료법에 초점을 맞춘다. 불행하게도, 이와 같은 치료법은 비암세포에 매우 독성이기 때문에, 골수 억제, 모발 감손 및 위장 장애와 같은 심각한 부작용을 유발한다. 특히, 이러한 치료법은 활성적으로 증식하는 모든 세포를 간단하게 사멸시키지만 종양 세포에서 특이적으로 아포프토시스를 유도할 수 없다. 그러나, 아포프토시스의 특이적 유도는 무차별적으로 세포 독성을 일으키지 않으면서 암세포를 선택적으로 사멸시키는 중요한 메카니즘임이 분명하다. 따라서, 명백하게 아포프토시스를 유발하는 약물은 악성종양의 치료에 매우 매우 유용할 것이다.
원발성 종양 성장, 종양 진행 및 전이의 억제를 포함한, 악성종양의 치료는 종양 성장 및 전이에 필요한 다수의 상이한 메카니즘을 억제하거나 달리 영향을 미침으로써 잠재적으로 작용할 수 있다. 이들 메카니즘은 상기한 바와 같이, 맥관형성, 콜라겐 침착 및 정상적인 아포프토시스의 부재를 포함한다. 불행하게도, 악성종양에 대한 현재 이용 가능한 치료법은 이들 메카니즘 중 하나의 억제보다는 세포독성에 초점을 맞추고 있다. 물론, 현재 이용 가능한 치료법 중 어느 것도 이들 메카니즘 모두를 억제할 수는 없다.
따라서, 실질적으로 다른 생리학적 과정에 부작용을 주지 않으면서, 특히 생체내에서 유효하며, 맥관형성을 억제할 수 있는 종양 성장, 진행 및 전이의 억제제가 광범위하게 인지된 절실한 의학적 요구가 존재한다.
발명의 요약
예상외로, 본 발명에 이르러, 아래 실시예에서 언급한 바와 같이, 할로퓨기논은 또한 생체내에서 종양 진행을 지연시키거나 중단시킬 수 있음을 밝혀내었다. 특정 가설에 제한되지 않길 바라면서, 할로퓨기논은 다수의 상이한 메카니즘을 통하여 작용할 수 있다. 예를 들면, 할로퓨기논은 맥관형성을 억제하고, ECM 침착을 차단하고, 콜라게나제 IV형 활성을 억제하고, 아포프토시스를 유도하거나 H19 유전자 발현을 억제함으로써, 또는 가능하게는 이들 메카니즘의 조합을 통해 작용할 수 있으나, 또 다른 메카니즘(들)이 원인이될 수도 있다. 그러나, 단일 메카니즘에 한정되는 것도 바람직하지 않으며, 아래에 기재한 생체내 데이타가 생체내에서의 종양 진행의 억제제로서의 할로퓨기논의 효능을 명백하게 입증하기 때문에 단일 메카니즘에 한정시킬 필요도 없다.
본 발명의 양태에 따라, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 종양 치료용 조성물을 제공한다.화학식 I
위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,
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R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R2는 하이드록시, 아세톡시 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R3은 수소 및 저급 알켄옥시로 이루어진 그룹의 일원이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 혈관신생을 실질적으로 억제하는 조성물을 제공한다.화학식 I
위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,
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R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R2는 하이드록시, 아세톡시 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R3은 수소 및 저급 알켄옥시로 이루어진 그룹의 일원이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 종양 세포의 아포프토시스 유도용 조성물을 제공한다.화학식 I
위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,
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R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R2는 하이드록시, 아세톡시 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R3은 수소 및 저급 알켄옥시로 이루어진 그룹의 일원이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체에 도입시키는 단계를 포함하여, 종양 치료용 약물을 제조하는 방법을 제공한다.화학식 I
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R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
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R3은 수소 및 저급 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체에 도입시키는 단계를 포함하여, 혈관신생을 실질적으로 억제하기 위한 약물을 제조하는 방법을 제공한다.화학식 I
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R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R2는 하이드록시, 아세톡시 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R3은 수소 및 저급 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체에 도입시키는 단계를 포함하여, 종양 세포내에서 아포프토시스를 유도하는 약물을 제조하는 방법을 제공한다.화학식 I
위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,
삭제
R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R2는 하이드록시, 아세톡시 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R3은 수소 및 저급 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물을 포함하는, 세포외 매트릭스의 침착에 의한 세포 증식 억제용 조성물을 제공한다.화학식 I
위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,
삭제
R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R2는 하이드록시, 아세톡시 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R3은 수소 및 저급 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 세포 이동 억제용 조성물을 제공한다.화학식 I
위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,
삭제
R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R2는 하이드록시, 아세톡시 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R3은 수소 및 저급 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 전이 억제용 조성물을 제공한다.화학식 I
위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,
삭제
R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, 저급 알킬, 페닐 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R2는 하이드록시, 아세톡시 및 저급 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,
R3은 수소 및 저급 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
상기 모든 양태의 경우, 바람직하게는 상기 화합물은 할로퓨기논이다. 또한 바람직하게는, 상기 종양은 유방암, 폐암, 방광암, 횡문근육종, 혈관육종, 결장 샘암종, 전립선 샘암종, 췌장 샘암종, 자궁 경부의 편평세포암종, 난소암, 악성 섬유성 조직구종, 피부암, 평활근육종, 별아교세포종, 신경아교종 및 간세포 암종으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 유방암은 유방의 침윤성 맥관 암종이다. 선택적으로 및 보다 바람직하게는, 상기 방광암은 방광 암종이다. 또한, 선택적으로 및 보다 바람직하게는, 상기 피부암은 악성 흑생종이다.
이하, 용어 "할로퓨기논"은 하기 화학식의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염으로서 정의한다.
조성물은 바람직하게는 화합물에 대해 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
바람직하게는, 상기에서 언급한 모든 화합물은 화학식으로 기재된 화합물 자체 및/또는 약제학적으로 허용되는 이의 염일 수 있다.
본 발명은 본원에서 첨부되는 도면을 단지 참고로 하여 예로써 설명한다.
도 1A 내지 도 1L은 할로퓨기논에 의한, 마우스 또는 래트에서의 7가지 상이한 모델의 암종에서 5가지 상이한 종양의 생체내 종양 성장의 억제를 나타낸 것이다.
도 2A 및 도 2B는 할로퓨기논이 3H-티미딘 혼입 및 사람 평활근육종 종양 세포 증식에 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 3은 할로퓨기논 존재하의 T50 방광 암종 세포 배양물내에서의 Ⅳ형 콜라게나제의 활성의 용량-의존성 억제를 나타낸 것이다.
도 4는 할로퓨기논에 의한 RT112 및 5376 방광 암종 세포 주에서의 H19 유전자의 발현의 억제를 나타낸 것이다.
도 5A 및 도 5B는 할로퓨기논의 투여 후 방광 종양 주변으로부터 유도된 부분에서의 아포프토시스 유도를 나타낸 것이다.
도 6A 내지 도 6D는 할로퓨기논 투여 후 종양의 중앙으로부터 취한 부분에서의 아포프토시스의 유도를 나타낸 것이다.
도 7A 내지 도 7D는 할로퓨기논에 의한 종양 세포 증식의 억제를 나타낸 것이다.
도 8A 및 8B는 소 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 부재 또는 존재하에서의 배양물에 유지된 소 대동맥 내피세포(BAEC)로의 3H-티미딘 혼입시의 할로퓨기논의 효과를 도시한 것이다.
도 9A 및 9B는 소 대동맥 내피세포의 모세관형 망상 조직으로의 조직화에 미치는 할로퓨기논의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 10A 및 10B는 I형 콜라겐 겔내에 삽입된 래트 대동맥륜으로부터 미소혈관 형성에 미치는 할로퓨기논의 억제 효과를 그림으로 나타낸 것이다.
도 11은 도 10A 및 10B의 래트 대동맥륜에 삽입된 콜라겐 I형을 사용한, 미소혈관 형성에 미치는 할로퓨기논의 억제 효과의 용량-반응 곡선이다.
도 12는 할로퓨기논의 억제 효과의 가역성을 도시한 것이다.
도 13은 소 각막 내피 세포에 의한 내피하의 ECM으로의 설페이트 혼입에 미치는 할로퓨기논의 영향을 도시한 것이다.
도 14A 내지 14D는 소 각막 내피세포에 의한 ECM으로의 설페이트, 프롤린, 라이신 및 글리신의 혼입에 미치는 할로퓨기논의 영향을 비교한 것이다.
도 15A 내지 15D는 래트 맥관막 세포의 ECM으로의 설페이트 및 글리신의 혼입에 미치는 할로퓨기논의 영향을 도시한 것이다.
도 16A 내지 16F는 마우스의 눈에서의 생체내 혈관신생에 미치는 할로퓨기논의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 17은 인테그린 αv 쇄 발현에 미치는 할로퓨기논의 영향을 나타내는 노던 블롯(Northern blot)을 나타낸 것이다.
도 18은 RT-PCR로 측정한 β 아단위 발현에 미치는 할로퓨기논의 영향을 나타낸 것이다.
발명의 간단한 설명
할로퓨기논, 및 확대 해석하여 미국 특허 제3,320,124호에서 기재되고 청구된 관련된 퀴나졸리논 유도체는 다수의 별개의 억제 메카니즘[이하, "판스타시스(panstasis)"라 칭함]을 통해 종양 성장, 진행 및 전이를 억제한다. 이들 메카니즘은 맥관형성 억제, ECM 침착 방지, 콜라게나제 Ⅳ형 활성 억제, 인테그린 발현 억제, 아포프토시스 유도 및 H19 유전자 발현 억제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
이들 메카니즘의 특정 국면과 관련하여, 맥관형성 및 ECM 침착은 이미 언급하였다. 콜라게나제 Ⅳ형은 전이 및 세포 침투에 관련된 중추 메탈로프로테아제 효소이다. 아포프토시스는 예정된 세포 사멸이고, 이는 이미 언급한 바와 같이 악성종양 세포내에서 차단되어서, "불멸"로서도 정의한다. H19 유전자는 방광 암종의 초기 단계에 관련된 종양 표식 유전자이다. 보다 구체적으로, H19 유전자는 조직 분화가 발생할 경우, 태아 발생 동안 발현이 절정에 이르는 발생적으로 조절된 유전자이다. H19를 함유하는 영역내의 염색체 이상은 빌름스 종양, 부신피질 암종, 간아세포종, 횡문근육종, 폐 종양, 영양막 종양 및 방광 암종과 같은 악성종양의 초기 단계와 관련된다[참조: B. Tycko, Am. J. Path., Vol. 144, p. 431-439, 1994; de Groot, N. et al., Trophoblast Res., Vol. 8, p. 2285-2302, 1994; Rachmilewitz, J. et al., Oncogene, Vol. 11, p. 863-870, 1995].
판스타시스의 중요성은 할로퓨기논의 작용 메카니즘이 활성적으로 세포독성이지 않으면서 다수의 상이한 세포증식억제 활성을 포함한다는 것이다. 이러한 세포증식억제 활성은 약물 내성을 유도하지 않고, 비암세포에 영향을 미쳐 부작용을 유발할 가능성이 적다. 따라서, 할로퓨기논은 활성적으로 세포독성인 암에 대한 현재 이용 가능한 치료제와 구분지을 수 있다.
바람직한 양태의 기술
예상외로, 본 발명에 이르러, 아래 실시예에 언급한 바와 같이, 할로퓨기논은 생체내에서 종양의 진행을 지연시키거나 중단시킨다는 것을 밝혀내었다. 특정한 메카니즘에 관계 없이, 아래에 기재한 데이터는 종양의 진행을 억제시키는데 있어서 생체내에서의 할로퓨기논의 효능을 입증한다.
이러한 발견은 3가지 이유에서 예상외이다. 첫째, 시험관내에서의 할로퓨기논의 거동은 생체내에서 할로퓨기논의 상응하는 거동과 정확하게 일치하지 않는다. 이는 시험관내 및 생체내에서 골 연골세포에서 관찰된 할로퓨기논의 차별적인 효과에 의해 입증될 수 있다. 할로퓨기논은 미국 특허 제5,449,678호에서 입증된 바와 같이, 시험관내에서 연골세포내에서의 콜라겐 I형의 합성을 억제한다. 그러나, 할로퓨기논으로 처리한 병아리에서는 골 파괴 속도가 증가되었다는 보고가 없는데, 이는 생체내에서는 효과가 나타나지 않는다는 것을 지시하였다. 따라서, 생체내에서 할로퓨기논의 정확한 거동은 시험관내 연구로부터 항상 예측될 수 있는 것은 아니다.
둘째, 할로퓨기논에 의한 세포 증식의 억제의 단지 기존의 공지된 예는 맥관 손상에 반응하여 표현형적으로 변형되는 평활근 세포, 또는 3T3 섬유아세포를 포함하였다[참조: 국제 공개특허공보 제96/06616호 및 Choi et al., Arch. Surg., Vol. 130, p. 257-261 (1995)]. 이들 세포는 조직화하지 않으면서 간단하게 증식되었다. 대조적으로, 맥관형성은 매우 조직화된 맥관 구조의 형성을 포함한다. 따라서, 할로퓨기논이 이와 같은 맥관형성을 억제할 수 있다는 발견은 신규하고 진보성이 있는 것이다.
또한, 아래에 기재된 실시예는 할로퓨기논이 또한 생체내 및 시험관내에서 세포외 매크릭스의 침착에 의해 가능한 세포 증식 억제에 유효하다는 것을 명백하게 입증한다. 콜라겐 침착의 특이적 억제는 이전에, 특히 생체내에서 입증된 바 없다.
또한, 본원에 기재된 데이터는 할로퓨기논이 IV형 콜라게나제 활성, 종양 표식 유전자 발현 및 인테그린 발현에 대한 효과적인 억제제라는 것을 입증한다. 이 데이터는 할로퓨기논은 종양 세포의 아포프토시스를 유도할 수 있음을 또한 입증한다. 할로퓨기논의 이러한 효과는 이전에는 입증된 바 없다.
따라서, 선행 기술분야에서 할로퓨기논이 생체내에서 악성종양을 치료하는 데 유용할 것으로 기재되거나 언급된 바가 전혀 없다. 또한, 종양 진행을 지연시키거나 중단시키고, 세포외 매트릭스의 침착에 의해 가능한 세포 증식을 억제하고, IV형 콜라게나제 활성을 억제하고, 인테그린 발현을 억제하며, 아포프토시스를 유도하는 할로퓨기논 및 이와 관련된 화합물의 능력은 신규하고 진보성이 있는 것이다. 생체내에서의 능력의 입증은 특히 예상외이며, 할로퓨기논에 대한 시험관내 및 생체내에서 나타나는 차별적 반응을 제공한다.
본 발명을 다음 도면 및 실시예에서 특정의 바람직한 양태와 관련하여 언급하여 이의 국면을 보다 완전히 이해하고 평가할 수 있도록 하고자 하지만, 본 발명을 이들 특정 양태로 제한하고자 하는 것은 아니다. 한편, 모든 변화, 수정 및 등가물은 첨부된 청구의 범위에 의해 정의한 바와 같은 본 발명의 범위내에 포함된다. 따라서, 바람직한 양태를 포함하는 다음 도면 및 실시예는 본 발명의 수행을 예시하는 작용을 하며, 세목은 예로써 본 발명의 바람직한 양태의 예식적인 토론의 목적을 위해 기재된 것이고, 이는 가장 유용하고 용이하게 이해되는 제형화 과정의 설명 뿐만 아니라 본 발명의 원리 및 개념적 국면의 설명으로 간주될 목적을 위해 기재되는 것이다.
본 발명은 다음 예시적인 실시예 및 도면을 참고로 하면 보다 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 할로퓨기논을 배타적으로 언급하고 있지만, 전문이 참고문헌에 의해 본원에 인용된 미국 특허 제3,320,124호에 기재되고 청구된 다른 퀴나졸리논 유도체도 유사한 특성을 갖는 것으로 간주된다는 것을 주의하여야 한다.
실시예 1
할로퓨기논에 의한 마우스 또는 래트에서의 생체내 종양 성장 억제
마우스, 래트 및 사람 공급원의 5가지 상이한 유형의 종양 성장 억제를 마우스의 3가지 상이한 균주, C3H, DC1-nu 무흉선 및 C57BL/6 마우스, 및 래트의 피셔 균주내에서 생체내 조사하였다. T50 방광 암종을 C3H 마우스에 투여하였다. 또한, 이들 마우스의 음료수에 N-부틸-N-4 하이드록시부틸 니트로사민을 첨가하여, 방광 암종을 C3H 마우스에서 동일계내에 유도하였다. C57BL/6 마우스에 EHS 육종 세포를 접종하였다. 누드 마우스에 MCF-7 유방 암종의 공격성 변이체인 MDA435, 또는 흑색종을 접종하였다. 피셔 래트에는 뇌에 1 X 105개의 악성 섬유성 조직구종 세포의 현탁액을 입체전술적으로 주사하였다. 예상외로, 할로퓨기논은 이러한 생체내 모델에서 종양 성장 및 진행에 상당한 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다.
할로퓨기논에 의한 T50 방광 암종의 억제
C3H 마우스에 T50 방광 암종 세포를 접종시키는 첫 번째 실험을 위해, C3H 마우스를 각각 6마리로 구성된 2개의 그룹으로 나누었다. T50 방광 암종 세포를 주사하기 3일전 주사 후 2주 동안 할로퓨기논을 10㎎/㎏ 또는 5㎎/㎏ 함유하는 규정식을 실험 그룹에 제공하였다. 화학적으로 유도된 MBT2 마우스 방광 암종의 보다 공격적인 변이체인 배양된 T50 세포를 트립신/EDTA를 사용하여 성장 배지내에서 단일 세포 현탁액(106 세포/㎖)으로 해리하고, 마우스 등쪽의 2개의 위치에 피하 접종시켰다. 우측에는 0.4 X 105개의 세포를 제공하고, 좌측에는 2 X 105개의 세포를 제공하였다. 종양 크기는 수학식 V=LW2/2(여기서, V는 용적이고, L은 길이이고, W는 폭이다)를 이용하여 2방향으로 종양 길이를 측정함으로써 추정하였다. 17일째에 실험을 종료하여, 마우스의 체중을 재고, 종양을 절제하여, 종양 조직 샘플을 고정시키고, 조직학적 검사를 수행하였다. 실험의 정량적 결과는 도 1A 및 1B에 기재하고, 5㎎/㎏의 용량에 대해서는 표 1에 기재한다. 대표적인 방광 암종을 갖는 마우스를 할로퓨기논으로 미처리한 경우(상단) 및 처리한 경우(하단)의 사진을 도 1I에 나타내었다. 대표적인 종양은 5㎎/㎏ 및 10㎎/㎏의 용량에 대해 도 1C에 나타내었다. 표 2는 할로퓨기논의 5㎎/㎏ 용량과 10㎎/㎏의 용량을 비교한 것이다.
도 1A 및 1B에 도시한 바와 같이, 5㎎/㎏의 할로퓨기논을 공급한 C3H 마우스에서의 T50 종양 크기는 규정식으로 유지된 대조군 마우스의 종양 크기와 비교하여 약 70 내지 80% 정도 상당히 감소되었다. 할로퓨기논의 항종양 효과는 대조군 마우스의 경우 5.0±3.07㎤의 용적 및 할로퓨기논 함유 규정식의 경우 1.0±0.92㎤의 용적을 갖는 높은 종양 세포 용량, 및 대조군 마우스의 경우 1.63±0.98㎤의 용적 및 할로퓨기논을 공급받은 마우스의 경우 0.29±0.28㎤의 용적을 갖는 낮은 종양 세포 용량 둘 다에서 관찰되었다. 또한, 할로퓨기논 처리된 C3H 마우스의 전체에 걸친 체중(24±3.1g)은 보다 낮은 종양의 무게로 인해, 미처리된 마우스(40±3.8g)보다 낮았다. 할로퓨기논 5㎎/㎏의 경우, 모든 마우스에 대한 데이터를 표 1에 기재한다.
| - 할로퓨기논 | + 할로퓨기논 | |||
| 샘플 번호 | 0.4 X 105개의 세포 | 2 X 105개의 세포 | 0.4 X 105개의 세포 | 2 X 105개의 세포 |
| 1 | 2.6 | 4.3 | 0.036 | 0.7 |
| 2 | 2.7 | 10.1 | 0.064 | 0.1 |
| 3 | 0.4 | 6.1 | 0.150 | 1.1 |
| 4 | 1.0 | 6.6 | 0.730 | 2.0 |
| 5 | 0.9 | 0.7 | 0.510 | 1.1 |
| 6 | 2.2 | 2.2 | NA | NA |
표 2 및 도 1C에 기재한 바와 같이, 할로퓨기논을 규정식 중 10㎎/㎏의 용량으로 투여할 경우에 억제 효과가 보다 컸다.
| -할로퓨기논(비교용) | +할로퓨기논(10㎎/㎏) | +할로퓨기논(5㎎/㎏) | |||
| 0.4 X 105개의 세포 | 2 X 105개의세포 | 0.4 X 105개의 세포 | 2 X 105개의세포 | 0.4 X 105개의 세포 | 2 X 105개의세포 |
| 1.430 ±0.705 | 2.620 ±0.344 | 0.019 ±0.016 | 0.244 ±0.47 | 0.843 ±0.346 | 1.733 ±0.720 |
종양을 절제하여 무게를 잴 경우, 유사한 결과를 수득하였다. 이 결과는 악성종양에 대한 할로퓨기논 효과의 용량-의존성을 명백하게 예시한다.
이어서, 할로퓨기논이 종양의 성장 및 진행을 억제할 수 있는지를 측정하기 위해, 원발성 T50 방광 암종 종양의 접종 후 할로퓨기논을 투여하였다. 이 목적을 위해, 1 X 105개의 T50 방광 암종 세포를 피하 주사하고, 종양이 발현되어 직경이 약 0.3㎝의 크기로 될 때까지(대략 8 내지 10일 정도 소요됨) 마우스에게 규정식을 제공하였다. 이어서, 할로퓨기논 5㎎/㎏을 함유하는 규정식을 마우스에게 제공하고, 종양 접종 후 18일 및 24일째에 종양의 크기를 측정하였다. 도 1D 및 1E에서 입증된 바와 같이, 종양 세포 주사 후 8 내지 10일째에 할로퓨기논을 제공하더라도 종양 성장은 할로퓨기논에 의해 억제되었다. 사실, 상기 그룹에서의 종양 성장의 억제율은 종양 세포 접종 2일 전에 할로퓨기논을 제공할 경우 수득되는 억제율과 유사하였다(각각 0.99±0.55㎤ 및 0.59±0.43㎤, n=8). 미처리된 그룹에서의 종양 크기는 4.78±1.87㎤이었다(도 1E).
또한, 종양 세포 주사한 날 시작하여 매일 마우스 1마리당 할로퓨기논을 1㎍의 양으로 복강내 주사하였다. 종양 성장의 충분한 억제는 18일째에 수득되는 반면(처리된 마우스:대조군 마우스 = 0.55±0.28㎤:2.09±0.85㎤, n=8)(도 1D), 24일째에는 종양 크기가 단지 약 50% 정도만 감소되었다(도 1E). 종양 세포 접종 후 27일째에 실험을 종료하였다. 이때, 각각 경구 또는 복강내로 제공한 할로퓨기논으로 처리된 마우스의 생존율이 각각 63% 및 71%인 것과 비교하여 미처리 대조군 마우스의 생존율은 단지 25%이었다. 종양 발현 후 시작한 규정식내에 제공한 할로퓨기논의 생존 효과는 그다지 현저하지 않다(상기 마우스 생존율은 단지 38%).
할로퓨기논에 의한 동일계내에서의 방광 암 억제
방광 암종을 동일계에서 C3H 마우스내에 유도시키는 두 번째 실험에서, C3H 마우스를 각각 6마리로 구성된 2개의 그룹으로 나누었다. 2그룹에서 이들의 음료수에 0.05% BHBN(N-부틸-N-4 하이드록시부틸 니트로사민)을 제공하여 암종을 유도함으로써, 사람에서의 방광암의 발현과 유사하게 하였다. 실험 그룹의 마우스에게는 할로퓨기논 5㎎/㎏을 함유하는 규정식을 제공하는 반면, 대조군(n=6)에게는 0.05% BHBN을 제공하고 정규식을 공급하였다. 26주 후에, 마우스의 체중을 재고, 종양을 절제하여, 종양 조직의 샘플을 고정시키고, 조직학적 검사를 수행하였다. 실험 결과는 도 1F 및 1G에 나타내었다.
종양 크기의 차이는 헤마토크실린 및 에오신으로 염색한 조직학적 부분으로 입증되고, 이는 도 1Fa(대조군 마우스) 및 1Fb(할로퓨기논 처리된 마우스)에 나타내었다. 대조군에서, 방광 종양 진행의 모든 특징적 단계(형성 장애, 동일계내의 암종, 침윤성 암종)가 상피층, 기저막 및 방광 막낭을 통한 종양 세포의 대량 침윤과 함께 모든 마우스에게서 관찰되었다(도 1G, A1 및 A2). 대조적으로, 할로퓨기논으로 처리된 마우스에서는 종양발생의 첫 단계(즉, 형성 장애)만 관찰되었다. 기저막을 통한 국소적 세포 침윤은 방광 막낭의 침투 없이 유일한 경우로 나타났다(도 1G, B1 및 B2). 26주 동안에 할로퓨기논으로 처리된 마우스의 체중은 대조군으로부터의 마우스 체중보다 20 내지 30% 낮았는데, 이는 아마도 대조군에서의 종양 자체의 과잉 무게때문일 것이다.
할로퓨기논에 의한 EHS 종양 억제
세 번째 실험으로서, C57BL/6 마우스에 엥겔브레스-홀름-스왐(Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)) 종양을 접종하였다. 실험방법은 다음과 같았다. 첫째, EHS 종양을 갖는 다른 동물은 폐사시키고, 종양 조직을 절제하여, 멸균 상태에서 잘게 썰었다. EHS 종양은 상당량의 기저막 성분을 특징으로 한다. PBS 0.2㎖ 중의 종양 조직 현탁액을 C57BL/6 수컷 마우스의 등쪽 후부에 피하 주사하였다. 마우스를 각각 10마리로 구성된 2개의 그룹으로 나누었다. 실험 그룹의 동물에게는 종양 주사 3일 전 및 주사 후 3주 동안 할로퓨기논 5㎎/㎏을 함유하는 규정식을 제공하였다. 종양 크기는 수학식 V=LW2/2를 사용하여, 2방향으로 종양의 길이를 측정함으로써 추정하였다. 실험 마지막 날, 즉, 종양 주사한지 20일 후에, 마우스의 체중을 재고, 종양을 절제하여, 종양 조직 샘플을 고정시키고, 조직학적 검사를 수행하였다. 실험의 정량적 결과는 도 1H 및 표 3에 기재하였다.
할로퓨기논을 공급한 C57BL/6 마우스의 종양 크기(1.72±1.85㎤)는 도 1H에 기재된 바와 같이 대조군 마우스의 종양 크기(8.15±4.88㎤)와 비교하여 약 75% 정도 감소하였다. 할로퓨기논을 공급받은 마우스는 거의 정상적인 체중(19.7±0.47g)이나 이와 반대로 대조군 마우스는 종양의 무게로 인하여 체중이 약 1.6배(33.3±2.49g) 높아진 것으로 할로퓨기논의 항종양 효과가 반영된다. 모든 마우스에 대한 데이터는 표 3에 기재하였다.
| 샘플번호 | -할로퓨기논 | +할로퓨기논 |
| 1 | 12.6 | 1.3 |
| 2 | 5.8 | 1.2 |
| 3 | 3.2 | 1.3 |
| 4 | 12.6 | 1.7 |
| 5 | 4.9 | 0 |
| 6 | 6.8 | 0 |
| 7 | 4.9 | 2.2 |
| 8 | 18.9 | 0.04 |
| 9 | 2.8 | 6.5 |
| 10 | 9.0 | 3.0 |
할로퓨기논에 의한 유방 암종의 억제
네 번째 실험으로서, 매우 공격적인 사람 유방 암종 세포(MDA435, 비전이성 MCF-7 유방 암종 세포주의 공격성 변이체)를 누드 마우스에 마우스 1마리당 1×106개의 종양 세포 피하내 접종하였다. 연구 그룹(n=4)에는 규정식으로 할로퓨기논 5㎎/㎏을 제공하고, 대조군(n=4)에는 정규식을 제공하였다. 육안으로 볼 수 있는 종양이 4 내지 5주내에 발현되면, 15주 후에 마우스를 폐사시키고 종양을 절제하여, 체중을 측정하였다. 각각의 그룹내에 변화도가 매우 큼에도 불구하고, 할로퓨기논으로 처리된 마우스에서 종양 무게(0.14±0.11g)는 미처리된 대조군의 마우스의 종양 무게(0.65±0.45g)와 비교하여 유의하게(p < 0.024) 감소되었다.
또 다른 실험에서, 이틀에 1회 마우스 1마리당 약 1㎍의 양으로 할로퓨기논을 복강내 투여하였다. 이 실험에서, CD1-nu 무흉선 암컷 마우스에는 에스트로겐-의존성 비전이 모(parental) MCF-7 사람 유방 암종 세포주를 주사하였다. 세포를 1 X 107개의 세포/0.5㎖의 농도로 마우스의 유방에 주입하였다. 모든 동물에는 17β-에스트라디올[0.72㎎/펠렛, 60일 방출; 이노베이션 리서치 오브 아메리카(Innovation Research of America)]의 서방형 펠렛을 주입하였다. 대조군 마우스의 종양의 평균 크기가 약 1㎤로 될 경우(주입한지 약 10주 후), 종양을 절제하였다(도 1J). 대조군 마우스 및 경구 할로퓨기논 처리된 마우스의 외형을 도 1K에 사진으로 나타내었다.
할로퓨기논에 의한 흑색종 종양의 억제
다섯 번째 실험으로서, 누드 마우스에 흑색종 종양을 접종하였다. 실험방법은 다음과 같았다. 우선, 106개의 종양 세포의 현탁액을 누드 마우스의 등쪽 후부에 피하 주사하였다. 마우스는 각각 5마리로 구성된 2개의 그룹으로 나누었다. 실험 그룹의 동물에는 2일에 1회 마우스 1마리당 할로퓨기논 1㎍을 종양 접종 1주일전부터 시작하여 접종 후 4주 동안 복강내 주사하였다. 대조군 마우스에는 염수를 주사하였다. 결과는 도 1L에 사진으로 나타내었다.
대조군의 모든 마우스(-H)에서 흑색 표면의 큰 흑색종 종양이 관찰되었다. 할로퓨기논으로 처리된 그룹(+H)에서는, 모든 마우스는 상당히 작은 종양을 가지며, 이는 흑색 표면의 흑색종 종양 단계에 도달하지 않았다. 따라서, 할로퓨기논을 제공받지 않은 대조군 마우스와 비교하여, 할로퓨기논으로 처리한 마우스에서 종양 성장이 상당히 억제되었다.
할로퓨기논에 의한 뇌 종양 억제
여섯 번째 실험으로서, 피셔 래트에게 뇌 종양을 접종하였다. 할로퓨기논은 분자량이 낮고, 소수성이기 때문에, 이들 분자는 혈액뇌장벽(BBB)을 침투할 것으로 예상되는데, 이와 같은 예상은 실험 결과에 의해 입증되었다. BBB는 화학요법의 개시를 손상시킨다는 걱정에도 불구하고, 상기 관문은 악성 병소 위치에서 선택적으로 파괴되어, 종양은 인접한 정상 뇌보다 전신 투여된 화학요법의 보다 높은 용량을 제공받을 것이다. 그러나, 동물 및 사람 둘 다에서 실시한 연구에서, 대부분 제제는 아마도 뇌로의 전이에 대한 것보다는 전신 종양에 대해 보다 유효하다. 이는 아마도 화합물의 뇌 종양으로의 부적절하고 느린 유입, 감소된 혈류의 결과, 부종 형성으로 인해 증가된 간질 압력 및 증가된 두개골내의 압력에 관련될 것이다.
시험한 뇌 종양은 메틸콜안트렌으로 유도된 악성 섬유성 조직구종의 선별되지 않은 래트 종양 주이며, 연속적인 피하 이식으로 동계의 피셔 래트에서 유지되었다. 입체전술적 뇌 접종을 위해, 종양 세포 현탁액을 소형 동물 입체전술적 장치를 사용하여, 성장한 암컷 피셔 래트(체중 180 내지 200g)의 우측 뇌반구로 접종하였다. 정수리점을 기준점으로 하여, 입체전술적 좌표는 P=3.5; L=2; H=-4㎜이었다. 머리를 수평하게 두고, 2㎕의 용적으로 주사하였다. 래트 1마리당 주사되는 종양 세포의 수는 105개이었다.
10마리 래트에 종양 세포 접종하기 2일전부터 시작하여 할로퓨기논(16㎍/래트)을 복강내로 매일 주사하였다. 접종한지 4일째에 시작하여, 할로퓨기논을 복강내 주사하는 대신에 규정식을 통하여 5㎎/㎏씩 제공하였다. 대조군 동물에는 염수를 복강내로 주사하고, 규정식을 공급하였다. 종양 세포의 입체전술적으로 주사한지 9, 11, 13 및 15일째, 각각의 그룹의 2마리의 동물에게 펜토바르비탈을 과다복용시켜 폐사시켰다. 육안으로 볼 수 있는 종양의 무게를 재고, 뇌를 신속하게 제거하여, 커팅 챔버에서, 두정부를 3㎜ 두께로 절단하였다. 육안으로 볼 수 있는 종양 무게를 재고, 3차원으로 측정하였다. 각각의 그룹의 2마리 동물의 종양을 병리학적 조사를 위해 처리한다.
미처리 대조군 동물과 비교하여, 할로퓨기논으로 처리한 각각의 래트에서의 종양 크기가 매우 상당히 감소하였다는 것을 볼 수 있다. 사실, 10마리의 전체 대조군 동물은 80mm3(9일째) 내지 260mm3(13일째) 크기의 종양을 가지는 것에 비해, 할로퓨기논으로 처리한 8마리의 래트 중 4마리에서는 거의 종양을 육안으로 확인할 수 없었다(1 내지 8mm3)(표 4). 또한, 생존한 처리된 래트와 비교하여, 15일 동안 미처리된 2마리의 래트의 사망으로 할로퓨기논의 항종양 효과가 반영되었다.
| 일 | -할로퓨기논 | +할로퓨기논 |
| 9 | 90 | 1 |
| 81 | 42 | |
| 11 | 154 | 1 |
| 210 | 81 | |
| 13 | 260 | 8 |
| 260 | 375 | |
| 15 | 사망 | 0 |
| 사망 | 315 |
래트 및 마우스 모두에서 실시한 이와 같은 6가지의 별개의 실험으로, 할로퓨기논은 방광 암종, 유방암, 흑색종, EHS 육종, 뇌 종양을 포함한 각종 악성종양에 대해 생체내에서의 종양 성장 및 진행을 억제할 수 있음을 알 수 있다. 뇌 종양의 성장 및 진행을 억제하는 할로퓨기논의 능력이 특히 흥미로운 것은, 혈액뇌장벽이 다수의 항-신생물성 약물의 뇌로의 침투를 제한하고 있기 때문이다. 마우스에서의 동일계내 방광암 실험을 위해 26주 정도의 상대적으로 긴 기간 동안 할로퓨기논을 투여하여도 사망률이 증가되지는 않았다. 따라서, 할로퓨기논은 각종 암을 치료하는 데 효과적이고 안전하며, 이러한 결과는 선행 기술분야에서 기재되거나 제안된 바가 없었다.
실시예 2
사람 평활근육종 종양 세포의 증식에 대한 할로퓨기논의 영향
사람 평활근육종 종양 세포의 증식에 대한 할로퓨기논의 영향을 조사하였다. 평활근육종 종양에는 세포외 매트릭스가 풍부하고, 충분히 혈관화되어 있다[참조: A. Ferenczy, et al., Cancer, No. 28, pp. 1004-1018(1971)]. 이들의 성장은 정상 및 악성종양 자궁근층 세포에 의해 생산되는 성장 인자(즉, bFGF, HB-EGF)에 의존하는 것으로 기재되어 있고[참조: A. Zhang, et al., Endocrinology, No. 134, pp. 1089-1094 (1994); R.S. Mangrulker, et al, Biology of Reproduction, No. 53, pp. 636-646 (1995)], 주변 ECM에 국소적으로 삽입되어 있다[참조: I. Vlodavsky, et al., Basement Membranes: Cellular and Molecular Aspects, D.H. Rohrbach and R. Timpl, Eds., 미국 플로리다주 올란도에 소재하는 아카데믹 프레스, 인코포레이티드(Academic Press, Inc.), pp. 327-343 (1993)].
문헌[참조: R.S. Mangrulker, et al., ibid.]에 기재되어 있는 바와 같이 외과적으로 자궁절개술을 받은 여성에게서 사람 평활근육종 종양 샘플을 수득하였다. 잘게 저민 조직을 20㎖의 차가운 균질화 완충액: 1M NaCl, 10mM Tris(pH 7.4), 1mM EDTA, 1mM 벤즈아미딘, 0.1% CHAPS, 0.01% 아프로티닌(Sigma), 10㎍/ml 로이펩틴, 1mM AEBSF[참조: R.S. Mangrulker, et al., ibid.]에 도입하였다. 샘플을 2분 동안 균질화시키고, 12000 x g를 4℃에서 60분 동안 원심분리하였다. 상층액은 10mM Tris(pH 7.4)로 1:5로 희석시켜 최종 용적이 100㎖로 되게 하고, 0.45㎛ 나일론 필터로 여과하였다. 세포를 도말하고, DMEM + 10% 송아지 혈청내에 유지시켰다. 세포는 계대하는 동안에 살아있도록 하나 2 또는 3회 계대한 것을 이용하였다.
증식 검정을 위해서, 세포를 200㎕의 배지[4.5g/ℓ 글루코스를 함유한 DMEM, 10% 송아지 혈청, 1% 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신]내에 10,000개의 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 도말한 다음, 융합될 때까지 2일 동안 항온처리하였다. 접종한지 24시간 후에, 할로퓨기논의 농도를 증가시켜(10 내지 100ng/㎖) 가하였다. 배지는 0.5% 송아지 혈청, 1μM 인슐린 및 5μM 트랜스페린을 함유하는 DMEM으로 교환하였다. 24시간 후에, 샘플(5 내지 10㎕)을 가하고, 추가로 24시간 후에, 각각의 웰에 [3H]티미딘(1μCi/웰)을 첨가하였다. 36 내지 48시간 동안 항온처리 후에, 세포를 메탄올로 고정시키고, DNA를 5% 트리클로로아세트산으로 침전시켰다. 세포를 0.3N NaOH의 150㎕/웰로 용해시키고, 신틸레이션 바이알로 옮기고, β-카운터로 카운팅하였다. 도 2A에서 입증된 바와 같이, 2.5ng/㎖ 할로퓨기논으로 3H-티미딘 혼입의 60 내지 70%가 억제되었다.
이어서, HB-EGF(헤파린-결합 상피 성장 인자)의 증식 및 혈청-자극된 평활근육종 세포에 미치는 할로퓨기논의 영향을 조사하였다. 평활근육종 종양 세포는 0.5% FCS를 함유하는 배지에서 48시간 동안 항온처리하여 성장을 멈추게 하였다. 이어서, 세포를 10ng/㎖ 할로퓨기논의 부재 또는 존재하에 10% FCS 또는 10ng/㎖ HB-EGF에 노출시켰다(24시간). 이어서, [3H]티미딘을 첨가하고, 36시간 후에 DNA 합성을 측정하였다. 도 2B에 도시한 바와 같이, 혈청 또는 HB-EGF에 의해 유도되는 세포 증식의 완전 억제는 할로퓨기논의 존재하에 관찰되었다.
실시예 3
할로퓨기논에 의한 콜라겐 I형 유전자 발현의 억제
동일한 환자로부터 자궁근층 및 평활근육종 세포를 채취하고, 10% FCS가 보충된 DMEM내의 10㎝ 플레이트에 도말하였다. 세포가 80% 융합에 도달하면, 배지는 48시간 동안 무혈청 DMEM + 0.1% BSA에 의해 대체하고, 세척한 후에, 동일한 배지내에서 약 48시간 동안 약 37℃에서 농도를 증가시키면서 할로퓨기논에 노출시켰다. 이어서, 세포를 수거하고, RNA 추출하고, 콜라겐 I형 유전자 발현에 대한 노던 블롯 분석에 적용하였다. 할로퓨기논은 용량-의존성 방식으로 콜라겐 I형 유전자 발현(5.4kb 및 4.8kb의 생성물)을 억제하였다.
실시예 4
시험관내에서의 할로퓨기논에 의한 IV형 콜라게나제 활성의 억제
종양 세포는 ECM을 절단하는 효소를 분비하여, 세포를 인접 조직으로 잠복시켜, 다른 조직으로 침투하도록 한다. 다수의 연구가 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP), 특히 Ⅳ형 콜라게나제를 종양 침투 및 전이의 진행에 연결지었다. Ⅳ형 콜라게나제는 독특한 mRNA에 의해 암호화된 2개의 72kDa 및 92kDa 단백질이다.
도 3에서 입증된 바와 같이, T50 방광 암종 세포 배양물내에서의 MMP2(72kDa IV형 콜라게나제)의 활성에 대한 현저한 억제는 25ng/㎖ 할로퓨기논의 존재하에 발휘되고, 거의 완전한 억제는 100ng/㎖ 할로퓨기논에서 수득되었다. 서브-융합성 세포 배양물은 무혈청 DMEM내에서 6-24시간 동안 항온처리하였다. 콜라겐분해 활성은 젤라틴 포화된(1mg/ml. Difco, Detroit, MI) SDS-PAGE 8% 겔 상에서 측정하였다. 간략하게, 배양 배지 샘플은 비환원 조건하에서 기질이 포화된 겔 상에서 분리하여, 30분간 2.5% Triton X-100(BDH, England)내에서 항온처리 하였다. 이어서, 겔은 50mM Tris, 0.2M NaCl, 5mM CaCl2, 0.02% Brij 35(중량/용적)내에서 pH 7.5에서 16시간 동안 37℃로 항온처리 하였다. 항온처리 종료 시점에서, 겔은 메탄올/아세트산/H2O(30:10:60) 중의 0.5% Coomassie G250(Bio-Rad Richmond CA)으로 염색시켰다. 컴퓨터화된 밀도계(Molecular Dynamics type 300A)를 이용하여 다양한 밴드 강도를 측정하였다.
보이덴 챔버 침투 검사(데이터는 나타내지 않음)를 이용하여 확인한 결과, 할로퓨기논은 마트리겔 ECM을 통하여 세포 침투를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 억제는 IV형 콜라게나제 억제가 상기한 바와 같이, 할로퓨기논이 세포증식 억제 활성을 통한 종양 성장, 진행 및 전이를 억제하는 판스타시스 메카니즘의 일부분으로 포함된다는 것을 지지한다.
실시예 5
시험관내에서의 할로퓨기논에 의한 종양-표식 유전자 발현의 억제
H19 유전자는 조직 분화가 일어날 경우, 태아 발생 동안 발현이 절정에 이르는 발생적으로 조절된 유전자이다. H19 유전자는 모체의 대립유전자에 의해서만 발현되는 부모로부터 인식된 것이다. H19는 또한 빌름스 종양, 부신피질 암종, 간아세포종, 횡문근육종, 폐 종양, 영양막 종양 및 방광 암종과 같은 악성 종양 초기 단계와 관련되어 있는 종양 표식 유전자이다. 실험방법은 다음과 같았다.
RT112 및 5376 사람 방광 암종 세포주는 할로퓨기논의 부재 또는 존재하에 배양하고(접종한지 24시간 또는 72시간 후에 130ng/㎖ 첨가), 노던 블롯 분석에 의해 H19 유전자의 발현을 평가하였다[참조: Nagler, A. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., Vol. 17, p. 194-202, 1997]. 할로퓨기논에 노출시킬 경우에는 도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 시험된 RT112 및 5376 방광 암종 세포주에서 H19 유전자 발현이 상당히 감소되었다. 이와 같은 결과는 실시예 1의 방광 암종에서의 할로퓨기논의 항종양 효과에 대한 생체내 연구 결과를 확인시켜 주는 것이다.
이와 같은 억제는 또한 H19 유전자 발현 억제가 상기한 바와 같이, 할로퓨기논이 세포증식 억제 활성을 통한 종양 성장, 진행 및 전이를 억제하는 판스타시스 메카니즘의 일부분으로 포함된다는 것을 지지한다.
실시예 6
생체내에서의 할로퓨기논에 의한 아포프토시스의 유도
아포프토시스 또는 예정된 세포 죽음은 악성종양 세포에 의해 제거되는 정상 세포내에서의 메카니즘에 의해 측정한다. 악성종양 세포는 아포프토시스의 부재로 인해 종종 "불멸" 세포로 정의되기도 한다. 할로퓨기논은 생체내에서 종양의 아포프토시스를 유도하는 것으로 보인다. 실험방법은 다음과 같다.
실시예 1의 마우스로부터 동일계내에서 유도된 방광 암종 종양의 주변 및 중앙 부분으로부터 조직학적 부위를 취하였다. 이어서, 이들 부위를 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT) 라벨링 기술[참조: Holmgren, L. et al., Nat. Med., Vol. 1, p. 149-153, 1995]을 이용하여 단편화된 DNA의 동일계내 라벨링에 적용시켰다. 도 5B에서 입증된 바와 같이, 미처리된 대조군 마우스로부터 유도된 종양(도 5A)과 비교할 경우, 경구 할로퓨기논(10㎎/㎏) 처리된 C3H 마우스의 방광 종양으로부터 유도된 부위에서 상당히 많은 수의 아포프토시스성 세포가 관찰되었다. 괴사를 겪은 종양의 중앙으로 유도된 조직 부위에서는 염색 정도에서 상당한 차이가 있는 것을 또한 볼 수 있다. 도 6A 및 6C에서는 미처리된 마우스의 종양을 나타내고, 6B 및 6D는 할로퓨기논으로 처리한 마우스의 종양을 보여준다. 아포프토시스는 도 5B에서 볼 수 있는 것과 같이, 생존하고 있는 세포 중앙에서의 단일 세포의 사멸을 특징으로 하는 점에서 아포프토시스는 괴사와는 상이하다. 할로퓨기논에 반응하여 관찰되는 증가된 아포프토시스 지수는 최근에 개발된 항-맥관형성 제제를 이용하여 관찰되는 바와 같은 상기한 항-맥관형성 효과로 인한 것일 수 있다.
전반적으로, 할로퓨기논을 공급받지 않은 대조군 마우스와 비교할 경우, 할로퓨기논을 투여한 마우스로부터 취한 조직 샘플에서는 약 10배 정도로 증가된 아포프토시스 지수가 관찰되었다. 이와 같은 억제는 또한 아포프토시스 유도가 상기한 바와 같이, 할로퓨기논이 세포증식 억제 활성을 통한 종양 성장, 진행 및 전이를 억제하는 판스타시스 메카니즘의 일부분으로 포함된다는 것을 지지한다.
실시예 7
할로퓨기논에 의한 세포 증식 억제
할로퓨기논의 항암 효과는 i) 콜라겐 합성 및 매트릭스 침착(기질 지지체); ii) 종양의 맥관형성; 및 iii) 종양 세포 증식의 직접적 억제에 대한 효과에 기여할 수 있다. 그러므로, 시험관내에서 유지된 T50 방광 암종 및 다른 종양 세포주의 증식에 미치는 할로퓨기논의 영향을 시험하였다. 세포를 10% FCS를 함유하는 DMEM에 접종하였다(24웰 플레이트에 16mm 웰당 2000개의 세포). 이후 24시간 동안 할로퓨기논의 농도를 증가시키면서 첨가하고, 세포를 분리시키고, 접종 후에 여러 날에서 코울터 카운터로 카운팅하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
30ng/㎖의 할로퓨기논 농도에서는 T50 방광 암종 세포의 완전한 억제를 수득하지만, 25 및 10ng/㎖에서는 거의 효과가 없거나 전혀 효과가 없었다(도 7A). 할로퓨기논의 농도를 최고 25ng/㎖로 상승시켜도 사람 흑색종(A375), 전립선(PC3) 및 유방 암종(MDA 231, MDA 435) 세포의 증식은 영향을 받지 않고, 100ng/㎖의 할로퓨기논의 존재하에서만 부분적으로 억제되었다(도 7B 및 7C). 유사하게, 사람 골수 백혈병 세포(HL60) 및 마우스 B 임파종 세포(F32)에서는 단지 낮은 할로퓨기논의 억제 효과가 존재하였다(도 7D). T50 방광 암종에서의 할로퓨기논의 항종양 효과는 매트릭스 침착, 맥관형성 및 종양 세포 증식에 미치는 복합 효과로 인한 것일 수 있다.
실시예 8
3
H -티미딘의 맥관 내피 세포로의 할로퓨기논-유도된 혼입 억제
맥관 내피 세포 배양물을 상기한 바와 같이 소 대동맥으로부터 제조하였다[참조: D, Gospodarowicz, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 73, p. 4120 (1979)]. 소 대동맥 내피 세포는 10% 송아지 혈청, 50U/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM(1g 글루코스/ℓ)에 10% CO2 가습 배양기내에서 37℃에서 도말하였다(4 x 104개의 세포/16mm 웰).
도말한지 4일 후, 서브-융합성 세포를 1ng/㎖ bFGF의 부재 또는 존재하에 농도를 증가시키면서(25 내지 500ng/㎖) 할로퓨기논에 노출시켰다. 이어서, 3H-티미딘(1μCi/웰)을 추가 48시간 동안 첨가하고, 트리클로로아세트산 불용성 물질에 혼입된 방사능활성을 측정함으로써 DNA 합성을 검정하였다[참조: M. Benezra, et al., Cancer Res., Vol. 52, pp. 5656-5662 (1992); I. Vlodavsky, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 84, pp. 2292-2296 (1987)].
도 8A는 bFGF의 부재하에 수득된 결과를 나타낸 것이고, 8B는 bFGF의 존재하에 수득된 결과를 나타낸 것이다. 도 8A 및 8B에서 입증된 바와 같이, 배양 배지에 bFGF(1ng/㎖)를 첨가하는지의 여부에 관계 없이, 100ng/㎖의 할로퓨기논으로 3H-티미딘 혼입의 50%가 억제되었다.
실시예 9
모세관형 망상 조직으로의 내피 세포의 조직화
할로퓨기논은 규정된 구조로 내피 세포가 조직화되는 것을 억제하는 것으로 밝혀졌는데, 특히 모세관형 망상 조직으로 이들 세포가 조직화되는 것을 억제하였다. 결과는 도 9A 및 9B에서 볼 수 있다.
성숙한 스프라그-돌리 래트의 꼬리 건으로부터 I형 콜라겐을 준비하였다. 간략히, 콜라겐 섬유를 멸균 1/1000(v/v) 아세트산 용액(콜라겐 1g당 300㎖)에 4℃에서 48시간 동안 서서히 교반하면서 용해시켰다. 생성된 용액을 멸균 삼중 거즈를 통하여 여과하고, 4℃에서 1시간 동안 16,000g으로 원심분리시켰다. 이어서, 상층액은 1/10 DMEM으로 광범위하게 투석시킨 다음, 4℃에서 저장하였다. 콜라겐 용액의 pH와 이온 강도를 동시에 상승시켜 콜라겐 매트릭스 겔을 수득하였다. 이를 위해, 콜라겐 용액 7용적을 10X 최소 필수 배지 1용적 및 중탄산나트륨(0.15M) 2용적과 신속하게 혼합하였다[참조: R.F. Nicosa and A. Ottinetti, Lab. Invest., Vol. 63, p.115-122 (1990)].
24웰 플레이트의 16㎜ 웰에 소 대동맥 내피세포를 접종하고, 24시간 동안 성장시켜, 서브-융합성 단층을 수득하였다. 이어서, 배양 배지를 제거하고, 상기한 냉각된 콜라겐 혼합물 0.4㎖를 세포 단층의 상부에 붓고, 37℃에서 10분 동안 중합시켰다. bFGF(1ng/㎖) 및 헤파린(1㎍/ml)을 함유하면서, 할로퓨기논 0.1㎍/ml을 함유하는 새로운 배지(0.6㎖)(도 9B) 또는 할로퓨기논을 함유하지 않는 새로운 배지(도 9A)를 각각 콜라겐이 겔화된 후에 첨가하였다. 내피 세포 단층의 재조직화를 모니터링하고, 자이쓰 역상 콘트라스트 광현미경으로 사진을 찍었다[참조: R. Monesano. et al., J. Cell Biol., vol. 97, pp. 1648-1652 (1983)].
도 9A는 모세관형 망상 조직으로의 내피 세포의 조직화를 나타낸 것이다. 이와 같은 조직화는 도 9B에서 입증되는 바와 같이 할로퓨기논에 의해 억제된다. 할로퓨기논은 콜라겐 겔로의 내피 세포의 침투 및 갈라지고 문합하여 모세관형 튜브의 망상 조직을 이루는 후속적인 조직화를 완전히 억제하였다.
실시예 10
미소혈관 형성
할로퓨기논은 래트에서 취한 대동맥 조직의 윤으로부터 미소혈관 형성을 억제하는 것으로 나타났다. 이와 같은 효과는 할로퓨기논을 제거하면 역전되는 것을 볼 수 있다. 결과는 도 10A, 10B, 11 및 12에 나타내었다.
1 내지 2개월된 SD(스프라그-돌리) 래트를 참수하여 가슴 대동맥을 수득하였다[참조: R.F. Nicosia and A. Ottinetti, Lab. Invest., Vol. 63, pp. 115-122 (1990)]. 대동맥은 즉시 PBS를 함유한 배양 접시로 이동하였다. 해부 현미경하에 대동맥 주변의 섬유-지방 조직을 조심스럽게 제거하고, 1㎜ 길이의 대동맥륜(aortic ring)을 잘라내어, PBS로 광범위하게 세정하였다.
I형 콜라겐 용액(0.2㎖)을 각각 16-mm의 웰에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 겔화시켰다. 각각의 대동맥륜을 겔의 중앙으로 이동시키고, 추가로 0.4㎖의 콜라겐 용액을 상기 윤(ring)의 상단에 조심스럽게 부었다. 겔이 형성된 후에, 0.1㎍/㎖ 할로퓨기논의 존재 또는 부재하에 0.4㎖의 무혈청 내피 성장 배지를 첨가하고, 배지는 2일에 한번씩 교환하였다.
도 10A는 10일째의 배양물을 나타내는데, 동맥의 절제 부분으로부터 새로 형성된 분지된 미소혈관이 발생되어 루프를 이루고, 망상 조직을 형성하였다. 도 10B는 2일에 한번씩 0.1㎍/ml의 할로퓨기논으로 처리된 동일한 배양물을 나타낸 것이다. 이와 같은 조건하에, 단일 세포는 대동맥륜으로부터 주변으로 이동하나, 미소혈관 튜브로의 배열을 이루지는 못하였다.
도 11은 할로퓨기논의 용량을 증가시키면서 이의 효과를 정량적으로 도시한 것이다. 100ng/㎖의 할로퓨기논에서는 거의 완전하게 미소혈관 형성이 억제되는 것으로 나타났다. 250ng/㎖의 할로퓨기논 존재하에서는 완전하게 억제되었다. 이 효과는 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이 2일째에 약물을 제거하면 역전되었다. 이러한 제거는 미처리된 대동맥륜에서 볼 수 있는 바와 유사한 미소혈관 형성을 초래하였다.
실시예 11
배양된 내피 세포의 ECM으로의 설페이트 혼입에 대한 할로퓨기논의 억제
도 13 및 하기의 다른 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 할로퓨기논은 ECM(세포외 매트릭스) 침착에 억제 효과를 갖는 것으로 보인다.
수송아지 눈에서 소 각막 내피 세포 배양물을 제조하고 상기한 바와 같이 유지시켰다[참조: D. Gospodarowicz, et al., Exp. Eye Res., No. 25, pp. 75-89 (1977)]. 세포는 10% CO2 가습 배양기내에서 37℃에서 배양하고, 실험은 초기(3-8) 세포 계대로 수행하였다.
설페이트-표지된 ECM(세포외 매트릭스)을 제조하기 위해, 각막 내피 세포를 4 내지 6시간내에 융합성 밀도를 형성하는 농도로 4-웰 플레이트에 접종시키고, 접촉 억제된 세포 단층은 상당히 밀접해 있는, 성장이 중단된 세포로 구성된다. 이와 같은 조건하에서, 할로퓨기논 농도가 2㎍/㎖가 될 때까지, 세포는 살아있고, 이들의 정상적인 단층 모양 및 형태학적 외양을 유지하였다. 접종 후 1일 및 5일째에, Na2[35S]O4(540-590mCi/mmol)를 첨가하고(40μCi/㎖), 배양물은 배지 교환 없이 항온처리 하였다. 접종 후 다양한 간격을 두고, 내피하 ECM은 0.5% Triton X-100 및 20mM NH4OH를 함유하는 PBS에 세포 층을 용해시키고(5분, 실온), PBS로 4회 세척하여 노출시켰다[참조: I. Vlodavsky, et al., Cancer Res., Vol. 43, pp. 2704-2711 (1983); I. Vlodavsky, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84 pp. 2292-2296 (1987)]. 설페이트-표지된 물질의 총량을 측정하기 위해, ECM을 트립신(25㎍/㎖, 24시간, 37℃)으로 분해하고, 용해된 물질은 β-카운터로 카운팅하였다.
도 13은 1㎍/㎖ 할로퓨기논에 의해 설페이트 혼입이 거의 완전히 억제됨을 도시한 것이다. 약물이 0.2㎍/㎖로 존재하는 경우에 50%가 억제된다(기재하지 않음).
실시예 12
설페이트, 프롤린, 라이신 및 글리신의 소 각막 내피 세포의 ECM으로의 혼입 억제
상기 실시예 11에 언급한 바와 같이 각막 내피 세포를 융합성 밀도로 접종하여 성장시켰다. 세포를 Na2 35SO4(도 14A), 3H-프롤린(도 14B), 14C-라이신(도 14C) 또는 14C-글리신(도 14D)의 존재하에 할로퓨기논의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 접종 후 8일째에, 세포 층을 실질적으로 상기 실시예 11에 언급한 바와 같이 용해시켰다. 이어서, 아래에 있는 ECM을 트립신으로 처리하여, 상기 실시예 11에 언급한 바와 같이 실질적으로 총 단백질로의 표지된 물질의 혼입에 미치는 할로퓨기논의 영향을 측정거나, 콜라게나제 및 트립신으로 연속 분해하여, 콜라게나제-분해된 단백질(CDP) 및 비콜라게나제 분해된 단백질(NCDP) 둘 다에 미치는 할로퓨기논의 영향을 측정하였다.
도 14A 내지 도 14D에서 볼 수 있는 바와 같이, 할로퓨기논은 CDP 및 NCDP로의 설페이트, 프롤린, 라이신 및 글리신의 혼입을 억제하는데, 이는 매트릭스 침착의 현저한 억제를 반영하는 것이다. 할로퓨기논의 콜라겐 이외의 다른 ECM 성분의 침착 억제 효과는 ECM의 초분자 구조로의 다른 성분들의 조합에 있어서의 콜라겐의 연관으로 인한 것으로 보인다. 또는, 할로퓨기논은 콜라겐 이외의 다른 ECM 성분의 합성에 영향을 줄 수 있는데, 이는 몇 가지 ECM 성분의 합성 및 침착에 영향을 주는 통상의 전사 인자 또는 TGFβ와 같은 사이토킨을 통하여 이루어지는 것으로 보인다.
실시예 13
설페이트 및 글리신의 래트 맥관막 세포 ECM으로의 혼입 억제
래트 맥관막 세포를 접종 후에 24시간 동안 융합시켜 성장시켰다. 이어서, 세포를 Na2 35SO4(도 15A 및 15B) 또는 14C-글리신(도 15C 및 15D)의 존재하에 할로퓨기논의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 접종 후 8일째에, 세포 층을 용해시켜, 아래에 있는 ECM을 노출시키고, 세척하고, 콜라게나제로 분해하여 CDP 단백질에 미치는 할로퓨기논의 영향을 측정한 바, 결과는 도 15A 및 도 15C에서와 같았다. 나머지 물질은 트립신으로 분해하고, β-신틸레이션 카운팅하여 NCDP 단백질에 미치는 할로퓨기논의 영향을 측정한 바, 결과는 도 15B 및 도 15D에서와 같았다.
CDP 단백질의 경우에는 설페이트 혼입이 약 30% 억제되는 것으로 나타나고, NCDP 단백질의 경우에는 할로퓨기논 200ng/㎖의 존재하에 약 70%가 억제되는 것으로 나타났다. 할로퓨기논에 의한 ECM 침착의 억제는 약물의 항증식 활성으로 인한 것이 아니라, 이는 약물이 고도로 융합된 비분열 세포에 첨가되었기 때문이었음을 직독해야 한다. 무기 설페이트는 주로 설페이트화된 글리코사미노글리칸에 혼입되고, 콜라겐으로는 혼입되지 않기 때문에, I형 콜라겐 합성을 억제함으로써, 콜라겐과 특이적으로 상호작용하여 ECM을 형성하는 것으로 공지된 헤파린 설페이트 프로테오글리칸과 같은 다른 ECM 거대분자 조합을 할로퓨기논이 방해하는 것으로 간주할 수 있다.
50ng/㎖의 할로퓨기논의 존재하에 CDP 및 NCDP 단백질 둘 다에서 글리신 혼입이 약 80% 억제되는 것을 볼 수 있다. 콜라게나제-분해된 ECM 단백질의 침착에 대한 할로퓨기논의 억제 효과는 설페이트 표지된 메트릭스의 경우보다는 글리신의 경우에 보다 현저한데, 이는 글리신과는 달리 설페이트는 콜라게나제에 의해 분해되지 않은 글리코사미노글리칸으로 주로 혼입되기 때문이다. 할로퓨기논의 존재하에 생산된 얇거나 존재하지 않는 ECM 층이 나타나는, 노출된 배양 접시를 현미경으로 조사하면, ECM 침착의 현저한 억제를 확인할 수 있다.
실시예 14
생체내 혈관신생에 대한 할로퓨기논의 억제 효과
생체내 모델에서 할로퓨기논은 맥관형성을 억제하는 것으로 나타난다. 이러한 억제 효과는 ECM 성분의 침착으로 인한 세포 증식을 억제하는 할로퓨기논의 능력을 입증한다. 결과는 도 16A 및 16B, 및 다음의 실시예에 제공한다.
쥐 각막 맥관형성 모델을 이용하여 생체내에서의 할로퓨기논의 억제 효과를 평가하였다. 맥관형성 인자 bFGF를 서방형 고분자로 제조한 펠렛형으로 하여, C57B1/6 마우스의 각막 포켓에 제공하고, 5일간 연속하여 할로퓨기논(2㎍/마우스/일)을 복강내 투여하였다[참조: Kenyon, B.M. et al., Invest. Ophthal. Visual Sci., Vol. 37, p. 1625-1632, 1996].
시술 후 5일째에, 마우스를 메톡시플루란으로 마취시키고, 눈을 돌출시키고, 가장자리 맥관망의 기저에서 펠렛으로 이어지는 혈관신생 영역의 최대 혈관 길이(VL)를 슬릿 램프를 통하여 선형 레티큘로 측정하였다. 혈관신생의 인접하는 주변 지역(CH)은 360도 레티큘로 시간으로서 측정하였다. 5일째에 눈을 사진찍고, 슬라이드를 이용하여 혈관신생 면적을 mm2로 측정하였다[참조: Kenyon, B.M. et al., Invest. Ophthal. Visual Sci., Vol. 37, p.1625-1632, 1996].
다음의 수학식 1에 따라 혈관신생 면적을 계산하였다.
위의 수학식 1에서,
A는 면적이고,
CH는 혈관신생의 인접하는 주변 영역이고,
VL은 최대 혈관 길이이다.
할로퓨기논은 영양물 중(5㎎/㎏) 또는 점안제의 형태로 국소적으로(100 및 200ng/㎖, 1일 3회 적용) 투여하였다. 대조군 마우스에는 정규식을 제공하였다. 각각의 그룹은 5마리의 마우스로 구성되었다. 시술 7일째에, 슬릿 램프 생체현미경을 이용하여 7개의 각막을 조사하여, 혈관신생 반응을 측정하고, 사진을 찍었다. 혈관신생은 가장자리 맥관구조로부터의 혈관신생 영역의 최대 혈관 길이(VL) 및 신생혈관의 인접하는 주변 영역(CH)인 펠렛으로서 ㎜로 측정하였다.
도 16에 입증된 바와 같이, 대조군 마우스의 눈에는 각막 가장자리 각막에서 펠렛까지 혈관신생이 발생하였다(도 16A). 경구로 할로퓨기논을 제공받은 마우스에서 펠렛에 대해 혈관신생 반응의 현저한 억제가 관찰되었다(도 16B). 대조군에서의 혈관신생 평균 면적은 1.59±0.25㎟인데 비교하여, 경구로 할로퓨기논을 제공받은 마우스에서는 0.15±0.2㎟이었다(도 16C).
도 16C 및 도 16D에 입증된 바와 같이, 할로퓨기논을 1일 3회 국소 공급한 경우, 100ng/㎖(0.93±0.62㎟, p<0.001) 및 200ng/㎖(0.56±0.6㎟; p<0.001; ~95% 억제) 모두에서 혈관신생의 상당한 억제를 수득하였다. 미처리된 그룹에서 10일째에 측정된 혈관신생 영역은 4.92±1.96㎟이고, 이와 대조적으로, 규정식 중의 할로퓨기논(5mg/Kg)을 제공받은 마우스에서는 0.23±0.47(~95% 억제; p<0.001)인 것을 측정되었다(도 16D).
할로퓨기논의 국소 적용 농도를 1일 3회씩 500 및 1000ng/㎖로 증가시켰다. 혈관신생을 bFGF 펠렛 주입 후 4일, 7일 및 10일째에 평가하였다. 이전의 실험과 유사하게, 할로퓨기논 농도가 1000ng/㎖에서도 할로퓨기논을 경구 공급하는 경우(약 70% 억제)가 국소 공급되는 경우(40 내지 50% 억제)보다 더 효과적이었다. 또한, 이러한 높은 농도의 할로퓨기논을 이용하여도, 국소적으로 눈에 경결 또는 자극이 일어나지 않았다. 10일째에 새로 형성된 혈관의 퇴화가 관찰되었다(도 16E).
복강내 투여된 할로퓨기논(1㎍/마우스/일)의 항-맥관형성 효과를 경구 및 국소 경로를 통한 투여의 효과와 비교하였다. 할로퓨기논(복강내, 7일)은 미처리된 그룹에서 1.75㎟로부터 0.63㎟(p<0.05)로 혈관신생을 억제하는데, 이는 동일한 실험에서 경구로 할로퓨기논을 제공하였을 경우의 효과(0.65㎟)와 유사하였다. 할로퓨기논 점적제(500ng/ml, 1일 3회)는 다소 효과가 낮았다(0.98㎟)(도 16F). 또한, 한 실험에서는 C3H 마우스에서 할로퓨기논의 항-맥관형성 효과를 시험하였는데, 그 결과는 C57BL 마우스에서 수득한 것과 유사하였다.
따라서, 결과를 보면, 할로퓨기논은 경구 또는 복강내 투여하였을 경우에 모두 효과적인 강력한 무독성 항-맥관형성 화합물이라는 것을 알 수 있다. 점안제로 국소적으로 적용시켰을 경우에는 할로퓨기논이 다소 효과가 낮았는데, 그 이유는 아마도 원하는 일정한 농도를 달성하지 못하고, 흘러내려 버리기 때문인 것으로 보인다. 할로퓨기논은 경구 투여할 경우, 항-맥관형성 효과를 발휘하는 것으로 문헌에 기재된 최초의 화합물로 보인다.
실시예 15
인테그린 발현 억제
인테그린은 생체내에서 맥관형성 및 맥관발생에 작용하는 것으로 보인다. 메추라기 배(quail embryo)에서 β1 아단위에 대한 중화 항체를 주사하면, 대동맥 내강 형성이 차단되었다[참조: Drake, C.J. et al., in vivo. Dev. Dyn. Vol. 193, p. 83-91, 1992]. 체레쉬 및 그의 동료는 혈관 성장에는 αvβ3이 필요하다는 증거를 제공하였다[참조: Brooks, P.C. et al., Science Vol. 264, p. 569-571, 1994]. αvβ3 인테그린 복합체에 대한 항체(LM609)는 CAM 검정에서 정상적인 혈관 성장 및 또한 FGF-2 자극되거나 종양-유도된 맥관발생을 억제하나, 기존 혈관을 파괴하지는 않았다. 항-αvβ3 mAb가 맥관발생을 방해하는 메카니즘은 아포프토시스를 포함하는 것으로 보인다. αvβ3 인테그린 또는 LM609 모노클로날 항체의 사이클릭 RGD 펩타이드 길항제를 단일 혈관내 주사하면 CAM에 이식된 사람 종양이 신속하게 퇴행된다. 종양세포는 αv 유전자 및 이로부터 αvβ3 인테그린을 발현시키지 못하여, 이들의 흡착 능력을 상실하고 무흉선 누드 마우스로 이식시에 상당히 감소된 종양형성능을 나타낸다. 이와 같은 세포로 αv cDNA를 안전하게 형질감염시키면 이들의 종양형성능이 완전하게 복원되었다[참조: Felding-Habermann, B. et al, J. Clin. Invest., Vol. 89, p. 2018-2022, 1992]. 또한, 할로퓨기논은 맥관발생 및 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 매우 공격적인 MDA 435 사람 유방 암종 세포주내에서의 αv, β3 및 β5 인테그린 아단위의 발현에 미치는 할로퓨기논의 영향에 대해 조사하였다. 세포는 할로퓨기논의 부재하(도 17, 레인 A & B) 또는 할로퓨기논의 농도를 증가시키면서(10 내지 400ng/㎖) 24시간 동안(레인 C: 400ng/㎖), 48시간 동안(레인 D 내지 G: 각각 10, 50, 200 및 400ng/㎖), 72시간 동안(도 17, 레인 H: 400ng/㎖) 세포를 배양시켰다. 총 RNA를 추출하여, 1.1% 포름알데히드-아가로즈 겔 전기영동시키고, 나일론 막에 옮긴 다음, αv에 상응하는 32P-표지된 PCR 프로브로 하이브리드화시켰다. 도 17에 입증한 바와 같이, 48시간 동안 10 및 50ng/㎖의 할로퓨기논에 유방 암종 세포를 노출시킬 경우, αv mRNA가 상향 조절되었다(도 17, 레인 D 및 E). 이와 같은 효과는 할로퓨기논의 보다 높은 농도(200 내지 400ng/㎖)에서 최소화되었다(도 17, 레인 F 내지 H). 이어서, RT-PCR를 이용하여, MDA 435 유방 암종 세포에 의한 β3 및 β5 인테그린 쇄의 발현에 미치는 할로퓨기논의 효과에 대해 분석하였다. 도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, 용량-의존성 방식으로 할로퓨기논은 β3 mRNA의 발현을 억제하여, 200ng/㎖에서 거의 완전한 억제를 수득하였다(도 18, 레인 1: 대조군; 레인 2 내지 5: 각각 10, 50, 200 및 400ng/㎖ 할로퓨기논에 24시간 동안 노출). 대조적으로, β5 mRNA의 발현에는 영향을 주지 않았다. αvβ3 인테그린 복합체는 종양 맥관발생에 중요한 역할을 하기 때문에, β3 유전자 발현을 억제함으로써 할로퓨기논의 항-맥관형성 효과를 조정할 수 있다.
실시예 16
할로퓨기논의 투여에 적합한 제형
할로퓨기논은 당해 분야에 익히 공지된 다수의 방식으로 피검자에 투여할 수 있다. 이후, 용어 "피검자"는 할로퓨기논을 투여하는 사람 또는 하등 동물을 말한다. 예를 들면, 투여는 국소적으로(눈, 질, 직장, 비강 포함), 경구 또는 비경구, 예를 들면, 정맥내 적주 또는 복강내, 피하 또는 근육내 주사로 수행할 수 있다.
국소 투여를 위한 제형으로는 로션, 연고, 겔, 크림, 좌제, 점적제, 용제, 스프레이 및 산제를 포함하나 이에 국한되지는 않은 것이다. 통상적인 약제학적 담체, 수용성, 분말 또는 오일 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.
경구 투여용 조성물에는 산제 또는 입제, 물 또는 비수성 매질 중의 현탁제 또는 용제, 샤세, 캡슐제 또는 정제를 포함한다. 증점제, 희석제, 향미제, 분산제, 유화제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.
비경구 투여용 제형에는 완충제, 희석제 및 다른 적절한 첨가제를 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
용량은 증상의 중증도 및 할로퓨기논에 대한 각각의 피검자의 반응에 따라 달라진다. 당업자는 최적의 용량, 투여방법 및 반복 속도를 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
실시예 17
악성종양의 치료방법
상기한 바와 같이, 할로퓨기논은 맥관형성을 억제함으로써 종양의 진행의 효과적인 억제제인 것으로 밝혀졌다. 다음의 예는 할로퓨기논으로 악성종양을 치료하는 방법을 단지 설명하기 위함이지, 이로써 한정하고자 함은 아니다.
당해 방법은 상기 실시예 16에 언급한 바와 같이, 치료할 피검자에게 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 할로퓨기논을 투여하는 단계를 포함한다. 효과적인 투여방법에 따라 할로퓨기논을 투여하는데, 바람직하게는 예정된 종점에 이를 때, 예를 들어 피검자에서 취한 샘플에서 특정 종양 표식이 없어질 때까지 실시한다.
이와 같은 치료에 효과가 있는 종양의 예는 유방의 침윤성 맥관 암종과 같은 유방암, 소형 세포 폐 암종과 같은 폐암, 골암, 방광 암종과 같은 방광암, 횡문근육종, 혈관육종, 결장, 전립선 또는 췌장 샘암종, 자궁 경부의 편평세포암종, 난소암, 악성 섬유성 조직구종, 악성 흑색종과 같은 피부암, 평활근육종, 별아교세포종, 신경아교종 및 간세포 암종을 포함하나, 이로써 국한되지는 않는다.
실시예 18
할로퓨기논을 함유하는 약제의 제조방법
다음은 할로퓨기논을 제조하는 방법을 예로 든 것이다. 우선, 할로퓨기논을 우수한 약제학적 제조방법에 따라 합성한다. 할로퓨기논 및 이와 관련된 퀴나졸리논 유도체의 합성방법은 미국 특허 제3,338,909호에 기재되어 있다. 이어서, 할로퓨기논을 다시 우수한 약제학적 제조방법에 따라 실시예 16에 언급한 바와 같은 적합한 약제학적 담체에 도입한다.
본 발명을 한정된 수의 양태와 관련하여 설명하였지만, 본 발명의 다수의 변화, 수정 및 이외의 적용을 수행할 수 있음을 인지할 것이다.
Claims (14)
- 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 유방암, 폐암, 방광암, 횡문근육종, 혈관육종, 선육종, 결장 샘암종, 전립선 샘암종, 췌장 샘암종, 자궁 경부의 편평 세포암종, 난포암, 악성 섬유성 조직구종, 피부암, 평활근육종, 별아세포종, 신경아교종, 간세포암종, 육종, 뇌종양, 골수성-백혈병 및 림프종으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 종양 치료용 조성물.화학식 I위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, C1-C6 알킬, 페닐 및 C1-C6 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,R2는 하이드록시, 아세톡시 및 C1-C6 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,R3은 수소 및 C1-C6 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
- 제1항에 있어서, 화합물이 할로퓨기논 및 약제학적으로 허용되는 이의 염인 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 유방암이 유방의 침윤성 맥관 암종인 조성물.
- 제1항에 있어서, 방광암이 방광 암종인 조성물.
- 제1항에 있어서, 피부암이 악성 흑색종인 조성물.
- 제1항에 있어서, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 혈관신생 억제에 의한 유방암 치료용 조성물.화학식 I위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, C1-C6 알킬, 페닐 및 C1-C6 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,R2는 하이드록시, 아세톡시 및 C1-C6 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,R3은 수소 및 C1-C6 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
- 제1항에 있어서, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 아포프토시스 유도에 의한 방광암 치료용 조성물.화학식 I위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, C1-C6 알킬, 페닐 및 C1-C6 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,R2는 하이드록시, 아세톡시 및 C1-C6 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,R3은 수소 및 C1-C6 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 흑색종, 전립선 암종, 유방암종, 골수성 백혈병 및 림프종 치료용 조성물.화학식 I위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, C1-C6 알킬, 페닐 및 C1-C6 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,R2는 하이드록시, 아세톡시 및 C1-C6 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,R3은 수소 및 C1-C6 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 약제학적 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 전이 억제에 의한 방광암 치료용 조성물.화학식 I위의 화학식 I에서,n은 1 또는 2이고,R1은 수소, 할로겐, 니트로, 벤조, C1-C6 알킬, 페닐 및 C1-C6 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,R2는 하이드록시, 아세톡시 및 C1-C6 알콕시로 이루어진 그룹의 일원이고,R3은 수소 및 C1-C6 알켄옥시-카보닐로 이루어진 그룹의 일원이다.
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