KR100236765B1 - C형 간염 바이러스의 외피 1 및 외피 2 단백질의 항원 결정부위 확인 - Google Patents

Abstract

본 발명은 C 형 간염 바이러스(이하 “HCV”라 함)의 외피 1 및 외피 2 단백질의 항원 결정 부위에 관한 것이다.

보다 상세하게는 HCV의 외피 1 및 외피 2 유전자로부터 발현된 외피 1 및 외피 2 단백질 절편을 사용하여 C 형 간염 환자의 혈청과 특이적으로 반응하는 주 항원 결정부위(immunodominant epitope)를 확인함으로써 제공된, 짧은 길이를 가지면서도 C형 간염 환자의 혈청과 특이적으로 반응하는 항원 결정부위를 포함하고 항원 단백질에 관한 것이며, 또한 HCV의 외피 1 또는 외피 2 단백질의 항원 결정부위의 유전자를 유비퀴틴 유전자와 결합된 상태로 포함하여 그의 발현시 HCV의 외피 1 또는 외피 2 단백질의 항원 결정 부위 단백질과 유비퀴틴을 포함하는 융합단백질을 생산하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 사용하여 HCV의 외피 1 또는 외피 2 단백질의 항원 결정 부위를 포함하는 항원 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

C형 간염 바이러스의 외피 1 및 외피 2 단백질의 항원 결정부위 확인

제1도는 중합효소 연쇄반응으로 외피 유전자 절편을 증폭시키기 위한 시발체들의 위치를 도시한 것이고,

제2도는 C형 간염 바이러스의 외피 1 및 외피 2 유전자 절편의 발현 벡터를 도시한 것이고,

제3(a)도는 외피 1 및 외피 2 유전자 절편들의 발현을 SDS 폴리아크릴아미드젤 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며,

제3(b)도는 외피 1 및 외피 2 유전자 절편의 발현물을 C형 간엽 환자의 혈청으로 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 것이다.

제4도는 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 1 단백질의 카르복실 말단(HCV 염기서열 1201 번 내지 1509 번)의 염기 서열 및 아미노산 서열(표준 단일약자로 나타냄)을 나타낸 것이다.

제5도는 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 2 단백질의 아미노 말단(HCV 염기서열 1510 번 내지 1749 번)의 염기 서열 및 아미노산 서열(표준 단일약자로 나타냄)을 나타낸 것이다.

제6도는 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 2 단백질의 카르복실 말단(HCV 염기서열 2281 번 내지 2529 번)의 염기 서열 및 아미노산 서열(표준 단일약자로 나타냄)을 나타낸 것이다.

본 발명은 C형 간염 바이러스(이하 “HCV”라 함)의 외피 1 및 외피 2 단백질의 항원 결정 부위에 관한 것이다.

보다 상세하게는 HCV의 외피 1 및 외피 2 유전자로부터 발현된 외피 1 및 외피 2 단백질 절편을 사용하여 C형 간염 환자의 혈청과 특이적으로 반응하는 주 항원 결정부위(immunodominant epitope)를 확인함으로써 제공된, 짧은 길이를 가지면서도 C형 간염 환자의 혈청과 특이적으로 반응하는 항원 결정 부위를 포함하는 항원 단백질에 관한 것이며, 또한 HCV의 외피 1 및 외피 2 단백질의 항원 결정부위의 유전자를 유비퀴틴 유전자와 결합된 상태로 포함하여 그의 발현시 HCV의 외피 1 및 외피 2 단백질의 항원 결정 부위 단백질과 유비퀴틴을 포함하는 융합단백질을 생산한는 발현벡터, 상기 발현벡터를 사용하여 HCV의 외피 1 또는 외피 2 단백질의 항원 결정 부위를 포함하는 항원 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근까지 바이러스성 간염은 A형 간염바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), 델타 간염바이러스(HDV), 사이토 메갈로 바이러스(CMV) 및 엡스틴바 바이러스(EBV)에 의해 발병되는 것으로 알려져 왔으나, 상기의 간염과는 달리 수혈 후 발병되는 간염의 90%를 차지하는 비A비B형 간염(NANBH) 바이러스가 확인 되었다(Alter, H.J., et al., Lancet 2, 838-841(1975)). 이 비A비B형 간염 바이러스에 감염된 간염환자가 전 세계적으로 매년 약 백만명씩 생기는 것으로 추정되며(Alter, H.J., A.J.Zuckerman(ed.), Viral Hepatitis and Liver Disease, 537-542, Alan R. Liss, New York(1988)), 이중 약 40-50%가 만성 간염으로 진전되고, 또 이중 약 20% 정도가 간 경변 및 간암으로 진전된다는 사실이 밝혀졌다(Dienstag, J.L., et al., Seminar Liver Dis. 6, 67-81(1986)).

브래들리(Bradley)등은 NANBH 환자의 혈장을 침팬지에 감염시켜 비A비B형 바이러스(이하 HCV이라 함)의 분리 및 회수가 가능함을 보고하였고(Bradley, D. W. et al., Gastroenterology, 88, 773-779(1985)), 츄(Choo)등은 이 바이러스가 양성가닥 리보핵산(positive-stranded RNA) 바이러스로서 약 10,000개의 염기로 이루어져 있으며 약 3010- 3011개의 아미노산으로 이루어진 다단백질 전구체를 코딩하는 하나의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 가지는 것으로 보고하였다(Choo, Q.L., et al., Science 244, 359-362(1989); Choo, Q.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455(1991)).

C형 간염 바이러스의 유전자 구조는 플라비바이러스(flavivirus) 및 페스티바이러스(pestivirus)의 유전자 구조와 유사성을 가지며, 이들의 유연관계로 미루어 C형 간염 바이러스의 다단백질(polyprotein)은 아미노 말단으로부터 핵(core)-외피 1(envelope 1)-외피 2/비구조1(E2/NS1)-비구조2(NS2)-비구조3(NS3)-비구조4 (NS4)-비구조5(NS5) 순서로 구성되어 있는 것으로 추정하고 있다(Choo, Q.L., et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88, 2451-2455(1991); Takamizawa, A., et al., J. Virol. 65, 1105-1113(1991); Kato, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 6524-6528(1990)).

외피 1 및 외피 2/비구조1 단백질(이하 외피2 단백질이라 함)은 생체외(in vitro) 실험을 통해 분자량이 각각 33,000, 72,000 달톤의 크기를 갖는 당단백질임이 밝혀졌고(Houghton, M., et al., Hepatology 14, 381-388(1991); Hijkata, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5547-5551(1991)), 플라비바이러스의 백신으로 추정되는 비구조1 단백질 및 페스티바이러스의 백신으로 추정되는 gp53/55 단백질과 상당한 구조적 유서성을 가지고 있어 C형 간염 바이러스의 잭신 개발 및 치료제 개발에 1차적 목표가 되어왔다(Spete, R.R. et al., Virology 188, 819-830(1992)).

비구조3 단백질은 바이러스 단백질 분해효소로서 비구조 유전자가 코딩하는 비구조 단백질들을 절단하여 각각의 비구조 단백질들을 생성하는 것으로 추정되고 있으며(Bajan, J.F, Virology 171, 637-639(1989)), 비구조5 단백질은 지금까지 알려진 바이러스 리보핵산 중합효소의 아미노산 서열과 상당히 유사하여 C형 간염 바이러스의 리보핵산 중합효소(RNA polymerase)로 추정되고 있다(Mita, E., et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 183, 925-930(1992)).

C형 간염 바이러스의 감염에 대한 진단방법은 초기에 미국 카이론사의 츄등이 부분적인 2개의 비구조 유전자 절편(NS3/NS4)을 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 유전자와 융합시켜 효모에서 융합단백질 SOD-C100-3를 발현시키고 이를 사용하여 효소면역 측정법에 의해 수혈성 간염환자의 70% 이상이 이 항원에 대한 항체를 가지고 있음을 증명하였다(Kuo, G., et al., Science 244, 362-384(1989)). 그러나 많은 환자의 경우 C100-3에 대한 항체가 C형 간염 바이러스 감염 후 4 내지 6개월이 지난 후에 생성되어 초기의 급성 간염환자에게서는 정확한 진단이 불가능하다는 단점(Alber, H.J. et al., N Engl. J. Med 321, 1494- 1500(1989); Miyamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 983-987(1990)) 및 C형 간염이외의 자가면역성 질환(autoimmune disease)등에 기인한 간염화자의 경우에서도 상당한 비율로 양성 반응이 나타나는 단점이 있음이 보고되었다(McFarlane, I.G., et al., Lancet 335, 754-757(1990)).

최근에 C형 간염 바이러스의 5′말단에 위치한 핵(core)구조 유전자로부터 발현시킨 핵 단백질을 사용한 진단방법의 경우 C100-3를 사용한 진단방법에 비해 약 6 내지 8 주 일찍 항체를 진단할 수 있음이 확인되어 기존의 C100-3 항원만을 사용한 제1세대 진단방법보다 조기진단이 가능하고 민감한 진단방법임이 보고되었다(Harada, S. et al., J. Virol. 65, 3015(1991)). 미국의 UBI사는 핵 구조 유전자로부터 15내지 65개 아미노산으로 구성된 합성 폴리펩타이드를 이용하여 특이도가 더 높은 개선된 진단방법을 보고하였고(Wang, C.Y., EP 442394(1991)), 기존의 C100-3 항원에 핵 구조유전자 유래 C22 및 비구조 3 유전자 유래의 C33C를 첨가한 제2세대 진단방법을 개발하여 HCV 항체에 대한 민감도와 특이도를 더욱 증가시킬 수 있음을 보고하였다(Van der poel, C.L., et al. Lacet 337, 317-319(1991)).

본 발명자들은 기존의 C형 간염의 진단에 사용되어온 다른 HCV 특이 항원들과 달리 C형 간염의 진단 및 백신의 개발에도 유용하게 사용될 수 있는 외피 단백질의 제조방법을 보고한 바 있다(본 출원인이 선출원한 대한민국 특허출원 제92-10039호 참조).

이러한 항원 단백질들에 있어서, C형 간염환자의 혈청 내에 존재하는 항체들이 특이적으로 결합하는 HCV의 항원 결정 부위(epitope)는 C형 간염진단시약의 개발과 C형 간염환자의 면역 반응 연구에 있어 중요한 표지가 되며 아울러 짧은 길이를 가지면서도 면역학적 특이성으로 보유하는 항원 단백질을 제조함으로써 간염의 진단 및 백신의 개발을 효율적이고 경제적으로 수행할 수 있으므로 HCV 항원들의 항원 결정 부위에 대한 연구가 계속 되어 왔다.

C100-3 항원의 경우에는 다수의 짧은 인공합성 펩타이드들을 이용하여 C형 간염환자의 혈청과의 반응을 측정함으로써 항체와 특이적으로 결합하는 항원 결정부위가 HCV 염기서열 1690 번 내지 1731번 내에 존재하고 있음이 밝혀졌고(Bahl, C., et al. p65-66, 제3회 국제 HCV 심포지움, Strasbourg, France, 1991), 핵 단백질의 경우에는 전체 유전자중 3개의 서로다른 부위의 절편들을 대장균에서 발현시킨 다음 C형 간염환자의 혈청과의 반응을 측정함으로써 항원 결정부위가 아미노말단을 코드하는 222개 염기쌍내에 위치하고 있음이 밝혀지게 되었다(Nasoft, M.S. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88, 5462-5466(1991)).

본 발명자들은 HCV의 외피 1 또는 외피 2 단백질의 항원 결정부위를 확인하고자할 경우 각 외피 단백질의 절편들을 유비퀴틴과 융합시킨 형태로 제조한 후 각 절편 단백질의 항원성을 측정함으로써 항원 결정부위를 확인할 수 있음을 발견하였다.

유비퀴틴은 진핵세포에서 전반적으로 발견되며 원핵세포에서는 그 유전자가 없는 것으로 보고된 분자량 5,500 달톤의 단백질로서(Goldstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 72,11(1975)) 지금까지 동물세포로부터 밝혀진 유비퀴틴은 모두 동일한 것으로 밝혀졌으며, 유비퀴틴의 중요한 역할은 여러가지가 있으나 그중에서도 단백질 분해공정이 중요한 것으로 알려져 있다(Finley, et al., Trends Biochem. Sci. 10,343(1985)). 대장균내에서는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포내에서 유비퀴틴 융합 단백질로 발현된 유전자 산물이 분해됨이 없이 융합단백질 그대로 세포내에 축적된다. 이러한 융합 단백질 시스템은 특히 발현시키고자 하는 단백질이 세포내에서 단백질 분해효소에 의해 분해가 용이하게 되는 경우에 융합된 유비퀴틴이 이를 보호하기 때문에 매우 유용하며, 항유비퀴틴 항체를 이용하여 발현을 확인할 수 있고, 정제에도 유용하게 사용될 수 있다.

또한 최근에는 효모에서 UBP 1이라 명명된 유비퀴틴 절단효소가 분리 동정되어 대장균 유래 유비퀴틴 융합 단백질로 부터 유비퀴틴이 제거된 목적 단백질만을 얻을 수 있게 되었다(Tobias, J.W. et al., J. Biological Chemistry 266, 12021-12028(1991)).

이러한 사실에 의거하여, 본 발명자들은 HCV의 외피 1 또는 외피 2 유전자 절편을 유비퀴틴 유전자와 융합시켜 대장균에서 융합단백질로서 발현시킨 다음, C형 간염 환자의 혈청과의 면역 반응성을 웨스턴 블롯팅으로 측정함으로써 외피 1 단백질의 카르복실 말단과 외피 2 단백질의 아미노 말단 및 카르복실 말단에 항원 결정 부위가 집중되어 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 C형 간염 바이러스의 외피 1 및 외피 2 단백질의 항원 결정부위를 확인함으로써 가능한한 짧은 길이를 가지면서도 민감도 및 정확성을 유지하는 항원 단백질을 제공하는 것으로 좀더 구체적으로는 한국형 HCV의 외피 1 또는 외피 2 단백질의 항원 결정 부위를 포함하며 유비퀴틴에 융합된 재조합 항원 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 HCV의 외피 1 또는 외피 2 단백질의 항원 결정 부위 단백질을 코딩하는 유전자 부위를 유비퀴틴 유전자와 결합된 상태로 포함하여 그의 발현시 HCV의 외피 1 또는 외피 2 단백질의 항원 결정 부위 및 유비퀴틴을 포함하는 융합 앙원 단백질을 생산할 수 있는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물, 및 이들 미생물을 이용하여 HCV의 외피 1 또는 외피 2 단백질의 항원 결정부위를 포함하는 항원 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

여기에서, 외피 단백질이란 외피 1 및 외피 2 단백질을 포함하는 의미이다. 여기에서 외피 단백질 절편이란 외피 1 또는 외피 2 단백질로부터 하나이상의 아미노산이 결실된 단백질을 말한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA 단편들에 대한 염기서열 정보(본 출원인이 선 출원한 대한민국 특허출원 제92-10039호 참조)로부터 각 외피 1 또는 외피 2 단백질 절편들을 코딩하는 외피 1 또는 외피 2 유전자 절편들의 5′말단과 3′말단에 대응하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)용 시발체를 합성하였다. 유전자 절편의 5′말단에 대응하는 시발체는 5′말단에 유비퀴틴 유전자의 3′말단과 접합이 가능하도록 제한효소 인식부위가 존재하도록 하며, 3′말단에 대응하는 시발체에는 종료 코오돈과 제한효소의 인식부위를 삽입하여 유비퀴틴의 시작 코오돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료 코오돈에서 단백질 합성이 완료되도록 함과 아울러 발현벡터로의 클로닝을 용이하게 한다.

이들 시발체들을 이용하여 외피 1 유전자(ATCC 68878, 1991년 12월 11일 기탁) 및 외피 2 유전자(ATCC 69866 및 ATCC 74117, 1991년 12월 11일 기탁)를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응으로 외피 1 및 외피 2 유전자 절편들을 증폭하며, 이 증폭된 유전자들을 제한효소로 절단하여 얻은 각 유전자 단편들을 플라스미드 ptrpH-UB-KHCV(ATCC 68640, ATCC 68641, ATCC 68642)(본 출원인이 선출원한 대한민국 특허출원 제92-10039호 참조)의 KHCV 유전자와 치환하여 각각의 발현 벡터를 제조하였다. 상기의 발현 벡터로부터 발현된 각 외피 1 및 외피 2 단백질 절편들을 15% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동한 후, 한국형 C형 간염환자의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린으로 웨스턴-블롯팅하여 한국형 C형 간염 바이러스의 항체에 특이적으로 반응하는 단백질 절편을 확인하고 이들의 HCV 유전자 내에서의 위치를 확인하였다.

즉, HCV의 외피 단백질의 경우, 주 항원 결정부위는 HCV 염기서열 1201 번 내지 1509 번에 해당하는 309 개의 염기쌍으로부터 발현된 외피 1 단백질의 카르복실 말단(제4도); HCV 염기서열 1510 번 내지 1749 번에 해당하는 240 개의 염기쌍으로부터 발현된 외피 2 단백질의 아미노 말단(제5도); 및 HCV 염기서열 2281 번 내지 2529 번에 해당하는 249 개의 염기쌍으로부터 발현된 외피 2 단백질의 카르복실 말단(제6도)에 존재하고 있음이 밝혀졌다.

본 발명에 의해 확인된 주항원 결정 부위가 집중되어 있는 외피 단백질 절편을 사용함으로써 외피 1 및 외피 2 유전자 전체로부터 얻어진 단백질을 사용하는 항체 진단방법보다 더 경제적이고, 정확하고, 민감한 C형 간염의 진단이 가능하게 되었다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것을 뿐이고, 발명의 범위를 제한하지는 않는다. 하기 실시예에서 사용된 실험방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예 1)-6)에 따라 실시하였다.

[참조예 1]

[제한효소를 사용한 DNA의 절단]

멸균된 1.5㎖ 에펜돌프 튜브에 제한 효소와 반응 완충용액을 50㎕ 내지 100㎕의 반응 부피가 되도록 넣고 37℃에서 1 내지 2 시간동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 제한 효소를 불활성화하기 위해 65℃에서 15분간 열처리하고, 내열성인 제한 효소에 대해서는 페놀 추출 및 에탄올 침전법을 사용하였다. 사용된 제한 효소와 반응 완충용액은 뉴 잉글랜드 바이오랩사(New England Biolabs, MA, USA)로부터 구입하였다. 10배 반응 완충용액의 조성은 다음과 같다.

10배 NEB 완충용액 1: 100mM 비스 트리스 프로판-HCl, 100mM MgCl₂, 10mM 디티오트 레이톨(dithiothreitol, DTT), pH 7.0

10배 NEB 완충용액 2: 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl₂, 500mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 3: 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl₂, 1000mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 4: 200mM 트리스-아세테이트, 100mM 마그네슘 아세테이트, 500mM 칼륨 아세테이트, 10mM DTT, pH 7.0

[참조예 2]

[페놀 추출과 에탄올 침전]

페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한 효소를 불활성화시키거나 핵산을 추출할 때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스-HCl(pH8.0), 1mM EDTA 용액으로 평형화시킨 후 사용하였다.

시료와 페놀을 1:1(v/v)의 비율로 섞은 후 강하게 흔들어 혼합한 다음 원심분리(15,000xG, 5분)시켜 상층액을 새 튜브로 옮긴다. 동일 과정을 3최 반복한 후, 동일 부피의 쿨로로포름 용액(클로로포름과 이소부탄올 비율 24:1(v/v))으로 상충액을 추출하여 0.1 부피의 3M 나트륨 아세테이트와 2.5 부피의 100% 에탄올을 가한다. 이를 -70℃에서 30분간 또는 -20℃에서 약 12시간 이상 정치한 후 원심분리(15,000xG, 20분, 4℃)하여 핵산을 침전시켰다.

[참조예 3]

[연결 반응(ligation)]

연결 효소로서 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase, New England Biolabs, Inc.) 및 10배 연결 완충용액(0.5M 트리스-HCl, pH7.8, 0.1M MgCl₂, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5㎎/㎖ BSA(소혈청 알부민))을 사용하여 연결 반응을 수행하였다. 보통 20㎕ 부피에서 10단위체의 연결 효소를 사용하고, 평활 말단(blunt ends)을 갖는 DNA의 연결에는 100 단위체의 연결 효소를 사용하여, 16℃에서 적어도 5 시간이상 또는 4℃에서 14시간이상 반응시켰고, 반응이 완료된 후 65℃에서 15분간 가열하여 연결효소를 불활성화시켰다.

[참조예 4]

[대장균 형질전환]

대장균 숙주 세포(대장균 HB101, W3110 또는 JM105)를 100㎖의 액체 LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨)에 접종한 후 650nm에서의 흡광도 값이 0.25 내지 0.5에 달할 때까지 37℃에서 진탕 배양한다. 그후 원심분리(2,500 xG, 10분)에 의해 세포를 분리한 후 50㎖의 0.1M MgCl₂를 가하여 세척한다. 이를 다시 원심분리(2,500 xG, 10분)하고 여기에 50㎖의 0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂용액을 가하여 얼음 위에서 30분간 정치시켰다. 이를 다시 원심분리(2,500 xG, 10분)하여 동일용액(0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂) 5㎖에 균일하게 분산시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다. 상기에서 얻은 세포현탁액중 0.2㎖에 연결 반응 용액 10㎕를 가하여 0℃에서 40분간 정치시킨 후 42℃에서 1분동안 열처리하였다. 이를 2.0㎖의 액체 LB 배지에 가하여 37℃에서 1시간동안 배양한 후 상기 배양액을 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 고체 LB 배지상에 도말한 후, 37℃에서 하룻밤동안 배양하여 콜로니가 형성되도록 하였다. M13 벡터 DNA는 열처리한 후 100㎕의 E. coli JM105 세포, 15㎕의 100mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside), 25㎕의 4% X-Gal(5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactoside) 및 48℃로 미리 가온시킨 3㎖의 2배 연성 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 8.7% 박토 아가)를 가하여 잘 섞어준 후 2배 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 1.5% 박토아가)위에 도말하였다.

[참조예 5]

[올리고머의 합성]

올리고머는 자동화된 고체상 포스아미다이트 케미스트리(solid phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, Inc., model 380 B, U.S.A.)로 합성한 후 변성 폴리아크릴아미드 젤(2M 우레아, 12% 아크릴아미드, 50mM 트리스중의 비스(29:1 w/w), 50mM 붕산, 1mM EDTA)을 이용한 전기영동으로 분리하였다. 다음으로 이를 C₁₈컬럼인 SEP-PAK(waters Inc., U.S.A.)에 부착시킨 후 아세토니트릴:물 혼합액(50:50(v/v))을 용출제로 사용하여 순수 정제하고, 260nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

[참조예 6]

[중합효소 연쇄 반응(PCR)]

주형 DNA(10ng 내지 100ng), 10㎍의 10배 농도 Taq 중합효소 완충용액(10mM 트리스-Cl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1%(w/v) 젤라틴), 10㎕의 dNTP 혼합용액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각 1.25mM), 시발체 2㎍ 씩(보통 2개의 시발체를 사용하며, 3개의 시발체를 동시에 사용할 때는 중간에 위치한 시발체는 20ng을 사용하였다), 0.5㎕의 AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위하여 50㎕의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)를 이용하였으며, 순환 프로그램은 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분간의 순환을 25회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응시켰다.

반응 후 중합효소를 제거하기 위하여 반응 혼합물에 동부피의 페놀/쿨로로포름을 넣고 잘 섞은 후 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮기고 1/10 부피의 3M 나트륨 아세테이트 및 2배 부피의 100% 에탄올을 넣고 혼합한 후 원심분리하여 이중 나선의 핵산을 얻었다. 상기 핵산을 20㎕의 TE 완충액(10mM 트리스-Cl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 녹인 후 다음 실험에 사용하였다.

[실시예 1]

[ HCV의 외피 1 및 외피 2 유전자 절편의 증폭]

(단계 1) 시발체의 합성

C형 간염 바이러스의 외피 1 및 외피 2의 각 유전자 절편을 얻기 위해 다음과 같은 PCR용 시발체들을 합성하였다.

시발체 PE1T2(5′-TGAGACTCCGCGGTGGTTATGAAGTGGGCAACGCGTCC-3′)

(제한효소 SacII 인식부위를 가지고 있으며 외피 1 유전자의 1번째 염기부터 21번째 염기를 포함하고 있음)

시발체 PE1DT2(5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGACTTGCTCGTTGGGGTAGCT-3′)

(제한효소 SacII 인식부위를 가지고 있으며 외피 1 유전자의 214번째 염기부터 234번째 염기를 포함하고 있음)

시발체 PE1EGT2(5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGTTTCCCAGCTGTTCACCTTC-3′)

(제한효소 SacII 인식부위를 가지고 있으며 외피 1 유전자의 286번째 염기부터 306번째 염기를 포함하고 있음)

시발체 PE1FT2(5′-TGAGACTCCGCGGTGGTACAACAGCCCTAGTGGTATCG-3′)

(제한효소 SacII 인식부위를 가지고 있으며 외피 1 유전자의 412번째 염기부터 432번째 염기를 포함하고 있음)

시발체 PE1AXH0(5′-AAAAAACTCGAGTTAGACATGGCGTCGCAATGTCGT-3′)

(외피 1 유전자의 213번째 염기 뒤에 해독을 종료시키는 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 Xhol 인식부위를 갖고 있음)

시발체 PE1BXH0(5′-AAAAAACTCGAGTTAAAGGAAAACAGATCCGCAGAG-3′)

(외피 1 유전자의 285번째 염기 뒤에 해독을 종료시키는 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 Xhol 인식부위를 갖고 있음)

시발체 PE1CDEXH0(5′-AAAAAACTCGAGTTAAGGCGACCAGTTCATCATCAT-3′)

(외피 1 유전자의 411번째 염기 뒤에 해독을 종료시키는 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 Xhol 인식부위를 갖고 있음)

시발체 PE1XH0(5′-AAAAAACTCGAGTTACCCTGTCACGTGGGTGGTTCC-3′)

(외피 1 유전자의 594번째 염기뒤에 해독을 종료시키는 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 Xhol 인식부위를 갖고 있음)

시발체 PE2T2(5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGGGGCGCAAGGTCGGGCCGCT-3′)

(제한효소 SacII 인식부위를 가지고 있으며 외피 2 유전자의 1번째 염기부터 21번째 염기를 포함하고 있음)

시발체 PE2T2(5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGGTCCCATCACTTACACTGAG-3′)

(제한효소 SacII 인식부위를 가지고 있으며 외피 2 유전자의 241번째 염기부터 261번째 염기를 포함하고 있음)

시발체 PE2DFT2(5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGGCACTGGGTTCACCAAGACA-3′)

(제한효소 SacII 인식부위를 가지고 있으며 외피 2 유전자의 502번째 염기부터 522번째 염기를 포함하고 있음)

시발체 PE2ET2(5′-TGAGACTCCGCGGTGGTACTCGGGGAGAGCGTTGTGAC-3′)

(제한효소 SacII 인식부위를 가지고 있으며 외피 2 유전자의 772번째 염기부터 792번째 염기를 포함하고 있음)

시발체 PE2AXH0(5′-AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGCGAATGTATC-3′)

(외피 2 유전자의 240번째 염기 뒤에 해독을 종료시키는 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 Xhol 인식부위를 갖고 있음)

시발체 PE2BCXH0(5′-AAAAAACTCGAGTTAATTCATCCAGGTACAACCGAA-3′)

(외피 2 유전자의 501번째 염기 뒤에 해독을 종료시키는 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 Xhol 인식부위를 갖고 있음)

시발체 PE2DXH0(5′-AAAAAACTCGAGTTACCAGTTGCATGCGGCGTCGAG-3′)

(외피 2 유전자의 771번째 염기 뒤에 해독을 종료시키는 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 Xhol 인식부위를 갖고 있음)

시발체 PE2XH0(5′-AAAAAACTCGAGTTACGCGTCCGCCAGAAGAAGGAAGAG-3′)

(외피 2 유전자의 1020번째 염기 뒤에 해독을 종료시키는 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 Xhol 인식부위를 갖고 있음)

(단 계 2) 중합효소 연쇄반응(PCR)

반응튜브 A에 시발체 PE1T2 2㎍, 시발체 PE1XH0 2㎍

반응튜브 B에 시발체 PE1T2 2㎍, 시발체 PE1AXH0 2㎍

반응튜브 C에 시발체 PE1T2 2㎍, 시발체 PE1BXH0 2㎍

반응튜브 D에 시발체 PE1T2 2㎍, 시발체 PE1CDEXH0 2㎍

반응튜브 E에 시발체 PE1DT2 2㎍, 시발체 PE1CDEXH0 2㎍

반응튜브 F에 시발체 PE1EGT2 2㎍, 시발체 PE1CDEXH0 2㎍

반응튜브 G에 시발체 PE1FT2 2㎍, 시발체 PE1XH0 2㎍

반응튜브 H에 시발체 PE1EGT2 2㎍, 시발체 PE1XH0 2㎍

반응튜브 I에 시발체 PE2T2 2㎍, 시발체 PE2AXH0 2㎍

반응튜브 J에 시발체 PE2BT2 2㎍, 시발체 PE2BCXH0 2㎍

반응튜브 K에 시발체 PE2T2 2㎍, 시발체 PE2BCXH0 2㎍

반응튜브 L에 시발체 PE2DFT2 2㎍, 시발체 PE2DXH0 2㎍

반응튜브 M에 시발체 PE2ET2 2㎍, 시발체 PE2XH0 2㎍

반응튜브 N에 시발체 PE2DFT2 2㎍, 시발체 PE2XH0 2㎍

를 각각 넣고 주형으로서 A 내지 H 튜브에는 외피 1 유전자를 , I 내지 N 튜브에는 외피 2 유전자를 각각 50ng 씩 넣은 다음, 10㎕의 10배 농도 중합완충용액, 10㎕의 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5㎕의 10단위체 Taq중합효소 및 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 참조예 6에서와 같이 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 처리하는 중합효소 연쇄반응을 25회 실시하였다(Saiki, R.K. et al., Science 239, 487(1988)).

(단계 3) PCR 산물의 분리 및 정제

상기 단계 2에서 얻은 각각의 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아미드 젤에서 분리한 결과 반응튜브 A에서는 약 600염기쌍의 DNA, 튜브 B에서는 약 220염기쌍의 DNA, 튜브 C에서는 약 300염기쌍의 DNA, 튜브 D에서는 약 410염기쌍의 DNA, 튜브 E에서는 약 200염기쌍의 DNA, 튜브 F에서는 약 110염기쌍의 DNA, 튜브 G에서는 약 190염기쌍의 DNA, 튜브 H에서는 약 300염기쌍의 DNA, 튜브 I에서는 약 210염기쌍의 DNA, 튜브 J에서는 약 300염기쌍의 DNA, 튜브 K에서는 약 505염기쌍의 DNA, 튜브 L에서는 약 290염기쌍의 DNA, 튜브 M에서는 약 240염기쌍의 DNA, 튜브 N에서는 약 520염기쌍의 DNA가 각각 증폭된 것을 확인하였으며 이들을 동일조건의 폴리아크릴 아미드젤로 분리 및 정제하였다. 이하, 각각의 DNA 단편을 단편 E1, 단편 E1A, 단편 E1B, 단편 E1C, 단편 E1D, 단편 E1E, 단편 E1F, 단편 E1G, 단편 E2A, 단편 E2B, 단편 E2C, 단편 E2D, 단편 E2E 및 단편 E2F로 명명하였다.

[실시예 2]

[대장균 발현 벡터의 제조]

본 출원인이 선 출원한 플라스미드 ptrpH-UB-CORE14(대한민국 특허출원 제92-10039호, ATCC 68642, 1991년 7월 1일자로 기탁) 2㎍을 제한효소 SacII 와 제한효소 SaII으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전 절단한 후 0.7% 아가로스 젤에서 분리하여 약 2.7Kb 단편을 분리정제하였다.

이하 이 단편을 ptrpH-UB-T2/L로 명명하였다.

한편 실시예 1의 단계 3에서 얻은 각각의 DNA 단편 2㎍을 제한효소 ScaII와 제한효소 Xhol 으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 참조예 1에서와 같이 완전 절단한 후 각각의 튜브에 절단된 DNA 단편 100ng, 50ng의 단편 ptrpH-UB-T2/L, 2㎕의 10배 농도 연결반응용액, 10단위의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간동안 반응켰다. 반응이 끝난 뒤 이를 사용하여 E. coli W3110(ATCC 37339)을 형질 전환시켜 단편 E1을 함유한 ptrpH-UBE1, 단편 E1A를 함유한 ptrpH- UBE1A, 단편 E1B를 함유한 ptrpH-UBE1B, 단편 E1C를 함유한 ptrpH-UBE1C, 단편 E1D를 함유한 ptrpH-UBE1D, 단편 E1E를 함유한 ptrpH-UBE1E, 단편 E1F를 함유한 ptrpH-UBE1F, 단편 E1G를 함유한 ptrpH-UBE1G, 단편 E2A를 함유한 ptrpH-UBE2A, 단편 E2B를 함유한 ptrpH-UBE2B, 단편 E2C를 함유한 ptrpH-UBE2C, 단편 E2D를 함유한 ptrpH-UBE2D, 단편 E2E를 함유한 ptrpH-UBE2E, 단편 E2F를 함유한 ptrpH-UBE2F를 각각 얻었다.

[실시예 3]

[외피 1 및 외피 2 유전자 절편들의 발현 유도]

상기 실시예 2에서 얻은 C형 간염 바이러스의 외피 1 또는 외피 2 유전자 절편들을 함유하고 있는 재조합 대장균 세포들을 10㎍/㎖의 암피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간동안 진탕 배양한 다음, 이중 3㎖ 씩을 각기 300㎖의 M9 배지(400mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ Vit. B₁, 40㎍/㎖ 암피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4시간동안 진탕배양하여 배양액의 흡광도가 650nm의 파장에서 약 0.3정도가 될 때 인돌 아크릴산(indole acrylic acid, IAA)을 최종농도 50㎍/㎖가 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4 시간 후에 각 세포배양액들의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 대장균 세포 침전물을 수거하였다.

[실시예 4]

[주항원 결정 부위(immundominant epitope)의 확인]

실시예 3의 세포침전물들을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하에서 15% 폴리아크릴 아미드 젤에서 전기영동하였고, 젤상에서 분리된 단백질을 토우빈의 방법(Towvin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4750(1979))에 따라 니트로 셀룰로스 필터(Bio-Rad Lab., 구멍크기 0.22㎛, CA, USA)로 전달시켰다. 이 필터를 0.5% 트윈(tween) 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH 7.0, 0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간동안 약하게 흔들면서 폐쇄시켰다. 이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 한국형 C형 간염환자들의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린(IgG)을 최종농도 16㎍/㎖이 되게 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간동안 약하게 흔들면서 반응시컨 다음, 필터를 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터를 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항 사람 면역 글로불린 G(Bio-Rad Lab, anti-human IgG-HRP, 0.01㎎·㎖, CA, USA)를 1:500으로 희석시켜서 첨가하고 상온에서 1시간동안 흔들면서 반응시키고, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM 트리스 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 400㎍/㎖의 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액을 가하여 필터를 발색시켰다. 그 결과는 제3도에 나타내었다.

제3도에서 제1열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균, 제2열은 ptrpH-UBE1을 함유한 대장균, 제3열은 ptrpH-UBE1A를 함유한 대장균, 제4열은 ptrpH-UBE1B를 함유한 대장균, 제5열은 ptrpH-UBE1C를 함유한 대장균, 제6열은 ptrpH-UBE1D을 함유한 대장균, 제7열은 ptrpH-UBE1E를 함유한 대장균, 제8열은 ptrpH-UBE1F을 함유한 대장균, 제9열은 ptrpH-UBE1G를 함유한 대장균, 제10열은 ptrpH-UBE2A을 함유한 대장균, 제11열은 ptrpH-UBE2B를 함유한 대장균, 제12열은 ptrpH-UBE2C을 함유한 대장균, 제13열은 ptrpH-UBE2D를 함유한 대장균, 제14열은 ptrpH-UBE2E을 함유한 대장균, 제15열은 ptrpH-UBE2F를 함유한 대장균으로부터 각각 얻은 세포침전물을 나타낸다.

외피 1 및 외피 2 단백질 절편을 함유한 대장균의 세포 침전물을 사용하여 C형 간염 환자들의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린과의 반응성을 확인한 웨스턴 블롯팅의 결과는 하기 표 1 및 제3도의 B에 나타내었다.

[표 1]

표 1 및 제3도의 B에서 알 수 있는 바와 같이, 한국형 C형 간염 환자의 혈청을 이용한 웨스턴 블롯팅에서 외피 1 단백질의 카르복실 말단의 단편 E1G, 외피 2 단백질의 아미노 말단의 단편 E2A와 카르복실 말단인 단편 E2E는 양성으로 나타났으나, 그 외의 유전자 부분들을 포함하는 E1A, E1B, E1C, E2B, E2D 등은 음성으로 나타난 사실로부터 HCV의 외피 단백질의 경우, 주 항원 결정 부위는 HCV 염기서열 1201번 내지 1509번에 해당하는 309개의 염기쌍으로부터 발현된 외피 1 단백질의 카르복실 말단(제4도); HCV 염기서열 1510번 내지 1749번에 해당하는 240개의 염기쌍으로부터 발현된 외피 2 단백질의 아미노 말단(제5도); 및 HCV 염기서열 2281번 내지 2529번에 해당하는 249개의 염기쌍으로부터 발현된 외피 2 단백질의 카르복실 말단(제6도)에 존재하고 있음이 밝혀졌다.

Claims (16)

1. 한국형 C형 간염 바이러스 외피 단백질의 면역학적 특이성을 유지하는 외피 단백질의 절편, 또는 이를 포함하는 재조합 단백질.
2. 제1항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 갖는 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 1 단백질의 카르복실 말단 단백질 절편, 또는 이를 포함하는 재조합 단백질.
3. 제1항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 갖는 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 2 단백질의 아미노말단 단백질 절편, 또는 이를 포함하는 재조합 단백질.
4. 제1항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 갖는 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 2 단백질의 카르복실 말단 단백질 절편, 또는 이를 포함하는 재조합 단백질.
5. 제1항에 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 외피 단백질 절편에 유비퀴틴이 융합된 재조합 단백질.
6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA.
7. 제6항에 있어서, 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 1 단백질의 카르복실 말단 단백질 절편을 코딩하는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
8. 제6항에 있어서, 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 2 단백질의 아미노 말단 단백질 절편을 코딩하는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
9. 제6항에 있어서, 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 2 단백질의 카르복실말단 단백질 절편을 코딩하는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
10. 제6항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 상기 외피 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 유비퀴틴 유전자가 융합된 재조합 DNA.
11. 제6항 내지 제10항중 어느 한 항의 DNA를 포함하는 발현 벡터.
12. 제11항에 있어서, ptrpH-UBE1G, ptrpH-UBE2A 또는 ptrpH-UBE2E 인 발현 벡터.
13. 제11항 또는 제12항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
14. 제13항에 있어서, ptrpH-UBE1G, ptrpH-UBE2A 또는 ptrpH-UBE2E로 형질전환된 대장균.
15. 제13항 또는 제14항의 대장균을 배양함을 포함하는, 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 단백질의 면역학적 특이성을 유지하는 단백질 절편 또는 이를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.
16. 제15항에 있어서, ptrpH-UBE1G, ptrpH-UBE2A 또는 ptrpH-UBE2E에 의해 형질전환된 대장균을 배양함을 포함하는, 유비퀴틴에 융합된 C형 간염 바이러스의 외피 단백질 절편의 제조방법.