KR100269802B1 - C형 간염 바이러스의 핵 구조단백질의 항원 결정부위와 khcv897 단백질의 항원 결정부위를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HCV의 핵 단백질의 항원 결정부위를 코딩하는 COREEPI 유전자와 KHCV897 단백질의 항원 결정부위를 코딩하는 유전자를 포함하는 KHCV518 유전자의 결합 유전자를 유비퀴틴 유전자와 결합된 상태로 포함하여 그의 발현시 HCV의 항원결정부위 융합단백질인 CORE518 단백질과 유비퀴틴의 재조합 단백질을 생산하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물, 상기 미생물을 사용하여 HCV의 CORE518 단백질과 유비퀴틴의 재조합 단백질을 대량으로 생산하는 방법 및 이에 의해 생산된 유비퀴틴에 융합된 HCV의 CORE518 단백질에 관한 것이다.

Description

C형 간염 바이러스의 핵 구조단백질의 항원 결정부위와 KHCV897 단백질의 항원 결정부위를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현

제1도는 C형 간염 바이러스의 핵 구조 단백질의 항원 결정부위를 코딩하는 COREEPI 유전자와 KHCV897 단백질의 항원 결정 부위를 코딩하는 유전자를 포함하는 KHCV518 유전자의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제2도는 COREEPI 유전자와 KHCV518 유전자의 연결 전략 및 연결 유전자인 CORE518 유전자의 발현 벡터를 도시한 것이고,

제3(a)도는 항원 결정 부위 융합단백질인 CORE518 단백질의 발현을 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며,

제3(b)도는 발현된 CORE518 단백 질을 C형 간염환자의 혈청으로 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 C형 간염 바이러스(이하 “HCV”라 함)의 핵(core) 구조단백질의 항원 결정 부위와 KHCV897 단백질의 항원 결정부위를 포함하는 KHCV518 단백질의 융합단백질, 이를 암호화하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 그에 의해 제조되는 재조합 단백질에 관한 것이다.

보다 상세하게는, HCV의 핵 단백질의 항원 결정부위를 코딩하는 COREEPI 유전자와 KHCV897 단백질의 항원 결정부위를 코딩하는 유전자를 포함하는 KHCV518 유전자의 결합유전자를 포함하여 그의 발현시 HCV의 항원 결정부위 융합단백질을 생산하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질 전환된 미생물, 상기 미생물을 사용하여 HCV의 핵구조 단백질의 항원결정부위와 KHCV 897 단백질의 항원 결정부위를 포함하는 KHCV518 단백질의 융합 단백질을 대량으로 생산하는 방법 및 이에 의해 생산된 HCV의 항원결정부위 융합 단백질에 관한 것이다.

최근까지 바이러스성 간염은 A형 간염바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), 델타 간염 바이러스(HDV), 사이토 메갈로 바이러스(CMV) 및 엡스틴바 바이러스(EBV)에 의해 발병되는 것으로 알려져 왔으나 상기의 간염과는 달리 수형 후 발병되는 간염의 90%를 차지하는 비A비B형 간염(NANBH) 바이러스가 확인되었다(Alter, H.J., et al., Lancet 2, 838-841(1975)). 이 비A비B형 간염 바이러스에 감염된 감염환자가 전 세계적으로 매년 약 백만명씩 생기는 것으로 추정되며(Alter, H.J., in A.J. Zuckerman(ed.), Viral Hepatitis and Liver Disease, 537-542, Alan R. Liss, New York(1988)), 이중 약 40-50%가 만성간염으로 진전되고, 또 이중 약 20% 정도가 간 경변 및 간암으로 진전된다는 사실이 밝혀졌다(Dienstag, J. L., et al., Seminar Liver Dis. 6, 67-81(1986)).

브래들리(Bradley) 등은 NANBH 환자의 현장을 침팬지에 감염시켜 비A비B형 바이러스(이하 HCV라 함)의 분리 및 회수가 가능함을 보고하였고(Bradley, D. W et al., Gastroenterology, 88, 773-779(1985)), 츄(Choo)등은 이 바이러스가 양성가닥 리보핵산(positive-stranded RNA) 바이러스로서 약 10,000개의 염기로 이루어져 있으며 약 3010-3011개의 아미노산으로 이루어진 다단백질 전구체를 코딩하는 하나의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 가지는 것으로 보고하였다(Choo, Q. L., et al., Science 244, 359-362(1989); Choo, Q. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455(1991)).

C형 간염 바이러스의 유전자 구조는 플라비바이러스(flavivirus) 및 페스티바이러스(pestivirus)의 유전자 구조와 유사성을 가지며, 이들의 유연관계로 미루어 C형 간염 바이러스의 다단백질(polyprotein)은 아미노 말단으로부터 핵(core)-외피1(envelope 1)-외피2/비구조1(E2/NS1)-비구조2(NS2)-비구조3(NS3)-비구조4(NS4)-비구조5(NS5) 순서로 구성되어 있는 것으로 추정하고 있다(Choo, Q. L., et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88, 2451-2455(1991); Takamizawa, A., et al, J. Virol 65, 1105-1113(1991); Kato. N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 6524-6528(1990)).

외피1 및 외피2/비구조1 단백질(이하 외피2 단백질이라 함)은 생체의(in vitro) 실험을 통해 분자량이 각각 33,000, 72,000달톤의 크기를 갖는 당단백질임이 밝혀졌고(Houghton, M., et al., Hepatology 14, 381-388(1991) ; Hijkata, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5547-5551(1991)), 플라비바이러스의 백신으로 추정되는 비구조1 단백질 및 페스티바이러스의 백신으로 추정되는 gp53/55 단백질과 상당한 구조적 유사성을 가지고 있어 C형 간염 바이러스의 백신개발 및 치료제 개발에 1차적 목표가 되어왔다(Spete, R.R. et al., Virology 188, 819-830(1992)).

비구조3 단백질은 바이러스 단백질 분해효소로서 비구조 유전자가 코딩하는 비구조 단백질들을 절단하여 각각의 비구조 단백질들을 생성하는 것으로 추정되고 있으며(Bajan, J.F., Virology 171, 637-639(1989)), 비구조5 단백질은 지금까지 알려진 바이러스 리보핵산 중합효소의 아미노산 서열과 상당히 유사하여 C형 간염 바이러스의 리보핵산 중합효소(RNA polymerase)로 추정되고 있다(Mita, E., et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 183, 925-930(1992)).

C형 간염 바이러스의 감염에 대한 진단방법은 초기에 미국 카이론사의 츄등이 부분적인 2개의 비구조 유전자 절편(NS3/NS4)을 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 유전자와 융합시켜 효모에서 융합단백질 SOD-C100-3를 발현시키고 이를 사용하여 효소면역 측정법에 의해 수혈성 간염환자의 70% 이상이 이 항원에 대한 항체를 가지고 있음을 증명하였다(Kuo, G., et al., Soience 244, 362-384(1989)). 그러나 많은 환자의 경우 C100-3에 대한 항체가 C형 간염 바이러스 감염 후 4 내지 6개월이 지난 후에 생성되어 초기의 급성 간염환자에게서는 정확한 진단이 불가능하다는 단점(Alber, H. J. et al., N. Engl. J. Med 321, 1494-1500(1989); Miyamura T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 983-987(1990)) 및 C형 간염 이외의 자가면역성 질환(autoimmune disease) 등에 기인한 간염환자의 경우에서도 상당한 비율로 양성반응이 나타나는 단점이 있음이 보고되었다(McFarlane, I. G., et. al., Lancet 335, 754-757(1990)).

최근에 C형 간염 바이러스의 5′ 말단에 위치한 핵(core) 구조 유전자로부터 발현시킨 핵 단백질을 사용한 진단방법의 경우 C100-3를 사용한 진단방법에 비해 약 6내지 8주 일찍 항체를 진단할 수 있음이 확인되어 기존의 C100-3 항원만을 사용한 제1세대 진단방법보다 조기 진단이 가능하고 민감한 진단방법임이 보고되었다(Harada, S. et al., J. Virol 65, 3015(1991)). 미국의 UBI사는 핵 구조 유전자로부터 15 내지 65개 아미노산으로 구성된 합성폴리펩타이드를 이용하여 특이도가 더 높은 개선된 진단방법을 보고하였고(Wang C.Y., EP 442394(1991)), 기존의 C100-3 항원에 구조유전자 유래 C22 및 비구조 3 유전자 유래의 C33C를 첨가한 제2세대 진단방법을 개발하여 HCV 항체에 대한 민감도와 특이도를 더욱 증가시킬 수 있음을 보고하였다(Van der poel, C. L, et al. Lancet 337, 377-313(1991)).

본 발명자들은 한국형 C형 간염 환자의 혈청으로부터 HCV 입자를 분리하고 그 유전자 구조를 규명하여 기존의 미국형 및 일본형 HCV와는 상이한 고유한 한국형 HCV가 존재함을 규명한 바 있으며 또한 핵 유전자로 부터 KHCV UB Core14, 비구조3 유전자로부터 KHCV UB897 단백질, 비구조5 유전자로부터 KHCV 403 단백질, 및 외피 유전자로부터 KHCV 외피1, KHCV 외피2N, KHCV 외피2C 단백질을 재조합 효모 및 대장균으로부터 밭현시켜(선행 한국 특허출원 제91-10942호, 제91-10943호, 제91-25505호 및 제92-10039호 참조), 이들 단백질들의 면역특이성을 확인한 다음 고순도로 대량 분리 및 정제할 수 있는 방법을 개발하였다(선행 한국 특허출원 제91-13594호, 제91-13595호, 제91-13597호, 제91-25506호 및 제92-10039호 참조).

또한 이들 HCV 특이항원들을 사용하여 기존의 공지된 효소면역측정법(ELISA immunoassay, EIA) 원리에 따라 환자의 혈청으로부터 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 검정하는 개선된 진단방법을 개발하여 보고한 바 있다(선행 한국 특허출원 제91-13601호 참조). 또한, 상기의 KHCV 403 단백질을 포함하는 비구조 5 유전자의 아미노 말단 1,200 염기쌍(NS5-1.2)의 단백질 산물이 HCV의 항체와 높은 특이도의 면역 반응을 보인다는 사실을 발견하고 이를 유비퀴틴과의 융합단백질(UB NS5-1.2)로서 재조합 대장균에서 발현시킨 바 있다(선행 한국 특허 출원 제93-4165호 참조).

그러나 상기한 HCV 항원들은 C형 간염의 진단에는 유용하나 그 치료를 위해 만성간염과 급성 간염 환자의 경과를 정확히 구분하기 위한 목적에 있어서는 만족스럽지 못하였다. 따라서 간염 초기에 나타나는 HCV항체를 좀 더 빨리 인식할 수 있는 진단방법과 바이러스 RNA 및 바이러스 항원을 인식할 수 있는 진단방법의 개발이 절실히 필요한 실정이다.

HCV의 항원 단백질들에 있어서, C형 간염환자의 혈청내에 존재하는 항체들이 특이적으로 결합하는 HCV의 항원결정부위(epitope)는 C형 간염 진단시약의 개발과 C형 간염환자의 면역 반응 연구에 있어 중요한 표지가 되며 아울러 짧은 길이를 가지면서도 면역학적 특이성을 보유하는 항원 단백질을 제조함으로써 간염의 진단 및 백신의 개발을 효율적이고 경제적으로 수행할 수 있으므로 HCV 항원들의 항원 결정 부위에 대한 연구가 계속 되어 왔다.

C100-3 항원의 경우에는 다수의 짧은 인공합성 펩타이드들을 이용하여 C형 간염 환자의 혈청과의 반응을 측정함으로써 항체와 특이적으로 결합하는 항원 결정부위가 HCV 염기서열 1690번 내지 1731번내에 존재하고 있음이 밝혀졌고(Bahl, C., et al., p65-66, 제3회 국제 HCV 심포지움, Strasbourg, France, 1991), 핵 단백질의 경우에는 전체 유전자중 3개의 서로 다른 부위의 절편들을 대장균에서 발현시킨 다음 C형 간염환자의 혈청과의 반응을 측정함으로써 항원 결정부위가 아미노말단을 코드하는 222개 염기쌍내에 위치하고 있음이 밝혀지게 되었다(Nasoft, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5462-5466(1991)).

본 발명자들은 HCV의 비구조3 유전자로부터 유래된 KHCV897 단백질의 경우 8개의 서로 다른 유전자 절편들을 대장균에서 발현시킨 후 C형 간염환자의 혈청과의 반응을 측정한 결과 항원 결정부위가 카르복실 말단 약 366개 염기쌍내에 존재하고 있음을 밝혔다(본 출원인이 1993년 4월 15일자로 출원한 한국 특허 출원 제 호 참조).

한편 유비퀴틴은 1975년에 발견된 분자량 5,500달톤의 단백질로서 진핵세포에서 전반적으로 발견되며 원핵세포에서는 그 유전자가 없는것으로 보고되었다(Goldstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 11(1975)). 지금까지 동물세포로부터 밝혀진 유비퀴틴은 모두 동일한 것으로 밝혀졌으며, 유비퀴틴의 중요한 역할은 여러 가지가 있으나 그중에서도 단백질 분해공정이 중요한 것으로 알려져 있다(Finley, et al., Trends Biochem. Sci. 10, 343(1985)). 대장균내에서는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포내에서 유비퀴틴 융합단백질로 발현된 유전자 산물이 분해됨이 없이 융합단백질 그대로 세포내에 축적된다. 이러한 융합단백질 시스템은 특히 발현시키고자 하는 단백질이 세포내에서 단백질 분해효소에 의해 분해 가 용이하게 되는 경우에 융합된 유비퀴틴이 이를 보호하기 때문에 매우 유용하며, 항유비퀴틴 항체를 이용하여 발현을 확인할 수 있고, 정제에도 유용하게 사용될 수 있다.

또한 최근에는 효모에서 UBP 1이라 명명된 유비퀴틴 절단효소가 분리 동정되어 대장균 유래 유비퀴틴 융합단백질로부터 유비퀴틴이 제거된 목적 단백질만을 얻을 수 있게 되었다(Tobias, J. W. et al., J. Biological Chemistry 266, 12021-12028(1991)).

이러한 사실에 의거하여, 본 발명자들은 한국형 C형 간염환자의 진단에 있어서, 기존의 미국형 및 일본형 HCV에 의해 코딩되는 단백질을 사용하는 것보다 감지도 및 특이도가 더 높은 한국형 HCV에 대한 진단시약 및 백신을 개발하고자 노력하던 중, HCV의 핵 단백질의 항원 결정부위를 코딩하는 COREEPI 유전자(KHCV 핵의 염기서열 제1번 내지 102번, Nasoft, M. S. et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 88, 5462-5466(1991))와 KHCV897 단백질의 항원 결정부위를 코딩하는 366개 염기쌍을 포함하는 KHCV518 유전자를 결합시킨 다음 이를 유전공학적인 방법으로 대장균에서 융합단백질로서 발현시키는데 성공하였다.

본 발명의 목적은 한국형 HCV에 대한 진단시약 및 백신의 개발에 기여할 수 있는 HCV의 항원 결정부위의 재조합 융합단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 HCV의 핵 구조단백질의 항원결정부위를 코딩하는 COREEPI 유전자와 KHCV897 단백질의 항원결정부위를 코딩하는 유전자를 포함하는 KHCV518 유전자의 결합유전자를 포함하여 그의 발현시 항원 결정 부위 융합단백질을 생산할 수 있는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 발현벡터로 형질 전환된 미생물을 이용하여 HCV의 핵 구조 단백질의 항원결정부위와 KHCV897 단백질의 항원결정부위를 포함하는 KHCV518 단백질의 재조합 융합단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

C형 간염 진단시약의 개발에 있어서는 C형 간염 항체에 대한 특이성이 높은 항원 단백질을 이용하는 것이 바람직하며, 그의 항원 결정 부위는 효율적이고 경제적인 진단시약 및 백신의 개발을 가능하게하므로 더욱 바람직하다. 특히 2개 이상의 항원결정부위를 융합시킨 항원결정부위 융합단백질이 경제성, 효율성 및 정확성의 측면에서 가장 바람직하다. 2개의 항원결정부위를 포함하는 융합단백질로서는 HCV의 핵 구조 단백질의 항원결정부위의 카복시말단쪽에 KHCV897 단백질의 항원결정부위를 포함하는 KHCV518 단백질이 연결되어 있는 재조합 융합단백질인 CORE518이 바람직하다. 또한, 이 융합단백질은 단백질의 안정화, 발현의 확인 및 간편한 정제 등을 위해 특정 단백질을 추가로 융합시켜 재조합 융합단백질로서 생산될 수 있으며 그러한 특정 단백질로서는 유비퀴틴이 바람직하다.

이러한 재조합 융합단백질을 암호화하는 DNA의 제조는 예를들면, 먼저 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA 단편들에 대한 염기서열정보(본 출원인이 선출원한 한국 특허 출원 제92-10039호 참조)로부터 KHCV897 유전자의 항원 결정 부위를 포함하는 KHCV518 단백질을 코딩하는 KHCV518 유전자의 5′ 말단과 3′ 말단에 대응하는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)용 시발체를 합성한다. 이들 시발체는 핵 구조 단백질의 항원결정부위를 코딩하는 COREEPI 유전자와 접합이 가능하도록 5′ 말단에 제한효소 인식 부위가 존재하며, 이에 대응되는 시발체에는 종료 코오돈과 제한효소의 인식 부위를 삽입하여 특정 단백질의 시작 코오돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료 코오돈에서 단백질 합성이 완료되도록 함과 아울러 발현벡터로의 클로닝을 용이하게 한다. 시발체의 서열을 적절히 조절하여 상기 두 항원 결정 부위를 코딩하는 두 유전자가 반대 순서가 되도록 할 수도 있으며, 항원으로서의 특성을 변화시키지 않는 범위 내에서 두 항원결정부위 사이에 다른 아미노산 서열이 삽입되도록 할 수도 있다.

발현벡터의 제조는, 예를들어 상기 시발체들을 이용하여 C형 간염 바이러스의 cDNA인 KHCV-LBCl(본 출원인이 선출원한 한국 특허출원 제92-10039호, ATCC 75008, 1991년 5월 14일자 기탁)을 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응으로 KHCV518 유전자를 증폭하며, 이 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 CORE14 유전자 및 특정 단백질의 유전자를 포함하는 플라스미드의 CORE14 유전자의 일부와 치환하여 발현 벡터를 제조할 수 있다. 상기의 발현벡터로부터 밭현된 항원결정부위 융합단백질을 15% 폴리아크릴 아미드젤에서 전기 영동한 후, 한국형 C형 간염 환자의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린으로 웨스턴-블롯팅하여 항원결정부위 융합단백질인 CORE518이 한국형 C형 간염 바이러스의 항체에 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있다.

본 발명의 항원 결정부위 융합단백질을 HCV 진단키트나 백신의 재조에 이용할 경우, 여러 항원 결정부위를 포함하되 단일한 하나의 단백질만을 사용하므로 기존의 HCV 항원들을 복합 사용하는 것에 비해 보다 경제적인 진단키트 또는 백신의 제조가 가능하고, HCV 항원들의 항원 결정부위만을 융합시킨 것이므로 진단키트로 사용될 경우 기존의 서로 다른 HCV 항원들을 단순하게 융합시킨 경우에 비해 보다 민감하고 정확한 진단이 가능하다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고, 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

하기 실시예에서 사용된 실험 방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예 1)-6)에 따라 실시하였다.

[참조예 1]

[제한효소를 사용한 DNA의 절단]

멸균된 1.5㎖ 에펜돌프 튜브에 제한 효소와 반응 완충용액을 50㎕ 내지 100㎕의 반응 부피가 되도록 넣고 37℃에서 1 내지 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 제한 효소를 불활성화하기 위해 65℃에서 15분간 열처리하고, 내열성인 제한 효소에 대해서는 페놀 추출 및 에탄올 침전법을 사용하였다. 사용된 제한 효소와 반응 완충용액은 뉴 잉글랜드 바이오랩사(New England Biolabs, MA, USA)로부터 구입하였다. 10배 반응 완충용액의 조성은 다음과 같다.

10배 NEB 완충용액 1 : 100mM 비스 트리스 프로판-HCl, 100mM MgCl₂,

10mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol. DTT),

pH 7.0

10배 NEB 완충용액 2 : 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl₂, 570mM NaCl,

10mM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 3 : 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl₂, 1000mM NaCl,

10mM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 4 : 200mM 트리스-아세테이트, 100mM 마그네슘 아세테이

트, 500mM 포타슘 아세테이트, 10mM DTT, pH 7.0

[참조예 2]

[페놀 추출과 에탄올 침전]

페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한 효소를 불활성화시키거나 핵산을 추출할 때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA 용액으로 포화시킨 후 사용하였다.

시료와 페놀을 1:1(v/v)의 비율로 섞은 후 강하게 흔들어 혼합한 다음 원심 분리(15,000×G, 5분)시켜 상층액을 새튜브로 옮긴다. 동일 과정을 3회 반복한 후, 동일 부피의 클로로포름 용액(클로로포름과 이소부탄올 비율 24:1(v/v))으로 상층액을 추출하여 0.1 부피의 3M 소듐 아세테이트와 2.5 부피의 100% 에탄올을 가한다. 이를 -70℃에서 30분간 또는 -20℃에서 약 2시간이상 정치한 후 원심 분리 (15,000×G, 20분, 4℃)하여 핵산을 침전시켰다.

[참조예 3]

[연결 반응(ligation)]

연결 효소로서 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase, New England Biolabs, Inc.) 및 10배 연결 완충용액(0.5M 트리스-HCl, pH 7.8, 0.1M MgCl₂, 0.2M 디티오트레이톨, 10mM ATP, 0.5mg/㎖ BSA)을 사용하여 연결 반응을 수행하였다. 보통 20㎖ 부피에서 10 단위체의 연결 효소를 사용하고, 평활 말단(blunt ends)을 갖는 DNA의 연결에는 100 단위체의 연결효소를 사용하여, 16℃에서 적어도 5시간이상 또는 4℃에서 14시간이상 반응시켰고, 반응이 완료된 후 65℃에서 15분간 가열하여 연결효소를 불활성화시켰다.

[참조예 4]

[대장균 형질전환]

대장균 숙주 세포(대장균 HB101, W3110 또는 JM105)를 100㎖의 액체 LB 배지 (1% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨)에 접종한 후 650nm에서의 광학밀도(O.D.) 값이 0.25내지 0.5에 달할 때까지 37℃에서 배양한다. 그후 원심 분리(2,500×G, 10분)에 의해 세포를 분리한 후 50㎖의 0.1M MgCl₂를 가하여 세척한다. 이를 다시 원심분리(2,500×G, 10분)하고 여기에 50㎖ 0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂, 용액을 가하여 얼음위에서 30분간 정치시켰다. 이를 다시 원심분리(2,500×G, 10분)하여 동일용액(0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂) 5㎖에 균일하게 분산시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다. 상기에서 얻은 용액 0.2㎖에 연결 반응 용액 10㎕를 가하여 0℃에서 40분간 정치시킨 후 42℃에서 1분동안 열처리하였다. 이를 2.0㎖의 액체 LB 배지에 가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 상기 배양액을 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 고체 LB 배지상에 도말한 후 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. M13 벡터 DNA는 열처리 한 후 100㎕의 JM105 세포, 15㎕의 100mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside), 25㎕의 4% X-Gal(5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactoside) 및 48℃로 미리 데워 놓은 3㎖의 2배 연성 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 8.7% 박토 아가)를 가하여 잘 섞어준 후 2배 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 1.5% 박토 아가) 위에 도말하였다.

[참조예 5]

[올리고머의 합성]

올리고머는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, Inc., model 380 B, U.S.A.)로 합성한 후 변성 폴리아크릴아미드 젤 (2M 우레아, 12% 아크릴아미드, 50mM 트리스중의 비스(29:1 w/w), 50mM 붕산, 1mM EDTA-Na₂)을 이용한 전기영동으로 분리하였다. 다음으로 이를 C18 컬럼인 SEP-PAK(Waters Inc., U.S.A.)에 부착시킨 후 아세토니트릴:물(50:50)을 용출제로 사용하여 순수 정제하고, 260mm에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

[참조예 7]

[중합효소 연쇄 반응(Po1ymerase Chain Reaction, PCR)]

주형 DNA(10ng 내지 100ng), 10㎍의 10배 Taq 중합효소 완충용액(10mM 트리스-Cl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1%(w/v) 젤라틴), 10㎕의 dNTP 혼합용액 (dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각 10mM), 시발체 2㎍, 0.5㎕의 AmpliTaq DNA 중합효소 (Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위하여 50㎕의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)를 이용하였으며, 순환 프로그램은 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분간의 순환을 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응시켰다.

[실시예 1]

[한국형 C형 간염 바이러스의 KHCV518 유전자의 증폭]

[단계 1]

기존에 클로닝된 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA(KHCV-LBCl, 본 출원인이 선출원한 한국 특허출원 제92-10039호, ATCC 75008, 1991년 5월 14일 기탁)의 일부인 KHCV518 유전자(KHCV LBCl상에서 염기서열 제4196번 내지 제4713번에 해당)를 유비퀴틴과 CORE14 유전자가 결합된 trp 프로모터를 갖고 있는 대장균 발현벡터에 클로닝하기 위하여 다음과 같은 시발체를 합성하였다.

PK518T2 5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGGAGGAGGAGGAGGAGGAATCACCACAGGCGCCCCTATC-3′

이 시발체는 제한효소 SaeI I인지 부위를 가지고 있고 6개의 글리신을 포함하며 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA인 KHCV-LBCl의 4195번째 염기부터 4215번째 염기를 포함하고 있다.

PK518SAL 5′-AAAAAAGTCGACTATTAACACGTATTACAGTCGATCAC-3′

이 시발체는 KHCV-LBCl의 4713번째 염기 뒤에 해독을 종료시키는 종료코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 SalⅠ 인지부위를 가지고 있다.

[단계 2]

반응튜브에 시발체 PK518T2 2㎍, 시발체 PK518SAL 2㎍을 넣고 주형으로 KHCV-LBCl 유전자를 50ng 넣은다음 10㎕의 10배 농도 중합효소완충용액, 10㎕의 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5단위의 Taq 중합효소 및 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 참조예 6에서와 같이 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 처리하는 중합효소 연쇄반응을 25회 실시하였다(Saiki, R. K. et. al., Science 239, 487(1988)).

[단계 3]

상기 단계 2에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아미드 젤에서 분리한 결과 약 520 염기쌍의 DNA가 증폭된 것을 확인하였으며 이를 동일 조건의 폴리아크릴아미드젤로 분리정제하였다. 이하 이 DNA 단편을 단편 GLYK518로 명명하였다.

[실시예 2]

[대장균 발현 벡터의 제조]

본 출원인이 선 출원한 플라스미드 ptrpH-UB-CORE14(대한민국 특허출원 제91-13603호, ATCC 68642, 1991년 7월 1일자로 기탁) 2㎍을 제한효소 SalⅠ으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전절단한 후 제한효소 SacⅡ로 부분 절단하여 0.7% 아가로스젤에서 분리하여 약 3.0kb 단편을 분리 정제하였다. 이하 이 단편을 ptrpH-UB-CORE(T2)/L로 명명하였다.

한편 실시예 1의 단계 3에서 얻은 단편 GLYK518 2㎍을 제한효소 Sac Ⅱ와 제한효소 SalⅠ으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 참조예 1에서와 같이 완전절단한 후 튜브에 절단된 DNA 단편 100ng, 50ng의 단편 ptrpH-UB-CORE(T2)/L, 2㎕의 10배 농도 연결반응용액, 10 단위의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난뒤 이를 사용하여 E. coil W3110(ATCC 37339)를 형질전환시켜 단편 GLYK518을 함유한 ptrpH-UBCORE518을 포함하는 재조합 대장균을 얻었다(제2도).

[실시예 3]

[CORE518 유전자의 발현]

상기 실시예 2에서 얻은 C형 간염 바이러스의 CORE518 유전자를 함유하고 있는 재조합 대장균 세포를 50㎍/㎖의 암피실린이 함유된 액체 루리아(Luria)배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트튬에서 12시간동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖씩을 각기 300㎖의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ Vit B₁, 40㎍/㎖ 암피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4시간동안 진탕배양하여 배양액의 흡광도가 650nm의 파장에서 약 0.3 정도가 될때 인돌아크릴산(indole acrylic acid, IAA)을 최종농도 50㎍/㎖가 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4시간후에 세포배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Bectman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 대장균 세포침전물을 수거하였다.

[실시예 4]

[CORE518 단백질 발현의 확인 및 C형 간염 환자 혈청과의 반응]

실시예 3의 세포침전물을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하에서 15% 폴리아크릴 아미드 젤에서 전기영동하였고(제3(a)도), 젤상에서 분리된 단백질을 토우빈의 방법(Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4750(1979))에 따라 니트로셀룰로스 필터(Bio-Rad Lab., pore size 0.22㎛, CA, USA)로 전달시켰다. 이 필터를 0.5% 트윈(tween) 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH 7.0, 0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간동안 약하게 흔들면서 폐쇄시켰다. 이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 한국형 C형 간염 환자들의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린(IgG)을 최종 농도 16㎍/㎖이 되게 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 필터를 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항 사람 면역 글로불린 G(Bio-Rad Lab, anti-human IgG-HRP, 0.01mg/m1, CA, USA)를 1:500으로 희석시켜서 첨가하고 상온에서 1시간동안 흔들면서 반응시키고, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM 트리스 완충액 (pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 400㎍/㎖의 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액을 가하여 필터를 발색시켰다. 그 결과는 제3(b)도에 나타내었다.

제3(a)도 및 제3(b)도에서 제1열 및 4열은 본 발명의 벡터를 함유하지 않은 대장균을 나타내고, 제2열 및 5열은 ptrpH-UBCORE518을 함유한 대장균을 나타내며 제3열은 표준 단백질 분자량으로서 위로부터 70, 43, 29, 18 및 14킬로 달톤을 나타낸다.

본 발명을 통해 HCV의 특이항원인 핵 단백질의 항원 결정부위와 KHCV897 단백질의 항원 결정 부위를 포함하는 KHCV518 단백질의 융합단백질을 유전공학적인 방법을 이용하여 대량생산할 수 있게 되었으며, 이를 이용하여 보다 정확한 C형 간염 진단 방법의 개발이 가능하게 되었다. 특히 두가지 항원을 단일 균주로부터 융합단백질로서 대량생산하여 값싸게 공급할 수 있게 됨으로써 HCV에 대한 진단시약 및 백신의 개발에도 크게 기여할 수 있게 되었다.

Claims (7)

1. 하기 아미노산 서열을 갖는 한국형 C형 간염 바이러스의 핵구조 단백질의 항원 결정부위와 KHCV897 단백질의 항원 결정부위를 포함하는 KHCV518 단백질을 포함하는 재조합 융합단백질.
2. 제1항에 있어서, 유비퀴틴을 추가로 포함하는 재조합 융합단백질.
3. 제1항 또는 2항의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
4. 제3항에 있어서, 한국형 C형 간염 바이러스의 핵구조 단백질의 항원결정부위 및, KHCV897 단백질의 항원 결정부위를 포함하는 KHCV518 단백질을 각각 코딩하는 하기 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
5. 제3항의 DNA를 포함하는 발현벡터 ptrpH-UBCORE518.
6. 제5항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
7. 제6항의 대장균을 배양함을 포함하는, 제1항 또는 제2항의 재조합 융합단백질의 제조 방법.