JP2001518075A - 新生血管形成の予防用および悪性疾患の治療用のキノゾリノン含有医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、医薬上許容される担体と組み合わされた、有効成分としての医薬上有効量の式（Ｉ）［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、および低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、Ｒ₃は水素および低級アルケノキシよりなる群のメンバーである］を有する化合物またはその医薬上許容される塩を含めた、新生血管形成を緩和するための、および悪性疾患を治療するための組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 新生血管形成の予防用および悪性疾患の治療用の キノゾリノン含有医薬組成物 発明の分野および背景 本発明は、キノゾリノンを含有する組成物に関する。さらに詳しくは、本発明 は、一次腫瘍増殖、腫瘍の進行および転移の阻害を含めた、脈管形成−関連病の 治療用の、ならびに悪性疾患の治療用の、キノゾリノン誘導体を含有する組成物 に関する。 悪性疾患は腫瘍の増殖および拡大によって特徴付けられる。多数の因子がこの 病気の進行において重要である。これらの因子は、アポトーシス（プログラムさ れた細胞の死滅）、脈管形成のメカニズムを回避する腫瘍細胞の能力および転移 する悪性腫瘍の能力を含む。これらの因子のいずれか１つは治療介入の潜在的な 標的である。これらの因子のうちの２以上に影響できる治療は特に望ましいであ ろう。 脈管形成は複雑なプロセスであり、ここに、毛細血管は秩序だった配列の事象 で増殖する［J．FolkmanおよびM．Klagsbrun，Science，第２３５巻、４４２− ４４７頁（１９８７）；J．FolkmanおよびY.Shing，J．Biol．Chem.，第２６７ 巻、１０９３１−１０９３４頁（１９９２）］。脈管形成は以下のように悪性疾 患の発生および進行に関係する。腫瘍が一旦開始すると、腫瘍細胞集団の各増加 は、腫瘍に集中し、かつ細胞に酸素および栄養素を供給する新しい毛細血管の増 加に先行される［J．Folkman，Perspect in Biol．and Med.，第２９巻，１０− ３６頁（１９８５），J．Folkman，J．Natl．Cancer Inst.，第８２巻，４−６ 頁（１９８９）；N．Weidnerら，Amer．J．Pathol.，第１４３巻、４０１−４０ ９頁（１９９３）］。従って、伴う脈管形成プログラムが活性化されるのが妨げ られる限り、腫瘍は比較的無害に止まり、元のそれらの組織に限られる。腫瘍進 行における脈管形成−依存性過程は全ての病因の固形腫瘍によって共に保有され るので、腫瘍−関連脈管形成を阻害する能力は癌と戦うのに最も有望なアプロー チである［M．S．O'Reillyら、Cell，第７９巻、３ １６−３２８頁（１９９４）］。 実質的な実験的証拠は、腫瘍脈管形成が固形腫瘍の増殖および転移の基礎であ ることを支持する［J．Folkman，前掲、（１９８９）；N．Weidnerら、前掲(199 3);M．S．O'Reillyら、前掲（１９９４）;N．Weidnerら、E．Eng．J．Med.、第 ３２４巻、１−８頁（１９９１）］。事実、固形腫瘍の大部分は、固形腫瘍にお けるその誘導が１以上の脈管形成因子によって媒介される新生血管形成の発生の 後まで臨床的に検出さえできない［J．Folkner、前掲（１９８７）;J．Folkman およびY．Shing、前掲（１９９２）］。 さらに、脈管形成は、関節炎、感染、糖尿病性網膜症、慢性炎症、強皮症、血 管腫、水晶体後繊維増殖症および友血病関節における異常毛細血管増殖、延長さ れた月経および出血、および女性生殖系の他の障害を含めた、多数の他の病理学 的プロセスでも重要である［J．Folkman，Nature Medicie、第１巻、２７−３１ 頁（１９９５）;J．W．Millerら、J．Pathol.、第１４５巻、５７４−５８４頁 （１９９４）;A．P．Adamidら，Amer．J．Ophthal.、第１１８巻、４４５−４５ ０頁（１９９４）；K．Takahashiら、J．Clin．Invest.、９３頁、２３５７−２ ３６４（１９９４）;D．J．Peacockら、J．Exp．Med.、第１７５頁、１１３５− １１３８（１９９２）；B．J．NickoloffらAmer．J．Pathol.、第４４巻、８２ ０−８２８頁（１９９４）;J．Folkman，Steroid Hormones and Uterine Bleedi ng、N．J．AlexanderおよびC．d'Areangues編、American Association for the Advancement of Science Press，ワシントンＤ．Ｃ．、米国、１４４−１５８頁 （１９９２）］。 従って、明らかに、脈管形成のメカニズムを特異的にブロックする新しいメカ ニズムは、多数の異なる病気の治療で医学的に有用である。脈管形成の基本的な メカニズムは以下の通りである。略言すれば、新しい脈管の新芽が細静脈の側面 から増殖すると、内皮細胞は基底膜を分解し、脈管形成源まで移動し、ルーメン を形成し、２つの新芽の先端を連結して毛細血管ループを生じ、新しい基底膜を 作成する［J．Folkman，Perspectives in Biology and Medicine、第２９巻、１ −３６頁（１９８５）］。 ＥＣＭの分解および再構築は脈管形成の必須の過程である。加えて、コラー ゲン、ラミニン、トロンボプラスチン、フィブロネクチンおよびＳＰＡＲＣのよ うな内皮細胞によって合成されたＥＣＭ成分は内皮細胞の増殖、移動および形状 を調節するように機能する［J．Bischoff，Trends Cell Biol.、第５巻、６９− ７４頁（１９９５）］。発芽および管形成を受けているウシ大動脈内皮細胞（Ｂ ＡＥ）はＩ型コラーゲンおよびＳＰＡＲＣを合成する。Ｉ型コラーゲンはＢＡＥ 細胞の移動および組み立てを指示できる［M．L．Iruela-Arispeら，Lab．Invest .，第６４巻、１７４−１８６頁（１９９１）。さらに、内因性Ｉ型コラーゲン は密集ヒト皮膚ミクロ血管内皮細胞による迅速な管形成を促進することが見出さ れた[C．J．JacksonおよびK.L．Jenkins，Exp．CellRes.、第１９２巻、３１９ −３２３頁（１９９１）］。そのように形成された管はルーメン空間でコラーゲ ンフィブリルを含有し、これは、内皮細胞が管構造に折り畳まれ、配列するのに フィブリルを使用することを示唆する。 脈管形成におけるコラーゲンの役割はいくつかのグループによって調査された 。Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンの合成の代謝阻害は漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイで 毛細血管形成を阻害する（Maragoudakis，M．E.ら，Int．J．Radiat Biol.、第 ６０巻、５４−９頁、１９９１）。さらに、ＣＡＭで実験的に誘導された脈管形 成は、大量のコラーゲンの沈積が伴うことが判明した。コラーゲンゲル内の大動 脈外植体からの内皮細胞移動は、もしプロリンアナログであるシス−ヒドロキシ プロリンの存在下で増殖したならば、阻害され、再度、正常なコラーゲン合成に 対する必要性を示す（Nicosia，R．F.ら、In Vitro Cell Dev．Biol.、第２７巻 Ａ、９６１−６頁、１９９１）。 In vitro実験は、Ｉ型コラーゲンおよびカルシウム結合性蛋白質ＳＰＡＲＣ（ 分泌蛋白質、酸性、システインが豊富）の共発現が、ウシ大動脈内皮細胞ＢＡＥ Ｃが発芽する脈管形成を受けると開始されることを示唆する（Iruela-Arispe，M ．L.ら、Arterioscler Thromb.、第１１巻、８０５−１５頁、１９９１）。ＶＩ ＩＩ型コラーゲンは発芽の間にも合成され、内皮コード内の増殖する内皮細胞に 局所化されている。正常な腫瘍および実験的に誘導された脈管形成の組織学的調 査は、Ｉ型およびＶＩＩＩ型コラーゲンが内皮コードおよび管内に局所化される という証明を拡大した(Kittelberger，R.ら、Connect．Tissue Res.、 第２４巻、３０３−１８頁、１９９０)。ＢＡＥＣが脈管形成ヒアルロン酸（Ｈ Ａ）オリゴ糖に露出されると、Ｉ型コラーゲンの合成は４−５倍上昇調節され、 ＶＩＩＩ型コラーゲンの合成は１２時間内に５．８倍増強されると報告されてい る。Ｉ型コラーゲンは内皮細胞移動を助けると考えられ、他方、ＶＩＩＩ型コラ ーゲンは内皮細胞の移動および管形成に関与すると考えられている。 コラーゲンの生産に加えて、毛細血管を拡大するには、相互作用がＥＣＭ成分 と周囲のマトリックス分子との間で起こらなければならず、これは新しい血管の ＥＣＭ成分のための足場を供する［Brooks，P．C.ら、Cell、第７９巻、１１５ ７−１１６４頁（１９９４）］。脈管形成血管細胞において増強された発現を有 するヒト内皮細胞インテグリンα₂β₃でのこれらの細胞−マトリックス相互作用 誘導アポトーシスの破壊もまた生存シグナルを促進することが判明した。という のは、このインテグリンの阻害剤は計画されていないアポトーシスおよび新しく 形成された血管の崩壊を引き起こした。 脈管形成−関連病を治療するために、血小板第４因子、フマジリン誘導体ＡＧ Ｍ１４７０、インターフェロンα₂ａ、トロンボスポンジン、血管静止ステロイ ド、およびアンジオスタチンを含めた脈管形成の前記メカニズムのいくつかの阻 害剤が研究されつつある［J．Folkman，前掲，（１９９５）；M．S．O'Reillyら 、前掲（１９９４）；V．Castleら、J．Clin．Invest.、第８７巻、１８８３− １８８８頁；D．Ingberら、Nature、第３４８巻、５５５−５５７頁］。これら のテストした化合物は全て不利を有する。例えば、エンドスタチンおよびアンジ オスタチンは蛋白質であり、従って、それらは、非経口投与されるための要件を 含めた、蛋白質の不利の全てを有する。従って、他の生理学的機能に悪影響する ことなく脈管形成の基礎となるメカニズムを選択的にブロックし、多くの異なる 経路によって投与し得る非蛋白質性阻害剤は極端に有用である。そのような阻害 剤は、病理学的過程の一部として脈管形成を含む、悪性疾患のような広く種々の 病気の治療で有用であろう。 前記したように、ＥＣＭの分解および再構築は脈管形成に必須のプロセスであ る。このようなプロセスはコラーゲンのようなＥＣＭの多数の成分の合成を含む 。コラーゲン代謝の多数のモジュレーターが脈管形成に対するそれらの効 果につき調べられている［Nakajima M.ら、Cancer Res.、第９巻、１６９８−１ ７０６頁、１９８９；Turpeenniemi-Hujanen，T.ら、J．Natl．Cancer Inst.、 第７５巻、９９−１０３頁、１９８５；Monteagudo，C.ら、Amer．J．Pathol.、 第１３６巻、５８５−５９２頁、１９９０］。ニワトリヒナ胚における増殖する 毛細血管の退行は、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸、シス−ヒドロキシプロリ ン、ｄＬ−３，４−デヒドロキシプロリンおよびチオプロリンのようなプロリン アナログによって誘導された。これらの化合物およびα，α−ジピリジル（プロ リルヒドロキシラーゼの阻害剤）は、全て、三重ラセン形成に干渉し、コラーゲ ン沈積を妨げる。β−アミノ−プロピオニトリル（コラーゲン架橋の阻害剤）も また抗−脈管形成であるが、β−メチル−ｄ−キシロシド（グリコサミノグリシ ン沈積の阻害剤）は抗脈管形成活性を有しなかった［Herron，G.S．ら、J．Biol ．Chem.、第２６１巻、２８１４−２８１８頁、１９８６；Reich，R.ら、Clin． and Exp．Metastasis、第１３巻、１３４−１４０頁、１９９５］。脈管静止ス テロイドおよび／またはヘパリンとのコラーゲンモジュレーターの最適下用量の 共投与は脈管形成の阻害を増強した。 加えて、腫瘍自体、特に固形腫瘍は、腫瘍増殖を支持する脈管形成用のコラー ゲンの要件に加えて、継続した増殖および進行のためにコラーゲンの合成および 沈積に頼っている。固形腫瘍は２つの区別されるが相互に依存する区画：悪性細 胞自体および間質よりなり、これは増大したＥＣＭおよびＩ型コラーゲン合成に よる腫瘍増殖を支持する(Folkman，J.，Seminars in Cancer Biology，第３巻、 ５６−７１頁、１９９２)。間質は腫瘍増殖に必須である。というのは、それは 栄養素、ガス交換および廃棄物の廃棄を得るために腫瘍によって要求される血管 供給を支持するからである。大量の腫瘍間質（いくつかの場合では９０％まで） は間隙結合組織よりなる。この組織はＩ型およびＩＩＩ型、フィブリン、フィブ ロネクチン、テナシン、エラスチンおよび硫酸化プロテオグリカンを含めた間隙 コラーゲンのような構造蛋白質を含む（Dvorak，H．F.，N．Eng．J．Med.、第３ １５巻、１６５０−１６５９頁、１９８６；Yeo，T．K.、Diagnostic Immunopat hology中の「Tumor Stroma」、Colvin，R．B.ら編、Raven Press，New York，９ ８５−６９６頁）。コラーゲン形成の一般的阻害剤が腫 瘍増殖に対するそれらの効果につき調べられ、マウスにおける腫瘍増殖を阻害す ることが判明しているが、長期安全投与では余りにも毒性であるとことが判明し た。かくして、コラーゲンの合成および沈積の現在入手できる阻害剤は悪性疾患 に適しない。 加えて、脈管形成または腫瘍増殖に対するそれらの効果が調べられていないコ ラーゲンの合成および沈積の多くの他の阻害剤は一般に望ましくない。何故なら ば、それらはコラーゲン代謝経路につき特異性を欠くからである。かくして、多 くの現在入手可能な薬物は有害な副作用を有する。 例えば、コラーゲン生産繊維芽細胞の増殖を遅延させようとする試みにおいて 、細胞外マトリックスへのコラーゲン分泌を遅らせるコルヒチン［D．Kershenob ichら、N．Engl．J．Med.、第３１８巻、１７０９頁（１９８８）］のような細 胞傷害性薬物が使用されてきた［J．A．Casesら、Ann．Rhem．Dis.、４６巻、７ ６３頁（１９８７）］。他の薬物は鍵となるコラーゲン代謝酵素の阻害剤として 作用する［K．Karvonenら、J．Biol．Chem．、第２６５巻、８４１４頁（１９９ ０）；C．J．Cunliffeら、J．Med．Chem．、第３５巻、２６５２頁（１９９２） ］。しかしながら、これらの阻害剤のいずれも特異的タイプのコラーゲンの代謝 および沈積につき特異的効果を有しない。また、これらの薬物は、古典的補体経 路におけるＣｌｑ、神経−筋肉接合終板のアセチルコリンエステラーゼ、コング ルチニンおよび肺界面活性剤アプロプロテインのような、他のウイルスコラーゲ ン様分子の生合成に干渉し得る。このような干渉および特異性の欠如は潜在的に ひどい悪影響を有し得る。 ニフェジピンおよびフェニトインのような、コラーゲン合成を阻害できる他の 薬物は同様に他の蛋白質の合成を阻害し、それにより、コラーゲン生合成経路を 非特異的にブロックする［T．Saloら、J．Oral Pathol．Med.、第１９巻、４０ ４頁（１９９０）］。蛋白質合成の非特異的阻害の結果、薬物を患者に投与した 場合に、有害な副作用がもたらされかねない故に、再度、特異性の欠如はこれら の薬物の臨床的用途をかなり低下させる。 事実、β−アミノ−プロピオニトリルのようなコラーゲン架橋性阻害剤を含め た、臨床的に利用できる抗−繊維症薬物も非特異的である。不運にも、これ らのコラーゲン架橋性阻害剤の特異性の欠如は、結局は、長期間の使用の後にひ どい副作用の結果となる。これらの副作用は、ラスリティック（lathritic）症 候群、ならびに破壊された染色体異常誘発性を含む。後者の副作用は、エラスチ ン（もう１つの繊維状結合組織蛋白質）の架橋の破壊の結果である。加えて、こ れらの薬物のコラーゲン架橋阻害効果は二次的であり、従って、コラゲナーゼに よる分解前にコラーゲンがまず過剰生産されなければならない。かくして、コラ ーゲン自体の合成のタイプ特異的阻害剤が明らかに要求される。 このようなタイプ特異的コラーゲン合成阻害剤は、強皮症および移植片−対− 受容者病のようなある種の繊維症疾患の治療用に、米国特許第５，４４９，６７ ８号に開示されている。これらの疾患の双方は、ハロフギノンによって阻害され 得る過剰コラーゲン沈積に関連する。この特異的阻害剤は、医薬上有効量の式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニルおよ び低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ の医薬上活性な化合物を含む組成物である。この群の化合物のうち、ハロフギノ ンがこのような治療に特に効果的であることが判明した。 ＰＣＴ特許出願第９６／０６６１６号は、さらに、これらの化合物が、血管平 滑筋細胞の増殖を予防することによって再狭窄を効果的に治療できることを開示 する。再狭窄は、血管損傷に応答しての患部血管のルーメン内の平滑筋細胞増殖 および細胞外マトリックス蓄積によって特徴付けられる［Choiら、Arch． Surg.、第１３０巻、２５７−２６１頁（１９９５）］。このような平滑筋細胞 増殖の他の１つの特質は、合成表現型に対する正常収縮性表現型からの表現型改 変である。Ｉ形コラーゲンは、ハロフギノンによってブロックされ得る、このよ うな表現型改変を支持することが示されている［Choiら、Arch．Surg.、第１３ ０巻、２５７−２６１頁（１９９５）；ＰＣＴ特許出願第９６／００６６１６号 ］。従って、ハロフギノンは、Ｉ型コラーゲンの合成をブロックすることによっ て、血管損傷後に平滑筋のこのような異常再分化を防止し得る。他のin vitro実 験は、ハロフギノンが３Ｔ３繊維芽細胞の増殖を阻害することもできることを示 す［米国特許第５，４４９，６７８号］。 しかしながら、ハロフギノンの該in vitro実験はそのin vivo効果を常には予 測しない。例えば、ハロフギノンは、米国特許第５，４４９，６７８号に証明さ れているごとく、in vitroで骨クロンドロサイトにおいてＩ型コラーゲンの合成 を阻害する。しかしながら、ハロフギノンで処理したニワトリは、骨破壊の増大 した速度を有すると報告されておらず、これは該効果がin vivoで観察されない ことを示す。従って、in vivoでのハロフギノンの正確な挙動はin vitro実験か ら正確には予測できない。 さらに、腫瘍の増殖および進行に関連する生理学的プロセスをブロックまたは 阻害するハロフギノンまたは他の関連キノリノンの能力は当該分野で知られてい ない。ハロフギノンはＩ型コラーゲンの合成に対する特異的阻害効果を有するこ とが知られているが、このような阻害は特にin vivoにて腫瘍進行を遅延または 停止させることが従前には示されていない。事実、脈管形成単独のメカニズムの 特異的阻害は、典型的には、悪性疾患の治療用に臨床的に使用されなかった。 悪性疾患の治療用の最も臨床的に利用できるアプローチは、増殖する細胞を活 動的に死滅させるために、化学療法または照射治療のような細胞傷害性療法に焦 点を当てる。不運にも、これらの療法は非癌細胞にとってはかなり毒性であり、 骨髄抑制、毛髪喪失および胃腸の乱れのようなひどい副作用を引き起こす。特に 、これらの療法は、全ての活動的に増殖する細胞を単純に死滅させるというより は、腫瘍細胞において特異的にアポトーシスを誘導することができ ない。しかしながら、アポトーシスの特異的誘導は、明らかに、無差別な細胞傷 害性を引き起こすことなく、癌細胞を選択的に死滅させるための重要なメカニズ ムである。従って、明らかに、アポトーシスを引き起こす医薬は悪性疾患の治療 でかなり有用であろう。 一次腫瘍増殖、腫瘍の進行および転移を含めた悪性疾患の治療は、かくして、 腫瘍の増殖および転移に要求される多数の異なるメカニズムを阻害する、または そうでなければそれに影響することによって、潜在的に作用し得る。従前に記載 されているこれらのメカニズムは、脈管形成、コラーゲンの沈積および正常アポ トーシスの不在を含む。不運にも、悪性疾患用の現在入手できる治療は、これら のメカニズムのうちの１つの阻害よりもむしろ細胞傷害性に焦点を当てる。確か に、現在入手できる治療のいずれもがこれらのメカニズムの全てを阻害すること はできない。 かくして、他の生理学的プロセスに実質的に悪影響することなく、特にin viv oで効果的であり、脈管形成を阻害できる、腫瘍の増殖、進行および転移の阻害 剤に対する広く認識された医学的要望がある。 発明の概要 予期せぬことに、後記実施例に記載するごとく、ハロフギノンがin vivoで腫 痘進行を遅延させまたは停止させることができることが判明した。特定の仮定に 拘束させるつもりはないが、ハロフギノンは多数の異なるメカニズムを通じて作 用することができる。例えば、ハロフギノンは、脈管形成を阻害することによっ て、ＥＣＭ沈積をブロックすることによって、ＩＶ型コラーゲンの活性を阻害す ることによって、アポトーシスを誘導することによって、またはＨ１９遺伝子発 現を阻害することによって、あるいは恐らくは、これらのメカニズムの組合せを 介して、作用することができるが、もう１つのメカニズムまたは複数のメカニズ ムも応答可能であろう。しかしながら、単一のメカニズムに限定されるのは望ま れるものではなく、また必要でもない。というのは、後記にて提示するin vivo データは明らかにin vivoにて腫瘍進行の阻害剤としてのハロフギノンの効果を 示すからである。 本発明の実施形態により、医薬上許容される担体と組み合わされた医薬上有効 量の化合物を含む、腫瘍を治療するための組成物が提供され、該化合物は式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシよりなる群のメンバーである］ を有する群のメンバーである。 本発明のもう１つの実施形態により、医薬上許容される担体と組み合わされた 医薬上有効量の化合物を含む、新生血管形成を実質的に阻害するための組成物が 提供され、該化合物は式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシよりなる群のメンバーである］ を有する群のメンバーである。 本発明のさらにもう１つの実施形態により、医薬上許容される担体と組み合わ された医薬上有効量の化合物を含む、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するた めの組成物が提供され、該化合物は式：［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシよりなる群のメンバーである］ を有する群のメンバーである。 本発明のさらにもう１つの実施形態により、医薬上許容される担体に医薬上有 効量の化合物を配合する工程を含むことを特徴とする、腫瘍を治療するための医 薬を製造する方法が提供され、該化合物は式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ を有する群のメンバーである。 本発明のさらにもう１つの実施形態により、医薬上許容される担体に医薬上有 効量の化合物を配合する工程を含むことを特徴とする、新生血管形成を実質 的に阻害するための医薬を製造する方法が提供され、該化合物は式：［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ を有する群のメンバーである。 本発明のさらにもう１つの実施形態により、医薬上許容される担体に医薬上有 効量の化合物を配合する工程を含むことを特徴とする、腫瘍細胞においてアポト ーシスを誘導するための医薬を製造する方法が提供され、該化合物は式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ を有する群のメンバーである。 本発明のさらにもう１つの実施形態により、医薬上有効量の式：［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ の化合物を含む、細胞外マトリックスの沈積によって可能となる細胞増殖を阻害 するための組成物が提供される。 本発明のさらにもう１つの実施形態により、医薬上有効量の式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ の化合物を含む、細胞移動を阻害するための組成物が提供される。 本発明のさらにもう１つの実施形態により、医薬上有効量の式：［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ の化合物を含む、転移を阻害するための組成物が提供される。 前記実施形態の全てに関し、好ましくは、該化合物はハロフギノンである。 また、好ましくは、該腫瘍は乳癌、肺癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、結服 、前立腺または膵臓の腺癌、頸部の鱗状細胞癌、卵巣眼、悪性繊維状組織球癌、 皮膚癌、平滑筋肉腫、星状細胞腫、神経膠腫および肝細胞肉腫よりなる群から選 択される。より好ましくは、該乳癌は乳房の侵潤性管癌である。あるいは、かつ より好ましくは、該膀胱癌は膀胱癌腫である。また、あるいは、かつより好まし くは、該皮膚癌は悪性メラノーマである。 以後、「ハロフギノン」なる用語は、式： を有する化合物およびその医薬上許容される塩として定義される。該組成物は、 好ましくは、該化合物用の医薬上許容される担体を含む。 好ましくは、前記で言及した化合物の全ては、該式で定義した化合物自体、お よび／またはその医薬上許容される塩のいずれかであり得る。 図面の簡単な説明 添付の図面を参照し、例示としてのみ本発明をここに記載する。 図１Ａ−１Ｌは、ハロフギノンによる、マウスまたはラットにおける癌の７つ の異なるモデルでの５つの異なる腫瘍のin vivo腫瘍増殖の阻害を示す。 図２Ａおよび２Ｂは、ヒト平滑筋腫瘍細胞の³Ｈ−チミジン取り込みおよび増 殖に対するハロフギノンの効果を示す。 図３はハロフギノンの存在下におけるＴ５０膀胱癌腫培養におけるＩＶ型コラ ゲナーゼ活性の用量依存性阻害を示す。 図４はハロフギノンによるＲＴ１１２および５３７６膀胱癌腫細胞系における Ｈ１９遺伝子の発現の阻害剤である。 図５Ａおよび５Ｂは、ハロフギノンの投与後の、膀胱腫瘍の周囲に由来する切 片におけるアポトーシスの誘導を示す。 図６Ａ−６Ｄは、ハロフギノンの投与後の、腫瘍の中心から採取した切片にお けるアポトーシスの誘導を示す。 図７Ａ−７Ｄはハロフギノンによる腫瘍細胞増殖の阻害を示す。 図８Ａおよび８Ｂは、ウシ繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の不在下または存 在下における、培養中に維持されたウシ大動脈内皮細胞への³Ｈ−チミジン取り 込みに対するハロフギノンの効果を示す。 図９Ａおよび９Ｂは毛細血管様ネットワークへのウシ大動脈内皮細胞の組織化 に対するハロフギノンの阻害効果を示す。 図１０Ａおよび１０Ｂは、Ｉ型コラーゲンゲルに包埋したラット大動脈環から のミクロ血管形成に対するハロフギノンの阻害効果を示す。 図１１は、図１０Ａおよび１０ＢのI型コラーゲン包埋ラット大動脈環を用い る、ミクロ血管形成に対するハロフギノンの阻害効果の用量依存性曲線である。 図１２は、ハロフギノンの阻害効果の可逆性を示す。 図１３は、ウシ角膜内皮細胞と共に内皮下細胞ＥＣＭへのスルフェート取り込 みに対するハロフギノンの効果を示す。 図１４Ａ−１４Ｄは、ウシ角膜包埋内皮細胞によるＥＣＭへのスルフェート、 プロリン、リシンおよびグリシンの取り込みに対するハロフギノンの効果を比較 する。 図１５Ａ−１５Ｄは、ラット糸球体間質細胞のＥＣＭへのスルフェートおよび グリシン取り込みに対するハロフギノンの効果を示す。 図１６Ａ−１６Ｆは、マウスの眼におけるin vivo新生血管形成に対するハロ フギノンの阻害効果を示す。 図１７は、インテグリンα鎖発現に呈するハロフギノンの効果に関するノーザ ンブロットを示す。 図１８は、ＲＴ−ＰＣＲによって測定したβサブユニット発現に対するハロフ ギノンの効果を示す。 発明の簡単な説明 ハロフギノン、および拡張により、米国特許第３，３２０，１２４号に記載さ れ、特許請求されている関連キナゾリノン誘導体は、以下「パンスタシス（pans tasis）」という多数の区別される阻害メカニズムを介して、腫瘍の増殖、進行 および転移を明害する。これらのメカニズムは、限定されるものではないが、脈 管形成の阻害、ＥＣＭ沈積の予防、ＩＶ型コラゲナーゼ活性の阻害、インテグリ ン発現の阻害、アポトーシスの誘導およびＨ１９遺伝子発現の阻害を含む。 これらのメカニズムの特異的態様に関して、脈管形成およびＥＣＭ沈積は従前 に記載されている。ＩＶ型コラゲナーゼは転移および細胞侵入に関与する重要な 金属プロテアーゼ酵素である。アポトーシスは、前記したように、悪性細胞にお いてブロックされるプログラムされた細胞死滅であり、これは従って「不滅」と も記載される。Ｈ１９遺伝子は膀胱癌の初期段階に関連する腫瘍マーカー遺伝子 である。より具体的には、Ｈ１９遺伝子は、組織分化が起こっている時の胎児発 生間にその発現がピークとなる発生学的に調節された遺伝子である。Ｈ１９含有 領域内の染色体異常は、Wilms腫瘍、副腎皮質癌、胚芽腫、横紋筋肉腫、肺腫瘍 、栄養膜腫瘍および膀胱癌のような悪性疾患の初期段階に関連する［B．Tycko， Am．J．Path.、第１４４巻、４３１−４３９頁、１９９４；de Gr oot，N.ら、Trophoblast Res.、第８巻、２２８５−２３０２頁、１９９４；Rac hmilewitz，J.ら、Oncogene、第１１巻、８６３−８７０頁、１９９５］。 パンスタシスの重要性は、ハロフギノンの作用メカニズムが活動的に細胞傷害 性であること無くして多くの異なる細胞増殖抑制活性を含むことである。そのよ うな細胞増殖抑制活性は、薬物耐性を生じるようではなく、また、非癌細胞に影 響することによって、有害な副作用を生じるようでもない。従って、ハロフギノ ンは活動的に細胞傷害性である癌に対する現在利用可能な療法から区別できる。 好ましい実施形態の説明 予期せぬことに、後記実施例に記載するように、ハロフギノンはin vivoで腫 瘍の進行を遅延させまたは停止させることが判明した。具体的メカニズムに関係 なく、後記にて提示するデータは、明らかに、腫瘍進行を阻害する時点における in vivoでのハロフギノンの効果を示す。 そのような知見は３つの理由で予期せぬことである。まず、in vitroでのハロ フギノンの挙動はin vivoでのその挙動に正確には対応しない。これは、in vivo およびin vitroにて骨軟骨細胞で観察されるハロフギノンの種々の効果によって 示される。ハロフギノンは米国特許第５，４４９，６７８号で示されるように、 in vitroで軟骨細胞におけるＩ型コラーゲンの合成を阻害する。しかしながら、 ハロフギノンで処理したニワトリは、骨破壊の増加した速度を有することは報告 されておらず、これは、該効果がin vivoでは観察されないことを示す。従って 、in vivoでのハロフギノンの正確な挙動は、常には、in vitro実験から予測す ることはできない。 第２に、ハロフギノンによる細胞増殖の阻害の唯一の従前に知られている例は 、血管損傷に応答して表現型が変化したようになった平滑筋細胞、または３Ｔ３ 繊維芽細胞いずれかに関係するものであった[ＰＣＴ出願第９６／０６６１６号 およびChoiら、Arch．Surg.、第１３０巻、２５７−２６１頁(１９９５)]。これ らの細胞は組織化無くして単純に増殖した。対照的に、脈管形成は高度に組織化 された血管構造の形成を含む。かくして、ハロフギノンがそのような脈 管形成を阻害できるという知見は新規であると共に非自明である。 さらに、後記にて与えられる実施例は、ハロフギノンが、in vivoならびにin vitroにて、細胞外マトリックスの沈積によって可能となる細胞増殖の阻害でも 有効であることを明らかに示す。コラーゲン沈積の阻害は特にin vivoでは従前 には示されていない。 加えて、本明細書中で提示するデータは、ＩＶ型コラゲナーゼ活性の、腫瘍マ ーカー遺伝子発現の、およびインテグリン発現の阻害の効果的な阻害剤であるこ とも示す。また、該データはハロフギノンが腫瘍細胞のアポトーシスを誘導でき ることも示す。ハロフギノンのこれらの効果は従前には示されていない。 かくして、先行技術はハロフギノンがin vivoで悪性疾患の治療で有用であろ うことを教示も示唆もしない。さらに、腫瘍進行を遅延させまたは停止させる、 細胞外マトリックスの沈積によって可能となる細胞増殖を阻害する、ＩＶ型コラ ゲナーゼ活性を阻害する、インテグリン発現を阻害する、およびアポトーシスを 誘導するハロフギノンおよび関連化合物の能力は新規であると共に非自明である 。in vivoにおいてこのような能力が示されるのは、ハロフギノンに対するin vi troおよびin vivoでの種々の応答を考えれば、特に予期せぬことである。 さて、その態様がより十分に理解され、認識されるように、以下の図面および 実施例におけるある好ましい実施形態と関連させて本発明を記載するが、本発明 はそれらの特定の実施形態に限定される意図のものではない。対照的に、全ての 別法、修飾および同等物は添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲内 に含まれる。かくして、好ましい実施形態を含む以下の図面および実施例は本発 明の実施を例示するために供され、示された詳細は例示的なものであり、本発明 の好ましい実施形態の例示的記載の目的のためだけのものであって、最も有用で あり、かつ処方的手法の、ならびに本発明の原理および概念的態様の記載を容易 に理解すると考えられるものを提供するために提示されると理解される。 以下の例示的実施例および図面を参照して本発明はより容易に理解することが でき、専らハロフギノンに言及するが、ここに出典を明示してその教示を本明細 書の一部とみなす米国特許第３，３２０，１２４号に記載され特許請求さ れている他のキナゾリノン誘導体は同様の特性を有するものと考えられる。 実施例１ ハロフギノンによるマウスおよびラットにおける腫瘍増殖の阻害 マウス、ラットおよびヒト起源の５つの異なるタイプの腫瘍の増殖の阻害を、 ３つの異なる株のマウス、Ｃ３Ｈ、ＣＤ１−ｎｕ無胸腺およびＣ５７ＢＬ／６マ ウス、およびラットのFischer株で、in vivoにて調べた。Ｔ５０膀胱癌をＣ３Ｈ マウスに投与した。加えて、Ｎ−ブチル−Ｎ−４−ヒドロキシブチルニトロソア ミンをこれらのマウスの飲料水に添加することによって、膀胱癌をin situにて Ｃ３Ｈマウスにおいて誘導した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＥＨＳ肉腫細胞で接種 した。ＭＣＦ−７乳癌またはメラノーマの攻撃的変種であるＭＤＡ４３５でヌー ドマウスを接種した。Fischerラットの脳に、１^*１０⁵悪性繊維状組織球腫細胞 の懸濁液を定位注射した。予期せぬことに、ハロフギノンはこれらのin vivoモ デルで腫瘍の増殖および進行に対して有意な阻害効果を有することが示された。ハロフギノンによるＴ５０膀胱癌の阻害 Ｃ３ＨマウスをＴ５０膀胱癌細胞で接種する最初の実験のために、Ｃ３Ｈマウ スを各々６匹マウスの２つの群に分割した。Ｔ５０膀胱癌細胞の注射の３日前お よびその後２週間の間、実験群は、１０ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇいずれか のハロフギノンを含有するダイエットを摂取させた。培養したＴ５０細胞（化学 的に誘導したＭＢＴ２マウス膀胱癌のより攻撃的変種）を、トリプシン／ＥＤＴ Ａで解離して、増殖培地中の単一細胞懸濁液（１０⁶細胞／ｍｌ）に入れ、マウ スの背中の２つの部位に皮下接種した。右側には０．４^*１０⁵細胞を摂取させ、 左側には２^*１０⁵細胞を摂取させた。式Ｖ＝ＬＷ²／２（ここに、Ｖは容量であ り、Ｌは長さであってＷは幅である）を用い、２方向の腫瘍長さを測定すること によって腫瘍サイズを見積もった。第１７日における実験の最後に、マウスを秤 量し、腫瘍を切り出し、腫瘍組織の試料を固定し、組織学的調査のために加工し た。実験の定量的結果を図１Ａおよび１Ｂに、および５ｍｇ／ｋｇの用量につき 表１に示す。ハロフギノンで処理しない（頂部）または 処理した（底部）代表的癌担持マウスの写真を図１１に示す。代表的腫瘍を５ｍ ｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量につき図１Ｃに示す。表２はハロフギノン の５ｍｇ／ｋｇの用量および１０ｍｇ／ｋｇの用量の間の比較を示す。 ５ｍｇ／ｋｇハロフギノンを摂取させたＣ３ＨマウスにおけるＴ５０腫瘍サイ ズは、図１Ａおよび１Ｂに示すごとく、正常ダイエットで維持した対照マウスと 比較して、約７０−８０％だけ有意に低下した。ハロフギノンの抗−腫瘍効果は 、高腫瘍細胞用量（対照マウスでは５．０±３．０７ｃｍ³およびハロフギノン 含有ダイエットで１．０±０．９２ｃｍ³の容量）および低腫瘍細胞用量（対照 マウスで１．６３±０．９８ｃｍ³およびハロフギノン摂取マウスで０．２９± ０．２８ｃｍ³の容量）の双方で観察された。さらに、より低い腫瘍負荷のため 、ハロフギノン処理Ｃ３Ｈマウスの総じての体重は、未処理マウスの体重よりも 低かった（各々、２４±３．３ｇおよび４０±３．８ｇ）。全てのマウスの５ｍ ｇ／ｋｇに関するデータを表１に示す。 表２および図１Ｃに示すごとく、ハロフギノンを１０ｍｇ／ｋｇダイエットの 用量で投与した場合、より大きな阻害効果があった。 腫瘍を切り出し、秤量した場合に、同様の結果が得られた。これらの結果は、 明らかに、悪性疾患に対するハロフギノンの効果の用量依存性を示す。 次いで、初代Ｔ５０膀胱癌腫の接種後にハロフギノンを投与して、ハロフギノ ンが依然として腫瘍の増殖および進行を阻害できるかを判定した。この目的で、 １×１０⁵のＴ５０膀胱癌細胞を皮下注射し、腫瘍が出現し、約０．３ｃｍ直径 のサイズに達するまで（これは約８−１０日要した）マウスを正常ダイエットに 維持した。次いで、該マウスに５ｍｇ／ｋｇハロフギノンを含有するダイエット を摂取させ、腫瘍接種後１８日および２４日に腫瘍サイズを測定した。図１Ｄお よび１Ｅに示すごとく、腫瘍増殖は、腫瘍細胞注射後８−１０日に与えた場合で さえ、ハロフギノンによって抑制された。事実、この群における腫瘍増殖の阻害 は、腫瘍細胞接種に２日先立ってハロフギノンを与えた場合に得られたものと同 様であった（各々、０．９９±０．５５ｃｍ³および０．５９±０．４３ｃｍ³、 ｎ＝８）。未処理群における腫瘍サイズは４．７８±１．８７ｃｍ³であった（ 図１Ｅ）。 加えて、１日当たりマウスにつき１μｇの量でハロフギノンを腹腔内投与し、 腫瘍細胞の注射は該日に開始した。第１８日に腫瘍増殖のかなりの阻害が得られ （０．５５±０．２８ｃｍ³−対−２．０９±０．８６ｃｍ³、処理マウス−対− 対照マウス、ｎ＝８）（図１Ｄ）、一方、腫瘍サイズの約５０％低下のみが第２ ４日に観察された（図１Ｅ）。腫瘍細胞接種後２７日に実験を終了した。この時 点で、各々、経口または腹腔内投与にてハロフギノンで処理したマウスの６３％ および７１％と比較して、対照マウスの２５％のみが生存した。腫瘍の出現後に 開始したダイエット中で与えたハロフギノンの生存効果は顕著さは低かった（３ ８％のみ生き残ったマウス）。ハロフギノンによるin situ膀胱癌の阻害 膀胱癌をin situにてＣ３Ｈマウスで誘導した第２の実験において、Ｃ３Ｈマ ウスを各々６匹マウスの２つの群に分割した。両群にその飲料水を介して０．０ ５％ＢＨＢＮ（Ｎ−ブチル−Ｎ−４−ヒドロキシブチルニトロソアミン）を摂取 させて癌を誘導し、それにより、ヒトにおける膀胱癌の発生に似させた。 実験群のマウスには５ｍｇ／ｋｇハロフギノンを含有するダイエットを摂取させ 、他方、対照群（ｎ＝６）には０．０５％ＢＨＢＮを摂取させ、かつ正常ダイエ ットを与えた。２６週間後、マウスを秤量し、腫瘍を切り出し、腫瘍組織の試料 を固定し、組織学的調査のために加工した。実験の結果を図１Ｆおよび１Ｇに示 す。 腫瘍のサイズの差異はヘマトキシリンおよびエオシンで染色した組織学的切片 で示され、図１Ｆａ（対照マウス）および１Ｆｂ（ハロフギノン処理マウス）に 提示する。対照群では、膀胱腫瘍進行の全ての特徴的段階（形成異常、in situ 癌、侵入性癌）が、上皮層、基底膜および膀胱被膜を通じて腫瘍細胞のかなりの 侵入を受けた全てのマウスで観察された（図１Ｇ、Ａ１およびＡ２）。対照的に 、ハロフギノン処理マウスでは、腫瘍形成の最初の段階（すなわち、形成異常） のみが明らかであった。基底膜を介する局所的細胞侵入が、膀胱被膜の貫通のな いただ１つの場合に観察された（図１Ｇ、Ｂ１およびＢ２）。２６週間の間にハ ロフギノンで処理したマウスの体重は、恐らくは、対照群における腫瘍それ自体 の過剰重量のため、対照群からのマウスの体重よりも２０−３０％低かった。ハロフギノンによるＥＨＳ腫瘍の阻害 第３の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにEngelbreth-Holm-Swarm（ＥＨＳ） 腫瘍を接種した。実験方法は以下の通りであった。まず、ＥＨＳ腫瘍を担持する 他の動物を犠牲にし、腫瘍組織を切り出し、無菌条件下でミンチした。ＥＨＳ腫 瘍は大量の基底膜成分によって特徴付けられる。０．２ｍｌのＰＢＳ中の腫瘍組 織の懸濁液を、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスの背中領域に皮下注射した。該マウスを 各々１０匹マウスの２つの群に分割した。実験群の動物に、腫瘍注射に先立って ３日間およびその後３週間の間、５ｍｇ／ｋｇハロフギノンを含有するダイエッ トを摂取させた。腫瘍サイズは、式Ｖ＝ＬＷ²／２を用い、２方向の腫瘍長さ測 定によって見積もった。実験の最終日に、すなわち、腫瘍注射の２０日後に、マ ウスを秤量し、腫瘍を切り出し、腫瘍組織の試料を固定し、組織学的調査のため に加工した。実験の定量的結果を図１Ｈおよび表３に示す。 ハロフギノンを摂取したＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍サイズは、図１Ｈに示す ように、各々、１．７２±１．８５ｃｍ³および８．１５±４．８８ｃｍ³の容量 である対照マウスと比較して約７５％だけ低下した。ハロフギノンの抗−腫瘍効 果は、腫瘍負荷のため、対照マウスのほぼ１．６倍高い体重（３３．３±２．４ ９ｇ）に対して、ハロフギノン摂取マウスのほとんど正常な体重（１９．７±０ ．４７ｇ）によって反映された。全てのマウスについてのデータを表３に示す。 ハロフギノンによる乳癌の阻害 第４の実験では、高度に攻撃的なヒト乳癌細胞（ＭＤＡ４３５、非転移ＭＣＦ −乳癌細胞系の攻撃的変種）をヌードマウスにマウス当たり１×１０⁶腫瘍細胞 にて皮下接種した。実験群（ｎ＝４）にはダイエット中にて５ｍｇ／ｋｇハロフ キノンを摂取させ、他方、対照群（ｎ＝４）はレギュラーダイエットに維持した 。目に見える腫瘍は４−５週内に出現し、該マウスを１５週後に犠牲にし、腫瘍 を切り出し、秤量した。各群内での高い変動にも拘わらず、ハロフギノン処理マ ウス（０．１４±０．１１ｇ）−対−未処理対照マウス（０．６５±０．４５ｇ ）において腫瘍重量の有意な（ｐ＜０．０２４）低下があった。 もう１つの実験において、一日置きに、マウス当たり１μｇの量でハロフギノ ンを腹腔内投与した。この実験では、ＣＤ１−ｎｕ無胸腺雌マウスにエスト ロゲン依存性非転移性親ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞系を注射した。該細胞を１×１ ０⁷細胞／０．５ｍｌの濃度でマウスの乳パッドに移植した。全ての動物に１７ β−エストラジオール(０．７２ｍｇ／ペレット、６０−日放出、Innovation Re search of America)の徐放ペレットを移植した。対照マウスの腫瘍が約１ｃｍ³ の平均サイズに達したら（移植の約１０週後）、腫瘍を切り出した（図１Ｊ）。 対照マウスおよび経口ハロフギノンで処理したマウスの外観は図１Ｋの写真のよ うに提示される。ハロフギノンによるメラノーマ腫瘍の阻害 第６の実験において、ヌードマウスをメラノーマ腫瘍で接種した。実験方法は 以下の通りであった。まず、１０⁶腫瘍細胞の懸濁液をヌードマウスの背中後方 領域に皮下注射した。該マウスを各々５匹の２つの群に分割した。実験群の動物 に一日置きにマウス当たり１μｇのハロフギノンを腹腔内注射し、腫瘍の接種の １週間前に開始し、接種後４週間の間注射した。対照マウスには生理食塩水を注 射した。結果を図１Ｌの写真に示す。 黒色の表面の大きなメラノーマ腫瘍が対照群の全てのマウスで観察された（− Ｈ）。ハロフギノンで処理した群では（＋Ｈ）、全てのマウスは、黒色の表面メ ラノーマ腫瘍段階に達しなかったかなり小さな腫瘍を有した。かくして、腫瘍増 殖の有意な阻害が、ハロフギノンを摂取しなかった対照群と比較して、ハロフギ ノンで処理したマウスで達成された。ハロフギノンによる脳腫瘍の阻害 第６の実験では、Fischerラットを脳腫瘍で接種した。ハロフギノンの分子量 は低く、ハロフギノンは疎水性であるので、該分子は脳血液関門（ＢＢＢ）を通 過できると予測された（実験結果によって支持される予測）。ＢＢＢは化学療法 エントリーを損なうという関心にも拘わらず、この関門は悪性病巣において選択 的に破壊され、従って、腫瘍は、隣接する正常脳よりも高用量の全身投与化学療 法を受けるであろう。しかしながら、動物およびヒト実験双方において、ほとん どの剤は、脳への転移に対するよりも全身腫瘍に対してより効果的 である。これは、恐らくは、脳腫瘍への化合物の不適切で遅い流入に関係する（ 低下した血流および浮腫形成に由来する増加した間隙圧力および増加した間隙圧 力）。 テストした脳腫瘍は、系統的皮下移植によって同質遺伝子Fischerラットに維 持された、メチルコラントレン−誘導悪性繊維状組織球腫の末処理ラット腫瘍系 であった。定位脳接種のために、小さな動物定位装置を用い、腫瘍細胞懸濁液を 成体Fischerラット（体重１８０−２００ｇ）の右大脳半球に注射した。ゼロ参 照点としてのブレグマでは、定位座標はＰ＝３．５；Ｌ＝２；Ｈ＝−４ｍｍであ った。頭部を水平位置に保持し、注射の容量は２μｌであった。ラット当たりの 注射した腫瘍細胞の数は１０⁵であった。 腫瘍細胞の接種に２日先立って開始して、１０匹のラットにハロフギノン（１ ６μｇ／ラット）の腹腔内注射を毎日接種させた。接種４日後に開始し、５ｍｇ ／ｋｇハロフギノンを腹腔内の代わりにダイエット中にて投与した。対照動物に は生理食塩水の腹腔内注射および正常ダイエットを摂取させた。腫瘍細胞の定位 注射後第９、１１、１３および１５日に、各群の動物のうちの２匹をペントバル ビタールの過剰用量で犠牲とした。目に見える腫瘍塊を秤量し、脳を迅速に摘出 し、カッティングチャンバー中に入れ、３−ｍｍ厚みの対照切片に切断した。目 に見える腫瘍塊を秤量し、３次元で測定した。各群の２匹の動物の腫瘍を病理学 的調査のために加工した。 腫瘍サイズの最も顕著な減少が、未処理対応動物と比較して、各ハロフギノン 処理ラットで観察された。事実、８匹のハロフギノン処理ラットのうち４匹は、 ８０ｍｍ³（第９日）ないし２６０ｍｍ³（第１３日）のサイズ範囲の腫瘍を有す る１０匹の対照動物と比較して、ほとんど目に見えない腫瘍であった(１−８ｍ ｍ³)（表４）。ハロフギノンの抗−腫瘍効果は、依然生きていた処理ラットと比 較して、１５日間未処理で放置した２匹のラットの死亡によって反映された。 ラットおよびマウスで行ったこれらの６つの別々の実験は、膀胱癌、乳癌、メ ラノーマ、ＥＨＳ肉腫および脳腫瘍を含めた、非常に種々の悪性疾患に対して、 in vivoで腫瘍の増殖および進行をハロフギノンが阻害できることを示す。脳腫 瘍の増殖および進行を阻害するハロフギノンの能力は特に興奮する程である。と いうのは、脳血液関門は多くの抗−新生物薬物の脳への侵入を制限するからであ る。マウスにおいてのin situ膀胱癌実験についての２６週間のような比較的長 期間のハロフギノンの投与は、増大した死亡率を引き起こさなかった。かくして 、ハロフギノンは非常に種々の癌で効果的かつ安全な処理を表し、その結果は先 行技術によって教示も示唆もされていない。 実施例２ ヒト平滑筋肉腫腫瘍細胞の増殖に対するハロフギノンの効果 ヒト平滑筋肉腫腫瘍細胞の増殖に対するハロフギノンの効果を調べた。平滑筋 肉腫腫瘍は豊富な細胞外マトリックスを有し、またよく血管化されている［A．F ernczyら，Cancer、第２８巻、１００４−１０１８頁（１９７１）］。それらの 増殖は、正常および悪性子宮筋相細胞［A．Zhangら、Endocrinology、第１３４ 巻、１０８９−１０９４頁（１９９４）；R.S.，Mangrulkerら、Biology of Rep roduction、第５３巻、６３６−６４６頁（１９９５）］によって生産され、周 囲ＥＣＭ［I．Vlodavskyら、Basement Membranes:Cellular and Molecular Aspe cts、D．H．RohrbachおよびR．Timpl編、Academic Press，Inc.、Orla ndo、フロリダ州、米国、３２７−３４３頁（１９９３）］に局所的に包埋され た増殖因子（すなわち、ｂＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ）に依存すると考えられる。 ヒト平滑筋肉腫腫瘍の試料は記載されているごとく外科的子宮摘出を受けた婦 人から得た[R.S．Mangrulkerら、前掲]。ミンチした組織を２０ｍｌの冷ホモゲ ナイゼーション緩衝液：１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス(ｐＨ７．４)、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ベンズアミジン、０．１％ＣＨＡＰＳ、０．０１％アプ ロチニン(Sigma)、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ[R．S．Ma ngrulkerら、前掲]に入れた。試料を２分間ホモゲナイズし、４℃で１２０００ ×ｇにて６０分間遠心した。上清を１０ｍＭトリス(ｐＨ７．４)で１：５希釈し て、１００ｍｌの最終容量とし、０．４５μｍナイロンフィルターで濾過した。 細胞を平板培養し、ＤＭＥＭ＋１０％胎児ウシ血清中に維持した。細胞は多数継 代にわたって生きていたが、２または３継代で用いた。 増殖アッセイでは、細胞を２００μｌの培地（４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ ％胎児ウシ血清、１％グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む ＤＭＥＭ）中、１０，０００細胞／ウェルにて、９６−ウェルプレート中で平板 培養し、密集するまで２日間インキュベートした。接種後２４時間に、濃度を増 加させてゆくハロフギノン（１０−１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した。培地を０． ５％子ウシ血清、１μＭインスリンおよび５μＭトランスフェリンを含むＤＭＥ Ｍに変更した。２４時間後、試料（５−１０μｌ）を添加し、さらに２４時間後 、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を各ウェルに添加した。３６−４８時 間のインキュベーションの後に、細胞をメタノールで固定し、ＤＮＡを５％トリ クロロ酢酸で沈殿させた。細胞を１５０μｌ／ウェルの０．３Ｎ ＮａＯＨで溶 解させ、シンチレーションバイアルに移し、β−カウンターで計数した。図２Ａ に示すように、［³Ｈ］チミジン取り込みの６０−７０％阻害剤が２．５ｎｇ／ ｍｌハロフギノンで得られた。 次いで、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン−結合性表皮細胞増殖因子）および血清−刺 激平滑筋肉腫細胞の増殖に対するハロフギノンの効果を調べた。平滑筋肉腫腫瘍 細胞を、０．５％ＦＣＳを含有する培地中での４８時間のインキュベーションに よって増殖阻止した。次いで、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌハロフギノンの 不在下または存在下で、１０％ＦＣＳまたは１０ｎｇ／ｍｌ ＨＢ−ＥＧＦいず れかに露出した（２４時間）。次いで、［³Ｈ］チミジンを添加し、ＤＮＡ合成 を３６時間後に測定した。血清またはＨＢ−ＥＧＦ双方によって誘導された細胞 増殖の完全な阻害が、図２Ｂに示すように、ハロフギノンの存在下で観察された 。 実施例３ ハロフギノンによるＩ型コラーゲン遺伝子発現の阻害 子宮筋層および平滑筋肉腫細胞を同一患者から採取し、１０％ＦＣＳを補足し たＤＭＥＭ中の１０ｃｍプレートに平板培養した。細胞が８０％密集に到達すれ ば、培地を４８時間で無血清ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡによって置き換え、洗浄 し、約３７℃にて、約４８時間、同一培地中の増大させる濃度のハロフギノンに 露出した。次いで、細胞を収穫し、Ｉ型コラーゲン遺伝子発現につきＲＮＡ抽出 およびノーザンブロット分析に付した。ハロフギノンは用量依存的にＩ型コラー ゲン遺伝子発現を阻害した（５．４および４．８ｋｂにおける産物）。 実施例４ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるハロフギノンによるＩＶ型コラゲナーゼ活性の阻害 腫瘍細胞はＥＣＭを消化する酵素を分泌し、細胞が隣接する組織を通って潜り 込み、他の組織に侵入するのを可能とする。多数の研究がマトリックス金属プロ テアーゼ（ＭＭＰ）、特にＩＶ型コラゲナーゼを腫瘍侵入および転移と結び付け てきた。ＩＶ型コラゲナーゼはユニークなｍＲＮＡによってコードされる２つの ７２および９２ｋＤａ蛋白質として出現する。 図３に示すように、Ｔ５０膀胱癌細胞培養におけるＭＭＰ２（７２ｋＤａのＩ Ｖ型コラゲナーゼ）の活性のかなりの阻害が２５ｎｇ／ｍｌハロフギノンの存在 下で発揮され、他方、ほとんど完全な阻害が１００ｍｇ／ｍｌハロフギノンで得 られた。密集下細胞培養を無血清ＤＭＥＭ中で６−２４時間インキュベートした 。コラーゲン分解活性を、ゼラチン含浸（１ｍｇ／ｍｌ、Difco、デトロイト、 ミシガン州）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ８％ゲルで測定した。略言すると、培 地試料を還元条件下で基質含浸ゲルで分離し、続いて２．５％トリトンＸ−１０ ０（ＢＤＨ、イングランド）中で３０分間インキュベートした。次いで、ゲルを 、ｐＨ７．５にて５０ｍＭトリス、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂、 ０．０２％ １３ｒｉｊ３５（重量／容量）中、３７℃で１６時間インキュベー トした。インキュベーション時間の最後に、ゲルをメタノール／酢酸／水（３０ ：１０：６０）中の０．５％クーマシーＧ２５０（Bio-Radリッチモンド、カリ フォルニア州）で染色した。種々のバンドの強度を区画化されたデンシトメータ ー（Molecular Dynamicsタイプ３００Ａ）で測定した。 また、Boydenチャンバー侵入アッセイを用い、ハロフギノンはマトリケルＥＣ Ｍを介する細胞侵入を阻害することが判明した（データは示さず）。このような 阻害は、従前に記載されているように、細胞増殖抑制活性を介してハロフギノン が腫瘍の増殖、進行および転移を阻害するパンスタシスメカニズムの一部として のＩＶ型コラーゲン阻害の包含を支持する。実施例５ in vitro におけるハロフギノンによる腫瘍マーカー遺伝子発現の阻害 Ｈ１９遺伝子は、組織分化が起こりつつある時に胎児発生の間にその発現がピ ークとなる発生学的に調節された遺伝子である。Ｈ１９遺伝子は親により付与さ れ、母性対立遺伝子によってのみ発現される。また、Ｈ１９遺伝子は、Wilms腫 瘍、副腎皮質癌、胚芽腫、横紋筋肉腫、肺癌、栄養膜腫瘍および膀胱癌のような 悪性疾患の初期段階に関連した腫瘍マーカー遺伝子でもある。実験方法は以下の 通りであった。 ＲＴ１１２および５３７６ヒト膀胱癌細胞系をハロフギノン（１３０ｎｇ／ｍ ｌ、接種後２４時間および７２時間に添加）の存在下で培養し、Ｈ１９遺伝子の 発現はノーザンブロット分析（Nagler，A,ら、Arterioscler；Thromb．Vasc．Bi ol.、第１７巻、１９４−２０２頁、１９９７）によって評価した。ハロフギノ ンへの露出の結果、図４に示すように、ＲＴ１１２および５３７６膀胱癌におけ るＨ１９遺伝子の発現が実質的に低下した。この結果は、膀胱癌におけるハロフ ギノンの抗−腫瘍形成効果についての実施例１のin vivo実験を確 証する。 また、このような阻害は、前記したように、ハロフギノンが、細胞増殖抑制活 性を介して腫瘍の増殖、進行および転移を阻害するパンスチシスメカニズムの一 部としてのＨ１９遺伝子発現の阻害の包含を支持する。 実施例６ in vivo におけるハロフギノンによるアポトーシスの誘導 アポトーシス、またはプログラムされた細胞死滅は、悪性細胞によって排除さ れた正常細胞内のメカニズムによって測定される。悪性細胞は、しばしば、アポ トーシスの不在のため「不滅」として記載される。ハロフギノンはin vivoで腫 瘍のアポトーシスを誘導することが示された。実験方法は以下の通りであった。 組織学的切片は実施例１からのマウスにおいてin situで誘導した膀胱癌腫の 周辺および中央領域から採取した。次いで、これらの切片を、デオキシヌクレオ チジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）標識技術［Holmgren，L.ら、Nat．Med.、 第１巻、１４９−１５３頁、１９９５］を用いて、断片化ＤＮＡのin situ標識 に付した。図５Ｂに示すように、かなり多数のアポトーシス細胞が、未処理対照 マウスに由来する腫瘍と比較して、経口ハロフギノン（１０ｍｇ／ｋｇ）処理Ｃ ３Ｈマウスの膀胱腫瘍に由来する切片で観察された。染色の低度のかなりの差異 も壊死を受ける腫瘍の中央に由来する組織切片で観察された（図５Ａ）。図６Ａ および６Ｃは未処理マウスの腫瘍を示し、他方、図６Ｂおよび６Ｄは、ハロフギ ノン処理マウスの腫瘍を示す。アポトーシスは、図５Ｂに示すように、アポトー シスが生きた細胞の中央における単一細胞死滅によって特徴付けられる点で壊死 とは異なる。ハロフギノンに応答して観察された増大したアポトーシス指標は、 いくつかの最近開発された抗−腫瘍形成剤で観察された、前記抗−腫瘍形成剤に よるものであろう。 総じて、約１０倍の大きさの増大したアポトーシス指標が、ハロフギノンを摂 取しなかった対照マウスと比較して、ハロフギノンを投与されたマウスから採取 した組織試料で観察された。このような阻害は、ハロフギノンが前記した ごとく細胞増殖抑制活性を介して腫瘍の増殖、進行および転移を阻害するパンス チシスメカニズムの一部としてのアポトーシスの誘導の包含を支持する。 実施例７ ハロフギノンによる細胞増殖の阻害 ハロフギノンの抗癌効果はｉ）コラーゲン合成およびマトリックス沈積（間質 支持体）；ｉｉ）腫瘍形成；およびｉｉｉ）腫瘍細胞増殖の直接的阻害剤に対す る効果に帰すことができる。in vitroに維持されたＴ５０膀胱癌および他の腫瘍 細胞系の増殖に対するハロフギノンの効果を従ってテストした。細胞を、１０％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で接種した（２４−ウェルプレートの１６ｍｍウェ ル当たり２０００細胞）。増大させる濃度のハロフギノンを２４時間後に添加し 、細胞を解離し、接種後の種々の日にコールターカウンターで計数した。結果は 以下の通りであった。 Ｔ５０膀胱癌細胞の完全な阻害が、３０ｎｇ／ｍｌハロフギノンで得られ、２ ５および１０ｎｇ／ｍｌではほとんどまたは全く効果がなかった（図７Ａ）。ヒ ト・メラノーマ（Ａ３７５）、前立腺（ＰＣ３）および乳癌（ＭＤＡ２３１、Ｍ ＤＡ４３５）細胞の増殖は、２５ｎｇ／ｍｌの濃度までハロフギノンによって影 響されず、１００ｎｇ／ｍｌハロフギノンの存在下でのみ部分的に阻害された（ 図７Ｂおよび７Ｃ）。同様に、ヒト骨髄系白血病細胞（ＨＬ６０）およびマウス Ｂリンパ腫細胞（Ｆ３２）に対するハロフギノンの小さな阻害効果があったに過 ぎない（図７Ｄ）。Ｔ５０膀胱癌におけるハロフギノンの抗−腫瘍効果は、マト リックス沈積、脈管形成および腫瘍細胞増殖に対する組合せ効果によるものであ ろう。 実施例８ 血管内皮細胞への³Ｈ−チミジン取り込みのハロフギノン−誘導阻害 血管内皮細胞の培養は従前に記載されているようにウシ大動脈から確立した［ D．Gospodarowiczら、Proc．Natl．Acad．Sci.、米国、第７３巻、４１２０頁（ １９７９）］。ウシ大動脈内皮細胞を、１０％ＣＯ₂湿潤化インキュベータ ー中、３７℃にて、１０％子ウシ血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ（１ｇグルコース／リットル）中 で平板培養した（４×１０⁴細胞／１６ｍｍウェル）。 平板培養から４日後、密集下細胞を、１ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦの不在下または 存在下で増大する濃度のハロフギノン（２５−５００ｎｇ／ｍｌ）に露出した。 次いで、³Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）をさらに４８時間添加し、トリク ロロ酢酸不溶性物質に取り込まれた放射能を測定することによってＤＮＡ合成を アッセイした［M．Benezraら，Cancer Res.、第５２巻、５６５６−５６６２頁 （１９９２）］；I．Vlodavskyら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.、第８４巻 、２２９２−２２９６頁（１９８７）］。 図８ＡはｂＦＧＦの不在下で得られた結果を示し、他方、図８ＢはｂＦＧＦの 存在下で得られた結果を示す。図８Ａおよび８Ｂで示されるように、³Ｈ−チミ ジン取り込みの５０％阻害は、ｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）が培地に添加されたか 否かに拘わらず、１００ｎｇ／ｍｌハロフギノンで得られた。 実施例９ 毛細血管様ネットワークへの内皮細胞の組織化 ハロフギノンははっきりとした構造への内皮細胞の組織化を妨げることが判明 し、これらの細胞が毛細血管様ネットワークに組織化するのを特異的に阻害した 。図９Ａおよび９Ｂに結果を示す。 Ｉ型コラーゲンは成体スプラグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラツトの尾腱か ら調製した。略言すれば、コラーゲン繊維は、滅菌した１／１０００（ｖ／ｖ） 酢酸溶液（１ｇのコラーゲンにつき３００ｍｌ）中、４℃で４８時間ゆっくりと 撹拌することによって可溶化した。得られた溶液を滅菌した三重ケージを通して 濾過し、４℃で１時間、１６，０００ｇで遠心した。次いで、上清を１／１０ ＤＭＥＭに対して十分に透析し、４℃で貯蔵した。コラーゲンマトリックスゲル は、コラーゲン溶液のｐＨおよびイオン強度を同時に上昇させることによって得 た。この目的で、７容量のコラーゲン溶液を１容量の１０Ｘ最小必須培地および ２容量の炭酸水素ナトリウム（０．１５Ｍ）と素早く混合し た［R．F．NicosaおよびA．Ottinetti，LabInvest、第６３巻、１１５−１２２ 頁（１９９０）］。 ウシ大動脈内皮細胞を２４−ウェルプレートの１６ｍｍウェルに接種し、２４ 時間増殖させ、密集下単層を得た。次いで、培地を取り除き、前記した冷コラー ゲン混合物０．４ｍｌを細胞単層の頂部に注ぎ、３７℃で１０分間重合させた。 ０．１μｇ／ｍｌハロフギノンを含む（図９Ｂ）または含まない（図９Ａ）ｂＦ ＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）およびヘパリン（１μｇ／ｍｌ）を含有する新鮮な培地（ ０．６ｍｌ）を、コラーゲンがゲル化した後に添加した。内皮細胞単層の再組織 化をモニターし、Zeiss逆走コントラスト写真顕微鏡で写真をとった［R．Monesa noら、J．Cell Biol.、第97巻、１６４８−１６５２頁（１９８３）］。 図９Ａは毛細血管様ネットワークへの内皮細胞の組織化を示す。このような組 織化は図９Ｂに示すようにハロフギノンによって阻害される。ハロフギノンはコ ラーゲンゲルへの内皮細胞の侵入および分岐し吻合する毛細血管様管のネットワ ークへのそれらの引き続いての組織化を完全に阻害した。 実施例１０ ミクロ血管の形成 ハロフギノンはラットから採取した大動脈組織の環からのミクロ血管形成を阻 害することが示された。この効果はハロフギノンの除去に際して可逆的であるこ とも示された。結果を図１０Ａ、１０Ｂ、１１および１２に示す。 胸大動脈は、断頭によって犠牲にした１月ないし２月齢ＳＤ(Sprague-Dawley) ラットから得た［R．F．NicosiaおよびA．Ottinetti，Lab．Invest.、第６３巻 、１１５−１２２頁（１９００）］。大動脈を直ちにＰＢＳを含むペトリ皿に移 した。大動脈の回りの繊維脂肪組織を解剖顕微鏡下で注意深く摘出し、１ｍｍ長 の大動脈環を切片化し、ＰＢＳ中で十分にすすいだ。 Ｉ型コラーゲン溶液（０．２ｍｌ）を各１６−ｍｍウェルに添加し、３７℃で １５分間ゲル化させた。各大動脈環を移し、ゲルの中央に位置させ、さらに０． ４ｍｌのコラーゲン溶液を該環の頂部に注意深く注いだ。ゲルが形成され た後、０．１μｌ／ｍｌハロフギノンを含むまたは含まない無血清内皮細胞増殖 培地０．４ｍｌを添加し、培地を一日置きに交換した。 図１０Ａは、新たに形成された分岐ミクロ血管が大動脈の再切片の端部から発 達し、ループおよびネットワークを生起する第１０日における培養を示す。図１ ０Ｂは一日置きに交換した０．１μｇ／ｍｌハロフギノンで処理した同一培養を 示す。これらの条件下で、単細胞が大動脈環から周辺に向けて移動していたが、 ミクロ血管への配置はしなかった。 図１１は増大する用量のハロフギノンにてのこの効果を定量的に示す。ミクロ 血管形成のほとんど完全な阻害剤は１００ｎｇ／ｍｌのハロフギノンで得られた 。完全な阻害は２５０ｎｇ／ｍｌハロフギノンの存在下で観察された。図１２に 示すように、この効果は第２日の薬物の除去に際して逆となった。このような除 去の結果、未処理大動脈環で観察されたものと同様のミクロ血管が得られた。 実施例１１ 培養した内皮細胞のＥＣＭへのスルフェート取り込みのハロフギノン阻害 図１３および後記他の実施例に示すごとく、ハロフギノンはＥＣＭ（細胞外マ トリックス成分）の沈積に対する阻害効果を有することが示された。 ウシ角膜内皮細胞の培養は、去勢ウシの目から確立し、従前に記載されている ように維持した［D．Gospodarowiczら、Exp．Eye Res.、第２５巻、７５−８９ 頁（１９７７）］。細胞を１０％ＣＯ₂湿潤化インキュベーター中にて３７℃で 培養し、実験は初期（３−８）細胞継代にて行った。 スルフェート−標識ＥＣＭ（過剰細胞マトリックス）の調製のために、角膜内 皮細胞を密集密度にて４−ウェルのプレートに接種し、４−６時間以内に、密に 並んだ増殖が阻止された細胞よりなる接触阻止された細胞単層を形成した。これ らの条件下、細胞は生きたままであり、２μｇ／ｍｌハロフギノンの濃度までは それらの正常な単層形状および形態学的外観を保持した。接種の１日および５日 後にＮａ₂［³⁵Ｓ］Ｏ₄（５４０−５９０ｍＣｉ／ミリモル）を添加し（４０μＣ ｉ／ｍｌ）、培養を培地を変化させることなくインキュベートした。 接種後、種々の間隔にて、細胞層を０．５％トリトンＸ−１００および２０ｍＭ ＮＨ₄ＯＨを含有するＰＢＳで溶解させ（５分間、室温）、続いてＰＢＳ中で ４回洗浄することによって、内皮細胞下ＥＣＭを露出させた［I．Vlodavskyら、 Cancer Res.、第４３巻、２７０４−２７１１頁（１９８３）；I．Vlodavskyら 、Proc．Natl．Acad．Sci．USA）第８４巻、２２９２−２２９６頁（１９８７） ］。スルフェート標識物質の全量を測定するために、ＥＣＭをトリプシン（２５ μｇ／ｍｌ、２４時間、３７℃）で消化し、可溶化した物質をβ−カウンターで 計数した。 図１３は、１μｇ／ｍｌハロフギノンによるスルフェート取り込みのほとんど 完全な阻害を示し、０．２μｇ／ｍｌの該薬物の存在下で５０％阻害が得られた （データは示さず）ことを示す。 実施例１２ ウシ角膜内皮細胞のＥＣＭへの スルフェートプロリン、リシンおよびグリシンの取り込みの阻害 角膜内皮細胞を密集密度で接種し、前記実施例１１に記載したように増殖させ た。Ｎａ₂ ³⁵ＳＯ₄（図１４Ａ）、³Ｈ−プロリン（図１４Ｂ）、¹⁴Ｃ−リシン（ 図１４Ｃ）または¹⁴Ｃ−グリシン（図１４Ｄ）いずれかの存在下、細胞をハロフ ギノンと共にまたはそれ無くして培養した。接種の８日後、実質的には前記実施 例１１に記載したように細胞層を溶解させた。次いで、下に存在するＥＣＭをト リプシン処理して、実質的には前記実施例１１に記載したように、標識物質の全 蛋白質への取り込みに対するハロフギノンの効果を測定するか、あるいはコラゲ ナーゼおよびトリプシンでの連続的消化に付して、コラゲナーゼ消化性蛋白質（ ＣＤＰ）および非コラゲナーゼ消化性蛋白質（ＮＣＤＰ）双方に対するハロフギ ノンの効果を評価した。 図１４Ａ−１４Ｄが示すように、ハロフギノンはスルフェート、プロリン、リ シンおよびグリシンのＣＤＰおよびＮＣＤＰ双方への取り込みを阻害し、これは マトリックス沈積のかなりの阻害を反映する。コラーゲン以外のＥＣＭ成分の沈 積に対するハロフギノンの阻害効果は、最もありそうなのは、ＥＣＭの 超分子構造への他の成分の組み立てにおけるコラーゲンの関与によるものらしい 。あるいは、ハロフギノンは、恐らくは、いくつかのＥＣＭ成分の合成および沈 積に影響する、ＴＧＦβのような普通の転写因子またはサイトカインを介して、 コラーゲン以外のＥＣＭ成分の合成に影響するのであろう。 実施例１３ ラット糸球体間質細胞ＥＣＭへのスルフェートおよびグリシン取り込みの阻害 接種２４時間後に、ラット糸球体間質細胞を密集するまで増殖させた。次いで 、該細胞を、Ｎａ₂ ³⁵ＳＯ₄（図１５Ａおよび１５Ｂ）または¹⁴Ｃ−グリシン（図 １５Ｃおよび５Ｄ）いずれかの存在下、ハロフギノンと共にまたはそれ無くして 培養した。接種８日後、細胞層を溶解させて、下に存在するＥＣＭを露出させ、 洗浄し、コラゲナーゼで消化して、図１５Ａおよび１５Ｃに示したごとくに、Ｃ ＤＰ蛋白質に対するハロフギノンの効果を測定した。残存する物質をトリプシン で消化し、β−シンチレーションカウンターに付して、図１５Ｂおよび１５Ｄに 示したように、ＮＣＤＰ蛋白質に対するハロフギノンの効果を測定した。 スルフェート取り込みの約３０％阻害がＣＤＰ蛋白質で観察され、他方、約７ ０％阻害が２００ｎｇ／ｍｌハロフギノンの存在下でのＮＣＤＰ蛋白質で観察さ れた。ハロフギノンによるＥＣＭ沈積の阻害はその抗増殖活性によるものではな かったことに注意すべきである。というのは、薬物を高度に密集した非分裂性細 胞に添加されたからである。無機スルフェートは第一に硫酸化グリコサミノグリ カンに取り込まれ、コラーゲンには取り込まれなかったので、ハロフギノンは、 Ｉ型コラーゲン合成を阻害することによって、コラーゲンと特異的に相互反応し てＥＣＭを形成することが知られているヘパリン硫酸プロテオグリカンのように 、他のＥＣＭマクロ分子の組み立てに干渉し得る。 グリシン取り込みの約８０％阻害が、５０ｎｇ／ｍｌハロフギノンの存在下で ＣＤＰおよびＮＣＤＰ蛋白質双方で観察された。コラゲナーゼ−消化性ＥＣＭ蛋 白質の沈積に対するハロフギノンの阻害効果は、スルフェート−標識マトリック スでよりもグリシン−標識マトリックスでより顕著であった。というの は、グリシンとは異なり、スルフェートは、コラゲナーゼによって消化されない グリコサミノグリカンに第一に取り込まれるからである。ＥＣＭ沈積のかなりの 阻害が、露出された培養皿の鏡検によって支持され、これはハロフギノンの存在 下で生成した薄い層または層が生成しないことを明らかとした。 実施例１４ in vivo 新生血管形成に対するハロフギノンの阻害効果 ハロフギノンはin vivoモデルで脈管形成を阻害することが示された。このよ うな阻害効果は、ＥＣＭ成分の沈積によって可能となる細胞増殖を阻害するハロ フギノンの能力を示す。結果を図１６Ａおよび１６Ｂ、ならびに後記の他の実施 例に与える。 ネズミ角膜脈管形成モデルを用いて、in vivoでのハロフギノンの阻害効果を 評価した。脈管形成因子ｂＦＧＦを、徐放ポリマーで作成されたペレット中にて 、Ｃ５７Ｂ１／６マウスの角膜ポケットに適用し、ハロフギノン（２μｇ／マウ ス／日）を５連続日腹腔内投与した（Kenyon，B．M.ら、Invest．Opthal．Visua l Sci.、第３７巻、１６２５−１６３２頁、１９９６）。 手術後５日に、マウスをメトキシフルランで麻酔し、目を脱出させ、四肢血管 叢の基部からペレットまで伸びる新生血管形成ゾーンの最大血管長さ（ＶＬ）を スリットランプを介して直線レチクルで測定した。新生血管形成の近接周囲ゾー ン（ＣＨ）を３６０度レチクルで時計時間として測定した。目を第５日に写真に とり、スライドを用いて、平方ミリで表した新生血管形成の面積を測定した（Ke nyon，B.M.ら、Invest．Ophthal．Visual Sci.、第３７巻、１６２５−１６３２ 、１９９６）。 神経血管形成の面積は、以下の式： ［式中、Ａは面積であり、ＣＨは新生血管形成の近接周辺ゾーンであって、ＶＬ は最大血管長さである］ に従って計算した。 ハロフギノンを食物中（５ｍｇ／ｋｇ）にて、または点眼剤（１００および２ ００ｎｇ／ｍｌ、１日当たり３回適用）の形態で投与した。対照マウスはレギュ ラーダイエットを接種させた。各群は５匹のマウスを含んだ。手術７日後、角膜 をスリットランプバイオミクロスコピーによって調べて、新生血管応答を測定し 、写真をとった。脈管形成は、新生血管形成（ＣＨ）の近接周囲ゾーンのように 、四肢血管およびペレットからの新生血管形成の最大血管長さ（ＶＬ）としてｍ ｍにて測定した。 図１６に示すごとく、角膜縁からペレットへの新生血管形成は対照マウスの目 で起こった（図１６Ａ）。ペレットに対する新生血管応答のかなりの阻害が経口 ハロフギノンを摂取したマウスで観察された（図１６Ｂ）。対照群における新生 血管形成の平均面積は、経口ハロフギノンを摂取したマウスにおける０．１５± ０．２ｍｍ²と比較して、１．５９±０．２５ｍｍ²であった（図１６Ｃ）。 図１６Ｃおよび１６Ｄに示すように、ハロフギノンの１日３回の局所適用は、 １００ｎｇ／ｍｌ（０．９３＝０．６２ｍｍ²、ｐ＜０．００１）および２００ ｎｇ／ｍｌ（０．５６±０．６ｍｍ²；ｐ＜０．００１；〜９５％阻害）双方に おいて新生血管形成の有意な阻害を生じた。未処理群で第１０日に測定した新生 血管ゾーンは、ダイエット中にてハロフギノンを摂取したマウスにおける０．２ ３±０．４７（〜９５％阻害；ｐ＜０．００１）と比較して、４．９２±１．９ ６ｍｍ²であった（図１６Ｄ）。 局所適用したハロフギノンの濃度を５００および１０００ｎｇ／ｍｌまで増加 させ、１日当たり３回与えた。新生血管形成をｂＦＧＦペレットの移植後４、７ および１０日に評価した。従前の実験と同様に、経口ハロフギノンは１０００ｎ ｇ／ｍｌ（４０−５０％阻害）において局所投与されたハロフギノンよりも効果 的であった（〜７０％阻害）。また、この高濃度のハロフギノンにおいてさえ、 目の局所的硬化または刺激はなかった。新しく形成された血管の退行が第１０日 に観察された（図１６Ｅ）。 腹腔内投与した（１μｇ／マウス／日）ハロフギノンの抗−脈管形成効果を、 投与の経口および局所様式の効果と比較した。ハロフギノン（腹腔内、第７日） は新生血管形成を未処理群の１．７５ｍｍ²から０．６３ｍｍ²（ｐ＜０．０５） まで阻害し、これは同一実験における経口ハロフギノンの効果（０．６５ｍｍ² ）と同様である。また、１つの実験において、ハロフギノンの抗−脈管形成効果 をＣ３Ｈマウスでテストし、結果はＣ５７ＢＬマウスで得られたものと同様であ った。 かくして、結果は、ハロフギノンが、経口または腹腔内投与した場合に共に効 果的である優れたかつ非毒性の抗−脈管形成化合物であることを示す。ハロフギ ノンは、もっともらしくは、所望の一定濃度を達成することなく洗浄されたこと より、点眼剤として局所適用された場合に効果が低かった。ハロフギノンは経口 投与された場合に抗−脈管形成効果を発揮する文献記載の最初の化合物であるよ うである。 実施例１５ インテグリン発現の阻害 インテグリンは血管形成および脈管形成においてin vivoで機能することが示 されている。β１サブユニットに対する中和抗体の中和はウズラ胚の大動脈ルー メンの形成をブロックした（Drake，C.J.ら、in vivo．Dev．Dyn、第１９３巻、 ８３−９１頁、１９９２）。同業者は、α_vβ₃が、血液血管増殖に必要であると いう証拠を提供してきた（Brooks，P.C.ら、Science）第２６４巻、５６９−５ ７１頁、１９９４）。α_vβ₃インテグリン複合体に対する抗体（ＬＭ６０９）は 血管増殖を阻害し、また、ＣＡＭアッセイにおけるＦＧＦ−２刺激もしくは腫瘍 −誘導脈管形成を阻害したが、予め存在する血管を破壊しなかった。抗−α_vβ₃ ｍＡｂが脈管形成を破壊するメカニズムはアポトーシスを含むようである。α_v β₃インテグリンまたはＬＭ６０９モノクローナル抗体の環状ＲＧＤペプチドア ンタゴニストの単一血管内注射は、ＣＡＭへ移植されたヒト腫瘍の迅速な退行に 導く。α_v遺伝子および従ってα_vβ₃インテグリンを発現しない腫瘍細胞は、そ の接着能力を喪失し、無胸腺ヌードマウスへの移植に際してかなり低下した腫瘍 形成性を示した。これらの細胞に対するα_vｃＤＮＡの安定なトランスフェクシ ョンの結果、その腫瘍形成能力の十分な回復が得られる（Felding-Haberman，B. ら、J．Clin．Invest.、第８９巻、２０１８−２０ ２２頁、１９９２）。さらに、ハロフギノンは脈管形成および腫瘍増殖を阻害す ることが判明した。 従って、高度に攻撃的なＭＤＡ４３５ヒト乳癌細胞系においてα_v、β₃および β₅インテグリンサブユニットの発現について、ハロフギノンの効果を調べた。 増大させる濃度の（１０−４００ｎｇ／ｍｌ）のハロフギノンの不在下（図１７ 、レーンＡおよびＢ）または存在下で細胞を２４時間（レーンＣ：４００ｎｇ／ ｍｌ）、４８時間（レーンＤ−Ｇ：各々、１０、５０、２００および４００ｎｇ ／ｍｌ）または７２時間（図１７、レーンＨ：４００ｎｇ／ｍｌ）培養した。全 ＲＮＡを抽出し、１．１％ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動に付し、 ナイロン膜に移し、α_vに対応する³²Ｐ−標識ＰＣＲプローブとハイブリダイズ させた。図１７に示すように、４８時間の乳癌細胞の１０および５０ｎｇ／ｍｌ ハロフギノンへの露出の結果、α_vｍＲＮＡが上昇調節された（図１７、レーン ＤおよびＥ）。この効果は高濃度（２００−４００ｎｇ／ｍｌ）のハロフギノン で最小であった（図１７、レーンＦ−Ｈ）。次に、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＭＤ Ａ４３５乳癌細胞によるβ₃およびβ₅インテグリン鎖の発現に対するハロフギノ ンの効果を分析した。図１８に示すように、ハロフギノンはβ₃ｍＲＮＡの発現 を用量依存的に阻害し、２００ｎｇ／ｍｌにおいてほとんど完全な阻害を生じた （図１８、レーン１：対照；レーン２−５：各々、１０、５０、２００および４ ００ｎｇ／ｍｌハロフギノンへの２４時間露出）。対照的に、β₅ｍＲＮＡの発 現に対して効果はなかった。α_vβ₃インテグリン複合体は腫瘍脈管形成で重要な 役割を演じるので、ハロフギノンの抗−脈管形成効果は、部分的には、β₃遺伝 子発現のその阻害によって媒介され得る。 実施例１６ ハロフギノンの投与用の適当な処方 ハロフギノンは当該分野でよく知られた多数の方法にて対象に投与することが できる。以後、「対象」なる用語は、ハロフギノンが投与されたヒトまたは下等 動物をいう。例えば、投与は、局所（眼内、膣内、直腸、鼻孔内を含む）、経口 、または非経口、例えば、静脈内点滴または腹腔内、皮下または筋肉内注 射により行うことができる。 局所投与用の処方は、ローション剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、滴剤、液 剤、スプレー剤および散剤を含むことができるが、それらに限定されるものでは ない。通常の医薬担体、水性、粉末もしくは油性基剤、増粘剤等は必要であるか 、あるいは望ましいであろう。 経口投与用の組成物は、散剤もしくは顆粒剤、水中もしくは非水媒体中の懸濁 剤もしくは溶液剤、カシェ剤、カプセル剤または錠剤を含む。増粘剤、希釈剤、 フレーバー剤、分散助剤、乳化剤または結合剤は望ましいであろう。 非経口投与用の処方は、緩衝剤、希釈剤および他の適当に添加剤も含有するこ とができる滅菌水性溶液を含むことができるが、これらに限定されるものではな い。 投与は、徴候のひどさに、およびハロフギノンに対する対象の応答性に依存す る。当業者であれば、最適用量、投与方法および反復速度を容易に決定できるで あろう。 実施例１７ 悪性疾患の処置の方法 前記したように、ハロフギノンは、脈管形成を阻害することによって腫瘍の進 行の効果的な阻害剤であることが示された。以下の実施例は、ハロフギノンで悪 性疾患を治療する方法を例示するに過ぎず、限定的であることを意図するもので はない。 該方法は、前記実施例１６に記載された医薬上許容される担体中にてハロフギ ノンを治療すべき対象に投与する工程を含む。ハロフギノンは、好ましくは、対 象から採取した試料中の特定の腫瘍マーカーの不在のように、所定の終点に到達 するまで、効果的な投与方法に従って投与される。 このような処置が効果的である腫瘍の例は、限定されるものではないが、乳癌 、小細胞胚癌のように肺癌、骨癌、膀胱癌腫のような膀胱癌、横紋筋肉腫、血管 肉腫、結腸、前立腺または膵臓の腺癌、頸部の鱗状細胞癌、卵巣眼、悪性繊維状 組織球腫、悪性メラノーマのように皮膚癌、平滑筋肉腫、星状細胞腫、 神経膠腫および肝細胞癌を含む。 実施例１８ ハロフギノン含有試薬の製造方法 以下はハロフギノンを製造する方法の例である。まず、良好な医薬製造プラク ティスに従ってハロフギノンを合成する。ハロフギノンおよび関連キナゾリノン 誘導体を合成する方法の例は米国特許第３，３３８，９０９号に与えられる。次 に、再度、良好な医薬製造プラクティスに従って、前記実施例１６に記載したよ うに、ハロフギノンを適当な医薬担体中に配合する。 限定された数の実施形態に関して本発明を記載してきたが、本発明の多くの変 形、修飾および他の適用をなすことができることは認識されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 パインズ マーク イスラエル レホボット 76308 ピンス カー ストリート 12Ｂ (72)発明者 ネイグラー アーノン イスラエル エルサレム 74381 スデロ ット ヘルツル 46 (72)発明者 ブロダフスキー イスラエル イスラエル メバセレット ジオン 90805 アルベル ストリート 34 (72)発明者 ミヤオ ファ チュアン イスラエル エルサレム 91120 ハダシ ャー アイン―ケレム リムランド 14

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．医薬上許容される担体と組み合わされた医薬上有効量の化合物を含む、腫 瘍を治療するための組成物であって、該化合物が式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシよりなる群のメンバーである］ を有する群のメンバーまたはその医薬上許容される塩である該組成物。 ２．該化合物がハロフギノンまたはその医薬上許容される塩である請求項１記 載の組成物。 ３．該腫瘍が乳癌、肺癌、骨癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、結腸、前立 腺または膵臓の腺癌、頸部の鱗状細胞癌、卵巣眼、悪性繊維状組織球腫、皮膚癌 、平滑筋肉腫、星状細胞腫、神経膠腫および肝細胞癌よりなる群から選択される 請求項１記載の組成物。 ４．該乳癌が乳房の侵潤性管癌腫である請求項３記載の組成物。 ５．該膀胱癌が膀胱癌腫である請求項３記載の組成物。 ６．該皮膚癌が悪性メラノーマである請求項３記載の組成物。 ７．医薬上許容される担体と組み合わされた医薬上有効量の化合物を含む、新 生血管形成を実質的に阻害するための組成物であって、該化合物が式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシよりなる群のメンバーである］ を有する群のメンバーまたはその医薬上許容される塩である該組成物。 ８．医薬上許容される担体と組み合わされた医薬上有効量の化合物を含む、腫 瘍細胞のアポトーシスを誘導するための組成物であって、該化合物が式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシよりなる群のメンバーである］ を有する群のメンバーまたはその医薬上許容される塩である該組成物。 ９．医薬上許容される担体に医薬上有効量の化合物を配合する工程を含むこと を特徴とする、腫瘍を治療するための医薬を製造する方法であって、該化合物が 式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ を有する群のメンバーまたはその医薬上許容される塩である該方法。 １０．医薬上許容される担体に医薬上有効量の化合物を配合する工程を含むこ とを特徴とする、新生血管形成を実質的に阻害するための医薬を製造する方法で あつて、該化合物が式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ を有する群のメンバーまたはその医薬上許容される塩である該方法。 １１．医薬上許容される担体に医薬上有効量の化合物を配合する工程を含むこ とを特徴とする、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するための医薬を製 造する方法であって、該化合物が式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ を有する群のメンバーまたはその医薬上許容される塩である該方法。 １２．医薬上有効量の式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ の化合物またはその医薬上許容される塩を含む、細胞外マトリックスの沈積によ って可能となる細胞増殖を阻害するための組成物。 １３．医薬上有効量の式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ の化合物またはその医薬上許容される塩を含む、細胞移動を阻害するための組成 物。 １４．医薬上有効量の式： ［式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニル、お よび低級アルコキシよりなる群のメンバーであり、 Ｒ₂はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシよりなる群のメンバーで あり、 Ｒ₃は水素および低級アルケノキシ−カルボニルよりなる群のメンバーである ］ の化合物またはその医薬上許容される塩を含む、転移を阻害するための組成物。