JP3327549B2 - Ｃ１００領域に対する組換え抗原を利用したｃ型肝炎アッセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、1990年８月24日に出願された米国特許出願
第07/572,822号及び1990年11月７日に出願された米国特
許出願第07/614,069号の一部継続出願であり、上記米国
特許出願は、同一所有権者を享受しており、ともに本明
細書に参考として組入れる。本出願はまた、「NS1領域
に対する組換え抗原を利用したＣ型肝炎アッセイ」（米
国特許出願第748,561号）、及び「NS5由来の組換え抗原
を利用したＣ型肝炎アッセイ」（米国特許出願第748,56
5号）という名称で同時出願された特許出願にも関連し
ており、上記米国特許出願は同一所有権者を享受してお
り、ともに本明細書に参考として組入れる。

一般的に、本発明はＣ型肝炎ウィルスと免疫学的に反
応する抗体の存在をサンプル中に同定するアッセイ、具
体的には、HCVゲノムの明瞭な領域を示す組換え抗原と
抗体との複合体を検出するアッセイに関する。HCVゲノ
ムの別個の抗原性領域を示す合成DNA配列の、分子クロ
ーニング及び異種発現系での発現に由来する組換え抗原
は、Ｃ型肝炎ウィルス（HCV）と接触のあった個体の体
液中に、抗体及び抗原を検出するための試薬として使用
することができる。

発明の背景 急性ウィルス性肝炎は、黄疸、肝臓圧痛、及びアラニ
ン・アミノトランスフェラーゼ（ALT）とアスパルテー
ト・アミノトランスフェラーゼの血清レベルでの上昇を
含む、明確に定義された患者の症状の組合せによって、
臨床学的に診断される。原因である特定のウィルスの型
を診断するのには、一般に、更に他の血清学的イムノア
ッセイが実施される。歴史的には、臨床的に肝炎の症状
を示す患者で、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、エプスタインバ
ー、又はサイトメガロウィルスに感染していない場合、
除外法によって、非Ａ非Ｂ型肝炎（NANBH）に罹患して
いると、臨床学的に診断された。この疾患から、慢性肝
臓障害に至ることもある。

Ａ型肝炎ウィルス（HAV）、Ｂ型肝炎ウィルス（HB
V）、及びＤ型肝炎ウィルス（HDV）は、肝炎誘発ウィル
スとして良く知られており、各々、免疫学的に特徴があ
って、別科のウィルスに属し、独自のウィルス構成、タ
ンパク質構造、そして複製機構を持っている。

NANBHウィルスを、既知の肝炎ウィルスのいずれかと
のゲノムの類似性によって同定しようとした試みが、失
敗したことからNANBHが独自の構成、構造を持つことが
示唆された。［Fowler,et al.,J.Med.Viol.,12:205−21
3（1983）及びWeiner,et al.,J.Med.Viol.,21:239−247
（1987）］。

NANBHに関連する抗原を正確に同定することの難しさ
が、NANBHに対する特異的抗体を検出するアッセイを開
発する上での著しい障害であった。例えば、Wands,J.,e
t al.,米国特許第4,870,076号、Wands,et al.,Proc.Na
t'l.Acad.Sci.,83:6608−6612（1986）、Ohori,et al.,
J.Med.Virol.,12:161−178（1983）、Bradley,et al.,P
roc.Nat'l.Acad.Sci.,84:6277−6281,（1987）、Akatsu
ka,T.,et al.,J.Med.Virol,20:43−56（1986）、Seto,
B.,et al.,米国特許出願第07/234,641号（U.S.Departme
nt of Commerce National Technical Information Serv
ice,Springfield,Virginia No.89138168より入手可）、
1998年11月30日公開のTakahashi,K.,et al.,ヨーロッパ
特許出願第0 293 274、及びSeelig,et al.,のPCT出願PT
C/EP88/00123を参照されたい。

近年、また別の肝炎誘発ウィルスが、Houghtonらによ
り、Ｃ型肝炎ウィルスとして明確に同定された（Hought
on,M.,et al.,ヨーロッパ特許出願公開第0 318 216号、
1989年５月31日）。このウィルスを記載した関連文献と
しては、Kuo,G.,et al.,Science,244:359−361（198
9）、及びChoo,Q.,et al.,Science,244:362−364（198
9）等がある。Houghtonらは、NANBH罹患患者の持つ抗体
と免疫学的に反応する抗原をコードしたHCV由来cDNA配
列を単離したと報告し、これによりHCVが、NANBHを引起
こす原因ウィルスの一つであることを確定した。HCVに
関連するcDNA配列は、慢性HCV感染チンパンジーの血清
をプールして得られたRNAから作製したcDNAライブラリ
ーから分離された。cDNAライブラリーは、平均して約20
0塩基対からなるcDNA配列を含んでいた。cDNAライブラ
リーをスクリーニングして、コードされたエピトープが
クローン中に発現され、NANBH歴のある患者の血清中の
抗体と結合するものが選択された。

前記ヨーロッパ特許出願の中で、Houghton,M.らはま
た、幾つかの、スーパーオキシドジスムターゼ融合ポリ
ペプチド（SOD）の製造、及びHCVスクリーニングアッセ
イを開発する上での、これらSOD融合ポリペプチドの使
用を記述した。ヨーロッパ特許出願に記載されたSOD融
合ポリペプチドの内、最も複雑なものはc100−３と称さ
れ、アミノ末端にヒトSODのアミノ酸154個、制限部位Ec
oR Iを含む、合成DNAアダプターの発現に由来するアミ
ノ酸残基５個、クローン化されたHCV cDNAフラグメント
の発現に由来するアミノ酸363個、そして、MS2クローニ
ング・ベクターのヌクレオチド配列由来のカルボキシ末
端アミノ酸５個を持つと、記載されている。このポリペ
プチドをコードするDNA配列は、プラスミドを用いて、
酵母細胞に形質転換された。形質転換した細胞を培養
し、発現した分子量54,000のポリペプチドは、分別抽出
法により、およそ80％の純度にまで精製された。

SOD−NANB_5-1-1及びSOD−NANB₈₁と称されるその他のS
OD融合ポリペプチドは、組換えバクテリア内で発現され
た。大腸菌融合ポリペプチドは、分別抽出法、また陰イ
オン及び陽イオン交換カラムを用いる。クロマトグラフ
ィーにより、精製された。この精製法により、純度約80
％のSOD−NANB_5-1-1、純度約50％のSOD−NAN38が製造で
きた。

Houghton,M.らによって記述された、組換えSOD融合ポ
リペプチドは、マイクロタイター・ウェルまたはポリス
チレン・ビーズにコーティングされて、血清サンプルの
アッセイに用いられた。簡潔に言えば、コーティングし
たマイクロタイター・ウェルは、希釈サンプルと共にイ
ンキュベートされた。インキュベーション後、マイクロ
タイター・ウェルを洗浄して、放射性同位体で標識した
ヒツジ抗ヒト抗体か、またはマウス抗ヒトIgG−HRP（西
洋ワサビペルオキシダーゼ）結合体を用いて、発色／現
像した。これらのアッセイは、後急性期及び慢性期双方
の、HCV感染を検出するために用いられた。

抗原の調製が前述の如くであるため、アッセイでは、
サンプルに酵母菌又は大腸菌抽出物を添加して、サンプ
ル中に存在する酵母菌又は大腸菌抗体との望ましくない
免疫学的反応を防ぐことが特に必要であった。

Ortho Diagnostic System Inc.は、HCV抗原に対する
抗体を検出する酵素免疫アッセイを開発した。Orthoア
ッセイ法は三段階からなり、組換え酵母/C型肝炎ウィル
スSOD融合ポリペプチドc100−３でコーティングしたマ
イクルウェル中で行なわれる血清／血漿検査である。

第一段階では、被検物は、直接テスト・ウェル中で希
釈され、一定時間インキュベートされる。もし被験物中
に、HCV抗原に対する抗体が存在する場合、マイクロウ
ェルの表面に抗原−抗体複合体が形成される。抗体が存
在しない場合は、複合体は形成されず、結合しない血
漿、血清タンパクは洗浄段階で除去される。

第二段階では、抗ヒトIgGマウスモノクロナール抗体
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を、マイクロウェル
に加える。結合体は、抗原−抗体複合体の抗体部分に特
異的に結合する。抗原−抗体複合体が存在しなければ、
結合しなかった結合体は、洗浄段階で除去される。

第三段階では、オルソ−フェニレンジアミン2HCL（OP
D）と過酸化水素からなる酵素検出系が、テスト・ウェ
ルに添加される。結着した結合体が存在すれば、OPDは
酸化されて、着色した最終生成物が出来る。着色した最
終生成物の形成後、希釈硫酸をマイクロウェルに添加、
色素形成検出反応を停止させる。

最終生成物の着色の程度は、マイクロウェル・リーダ
ーで測定される。このアッセイで、患者の血清及び血漿
をスクリーニングすることができる。

HCVが汚染された血液または血液製剤によって伝染す
る事があるのは確定している。輸血を受けた患者が、輸
血後肝炎にかかる率は10％に達する。この内約90％が、
HCVと診断される感染症の結果である。血液および血液
製剤によるHCV感染を防ぐには、HCVキャリア、また汚染
された血液や血液製剤を識別する、信頼性が高く感度の
よい、特異性のある診断、及び予後のツールが必要であ
る。それゆえ、サンプル中に、HCV抗体の存在を正確に
検知する、信頼性が高く効果的な試薬並びに手法を用い
たHCVアッセイの必要性がここにある。

発明の概要 本発明は、HCVゲノムの明瞭な（distinct）抗原性領
域を示す組換えタンパク質少なくとも一つを、サンプル
と接触させることにより、HCV抗原に対する抗体の存在
を、サンプル中に検出する改良アッセイを提供する。

合成DNA配列の、分子クローニング及び異種宿主内で
の発現に由来する組換え抗原が提供される。簡潔に述べ
ると、HCVゲノムの明瞭な抗原性領域を示す望ましいタ
ンパク質をコードした合成DNA配列を、特異的コドン選
択によって、大腸菌での発現のために最適化した。特
に、HCVゲノムの抗原性領域を表わす組換えタンパク質
を記述する。タンパク質は、E.coli CMP−KDOシンテタ
ーゼ（CKS）遺伝子とのキメラ融合体として発現され
る。第１タンパク質はプラスミドpHCV−62によって発現
され、配列番号11によって示される。pHCV−62なる用語
は融合タンパク質自体をも指し、pHCV−62'は、他の組
換え又は合成方法を使用するポリペプチドをも指す。他
の組換え方法としては、種々の発現系を使用するpHCV−
62'の作製が挙げられる。HCVの合成ペプチドの作製方法
は、本明細書と同じ名義人の1989年12月22日出願米国特
許第456,162号及び1990年11月７日出願米国特許第610,1
80号に記載されており、これらの特許は参照により本明
細書の一部を構成するものとする。次のタンパク質はプ
ラスミドpHCV−63によって発現され、配列番号12によっ
て示される。融合タンパク質自体もpHCV−63と称され、
pHCV−63'は、他の組換え又は合成方法を使用して作製
された、配列番号12によって示されるポリペプチドを指
す。配列番号13は、pHCV−204の組換えタンパク質及び
融合タンパク質を示す。ポリペプチドpHCV−204'も配列
番号13によって示される。次のタンパク質はプラスミド
pHCV−112によって発現され、配列番号14によって示さ
れる。融合タンパク質自体もpHCV−112と称され、pHCV
−112'は、他の組換え又は合成方法を使用して作製され
た、配列番号14によって示されるポリペプチドを指す。
配列番号16は、pHCV−72の組換えタンパク質及び融合タ
ンパク質を示す。ポリペプチドpHCV−72'も配列番号16
によって示される。次のタンパク質はプラスミドpHCV−
72によって発現され、配列番号17によって示される。融
合タンパク質自体もpHCV−72と称され、pHCV−72'は、
他の組換え又は合成方法を使用して作製された、配列番
号17によって示されるポリペプチドを指す。配列番号18
は、pHCV−18の組換えタンパク質及び融合タンパク質を
示す。ポリペプチドpHCV−205'も配列番号18によって示
される。これらの抗原は、試料中のHCV抗体の存在を検
出するために本発明のイムノアッセイに使用される。

本発明のアッセイ方式の一つは、HCV抗原と免疫学的
に反応する抗体の存在を同定するためのスクリーニング
・アッセイである。簡潔にいえば、液体サンプルを、PH
CV−62、pHCV−63、pHCV−204、pHCV−112、pHCV−72、
pHCV−73及びpHCV−205からなる群から選択される２種
類のいずれも結合された組換えタンパク質を含む固相担
体（又は固体支持体）と共にインキュベートする。最終
的には、抗体−抗原複合体を検出する。

別のアッセイ方式は、HCV抗原と免疫学的に反応する
抗体の存在を明確に同定するための確認アッセイ（conf
irmatory assay）である。確認アッセイは、スクリーニ
ング・アッセイで説明した、組換えタンパク質によって
表わされる領域と同じである、HCVゲノムのC100領域の
内包するエピトープ類を示す、合成ペプチド又は組換え
抗体を含んでいる。確認アッセイに用いる組換えタンパ
ク質は、一次スクリーニング・アッセイに用いたのと
は、異種の起源の抗原でなければならない（即ち、大腸
菌によって誘導される組換え抗原や、一部CKS配列から
なる組換え抗原であってはならない）。簡潔にいうと、
一次スクリーニング・アッセイで繰返し陽性であった検
体が、確認アッセイで再検査される。同一量の検体を含
むアリコートを、別々に固相担体上にコーティングした
合成ペプチドまたは組換え抗原と接触させる。最終的に
は、抗体−抗原複合体を検出する。合成ペプチドは、
「Ｃ型肝炎アッセイ」という名称で1989年12月22日に出
願された、米国特許出願第456,162号及び1990年11月７
日に出願された米国特許610,180号に記載されている。
これらの米国特許出願は、同一所有権者を享受してお
り、本明細書中に参考として組入れる。

別のアッセイ方式は、陽性結果が誤認でないことを確
認するために、サンプルを用いて第一及び第二の免疫学
的に同一のアリコートを作成した液体サンプル（又は試
料）中に、HCV抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を
同定する、競合アッセイ又は中和アッセイである。第一
のアリコートは、抗体と結合して検出可能な抗体−ポリ
ペプチド複合体を形成するのに適した条件下、HCV抗原
のエピトープを少なくとも一つ含有する結合ポリペプチ
ドを含む固相担体に接触させ、また第二のアリコート
は、最初に、結合ポリペプチドを含む同じ固相担体に接
触させる。

別のアッセイ方式は、抗体と、少なくとも一方のポリ
ペプチドが、複合体形成するのに適した条件下、サンプ
ルを、各々HCV抗原の明瞭なエピトープを含む組換えポ
リペプチドと同時に接触させた後、複合体と発色剤を反
応させて、抗体ポリペプチド複合体を検出することによ
って、HCV抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を同定
するイムノドット・アッセイである。使用する好ましい
組換えポリペプチドは、pHCV−62、pHCV−63、pHCV−7
2、pHCV−73、pHCV−112、pHCV−204及びpHCV−205から
誘導される組換えポリペプチドである。

全てのアッセイでは、固相担体に吸着されたポリペプ
チドに、接触する前に、サンプルを希釈しておくことが
望ましい。サンプルは、全血、血清、血漿、脳脊髄液、
またリンパ球や細胞の培養液上清の様な、種々の生物学
的サンプルから得ることができる。固相担体の材質とし
ては、紙やニトロセルロースの様なセルロース素材、ま
たポリアクリルアミド、ポリスチレン及び綿の様な天然
又は人造高分子材料、あるいはシリカゲル、アガロー
ス、デキストラン、ゼラチンの様な多孔質ゲル、並びに
不活性化アルミナ、硫酸マグネシウム、及びガラスのよ
うな無機物が利用できる。好適な固相担体材料は、マイ
クロタイター・ウェル、試験管、ビーズ、ストリップ、
膜、及び極微粒子のような周知の種々の物理的形状で、
アッセイに使用できる。イムノドット以外のアッセイで
は、ポリスチレン・ビーズを固相担体として用いること
が好ましい。イムノドット・アッセイでは、ニトロセル
ロースを固相担体として用いることが好ましい。

本発明のアッセイにおいて、抗体−抗原複合体を検出
する手法及び試薬として適当なものは、市販されている
か、あるいは関連技術として知られている。代表的手法
としては、酵素、放射性同位体、蛍光試薬、発光試薬、
あるいは化学発光試薬の様な検出試薬を用いることがで
きる。これらの試薬は、既知の手順に従ってハプテン標
識抗ハプテン検出系の作成に使用でき、例えば、ビオチ
ン標識抗ビオチン系は、抗体−抗原複合体の検出に使用
できる。

本発明はまた、固相担体に結合した、HCV抗原のエピ
トープを少なくとも一つ含有しているポリペプチド、及
び必須のサンプル調製試薬、洗浄剤、検出試薬、そして
シグナル生成試薬を含む、アッセイ・キットも包括して
いる。

目下好適な実施態様において本発明を説明する以下の
詳細な説明を考慮すれば、本発明のその他の態様及び利
点は、当業者には一目瞭然であろう。

本発明の構築物に有用なプラスミドを含んだ大腸菌株
類は、American Type Culture Collection,Rockville,M
arylandに1990年８月10日に寄託され、ATCC 68380（pHC
V−23）、ATCC 68381（pHCV−29）、ATCC 68382（pHCV
−31）、ATCC 68383（pHCV−34）の受託番号を得、また
構築物に有用なプラスミドを含んだ大腸菌株類は、1990
年11月６日に寄託され、ATCC 68458（pHCV−50）、ATCC
68459（pHCV−57）、ATCC 68460（pHCV−103）、ATCC
68461（pHCV−102）、ATCC 68462（pHCV−51）、ATCC 6
8463（pHCV−105）、ATCC 68464（pHCV−107）、ATCC 6
8465（pHCV−104）,ATCC 68466（pHCV−45）、ATCC 684
67（pHCV−48）、ATCC 68468（pHCV−49）、ATCC 68469
（pHCV−58）、及びATCC 68470（pHCV−101）の受託番
号を得た。本発明の構築物に有用なプラスミドを含んだ
大腸菌株類は、1991年９月26日にA.T.C.C.に寄託され、
ATCC 68692（pHCV−62）、ATCC 68687（pHCV−63）、AT
CC 68685（pHCV−72）、ATCC 68684（pHCV−73）、ATCC
68694（pHCV−204）、ATCC 68693（pHCV−205）及びAT
CC 68686（pHCV−112）の受託番号を得た。

図面の簡単な説明 図１は、HCVゲノムを示す。

図２は、HCV接種チンパンジーにおける抗体の存在を
同定するための、組換えポリペプチドの使用を示す。

図３は、pHCV−34及びpHCV−31抗原を用いてスクリー
ニング・アッセイを行った場合の、感度及び特異性の向
上を示す。

図４は、プラスミドpHCV−34の構築を示す。

図５は、融合タンパク質pHCV−34を示す。

図６は、大腸菌中でのpHCV−34の発現を示す。

図７は、プラスミドpHCV−23の構築を示す。

図８は、プラスミドpHCV−29の構築を示す。

図９は、プラスミドpHCV−31の構築を示す。

図10は、融合タンパク質pHCV−31を示す。

図11は、大腸菌中でのpHCV−29の発現を示す。

図12は、大腸菌中でのpHCV−23の発現を示す。

図13は、大腸菌中でのpHCV−31の発現を示す。

図14は、pHCV−34を用いてスクリーニング・アッセイ
を行った場合の、感度の向上を示す。

図15は、pHCV−34及びpHCV−31を用いてスクリーニン
グ・アッセイを行った場合の、特異性の向上を示す。

図16は、血液透析患者における、スクリーニング及び
確認アッセイの結果を示す。

図17は、スクリーニング・アッセイを行った場合の、
血液透析患者におけるHCVのより早期の検出を示す。

図18は、急性NANBH罹患個体からのサンプルを、pHCV
−34及びpHCV−31を用いてスクリーニング・アッセイし
た結果を示す。

図19は、図18と同じ被検群における、確認アッセイの
結果を示す。

図20は、慢性NANBH感染個体におけるスクリーニング
及び確認アッセイの結果を示す。

図21は、HCVイムノドット・アッセイのための、好適
な緩衝液、pH条件、及びスポッティング濃度を示す。

図22は、HCVイムノドット・アッセイの結果を示す。

図23は、融合タンパク質pHCV−45を示す。

図24は、大腸菌におけるpHCV−45の発現を示す。

図25は、融合タンパク質pHCV−48を示す。

図26は、大腸菌におけるpHCV−48の発現を示す。

図27は、融合タンパク質pHCV−51を示す。

図28は、大腸菌におけるpHCV−51の発現を示す。

図29は、融合タンパク質pHCV−50を示す。

図30は、大腸菌におけるpHCV−50の発現を示す。

図31は、融合タンパク質pHCV−49を示す。

図32は、大腸菌におけるpHCV−49の発現を示す。

図33は、pHCV−23、pHCV−45、pHCV−48、pHCV−51、
pHCV−50及びpHCV−49のイムノブロットを示す。

図34は、融合タンパク質pHCV−24、pHCV−57、pHCV−
58を示す。

図35は、大腸菌におけるpHCV−24、pHCV−57及びpHCV
−58の発現を示す。

図36は、融合タンパク質pHCV−105を示す。

図37は、大腸菌におけるpHCV−105の発現を示す。

図38は、融合タンパク質pHCV−103を示す。

図39は、融合タンパク質pHCV−101を示す。

図40は、融合タンパク質pHCV−102を示す。

図41は、大腸菌におけるpHCV−102の発現を示す。

図42は、融合タンパク質pHCV−107を示す。

図43は、融合タンパク質pHCV−104を示す。

図44Aは、E.coliにおけるpHCV−19（レーン１）、pHC
V−54（レーン２）、pHCV−55（レーン３）,pHCV−94
（レーン４）、pHCV−95（レーン６）、pHCV−96（レー
ン７）及びpHCV−97（レーン８）の発現を示す。

図44Bは、E.coliにおけるpHCV−19（レーン１）、pHC
V−54（レーン２）、pHCV−55（レーン３）,pHCV−94
（レーン４）、pHCV−95（レーン６）、pHCV−96（レー
ン７）及びpHCV−97（レーン８）のイムノブロットを示
す。

図45Aは、E.coliにおけるpHCV−202（レーン1,2及び
３）及びpHCV−203（レーン4,5及び６）の発現を示す。

図45Bは、E.coliにおけるpHCV−202（レーン1,2及び
３）及びpHCV−203（レーン4,5及び６）のイムノブロッ
トを示す。

図46Aは、pHCV−62（レーン１及び２）及びpHCV−63
（レーン３及び４）によって発現された組換え抗原のア
ミノ酸配列を示す。

図46Bは、pHCV−62（レーン１及び２）及びpHCV−63
（レーン３及び４）のイムノブロットを示す。

図47Aは、E.coliにおけるpHCV−204の発現を示す。

図47Bは、E.coliにおけるpHCV−204のイムノブロット
を示す。

図48Aは、E.coliにおけるpHCV−72（レーン1,2及び
３）及びpHCV−73（レーン4,5及び６）の発現を示す。

図48Bは、E.coliにおけるpHCV−72（レーン1,2及び
３）及びpHCV−73（レーン4,5及び６）のイムノブロッ
トを示す。

図49Aは、E.coliにおけるpHCV−205の発現を示す。

図49Bは、E.coliにおけるpHCV−205のイムノブロット
を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、サンプル中で、HCV抗原に対する抗体を検
出するためのアッセイに関する。ヒト血清または血漿
は、望ましくはサンプル希釈液で希釈され、HCVゲノム
の明瞭な抗原性領域を示す組換えポリペプチドでコーテ
ィングされたポリスチレン・ビーズと共にインキュベー
トされる。もしサンプル中に抗体が存在する場合、それ
らは、抗原性ポリペプチドと共に複合体を形成し、ポリ
スチレン・ビーズに結合される。複合体形成後、結合し
ない物質及び試薬は、ビーズの洗浄により除去され、ビ
ーズ−抗原−抗体複合体は、西洋ワサビペルオキシダー
ゼで標識した、ヒト抗体に対するヤギ抗体を含んだ溶液
と反応させられる。次いで、このペルオキシダーゼ酵素
は、すでにビーズに固定された抗原−抗体複合体に結合
する。最終反応では、西洋ワサビペルオキシダーゼは、
オルソ−フェニレンジアミン及び過酸化水素と接触し、
黄橙色に発色する。色の濃さは、最初にビーズに固定し
た抗原と結合する抗体の量に比例する。

HCVの抗原性エピトープを持つ、望ましい組換えポリ
ペプチドは、免疫学的に反応性のある他の既知物質と類
似のアミノ酸配列を有し、且つ、免疫学的に何らかの反
応性を持つと同定されたポリペプチドをコードするHCV
ゲノムの一部より選択された。（ポリペプチドの免疫学
的反応性は、最初に、HCVゲノムのcDNAフラグメントで
形質転換させた大腸菌クローンの細胞抽出物と、HCV感
染血清とを反応させて確定した。cDNAを取込んだクロー
ンによって発現されたポリペプチドは、HCV抗原に対す
る抗体を含んでいることが分っている血清と免疫学的に
反応した。）しかし、所与のアミノ酸配列の分析から
は、免疫学的反応性を予知する上での大まかな手掛かり
しか得られない。所与のアミノ酸配列を作成し、アッセ
イ中でその疑わしい配列をテストする以外には、免疫学
的反応性を確定する一定不変の予想法は無い。

HCV抗原に対する抗体の存在を検出するための、HCVゲ
ノムの明瞭な抗原性領域を表わす組換えポリペプチドの
使用は、図２に示されている。チンパンジーPanのHCV感
染の経過は、組換えポリペプチドc100−３を使った１つ
のアッセイ、及びプラスミドpHCV−34とpHCV−31によっ
て各々発現される２つの組換え抗原CKS−Core（pHCV−3
4）（配列番号22及び23）及びpHCV−33c−BCD（pHCV−3
1）（配列番号24及び25）を用いた改良アッセイによっ
てフォローされた。組換えタンパク質pHCV−34とpHCV−
31を用いたアッセイでは、c100−３を使ったアッセイに
よる抗体検出の３週間前に、血漿中の抗体が検出され
た。

Pan及び他の６匹のチンパンジーにおけるHCV感染の経
過を、上記二つのアッセイを用いてたどった研究結果
は、図３に要約されている。両アッセイとも接種前は、
結果は陰性であり、また実験動物がHCVに感染した後
は、両アッセイともに抗体の存在を検知した。しかしな
がら、２つのアッセイを比較すると、７匹のチンパンジ
ー中６匹で、pHCV−34とpHCV−31を用いた改良スクリー
ニングが、HCV抗原に対する血清転換（seroconversio
n）を、より早い時期か、同様の採血日に検出した。こ
れらチンパンジーにおける研究データは、pHCV−34とpH
CV−31タンパク質を用いたアッセイによって、HCV抗体
の全般にわたる検出が大きく向上することをはっきり実
証している。このテストの感度は充分に高く、ALTレベ
ルの上昇で定義される、この疾患の急性期における血清
転換を、ほとんどの動物で検出できる。同様に重要なこ
とは、接種前の検体が反応性を全く示さなかったとい
う、テストの特異性の高さである。

本発明の実施に有用なポリペプチドは、組換え技術を
用いて作製される。所望のポリペプチドをコードしたDN
A配列は、完全な所望配列のフラグメントから組立てら
れることが望ましい。HCVゲノムの合成DNAフラグメント
は、対応するアミノ酸配列に基づいて合成できる。ひと
たびアミノ酸配列が選択されると、選択した系での発現
を容易にするのに最適なコドンを用いて、相補DNA配列
を決定するために、そのアミノ酸配列を逆翻訳する。一
般に、フラグメントは、良く知られた自動的方法及び装
置を用いて作成される。完全な配列が形成された後、求
む配列は、発現ベクターに取込まれ、それは宿主細胞に
形質転換される。次いでDNA配列は、宿主細胞によって
発現されて、求むポリペプチドが形成され、それは宿主
細胞から、あるいは宿主細胞の培養液から採集できる。
組換え技術を用いて、より小さなペプチドを作る場合、
求むポリペプチドの、幾つかのコピーをコードした、鎖
状に繋がった単一のDNA配列を作成したほうが好都合な
こともある。次いで、長い鎖を単離して、より短い所望
の配列に切断する。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の手法を用いて、HCVゲ
ノムのあらゆる部分から、PCR増幅遺伝子を得ることも
可能である。増幅遺伝子は、次いでクローン化して、合
成遺伝子と同様の仕方で、発現させることができる。

ベクター系として使用できるものは、例えば植物、細
菌、酵母菌、昆虫、及び哺乳類の発現系である。コドン
は、使用する系での発現のために最適化されることが望
ましい。

望ましい発現系では、組換えHCVタンパク質が、大腸
菌酵素CKS（CTP:CMP−３−デオキシ−マンノ−オクツロ
ソネート・シチジル・トランスフェラーゼ、又はCMP−K
DOシンテターゼ）の融合タンパク質として発現される融
合系のためにキャリアー遺伝子が利用される。タンパク
質合成のCKS法は、Bolling（EPO 891029282）によっ
て、1988年３月11日に出願された米国特許出願第167,06
7号、及び1988年11月23日に出願された同第276,263号に
開示されている。これらは同一所有権者を享受してお
り、本明細書中に参考として組入れる。

利用できる他の発現系としては、強力なラムダPLプロ
モーター、強力な３−フレーム翻訳ターミネーターrrnB
tl、及びATGコドンでの翻訳開始を含むことを特徴とす
る、ラムダPLベクター系が挙げられる。

本発明では、問題の組換えHCV抗原をコードするアミ
ノ酸配列は、大腸菌での高い発現レベルを容易にするよ
うに最適化したコドンを用いて、逆翻訳される。個々の
オリゴヌクレオチドは、Mandecki（EPO 87109357.1）に
よって、1986年７月８日に出願された米国特許出願第88
3,242号に開示された、オリゴヌクレオチド特異的二本
鎖切断修復法によって合成される。この米国特許出願
は、同一所有権者を享受しており、本明細書中に参考と
して組入れる。あるいは、個々のオリゴヌクレオチド
は、Applied Biosystem 380A DNA合成機により、製造元
の勧める手法と試薬を用いて合成することもできる。個
々のオリゴヌクレオチドのDNA配列は、Sangerジデオキ
シ鎖終結法（Sanger et al.,J.Mole.Biol.,162:729（19
82））により確認された。これら個々の遺伝子フラグメ
ントは、次いでアニール及び連結されて、CKS融合ベク
ターpJO200において、EcoR I−BamH Iサブフラグメント
としてクローニングされる。次いで、生じたDNA配列をS
angerジデオキシ鎖終結法により確認した後、サブフラ
グメントを、適当な制限酵素で消化し、ゲル精製し、連
結し、CKS融合ベクターpJO200内に、EcoR I−BamH Iフ
ラグメントとしてクローニングした。得られたクローン
は、CKS（CMP−KDOシンテターゼ）遺伝子の3'末端に挿
入されたEcoR I−BamH Iフラグメントから成るハイブリ
ッド遺伝子を同定するために、マッピングされた。lac
プロモーターの調節下、生成した融合タンパク質は、HC
Vの様々な領域に融合したCKSタンパク質のアミノ酸239
個より構成される。

組換えポリペプチドの合成、クローニング及び性状確
認、並びにこれらポリペプチドを用いたアッセイの好ま
しい方式は、以下の実施例に示されている。実施例１及
び２は、各々、CKS−Core及びCKS−33−BCDの合成とク
ローニングについて説明している。実施例３は、スクリ
ーニング・アッセイの説明、実施例４は、確認アッセイ
の説明である。実施例５は、競合アッセイの説明であ
る。実施例６は、イムノドット・アッセイの説明であ
る。実施例７はHCV CKS−NS5E、CKS−NS5F、CKS−NS5
G、CKS−NS5H及びCKS−NS5Iの合成とクローニングを説
明している。実施例８はHCV CKS−C100ベクターの調製
の説明である。実施例９は、HCV PCR誘導の発現ベクタ
ーの調製を説明する。実施例10は、組換え抗原HCV pHCV
−202、pHCV−204及びpHCV−205の合成方法、欠失分
析、製造及び特性分析を説明する。

試薬及び酵素 Luria−Bertani（BL）、及びSuperbroth II（Dri For
m）の様な培地は、Gibco Laboratories Life Technolog
ies,Inc.,Madison Wisconsinより入手した。制限酵素、
DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、T4 DNAリ
ガーゼ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、核酸分子量スタ
ンダード、M13塩基配列決定システム、Ｘ−gal（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドニル−ベータ−Ｄ−ガラ
クトシド）、IPTG（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガ
ラクトシド）、グリセロール、ジチオスレイトール、４
−クロロ−１−ナフトールは、Boehringer Mannheim Bi
ochemicals,Indianapolis,Indiana New England Biolab
s,Inc.,Beverly,Massachusetts、またはBethesda Resea
rch Laboratories Life Technologies,Inc.,Gaithersbu
rg,Marylandより購入した。前染色タンパク質分子量ス
タンダード、アクリルアミド（結晶、電気泳動等級99％
以上）、N,N'−メチレン−ビス−アクリルアミド（BI
S）、N,N,N',N'−テトラメチレンジアミン（TEMED）、
及びドデシル硫酸ナトリウムは、BioRad Laboratories,
Richmond,Calforniaより購入した。リゾチーム及びアン
ピシリンは、Sigma Chemical Co.,St.Louis,Missouriよ
り入手した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）標識
二次抗体はKirkegaard ＆ Perry Laboratories,Inc.,Ga
ithersburg,Marylandより入手した。Seaplaque（登録商
標）アガロース（低融点アガロース）は、FMC Bioprodu
cts,Rockland,Maineより購入した。

T50E10は、50mMのトリス（Tris）、pH8.0、及び10mM
のEDTAを含有する。１×TGは、100mMのトリス、pH7.5及
び10％グリセロールを含む。２×SDS/PAGEローディング
緩衝液は、15％のグリセロール、５％のSDS、100mMのト
リス塩基、1Mのベータ−メルカプトエタノール及び0.8
％のブロモフェノール・ブルー染料からなる。TBSは50m
MのトリスpH8.0、及び150mMの塩化ナトリウムを含む。
ブロッキング溶液は、Carnation無脂肪粉ミルクのTBS中
５％溶液である。

宿主細胞培養物、DNA供給源及びベクター 大腸菌JM103細胞、クローニング・ベクターpCU8、pUC
18、pUC19及びM13は、Pharmacia LKB Biotechnology,In
c.,Piscataway,New Jerseyより購入した。Competent Ep
icurean^TM大腸菌株、XL1−Blue及びJM109は、Stratagen
e Cloning Systems,Lajolla,Californiaより購入した。
RR1細胞は、Coli Genetic Stock Center,Yale Universi
ty,New Haven,Connecticutより、大腸菌CAG456細胞は、
University of Wisconsin,Madison,WisconsinのDr.Caro
l Grossより入手した。ベクターpRK248.cltsは、Univer
sity of California,San Diego,CaliforniaのDr.Donald
R.Helinskiより入手した。

一般的手法 制限酵素による消化はすべて、メーカーの指示に従っ
て行った。DNA1マイクログラム当たり、最低５単位の酵
素を使用し、DNAを完全に消化するまで充分にインキュ
ベートした。ミニセル溶解物（minicell lysate）DNA調
製物、フェノール−クロロホルム抽出、DNAのエタノー
ル沈澱、DNAのアガロース上での制限分析、DNAフラグメ
ントの低融点アガロースゲル精製は、標準的手法で行っ
た（Maniatis et al.,Molecular Cloning.A Laboratory
Manual［New York:Cold Spring Harbor,1982］）。大
腸菌株からのプラスミドの単離には、アルカリ溶解法
と、塩化セシウム−エチジウムブロマイド密度勾配法
（Maniatis et al.上掲）を用いた。T4 DNAリガーゼとT
4ポリヌクレオチドキナーゼには、標準の緩衝液を用い
た（Maniatis et al.上掲）。

実施例1.CKS−CORE A. プラスミドpJO200の構築 クローニング・ベクターpJO200は、組換えタンパク質
をCKSタンパク質に融合させる。このプラスミドは、改
変されたlacプロモーターが（CKSタンパク質の大腸菌CM
P−KDOシンテターゼの全アミノ酸248個の内、最初の239
個をコードする）KdsB遺伝子フラグメントに融合したプ
ラスミドpBR322、及びKdsB遺伝子フラグメント末端に融
合した合成リンカーより構成されている。クローニング
・ベクターpJO200はベクターpTB210の改変体である。合
成リンカーには、遺伝子挿入のための多重制限部位、翻
訳停止シグナル、そしてtrpA rho−非依存性転写ターミ
ネーターが含まれる。CKS法によるタンパク質合成、及
びpTB210を含むCKSベクターは、Bolling（EPO 89102928
2）により、1988年３月11日に出願された米国特許出願
第167,067号、及び1988年11月23日に出願された同第27
6,263号に開示されている。これらの米国特許出願は、
同一所有権者を享受しており、本明細書中に参考として
組入れる。

B. HCV CKS−Core発現ベクターの調製 HCVゲノムのアミノ酸１−150を表わす独立した６個の
ヌクレオチドは共に連結され、図４に示した様に、CKS
融合ベクターpJO200中に、EcoR I−BamH Iフラグメント
の466の塩基対としてクローニングされた。pHCV−34と
命名された、このプラスミドの完全なDNA配列、及び産
生された組換え抗原pHCV−34の全アミノ酸配列は、配列
番号22と23に示した。その結果生じた融合タンパク質HC
V CKS−Coreは、図５に示した様に、CKSのアミノ酸239
個と、リンカーDNA配列起源のアミノ酸７個、及びHCVの
最初のアミノ酸150個から構成される。

プラスミドpHCV−34、及びCKSプラスミドpTB210は、
塩化カルシウム法によって、受容能を持たせた大腸菌Ｋ
−12株のxL−１（recA1,endA1,gyrA96,thi−1,hsd R17,
supE44,relA1,lac/F',pro AB,laclqZDM15,TN10）細胞
に、形質転換された。これらの構築過程で、CKS融合タ
ンパク質の発現は、lacプロモーターの調節下にあり、I
PTGの添加によって誘発される。これらプラスミドは、
独立した要素として複製され、不動化可能であり、１細
胞当たり約10−30コピーの割合で保持された。

C. 組換えHCV−Coreの特性分析 クローンpHCV−34が、唯一のHCV−CKS Coreタンパク
質を発現していることを確定するため、pHCV−34/XL−
１培養株を、酵母抽出物、チロシン、リン酸塩、グルコ
ース、及びアンピシリンからなる成長培地中、37℃で一
晩培養した。培養液が、OD600で1.0に達したところで、
発現を誘導するために、IPTGを最終濃度で1mMになるよ
うに添加した。サンプル（1.5ml）を、１時間間隔で採
取し、細胞をペレット状にした後、２×SDS/PAGEローデ
ィング緩衝液中に、OD600が1.0になるように再懸濁し
た。調製サンプルのアリコート（15μｌ）を、二重にセ
ットした12.5％SDS/PAGEゲル上で分離した。

ゲルの一つを、室温で20分間、50％メタノール/10％
酢酸の溶液にて固定した後、50％メタノール/10％酢酸
溶液中0.25％クマシー・ブルー染料を用いて30分間、染
色した。脱色は、10％メタノール/7％酢酸溶液を用いて
３−４時間、又は背景が透明になるまで行った。

図６は、大腸菌におけるpHCV−34タンパク質の発現を
示す。分子量標準は、レーンＭにて泳動した。レーン１
には、HCV配列を含まないCKSベクター、pJO200プラスミ
ドが含まれている。左の矢印は、上から下に、110,000,
84,000,47,000,33,000,24,000,及び16,000ダルトンの分
子量マーカーの移動度を示している。右の矢印は、組換
えHCVタンパク質の移動度を示している。レーン２には
誘導前の、そしてレーン３には誘導３時間後の、CKS−C
ore（アミノ酸１−150）を発現するpHCV−34を含有する
大腸菌溶解物が含まれている。その結果、組換えタンパ
ク質pHCV−34は、分子量48,000ダルトンに相当する、見
かけの移動度を有していた。これは、予想された分子量
43,750ダルトンと比較できる許容可能な値である。

もう一つの12.5％SDS/PAGEゲルからのタンパク質は、
イムノブロット用に、電気泳動的にニトロセルロースに
転写した。その転写タンパク質を含んだニトロセルロー
ス紙を、ブロッキング溶液と共に１時間インキュベート
し、そして大腸菌Ｋ−12株XL−１溶解物を含むTBSで希
釈したHCV患者血清と共に、４℃で一晩インキュベート
した。ニトロセルロース紙を、TBS中で三回洗浄した
後、10％ウシ胎仔血清を含むTBSで希釈されたHRPO標識
ヤギ抗ヒトIgGと共にインキュベートした。ニトロセル
ロースは、TBSで三回洗浄した後、2mg/ml4−クロロ−１
−ナプトール、0.02％過酸化水素水、及び17％メタノー
ルを含んだTBSで発色させた。クローンHCV−34は、48,0
00ダルトンの位置に、HCV患者の血清と、免疫学的に強
く反応するバンドを示した。ゆえに、クマシー染色タン
パク質ゲル中の主要なタンパク質は、免疫学的反応性を
有した。正常ヒト血清は、pHCV−34の、どの成分とも反
応しなかった。

実施例2.HCV CKS−33C−BCD A. HCV CKS−33c−BCD発現ベクターの調製 HCV CKS−33−BCD抗体を発現するこの組換えクローン
は、以下に説明する三段階で構築された。最初に、HCV
CKS−BCD抗原を発現するクローンを構築し、pHCV−23と
命名した。次に、HCV CKS−33抗原を発現するクローン
を構築し、pHCV−29と命名した。最後に、pHCV−23から
HCV BCD領域を切除して、pHCV−29に挿入し、HCV CKS−
33−BCD抗原を発現するpHCV−31と称するクローンを構
築した。

プラスミドpHCV−23を構築するために、HCVゲノムの
アミノ酸1676−1931を表わす13個の個々のオリゴヌクレ
オチドを、一緒に連結し、CKS融合ベクターpJO200内
に、３個の別個のEcoR I−BamH Iサブフラグメントとし
てクローニングした。続いてDNA配列を確認した後、
Ｂ、Ｃ及びＤとそれぞれ命名した３個のサブフラグメン
トを、適当な制限酵素で消化して、ゲル精製後、共に連
結し、図７に示した如く、CKS融合ベクターpJO200中
に、781塩基対EcoR I−BamH Iフラグメントとしてクロ
ーニングした。その結果生じたプラスミドは、pHCV−23
と命名され、lacプロモーターの調節下、HCV CKS−BCD
抗原を発現する。HCV CKS−BCD抗原は、CKSのアミノ酸2
39個、リンカーDNA配列起源のアミノ酸７個、HCVのNS4
領域由来のアミノ酸256個（アミノ酸1676−1931）、及
びリンカーDNA配列起源の付加的アミノ酸10個より構成
される。

プラスミドpHCV−29を構築するために、HCVゲノムの
アミノ酸1192−1457を表わす12個の個々のオリゴヌクレ
オチドを一緒に連結し、CKF融合ベクターpJO200中に、
２つの別個のEcoR I−BamH Iサブフラグメントとしてク
ローニングした。続いてDNA配列を確認した後、２個の
サブフラグメントを適当な制限酵素で消化し、ゲル精製
し、一緒に連結し、図８に示した如く、CKS融合ベクタ
ーpJO200中に、816塩基対EcoR I−BamH Iフラグメント
として、再度、クローニングした。その結果生じたプラ
スミドは、pHCV−29と命名され、lacプロモーターの調
節下、CKS−33抗原を発現する。HCV CKS−33抗原は、CK
Sのアミノ酸239個、リンカーDNA配列起源のアミノ酸８
個、及びHCVのNS3領域のアミノ酸266個（アミノ酸1192
−1457）より構成される。

プラスミドpHCV−31を構築するために、HCV−BCD領域
を表わす、pHCV−23からの781塩基対EcoR I−BamH Iフ
ラグメントを、Cla I−BamH Iフラグメントを作製する
ために、リンカー適合（linker−adapted）させた。Cla
I−BamH Iを、次いでゲル精製し、図９に示した如くCl
a I−BamH I部位でpHCV−29中に連結した。その結果生
じたプラスミドは、pHCV−31と命名され、lacプロモー
ターの調節下、pHCV−31抗原を発現する。pHCV−31の完
全なDNA配列、及び産生されたHCV CKS−33−BCD組換え
抗原の全アミノ酸配列は、配列番号24及び25に示した。
HCV CKS−33−BCD抗原は、CKSのアミノ酸239個、リンカ
ーDNA配列起源のアミノ酸８個、HCVのNS3領域からの266
個のアミノ酸（アミノ酸1192−1457）、リンカーDNA配
列起源のアミノ酸２個、HCVのNS4領域からの256個のア
ミノ酸（アミノ酸1676−1931）、及びリンカーDNA配列
起源の付加的アミノ酸10個から構成されている。図10
は、pHCV−31抗原の模式図である。

pHCV−31プラスミドは、実施例１のpHCV−34及びCKS
−pTB210プラスミドと同様の仕方で、大腸菌Ｋ−12株の
XL−１に形質転換された。

B.組換えHCV CKS−33−BCDの特性分析 pHCV CKS−33BCDの特性は、実施例１のpHCV CHS−Cor
eと同様にして調べた。組換え融合タンパク質CKS−33
c、CKS−BCD及びCKS−33−BCDをそれぞれ発現するプラ
スミドpHCV−29（図11）、pHCV−23（図12）及びpHCV−
31（図13）を含んだ大腸菌溶解物を、pHCV−23,pHCV SD
S/PAGEゲルで電気泳動した。３つの図の各々で、分子量
標準をレーンＭにて泳動し、左の矢印は、上から下に、
110,000,84,000,47,000,33,000,24,000,及び16,000ダル
トンの分子量マーカーの移動度を示している。図11のレ
ーン１は誘導前の、そしてレーン２は、誘導４時間後
の、HCV CKS−33c（アミノ酸1192−1457）を発現するpH
CV−29を含んだ大腸菌溶解物である。これらの結果か
ら、組換えpHCV−29融合タンパク質は、分子量60,000ダ
ルトンに相当する、見かけの移動度を有していた。これ
は、予想された分子量54,911ダルトンと比較できる許容
可能な値である。

図12で、レーン１は、HCV配列を含有しないCKSベクタ
ー、pJO200を含んだ大腸菌の溶解物である。レーン２
は、HCV CKS−Ｂ（アミノ酸1676−1790）を発現するpHC
V−20を含む。レーン３は融合タンパク質pHCV−23（ア
ミノ酸1676−1931）を含む。これらの結果から、組換え
pHCV−23融合タンパク質は、分子量55,000ダルトンに相
当する、見かけの移動度を有していた。これは、予想さ
れた分子量55,070ダルトンと比較できる許容可能な値で
ある。

図13のレーン１は、HCV配列を含有しないCKSベクタ
ー、pJO200を含んだ大腸菌の溶解物である。レーン２
は、誘導前の、そしてレーン３は誘導２時間後の、CKS
−33c−BCD融合タンパク質（アミノ酸1192−1447、及び
1676−1931）を発現するpHCV−31である。これらの結果
から、組換えpHCV−31（CKS−33c−BCD）融合タンパク
質は、分子量90,000ダルトンに相当する、見かけの移動
度を有していた。これは、予想された分子量82,995ダル
トンと比較できる許容可能な値である。

pHCV−31/X1−１培養物からのSDS/PAGEゲルの一つで
は、イムノブロットも行った。HCVに接触のあった個人
からのヒト血清は、90,000ダルトンの所にある主要なpH
CV−31バンドと強く反応した。正常なヒト血清は、pHCV
−31（CKS−33−BCD）調製物の、いかなる成分とも反応
しなかった。

実施例3.スクリーニング・アッセイ c100−３の中にあるエピトープとHCVゲノム由来の他
の抗原性領域からのエピトープとを含んだ組換えポリペ
プチドを使用すれば、c100−３内のエピトープのみを使
ったHCV免疫学的アッセイに比べて、より高感度で、ま
た高特異性の可能性もある、免疫学的アッセイが提供さ
れる。

目下好適なスクリーニング・アッセイでは、大腸菌に
よって発現され、HCVゲノムの明瞭な３つの領域を表わ
す、２つの組換えタンパク質CKS−Core（pHCV−34）及
びCKS−33−BCD（pHCV−31）が用いられる。これらの組
換えポリペプチドは、上記の手法によって作成される。
スクリーニング・アッセイにおいては、両組換え抗原を
共に、同じポリスチレン・ビーズの上にコーティングす
る。スクリーニング・アッセイの変法としては、ポリス
チレン・ビーズを、SOD融合ポリペプチドc100−３でコ
ーティングしてもよい。

ポリスチレン・ビーズは、まず蒸溜水とプロパノール
で洗浄し、次いで、0.4M NaCl及び0.0022％トリトン（T
riton）Ｘ−100を含んだ0.1M NaH₂PO₄・H₂O（pH6.5）
で、0.5から2.0μg/mlに希釈したpHCV−31、及び0.1か
ら0.5μg/mlに希釈したpHCV−34を含む溶液と共に、イ
ンキュベートする。ビーズを、抗原溶液中で２時間（プ
ラス・マイナス10分間）、38−42℃でインキュベートし
た後、PBSで洗浄し、0.1％（w/v）トリトンＸ−100を含
んだPBSに60分間、38−42℃にて浸す。ビーズは、次い
でリン酸緩衝塩水（PBS）中で二回洗浄し、5.0％（w/
v）ウシ血清アルブミン（BSA）を含んだPBS溶液で60分
間、38−42℃でオーバーコーティングした後、PBSで一
度洗浄する。最後に、ビーズを、５％（w/v）ショ糖含
有のPBSで、オーバーコーティングしてから、窒素また
は空気中で乾燥する。

pHCV−31及びpHCV−34でコーティングしたポリスチレ
ンビーズは、抗体捕捉方式で使用する。サンプル10μｌ
を、希釈サンプル400μｌ、及び組換えタンパク質でコ
ーティングしたビーズと共に、反応トレーのウェルに添
加する。希釈サンプルは、10％（v/v）ウシ血清及び20
％（v/v）ヤギ血清の、20mMトリスリン酸緩衝液溶液か
らなり、これには、0.15％（v/v）トリトンＸ−100、１
％（w/v）BSA、１％大腸菌溶解物、及び500μg/ml以下
のCKS溶解物が含有される。組換え酵母c100−３ポリペ
プチドを使う場合、サンプル中に存在するかも知れない
酵母抗原に対する抗体は、希釈サンプルに添加した酵母
抽出物（通常約200μg/ml）と反応する。酵母抽出物の
希釈サンプルへの添加は、偽陽性を防ぐために行なわれ
る。最終生成物は、除菌濾過後、プラスチック瓶に詰
め、0.1％アジ化ナトリウムを加えて保存される。

40℃で１時間インキュベートした後、ビーズを洗浄し
て、200μｌの結合体を、反応トレーのウェルに添加す
る。

望ましい結合体は、ヤギ抗ヒトIgG西洋ワサビペルオ
キシダーゼ結合体である。結合体の濃縮液は、作業濃度
を決定するために力価測定する。次いで、結合体濃縮液
を、作業濃度の20倍の濃度になるまで、希釈剤にて希釈
する。20×濃縮液は、除菌濾過後、プラスチック瓶中で
保存する。

希釈結合体は、10％（v/v）ウシ血清、10％（v/v）ヤ
ギ血清、及び0.15％トリトン−X100の20mMトリス緩衝液
（pH7.5）溶液に、0.01％硫酸ゲンタマイシン、0.01％
チメロサル（thimerosal）、及び赤色顔料を添加したも
のよりなる。結合体は、除菌濾過後、プラスチック瓶中
で保存する。

抗HCV陽性コントロールは、HCV抗体に陽性の血漿ユニ
ットを用いて調製する。使用したユニットのプールに
は、pHCV−31及びpHCV−34に反応する抗体を持つ血漿が
含まれる。血漿ユニットは、再石灰化した後、51−61℃
で12時間、一定に攪拌して加熱失活させる。そのプール
は分割して、−20℃あるいは２−８℃にて保存する。陽
性コントロールの各ロットについては、0.1％アジ化ナ
トリウムを保存料として含む陰性コントロールで、保存
溶液を希釈する。最終生成物は、除菌濾過後、プラスチ
ック瓶に詰める。

抗HCV陰性コントロールは、HCVのpHCV−31及びpHCV−
34タンパク質に対する抗体に対して陰性のヒト血漿を再
石灰化したものから調製する。血漿は、ヒト免疫不全ウ
イルス（HIV）抗体に対しても陰性であり、またＢ型肝
炎ウイルス表面抗原（HBsAg）に対しても陰性である。
ユニットをプールして、0.1％アジ化ナトリウムを保存
料として添加する。最終生成物は、除菌濾過後、プラス
チック瓶に詰める。

結合体との、40℃で１時間のインキュベーションの
後、ビーズを洗浄し、OPD基質に30分間、室温で接触さ
せた後、1N H₂SO₄を添加して反応を停止させる。吸光度
は492nmで読み取る。

許容し得る特異性を維持するためには、アッセイのカ
ットオフ（cutoff）値は、正常母集団の平均の吸光度値
より少なくとも５−７標準偏差、高くなければならな
い。加えて、母集団の平均がサンプル対カットオフ値
（S/CO）0.25以下のところにある場合に、許容可能な特
異性が得られることが一般に観察されている。これらの
基準にそって、推定されるほとんどの「真の陰性」を、
「真の陽性」検体から明瞭に区別する「前臨床の（prec
linical）」カットオフ値が、スクリーニング・アッセ
イのために選ばれた。カットオフ値は、陽性コントロー
ルの平均吸光度値を0.25倍した値と、陰性コントロール
の平均吸光度値との和として算出される。カットオフ値
は代数学的に、次の式で表わされる。

カットオフ値＝0.25 PCx＋NCx テストは、アッセイにおいて最終的な発色を測定する
ための、自動化の程度及びメカニズムが基本的に違う二
つの手法で行うことができる。手法の一つは、429nmで
吸光度を測定するのに、Quantum又はQuantumaticを用い
る所から、マニュアル又はQuantum^TM法と呼ばれる。こ
の方法はまた、サンプルのピペッティング、洗浄、及び
試薬の添加が、通常テクニシャンにより、適切に検量さ
れたピペット、ディスペンサー及び洗浄用器具を用い
て、手動で行なわれる所から、マニュアル法とも呼ばれ
る。もう一つの手法は、PPC法と呼ばれ、自動化されたA
bbott Commanderシステムを用いる。同システムはE.
P.O.出願公開第91114072.1に開示された、サンプル・マ
ネージメント・センター（SMC）と呼ばれるピペッティ
ング装置、及びパラレル・プロセッシング・センター
（PPC）と呼ばれる、洗浄・ディスペンス・読取り装置
を用いている。PPCで用いる光学的読み取り機は、二重
波長読取り能力を有し、サンプル・ウェルから、示差吸
光度（ピークバンドとサイドバンド）を測定できる。こ
れらの測定値は、プロセッサーのコントロール・センタ
ーで結果に変換される。

スクリーニング・アッセイの性能 1.接種チンパンジーからの血清／血漿 先に説明した様に、表１は７匹のチンパンジーにおけ
るHCV感染の経過を、ポリペプチドc100−３を使ったス
クリーニング・アッセイ、及びpHCV−31とpHCV−34を使
ったスクリーニング・アッセイで調べた結果である。両
アッセイとも接種前は、結果は陰性であり、また実験動
物がHCVに感染した後は、両アッセイともに抗体の存在
を検知した。しかしながら、二つのアッセイを比較する
と、７匹のチンパンジー中６匹で、pHCV−31及びpHCV−
34を用いたアッセイが、HCV抗原に対する血清転換を、
より早い時期か同様の採血日に検出している。これらの
チンパンジーにおける実験データは、pHCV−31とpHCV−
34タンパク質を用いたアッセイによって、HCV抗体の全
般にわたる検出が大きく向上することをはっきり実証し
ている。このテストは感度が充分に高く、ALTレベルの
上昇で定義される、本疾患の急性期における血清転換
を、ほとんどの実験動物において検出できる。同様に重
要なのは、接種前の検体が、反応性を全く示さなかった
という、テストの特異性の高さである。

2.非Ａ非ＢパネルII（H.Alter.NIH） Dr.H.Alter,NIH,Bethesda,MD.より入手した、感染性H
CV血清、陰性血清、及びその他の疾患コントロールを含
んだ、血統的に純粋性の高いヒト血清のパネルを検査し
た。パネルには、全部で44の検体が存在した。

チンパンジーにおいて、「証明された感染性（proven
infectious）」有り、とされた血清７検体の内６検体
は、ポリペプチドc100−３を使ったスクリーニング・ア
ッセイ、及び組換えタンパク質pHCV−31とpHCV−34を使
ったスクリーニング・アッセイの両方で、陽性であっ
た。これら反応性のある６検体は、慢性肝炎に罹った個
体より得られた。反応性検体は、６検体とも全て陽性で
あることが、合成ペプチドsp67を用いて確認された。輸
血後NANB肝炎の急性期に得られた１検体は、両スクリー
ニング・アッセイにおいて反応性を示さなかった。

このグループの内、「感染性可能性あり（probable i
nfectious）」とラベルされたものは、同一の輸血後肝
炎患者から採取された３検体であった。急性期の最初の
２サンプルは、両アッセイで陰性であったが、３番目の
サンプルは、両アッセイで反応性を示した。疾病コント
ロール・サンプル、及び血統の明らかな（pedigreed）
陰性コントロールは、一様に陰性であった。

両スクリーニング・アッセイで陽性として検出された
16のサンプルは、全てSP117確認アッセイで、確認され
た（図14）。更に、検体10と29は、組換えpHCV−31とpH
CV−34抗原を使ったスクリーニング・アッセイで、新た
に陽性が検出され、sp75確認アッセイでも反応性を示し
た。検体39は、pHCV−34とpHCV−31を使ったスクリーニ
ング・テストで、最初は反応性であったが、再テストで
は陰性を示し、確認アッセイでも確認できなかった。

要約すれば、両スクリーニング・テストとも、慢性NA
NBHキャリア６人中６人を、そして、急性NANBH4サンプ
ル中の１つを、同定した。感染の疑いがあるドナーから
の、ペアにした検体は、c100−３を用いたスクリーニン
グ・テストでは反応しなかったが、pHCV−31及びpHCV−
34使用のスクリーニング・テストでは反応した。したが
って、組換え抗原pHCV−31及びpHCV−34を用いたスクリ
ーニング・テストは、c100−３を使用したスクリーニン
グ・アッセイに比較して、より感度が高い様である。疾
病コントロール検体、及び血統の明らかな陰性コントロ
ール標本は、いずれも両スクリーニング・アッセイでは
反応しなかった。

3.CBERレファレンス・パネル Ｃ型肝炎に対する抗体のレファレンス・パネル（refe
rence panel）は、Center for Biologics Evaluation a
nd Research（CBER）より入手した。この10構成員から
なるパネルには、HCV抗体に対して陰性の正常ヒト血清
で希釈した反応性のある８サンプル、及び検出できるHC
V抗体を含まない２血清が含まれる。このパネルは、c10
0−３を使用したスクリーニング・アッセイ、Ortho第一
世代HCVエンザイム・イムノアッセイ（EIA）、及びpHCV
−31とpHCV−34を用いたスクリーニング・アッセイにか
けられた。アッセイ結果は、図15に示した。

pHCV−31とpHCV−34を用いたスクリーニング・アッセ
イでは、HCV陽性又はボーダーライン・サンプルの希釈
液、６サンプル全てが検知された。２つの非反応性サン
プル希釈液（709及び710）は、両スクリーニング・アッ
セイの抗体検知能の限界を越えて希釈されている様だっ
た。c100−３を用いたスクリーニング・アッセイ又はOr
tho第一世代テストに比べて、pHCV−31とpHCV−34を用
いたスクリーニング・アッセイでは、３つの構成員でカ
ットオフ値の著しい増加が見られた。繰返し反応性を示
す検体はすべて確認された。

実施例4.確認アッセイ 確認アッセイは、HCV抗原と免疫学的に反応する抗体
の存在を明確に同定する手段を提供する。確認アッセイ
には、スクリーニング・アッセイで説明した２つの組換
え抗原が示す領域と同一の、HCVゲノムの明瞭な３領域
が内包する主要エピトープを表わす合成ペプチドあるい
は組換え抗体が含まれている。確認アッセイに用いる組
換えタンパク質は、一次スクリーニング・アッセイに用
いたのとは異種の抗原起源でなければならない（即ち、
大腸菌由来の組換え抗原や、CKS配列の一部からなる組
換え抗原であってはならない）。一次スクリーニング・
アッセイで、繰返し反応性であった検体は、確認アッセ
イで再検査される。同一量の検体を含むアリコートを、
別々にポリスチレン・ビーズ上にコーティングした合成
ペプチドまたは組換え抗原に接触させる。HCVゲノムのc
100−３領域内にあるエピトープに対する血清反応性（s
eroreactivity）は、合成ペプチドsp67及びsp65を用い
て確認される。c100−３領域との血清反応性は、合成ペ
プチドsp117を用いても確認できる。HCVの推定上のコア
領域内のHCVエピトープに対する血清反応性は、合成ペ
プチドsp75を用いて確認される。HCVの33c領域内にある
HCVエピトープに対する血清反応性を確認するには、酵
母菌において、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）
とのキメラタンパク質として発現する組換え抗原が用い
られる。最終的に、抗体−抗原複合体が検出される。

アッセイのプロトコールは、上記の実施例３にて説明
したのと同様であった。ペプチドは、別々にポリスチレ
ンビーズにコーティングされ、スクリーニング・アッセ
イで説明したのと同様の抗体捕捉方式で使用される。検
体10μｌを、希釈検体400μｌ、及びペプチドでコーテ
ィングしたビーズと共に、反応トレーのウェルに入れ
る。40℃で１時間インキュベートした後、ビーズを洗浄
し、（実施例３で説明したのと同一の）結合体200μｌ
を、反応トレーのウェルに添加する。40℃で１時間イン
キュベートした後、ビーズを洗浄し、OPD基質に30分
間、室温で接触させた後、1N H₂SO₄を添加して反応を停
止させる。吸光度は492nmで読み取る。ペプチド・アッ
セイのカットオフ値は、陰性コントロールの吸光度値の
平均値の４倍である。

1.HCV感染の「危険性のある（at risk）」検体を含むパ
ネル 臨床学的に全員NANBHと診断された血液透析患者23人
から採取した233検体からなるグループは、University
of California,Los Angeles Center for the Health Sc
iencesのGary Gitnick,M.D.より供与された。c100−３
を用いたスクリーニング・アッセイでテストされたサン
プルは、次いでpHCV−31とpHCV−34を用いたスクリーニ
ング・アッセイにかけられた。総計23人中７患者（30.4
4％）が、c100−３を用いたスクリーニング・アッセイ
で、反復的に反応性を示す総計36検体とした。23人中10
患者（43.48％）が、pHCV−31とpHCV−34を用いたスク
リーニング・アッセイで、入手出来た検体中反復的に反
応性を示す総計70検体と反応した（図16）。２検体はテ
ストに使用出来なかった。c100−３を用いたスクリーニ
ング・アッセイで繰返し反応性を示した36検体の全部
が、合成ペプチド確認アッセイで確認された。これら36
検体中、総計34がpHCV−31とpHCV−34を用いたHCVエン
ザイム・イムノアッセイで繰返し反応性を示した。２検
体は、テストに使用出来なかった。pHCV−31とpHCV−34
を用いたスクリーニング・アッセイで新たに検知された
36検体の内、９検体はcoreペプチド確認アッセイ（sp7
5）で確認され、27検体はSOD−33c確認アッセイで確認
された。

要約すると、これらのデータから、pHCV−34とpHCV−
31を使用したスクリーニング・アッセイによる抗HCV抗
体の検出は、c100−３スクリーニング・アッセイに比べ
て、同じ採血日に起こるか、あるいは、９ケ月以上も早
い可能性があることが示唆される。図17は、血液透析患
者での、pHCV−34とpHCV−31を用いたスクリーニング・
アッセイによる早期検出を示す。

5.急性／慢性非Ａ非Ｂ型肝炎 検体群は、急性又は慢性NANBHと診断された個体から
同定された。急性症例のNANBH個体より採取された検体
は、University of California,Los Angeles Center fo
r the Health SciencesのGary Gitnick,M.D.より供与さ
れた。急性肝炎の診断は、最低２つの血清サンプルにお
いて、６カ月未満の期間に亘り、細胞溶解性症候群（正
常上限の２倍以上のALTレベル）が存在することに基づ
いており、他の生物学的異常や臨床上の症状は伴って
も、伴わなくてもよい。全検体とも市販のテストで検査
した時、Ａ型肝炎ウイルス（HAV）に対するIgM抗体とは
陰性であり、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対しても陰性
であった。慢性NANBH症例からの検体は、２ケ所の臨床
現場より得られた。慢性NANBH罹患個体の診断は、以下
の基準によって行なわれた:ALTレベルの持続的上昇、肝
臓生検結果、及び／又は検知可能なＢ型肝炎ウイルス表
面抗原（HBsAg）の不在である。生検結果のある検体
は、更に活動性慢性NANBH、持続性慢性NANBH、あるいは
肝硬変を伴う慢性NANBHAに分類された。

これらの検体は、c100−３スクリーニング・アッセ
イ、及びpHCV−34とpHCV−31を用いたスクリーニング・
アッセイの両方でテストされた。後者のテストは、Quan
tum法とPPC法の両方を用い、２つの複製物で行った。

流行性（community acquired）NANBH（急性） c100−３スクリーニング・アッセイにおいては、10検
体中２検体（20.00％）が、繰返し反応性ありと検知さ
れ、２検体とも確認された。pHCV−34とpHCV−31を用い
たスクリーニング・アッセイでは、この２検体に加え
て、新たに２検体が検知された（図18）。これら２検体
は、sp75によって確認された（図19参照）。

急性輸血後NANBH c100−３スクリーニング・アッセイにおいては、32検
体中４検体（12.50％）が、繰返し反応性ありと検知さ
れ、全部が確認された。pHCV−34とpHCV−31を用いたス
クリーニング・アッセイでは、これら４検体中３検体
（75％）が反応性ありと検知された。見逃された１サン
プルは、後のスクリーニング・テストにおいて、S/COが
0.95であった。同サンプルは、sp67ペプチドによって確
認された（図18）。更に、pHCV−34とpHCV−31を用いた
スクリーニング・アッセイでは、c100−３スクリーニン
グ・アッセイでは反応性を示さなかった11検体が検知さ
れた。確認のために入手できた９検体中、８検体がsp75
によって確認され、１検体は確認されなかったものの、
sp65確認テストでのS/COは、0.90であった（図19参
照）。

慢性NANBH この群からの結果は、図24にまとめてある。全体で
は、164の慢性NANBHサンプル中155（94.5％）が、pHCV
−34とpHCV−31を用いた、QuantumあるいはPPC法による
スクリーニング・アッセイで検知された。155の反応性
サンプルの全部が、HCVゲノムのc100、33C、あるいはco
re領域からの配列に基づく合成ペプチドを用いた別のア
ッセイで確認された。それに反して、c100−３アッセイ
では、164検体中、わずか138検体（84.1％）のみが、陽
性であった。138個のc100−３サンプルの内１つを除く
全部が、pHCV−31とpHCV−34を用いたスクリーニングア
ッセイで陽性として検出された。不一致サンプルの一つ
は、合成あるいは中和アッセイのどちらにても確認され
なかった。反対に、確認された内の17サンプルが、pHCV
−34とpHCV−31を用いたスクリーニング・アッセイのみ
で、陽性を示した。

この結果から、慢性NANBH罹患集団においてHCV陽性個
体を検出する際には、pHCV−34とpHCV−31を用いたスク
リーニング・アッセイの方が、現行のテストよりも感度
が高いことが示された。

実施例5.競合アッセイ 抗原性HCVエピトープを含む組換えポリペプチドは、
競合アッセイにおいて有用である。中和アッセイを行う
には、例えばc100−３領域にあるCKS−BCDのようなエピ
トープを表わす組換えペプチド（pHCV−23）を可溶化し
て、サンプル希釈液と、最終濃度が0.5−50μg/mlにな
るように混合する。検体あるいは希釈検体10μｌを反応
ウェルに入れ、組換えポリペプチドを含む希釈検体400
μｌを加えて、望むなら、約15分から２時間、プレイン
キュベートしてもよい。次いで反応ウェルに、c100−３
抗原でコーティングしたビーズを加えて、40℃で１時間
インキュベートする。洗浄後、結合体希釈剤中のペルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG200μｌを添加して、40℃
で１時間インキュベートする。洗浄後、OPD基質を加え
て、30分間、室温でインキュベートする。1Nの硫酸を添
加して反応を停止させ、吸光度を492nmで測定する。

c100−３抗原に対する抗体を含んだサンプルは、溶液
中にあるこれら抗体に対するペプチドの競合的結合によ
って、シグナルの低下を起こす。競合結合率％は、組換
えポリペプチド存在下でのサンプルの吸光度と、組換え
ポリペプチドなしでアッセイされたサンプルの吸光度と
を、同一濃度で比較して計算できる。

実施例6.イムノドット・アッセイ イムノドット・アセイでは、ニトロ・セルロース固相
担体の上に並置した精製組換えポリペプチドからなるパ
ネルを用いる。調製された固相担体はサンプルと接触さ
せて、HCV抗原に対する特異抗体を捕捉する。捕捉され
た抗体は、結合体特異的反応によって検出される。結合
体特異的反応は、1988年８月２日に出願された米国特許
出願第07/227,408号に記載された装置内の反射光学的ア
センブリを用いて定量測定することが望ましい。関連し
た米国特許出願第07/227,272号、第07/227,586号、及び
第07/227,590号には、インムドット・アッセイを行う上
で有用な特定の手法や装置について記載されている。こ
のアッセイはまた、1990年６月６日に出願された米国特
許出願第07/532,489号でも説明されている。簡潔にいう
と、ニトロセルロース基材のテスト・カートリッジが、
多数の抗原性ポリペプチドで処理される。ポリペプチド
は、テスト・カートリッジの特異的反応帯に、それぞれ
含有される。全ての抗原性ポリペプチドをニトロセルロ
ース上に置いた後、ニトロセルロース上の余分な結合部
位をブロックする。次いでテスト・カートリッジをサン
プルと接触させ、これによって、サンプルが適当な抗体
を含んでいる場合、それぞれの反応帯にある抗原性ポリ
ペプチドが反応する。反応後、テスト・カートリッジを
洗浄し、抗原−抗体反応は、適当な既知の試薬を用いて
同定される。

上記特許出願で説明されている様に、全工程を容易に
自動化することができる。イムノドット・アッセイ実施
の手法、装置に関連したこれら特許出願の明細を本明細
書中に参考として組み入れる。

望ましいイムノドット・アッセイでは、図21にまとめ
た様に、組換えポリペプチドpHCV−23、pHCV−29、pHCV
−34、及びc100−３を好適緩衝液、pH条件、及びスポッ
ティング濃度に希釈して、事前組立てしたニトロセルロ
ース・テスト・カートリジに塗布した。カートリッジ
を、一晩、室温37℃にて乾燥した後、ニトロセルロース
の非特異性結合能をブロックした。ブロッキング液に
は、１％豚ゼラチン、１％酵素加水分解カゼイン、５％
Tween−20、0.1％アジ化ナトリウム、0.5M塩化ナトリウ
ム、及び20mMトリスpH7.5が含まれた。

40人の正常ドナーが、上記手法にてアッセイされた。
次いで、平均反射密度（mean reflectance density）
が、それぞれの組換えタンパクについて求められた。カ
ットオフ値は、陰性平均値に６平均偏差を加えて計算さ
れた。テスト・カートリッジは、サンプルA00642及び42
3と共にインキュベートされた（図22参照）。非Ａ非Ｂ
型肝炎回復期の患者より得たサンプル、A00642は、陰性
ヒト血漿にて、1:100から1:12800に希釈された。もう一
つのサンプル、423は、組換えc100−３ポリペプチドを
用いたアッセイで、陽性と判断された有料血漿ドナーか
らのサンプルであり、陰性ヒト血漿にて、1:40から1:25
60に希釈された。サンプルのインキュベーション後、続
く、ビオチン結合ヤギ抗ヒトイムノグロブリン特異抗
体、アルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ビオチン特異
抗体、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフ
ォスフェートとのインキュベーションで、反応部位に有
色生成物が形成される。サンプル対カットオフ値（S/C
O）が、全てのHCV組換えタンパク質について決定され
た。S/CO値が1.0以上ある場合は、反応性ありと判断し
た。限界希釈率は、S/COが1.0以上になる最低の希釈率
と定義された。図22に見られる様に、サンプルのそれぞ
れが、あらゆるHCV組換えタンパク質に対して陽性であ
った。このデータは、サンプルA00642に対する反応性が
pHCV−29を用いた場合最大であり、また、その他の抗原
pHCV−23、c100−３及びpHCV−34の場合には減少したこ
とを示している。サンプル423は、pHCV−29及びpHCV−3
4を発現する組換えタンパク質と最も強く反応し、pHCV
−23及びc100−３とは、それよりも弱く反応した。

実施例7.HCV CKS−NS5発現ベクター A. HCV CKS−NS5Eの調製 HCVゲノムのアミノ酸1932−2191を表わす８個の別個
のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、CKS融合ベクタ
ーpJO200中に、793塩基対EcoR I−BamH Iフラグメント
として、クローニングした。その結果生じたpHCV−45と
命名したプラスミドは、lacプロモーターの調節下に、H
CV CKS−NS5E抗原を発現する。HCV CKS−NS5E抗原は、C
KSのアミノ酸239個と、リンカーDNA配列起源のアミノ酸
９個、及びHCV NS4/NS5領域（アミノ酸1932−2191）か
らのアミノ酸260個により構成される。図23は、pHCV−4
5により発現される、組換え抗原の模式図である。配列
番号26及び27は、pHCV−45によって作られるHCV CKS−N
S5E組換え抗原のDNA及びアミノ酸配列を表わす。図27
は、大腸菌におけるpHCV−45タンパク質の発現を示す。
レーン１には誘導前の、そしてレーン２には誘導２時間
後、レーン３には誘導４時間後の、HCV CKS−NS5E抗原
（アミノ酸1932−2191）を発現するpHCV−45を含有する
大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク
質pHCV−45は、分子量55,000ダルトンに相当する見かけ
の移動度を有していた。これは、予想された分子量57,5
97ダルトンと比較できる許容可能な値である。

B. HCV CKS−NS5Fの調製 HCVゲノムのアミノ酸2188−2481を表わす11個の別個
のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、CKS融合ベクタ
ーpJO200中に、895塩基対EcoR I−BamH Iフラグメント
として、クローニングした。結果的に生じたpHCV−48と
命名されたプラスミドは、lacプロモーターの調節下
に、HCV CKS−NS5F抗原を発現する。HCV CKS−NS5F抗原
は、CKSのアミノ酸239個、リンカーDNA配列起源のアミ
ノ酸８個、及びHCV NS5領域（アミノ酸2188−2481）か
らのアミノ酸294個により構成される。図25は、pHCV−4
8により発現される組換え抗原の模式図である。配列番
号28及び29は、pHCV−48によって作られるHCV CKS−NS5
F組換え抗原のDNA及びアミノ酸配列を表わす。図26は、
大腸菌におけるpHCV−48タンパク質の発現を示す。レー
ン１には誘導前の、そしてレーン２には誘導２時間後
の、レーン３には誘導４時間後の、HCV CKS−NS5F抗原
（アミノ酸2188−2481）を発現するpHCV−48を含有する
大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク
質pHCV−48は、分子量65,000ダルトンに相当する見かけ
の移動度を有していた。これは、予想された分子量58,9
85ダルトンと比較できる許容可能な値である。

C. HCV CKS−NS5Gの調製 HCVゲノムのアミノ酸2480−2729を表わす７個の別個
のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、CKS融合ベクタ
ーpJO200中に、EcoR I−BamH Iフラグメントとして、ク
ローニングした。結果的に生じたpHCV−51と命名された
プラスミドは、lacプロモーターの調節下に、HCV CKS−
NS5G抗原を発現する。HCV CKS−NS5G抗原は、CKSのアミ
ノ酸239個、リンカーDNA配列起源のアミノ酸８個、及び
HCV NS5領域（アミノ酸2480−2729）からのアミノ酸250
個により構成される。図27は、pHCV−51により発現され
る組換え抗原の模式図である。配列番号30及び31は、pH
CV−51によって作られるHCV CKS−NS5G組換え抗原のDNA
及びアミノ酸配列を表わす。図28は、大腸菌におけるpH
CV−51タンパク質の発現を示す。レーン１には誘導前
の、そしてレーン２には誘導２時間後、レーン３には誘
導４時間後の、HCV CKS−NS5G抗原（アミノ酸2480−272
9）を発現するpHCV−51を含有する大腸菌溶解物が含ま
れている。その結果、融合タンパク質pHCV−51は、分子
量55,000ダルトンに相当する見かけの移動度を有してい
た。これは、予想された分子量54,720ダルトンと比較で
きる許容可能な値である。

D. HCV CKS−NS5Hの調製 HCVゲノムのアミノ酸2728−2867を表わす６個の別個
のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、CKS融合ベクタ
ーpJO200中に、439塩基対EcoR I−BamH Iフラグメント
として、クローニングした。結果的に生じたpHCV−50と
命名されたプラスミドは、lacプロモーターの調節下
に、HCV CKS−NS5H抗原を発現する。HCV CKS−NS5H抗原
は、CKSのアミノ酸239個、リンカーDNA配列起源のアミ
ノ酸８個、及びHCV NS5領域（アミノ酸2728−2867）か
らのアミノ酸140個により構成される。図29は、pHCV−5
0により発現される組換え抗原の模式図である。配列番
号32及び33は、pHCV−50によって作られるHCV CKS−NS5
H組換え抗原のDNA及びアミノ酸配列を表わす。図30は、
大腸菌におけるpHCV−50タンパク質の発現を示す。レー
ン１には誘導前の、そしてレーン２には誘導２時間後
の、レーン３には誘導４時間後の、HCV CKS−NS5H抗原
（アミノ酸2728−2867）を発現するpHCV−50を含有する
大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク
質pHCV−50は、分子量45,000ダルトンに相当する見かけ
の移動度を有していた。これは、予想された分子量42,7
83ダルトンと比較できる許容可能な値である。

E. HCV CKS−NS5Iの調製 HCVゲノムのアミノ酸2868−3011を表わす６個の別個
のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、CKS融合ベクタ
ーpJO200中に、460塩基対EcoR I−BamH Iフラグメント
として、クローニングした。結果的に生じたpHCV−49と
命名されたプラスミドは、lacプロモーターの調節下
に、HCV CKS−NS5I抗原を発現する。HCV CKS−NS5I抗原
は、CKSのアミノ酸239個、リンカーDNA配列起源のアミ
ノ酸８個、及びHCV NS5領域（アミノ酸2866−3011）か
らのアミノ酸146個により構成される。図31は、pHCV−4
9により発現される組換え抗原の模式図である。配列番
号34及び35は、pHCV−49によって作られるHCV CKS−NS5
I組換え抗原のDNA及びアミノ酸配列を表わす。図32は、
大腸菌におけるpHCV−49タンパク質の発現を示す。レー
ン１には誘導前の、そしてレーン２には誘導２時間後
の、レーン３には誘導４時間後の、HCV CKS−NS5I抗原
（アミノ酸2866−3011）を発現するpHCV−49を含有する
大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク
質pHCV−49は、分子量42,000ダルトンに相当する見かけ
の移動度を有していた。これは、予想された分子量43,4
97ダルトンと比較できる許容可能な値である。

F. HCV CKS−NS5抗原のイムノブロット pHCV−23、pHCV−45、pHCV−48、pHCV−51、pHCV−50
及びpHCV−49を含んだ誘導大腸菌溶解物のそれぞれを、
調製用SDS/PAGEゲル上で電気泳動して、種々のHCV CKS
−NS5又はHCV CKS−BCD組換え抗原を、その他の大腸菌
タンパク質の大部分からアッセイ用に分離した。分離し
たそれぞれのHCV CKS−NS5あるいはHCV CKS−BCD組換え
抗原を含んだゲル片は、電気泳動的にニトロセルロース
に転写し、次いでニトルセルロース紙を帯状に切断し
た。図33は、これらのニトロセルロース片を用いて、種
々の血清また血漿サンプルをウエスタン・ブロット分析
した結果である。右の矢印は、HCV CKS−BCD又はHCV CK
S−NS5組換え抗原のそれぞれの位置を示している。上か
ら下に、pHCV−23（HCV CKS−BCD）,pHCV−45（HCV CKS
−NS5E）,pHCV−48（HCV CKS−NS5F）,pHCV−51（HCV C
KS−NS5G）,pHCV−50（HCV CKS−NS5H）,pHCV−49（HCV
CKS−NS5I），及びpJO200（CKS）の順である。パネル
Ａには５つの正常ヒト血漿が、パネルＢには５つの正常
ヒト血清が、パネルＣには、Abbott HCV EIAテストで陽
性だった20のヒト血清が、パネルＤには、２つの抗CKS
マウス血清が、パネルＥには、２つの正常マウス血清が
含まれた。pHCV−45によって発現されたHCV CKS−NS5E
抗原、pHCV−48によって発現されたHCV CKS−NS5F抗原
の両者とも、HCV抗体を含んだヒト血清サンプルでスク
リーニングしたところ、免疫学的反応性を示した。

実施例8. HCV CKS−C100 A. HCV CKS−C100ベクターの作製 HCVゲノムのアミノ酸1569−1931を表わす18個の別個
のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、CKS融合ベクタ
ーpJO200中に、４つの別々のEcoR I−BamH Iサブフラグ
メントとしてクローニングした。続いて、DNA配列を確
認した後、４個のサブフラグメントを適当な制限酵素で
消化し、ゲル精製し、一緒に連結し、CKS融合ベクターp
JO200中に、1102塩基対EcoR I−BamH Iフラグメントと
して、クローニングした。結果として生じたプラスミド
は、pHCV−24と命名され、lacプロモーターの調節下、H
CV CKS−c100抗原を発現する。HCV CKS−c100抗原は、C
KSのアミノ酸239個、リンカーDNA配列起源のアミノ酸８
個、及びHCVのNS4領域由来のアミノ酸363個（アミノ酸1
569−1931）、及びリンカーDNA配列起源の付加的アミノ
酸10個より、構成される。HCV CKS−c100抗原は、pHCV
−24によって非常に低レベルで発現された。

このHCV CKS−c100組換え抗原の発現レベルの不良性
は、HCV c100領域のアミノ最終末端の欠失を含む２つの
追加的クローンを構築することで解消された。第１のク
ローンは、pHCV−57と命名され、23個のアミノ酸（HCV
アミノ酸1575−1597）の欠失を含み、69塩基対Dde I制
限酵素フラグメントの欠失によって構築された。二つめ
のクローンは、pHCV−58と命名され、21個のアミノ酸
（HCVアミノ酸1600−1620）の欠失を含み、63塩基対Nla
IV−Hae III制限酵素フラグメントの欠失によって構築
された。図34は、pHCV−24、pHCV−57、及びpHCV−58に
より発現される組換え抗原の模式図である。配列番号36
及び37は、pHCV−57によって作られるHCV−C100D1組換
え抗原のDNA及びアミノ酸配列を表わす。配列番号38及
び39は、pHCV−58によって作られるHCV−C100D2組換え
抗原のDNA及びアミノ酸配列を表わす。図35は、大腸菌
におけるpHCV−24、pHCV−57、及びpHCV−58タンパク質
の発現を示す。レーン１には誘導前の、そしてレーン２
には誘導２時間後の、レーン３には誘導４時間後の、HC
V CKS−c100抗原（アミノ酸1569−1931）を発現するpHC
V−24を含有する大腸菌溶解物が含まれている。レーン
４には誘導前の、そしてレーン５には誘導２時間後の、
レーン６には誘導４時間後の、HCV−CKS−C100D1抗原
（アミノ酸1569−1574及び1598−1931）を発現するpHCV
−57を含有する大腸菌溶解物が含まれている。レーン７
には誘導前の、そしてレーン８には誘導２時間後の、レ
ーン９には誘導４時間後の、HCV CKS−C100D2抗原（ア
ミノ酸1569−1599及び1621−1931）を発現するpHCV−58
を含有する大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融
合タンパク質pHCV−57及びpHCV−58は共に、pHCV−24融
合タンパク質よりも充分に高いレベルで発現されてお
り、また融合タンパク質pHCV−57及びpHCV−58は65,000
ダルトンに相当する見かけの移動度を有していた。これ
は、予想されたpHCV−57の分子量64,450ダルトン、及び
pHCV−58の分子量64,458ダルトンと比較できる値許容可
能なである。

実施例9.HCV PCR由来の発現ベクター A. HCV DANフラグメントの調製 RNAは、HCV感染チンパンジー及びヒト血清からの種々
のサンプルを、まずプロティナーゼＫとSDSを用いて、
摂氏37度で１時間消化してから、多数のフェノール：ク
ロロホルム抽出にかけて抽出した。次にRNAを、幾度か
エタノール沈澱させて濃縮後、水中に再懸濁した。次い
でRNAサンプルを、特異的プライマーを用いて、製造業
者の指示に従って、逆転写した。次いで第二のプライマ
ーを添加して、製造業者の指示に従って、PCR増幅を行
った。このPCR反応物の一部を、最初のプライマー・セ
ット内部に位置するネステッドプライマー（nested pri
mers）を用いて、更にもう一ラウンドのPCRにかけた。
通常、これらのプライマーには、その後のクローニング
に用いられる制限エンドヌクレアーゼ認識配列も含まれ
ている。この二度目のネステッドPCR反応物の一部を、
アガロース・ゲル電気泳動及びサザーン・ブロット分析
して、PCR反応の特異性を確認した。PCR反応物の残り
は、適当な制限酵素で消化して、目的のHCV DNAフラグ
メントのゲル精製後、適切なクローン化ベクターに連結
した。この連結生成物を大腸菌に形質転換した後、単一
コロニーを分離し、DNA配列分析のために、プラスミドD
NAを調製した。次に、目的の特異的HCVコード領域が無
傷であることを確認するために、DNA配列を評価した。
このようにした得られたHCV DNAフラグメントは、発現
分析のために、適切なベクター中にクローン化した。

B. HCV CKS−NS3の調製 上記した手法を用いて、HCVの推定上のN3領域由来の4
74塩基対DNAフラグメントを、PCRによって作製した。こ
のフラグメントは、HCVアミノ酸＃1473−1629を示し、
ブラント−エンド・ライゲーションによって、CKS発現
ベクターpJO201にクローン化された。結果的に生じた、
pHCV−105と命名されたプラスミドは、lacプロモーター
の調節下に、HCV CKS−NS3抗原を発現する。HCV CKS−N
S3抗原は、CKSのアミノ酸239個、リンカーDNA配列起源
のアミノ酸12個、HCV NS3領域（アミノ酸1473−1629）
からのアミノ酸157個、及びリンカーDNA配列起源のもう
９個のアミノ酸により構成される。図36は、pHCV−105
抗原の模式図である。配列番号40及び41は、pHCV−105
によって作られるHCV CKS−NS3組換え抗原のDNA及びア
ミノ酸配列を表わす。図37は、大腸菌におけるpHCV−10
5タンパク質の発現を示す。レーン１には誘導前の、そ
してレーン２には誘導２時間後の、レーン３には誘導４
時間後の、HCV CKS−NS3抗原（アミノ酸1472−1629）を
発現するpHCV−105を含有する大腸菌溶解物が含まれて
いる。その結果、融合タンパク質pHCV−105は、分子量4
3,000ダルトンに相当する見かけの移動度を有してい
た。これは、予想された分子量46,454ダルトンと比較で
きる許容可能な値である。

C. HCV CKS−5'ENVの調製 上記にて説明した手法を用いて、HCVの推定上のエン
ベロープ領域由来の489塩基対DNAフラグメントを、PCR
によって作製した。このフラグメントは、HCVアミノ酸1
14−276を表わし、EcoR I−BamH I制限部位を用いて、C
KS発現ベクターpJO202中にクローン化された。結果的に
生じた、pHCV−103と命名されたクローンは、lacプロモ
ーターの調節下に、HCV CKS−5'ENV抗原を発現する。HC
V CKS−5'ENV抗原は、CKSのアミノ酸239個、リンカーDN
A配列起源のアミノ酸７個、HCVエンベロープ領域（アミ
ノ酸114−276）からのアミノ酸163個、及びリンカーDNA
配列起源のもう16個のアミノ酸により構成される。図38
は、pHCV−103抗原の模式図である。配列番号42及び43
は、pHCV−103によって作られるHCV CKS−5'ENV組換え
抗原のDNA及びアミノ酸配列を表わす。図37は、大腸菌
におけるpHCV−103タンパク質の発現を示す。レーン１
には誘導前の、そしてレーン５には誘導２時間後の、レ
ーン６には誘導４時間後の、HCV CKS−5'ENV抗原（アミ
ノ酸114−276）を発現するpHCV−103を含有する大腸菌
溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク質pHCV
−103は、分子量47,000ダルトンに相当する見かけの移
動度を有していた。これは、予想された分子量46,091ダ
ルトンと比較できる許容可能な値である。

D. HCV CKS−3'ENVの調製 上記にて説明した手法を用いて、HCVの推定上のエン
ベロープ領域由来の621塩基対DNAフラグメントを、PCR
によって作製した。このフラグメントは、HCVアミノ酸2
63−469を表わし、EcoR I制限部位を用いて、CKS発現ベ
クターpJO202中にクローン化された。結果的に生じた、
pHCV−101と命名されたクローンは、lacプロモーターの
調節下に、HCV CKS−3'ENV抗原を発現する。HCV CKS−
3'ENV抗原は、CKSのアミノ酸239個、リンカーDNA配列起
源のアミノ酸７個、HCVエンベロープ領域（アミノ酸263
−469）からのアミノ酸207個、及びリンカーDNA配列起
源のもう15個のアミノ酸により構成される。図39は、pH
CV−101抗原の模式図である。配列番号44及び45は、pHC
V−101によって作られるHCV CKS−3'ENV組換え抗原のDN
A及びアミノ酸配列を表わす。図37は、大腸菌におけるp
HCV−101タンパク質の発現を示す。レーン７には誘導前
の、そしてレーン８には誘導２時間後の、レーン９には
誘導４時間後の、HCV CKS−3'ENV抗原（アミノ酸263−4
69）を発現するpHCV−101を含有する大腸菌溶解物が含
まれている。その結果、融合タンパク質pHCV−101は、
分子量47,000ダルトンに相当する見かけの移動度を有し
ていた。これは予想された分子量51,181ダルトンと比較
できる許容可能な値である。

E. HCV CKS−NS2の調製 上記にて説明した手法を用いて、HCVの推定上のNS2領
域由来の636塩基対DNAフラグメントが、PCRによって作
製された。このフラグメントは、HCVアミノ酸994−1205
を表わし、EcoR I制限部位を用いて、CKS発現ベクターp
JO201中にクローン化された。結果的に生じたpHCV−102
と命名されたプラスミドは、lacプロモーターの調節下
に、HCV CKS−NS2抗原を発現する。HCV CKS−NS2抗原
は、CKSのアミノ酸239個、リンカーDNA配列起源のアミ
ノ酸７個、HCV NS2領域（アミノ酸994−1205）からのア
ミノ酸212個、及びもう16個のリンカーDNA配列起源のア
ミノ酸により構成される。図40は、pHCV−102抗原の模
式図である。配列番号46及び47は、pHCV−102によって
作られるHCV CKS−NS2組換え抗原のDNA及びアミノ酸配
列を表わす。図41は、大腸菌におけるpHCV−102タンパ
ク質の発現を示す。レーン１には誘導前の、そしてレー
ン２には誘導２時間後の、レーン３には誘導４時間後
の、HCV CKS−NS2抗原（アミノ酸994−1205）を発現す
るpHCV−102を含有する大腸菌溶解物が含まれている。
その結果、融合タンパク質pHCV−102は、分子量53,000
ダルトンに相当する見かけの移動度を有していた。これ
は、予想された分子量51,213ダルトンと比較できる許容
可能な値である。

F. HCV CKS−NS1の調製 上記にて説明した手法を用いて、HCVの推定上のNS1領
域からの654塩基対DNAフラグメントが、PCRによって作
製された。このフラグメントは、HCVアミノ酸617−834
を表わし、EcoR I−BamH I制限部位を用いて、CKS発現
ベクターpJO200中にクローン化された。結果的に生じ
た、pHCV−107と命名されたプラスミドは、lacプロモー
ターの調節下に、HCV CKS−NS1抗原を発現する。HCV CK
S−NS1抗原は、CKSのアミノ酸239個、リンカーDNA配列
起源のアミノ酸10個、及びHCV NS1領域（アミノ酸617−
834）からのアミノ酸218個により構成される。図42は、
pHCV−107抗原の模式図である。配列番号48及び49は、p
HCV−107によって作られるHCV CKS−NS1組換え抗原のDN
A及びアミノ酸配列を表わす。

G. HCV CKS−ENVの調製 上記にて説明した手法を用いて、HCVの推定上のENV領
域由来の1068塩基対DNAフラグメントが、PCRによって作
製された。このフラグメントは、HCVアミノ酸＃114−46
9を表わし、EcoR I制限部位を用いて、CKS発現ベクター
pJO202中にクローン化された。結果的に生じた、pHCV−
104と命名されたプラスミドは、lacプロモーターの調節
下に、HCV CKS−ENV抗原を発現する。HCV CKS−ENV抗原
は、CKSのアミノ酸239個、リンカーDNA配列起源のアミ
ノ酸７個、HCVエンベロープ領域（アミノ酸114−469）
からのアミノ酸356個、及びもう15個のリンカーDNA配列
起源のアミノ酸により構成される。図43は、pHCV−104
抗原の模式図である。配列番号50及び51は、pHCV−104
によって作られるHCV CKS−ENV組換え抗原のDNA及びア
ミノ酸配列を表わす。

実施例10. HCV CKS−C100A A. HCV CKS−C100A欠失クローンの構築 実施例８に、HCV a.a.1569−1931をコードする合成遺
伝子の構築を記載した。この合成遺伝子の大腸菌中での
CKS融合タンパク質としての発現は極めて低レベルであ
った。大腸菌中でのHCV CKS−C100抗原の発現に不利な
領域を規定するため、HCV C100の４つの別個のサブフラ
グメントの発現レベルを、CKSへの融合体として調査し
た。pHCV−19と称されたかかる１つのクローンはHCV a.
a.1569−1677を含んでいたが、それに予定されたHCV CK
S−C100Aタンパク質を発現しなかった。C100（HCV a.a.
1575−1620）のアミノ末端部分に位置する２つの内部欠
失部を構築した。第１の欠失部pHCV−54は、制限部位Dd
e Iを使用する23個のアミノ酸（HCV a.a.1575−1597）
からなる内部欠失部であった。この欠失部は、大腸菌中
でCKS融合体として十分に発現した。配列番号１は、pHC
V−54によって産生される抗原のアミノ配列を示す。図4
4Aは、このHCV CKS−C100Aタンパク質の大腸菌中での発
現を示す。図44Bは、pHCV−54によって産生される抗原
のイムノブロットを示す。レーン２には、誘導４時間後
の、HCV CKS−C100Aを発現するpHCV−54を含有する大腸
菌溶解物が含まれている。第２の欠失クローンpHCV−55
は、制限部位Nla IV−Hae IIIを使用して21個のアミノ
酸（HCV a.a.1600−1620）が欠失されていた。この内部
欠失体も大腸菌中でCKS融合体として十分に発現した。
配列番号２は、pHCV−55によって産生された抗原のアミ
ノ酸配列を示す。図44Aは、このHCV CKS−C100Aタンパ
ク質の大腸菌中での発現を示す。図44Bは、pHCV−55に
よって産生された抗原のイムノブロットを示す。レーン
３には、誘導４時間後の、HCV CKS−C100Aを発現するpH
CV−55を含有する大腸菌溶解物が含まれている。

pHCV−55（HCV a.a.1600−1620）が欠失しているHCV
アミノ酸を、フラグメント置換法を使用してカルボキシ
末端から順次置換した。挿入したDNAフラグメントは、
一重鎖オリゴヌクレオチドの相補対として合成した。オ
リゴヌクレオチド対をキナーゼ処理し（kinased）、ア
ニーリングし、制限酵素Bsp1286I/Sau96Iを使用してpHC
V−19由来のC100Aフラグメントの残りの部分に連結し
た。得られた新たなＣ−100AフラグメントをCKS融合発
現ベクターpJO200中にクローニングし、大腸菌中で発現
させた。表１は、操作したHCVアミノ酸と種々のHCV CKS
−C100A抗原の大腸菌中での発現レベルとをまとめて示
すものである。配列番号３は、pHCV−94によって産生さ
れた抗原のアミノ酸配列を示す。図44Aは、このHCV CKS
−C100Aタンパク質の大腸菌中での発現を示す。図44B
は、pHCV−94によって産生された抗原のイムノブロット
を示す。レーン４には、誘導４時間後の、HCV CKS−C10
0A抗原を発現するpHCV−94を含有する大腸菌溶解物が含
まれている。配列番号４は、pHCV−95によって産生され
た抗原のアミノ酸配列を示す。図44Aは、このHCV CKS−
C100Aタンパク質の大腸菌中での発現を示す。図44Bは、
pHCV−95によって産生された抗原のイムノブロットを示
す。レーン５には、誘導４時間後の、HCV CKS−C100A抗
原を発現するpHCV−95を含有する大腸菌溶解物が含まれ
ている。配列番号５は、pHCV−96によって産生された抗
原のアミノ酸配列を示す。図44Aは、このHCV CKS−C100
Aタンパク質の大腸菌中での発現を示す。図44Bは、pHCV
−96によって産生された抗原のイムノブロットを示す。
レーン６には、誘導４時間後の、HCV CKS−C100A抗原を
発現するpHCV−96を含有する大腸菌溶解物が含まれてい
る。配列番号６は、pHCV−97によって産生された抗原の
アミノ酸配列を示す。図44Aは、このHCV CKS−C100Aタ
ンパク質の大腸菌中での発現を示す。図44Bは、pHCV−9
7によって産生された抗原のイムノブロットを示す。レ
ーン７には、誘導４時間後の、HCV CKS−C100A抗原を発
現するpHCV−97を含有する大腸菌溶解物が含まれてい
る。配列番号７は、pHCV−202によって産生された抗原
のアミノ酸配列を示す。図45Aは、このHCV CKS−C100A
の大腸菌中での発現を示す。図45Bは、pHCV−202によっ
て産生された抗原のイムノブロットを示す。レーン1,2
及び３には、それぞれ誘導前並びに誘導の２及び４時間
後の、HCV CKS−C100A抗原を発現するpHCV−202を含有
する大腸菌溶解物が含まれている。配列番号８は、pHCV
−203によって産生された抗原のアミノ酸配列を示す。
図45Aは、このHCV CKS−C100Aタンパク質の大腸菌中で
の発現を示す。図45Bは、pHCV−203によって産生された
抗原のイムノブロットを示す。レーン1,2及び３には、
それぞれ誘導前並びに誘導の２及び４時間後の、HCV CK
S−C100A抗原を発現するpHCV−203を含有する大腸菌溶
解物が含まれている。配列番号19は、上述のフラグメン
ト置換において操作したアミノ酸を示す。表１にまとめ
た結果は、HCV a.a.1600−1602（pHCV−96）における３
つのプロリン残基の欠失（配列番号５）によって、大腸
菌中でのHCV CKS−C100A抗原の高レベルの発現が可能に
なることを示している。更に分析すると、HCV a.a.1600
−1601（pHCV−202）における２つのプロリン残基の欠
失によっても、この抗原の高レベルの発現が維持される
ことが判った。しかしながら、これらのプロリン残基の
うちただ１つしか欠失していないと（pHCV−203）（配
列番号８）、この抗原の発現レベルはpHCV−19、即ち元
のHCV CKS−C100Aクローンのレベルにまで低下した。従
って、HCV a.a.1600−1601における２つのプロリンの欠
失は、SDS−PAGE分析によって判定したところでは大腸
菌中でのHCV CKS−C100A抗原の高レベルの発現に寄与す
る。かかる欠失クローンのウェスターンブロット分析
は、HCV C100に対する抗体を含むヒト抗血清を用いてプ
ローブしたとき、高度の免疫反応性を示した。

B. HCV CKS−C100発現クローンの構築 大腸菌中で種々のHCV CKS−C100欠失抗原を高レベル
で発現するベクターを構築するため、本発明者らは、pH
CV−24由来のEcoR I/Sal Iフラグメントを、上述の欠失
クローン由来の種々の対応EcoR I/Sal Iフラグメントで
置き換えた。pHCV−54及びpHCV−55由来のEcoR I/Sal I
フラグメントを使用してpHCV−24のEcoR I/Sal Iフラグ
メントを置き換え、実施例８に記載のごときプラスミド
pHCV−57及びpHCV−58を生成した。pHCV−57及びpHCV−
58によってコードされたHCV CKS−C100抗原は大腸菌中
で十分に発現した。かかるクローンの3'末端を、リンカ
ー付加アミノ酸配列をWDPLDCRHAK（配列番号９）からVH
HKR（配列番号10）に変更するPCRによって変性した。得
られたプラスミドをそれぞれpHCV−62及びpHCV−63と命
名した。配列番号11は、pHCV−62によって産生された抗
原のアミノ酸配列を示す。配列番号12はpHCV−63によっ
て産生された抗原のアミノ酸配列を示す。pHCV−62及び
pHCV−63によってコードされたHCV CKS−C100抗原は大
腸菌中で十分に発現した。図46Aは、これらのHCV CKS−
C100抗原の大腸菌中での発現を示す。図46Bは、pHCV−6
2及びpHCV−63によって産生された抗原のイムノブロッ
トを示す。レーン１及び２には、それぞれ誘導前及び誘
導４時間後の、HCV CKS−C100抗原を発現するpHCV−62
を含有する大腸菌溶解物が含まれている。レーン３及び
４には、それぞれ誘導前及び誘導４時間後の、HCV CKS
−C100抗原を発現するpHCV−63を含有する大腸菌溶解物
が含まれている。pHCV−202由来のEcoR I/Sal Iフラグ
メントを使用してpHCV−63のEcoR I/Sal Iフラグメント
を置き換え、プラスミドpHCV−204を生成した。配列番
号13は、pHCV−204によって産生された抗原のアミノ酸
配列を示す。表２は、HCV CKS−C100抗原に実施した欠
失分析とそれらの大腸菌中での発現レベルをまとめて示
すものである。HCV CKS−C100欠失クローンの発現レベ
ルは、それらを誘導したHCV CKS−C100A欠失クローンの
発現レベルに対応していた。図47Aは、pHCV−204タンパ
ク質の大腸菌中での発現を示す。図47Bは、pHCV−204に
よって産生された抗原のイムノブロットを示す。レーン
１及び２には、それぞれ誘導前及び誘導４時間後の、HC
V CKS−C100抗原を発現するpHCV−204を含有する大腸菌
溶解物が含まれている。

実施例11. HCV CKS−C200 HCV CKS−C200発現クローンの構築 大腸菌中でHCV CKS−C200抗原（HCV a.a.1192−193
1）を高レベルで発現するクローンの構築には下記のス
テップを要した。第１に、実施例２に記載のごとくHCV
CKS−33C抗原（HCV a.a.1192−1457）を発現するクロー
ンを構築し、pHCV−29と命名した。第２に、実施例９に
記載のごとくHCV a.a.1454−1569をコードするDNA配列
を含むクローンを、PCR法を使用して構築し、pHCV−108
と命名した（配列番号20）。次いで、HCV CKS−NS3−１
抗原（HCV a.a.1454−1568）を発現させるため、このDN
A配列を、CKSにフレーム内融合体としてクローニング
し、pHCV−112と命名した（配列番号14）。第３に、HCV
CKS−C100欠失抗原（HCV a.a.1569−1574及び1598−19
31）を発現するクローンを上述のごとく構築し、pHCV−
62と命名した。第４に、C100コーディング領域を含むNc
olフラグメントをpHCV−62から切断し、pHCV−108のNco
l部位に挿入し、pHCV−68を生成した（配列番号15）。
最後に、HCV NS3/C100コーディング領域（HCV a.a.1454
−1574及び1598−1931）を含むCla I/BamH Iフラグメン
トをpHCV−68から切断し、pHCV−29のCla I/BamH I部位
に挿入した。pHCV−72と命名した得られたクローンはHC
V CKS−C200抗原（HCV a.a.1192−1574及び1598−193
1）を発現する。配列番号16は、pHCV−72によって産生
された抗原のアミノ酸配列を示す。同様に、pHCV−63の
C100コーディング領域をpHCV−62のものと置き換え、pH
CV−69を生成した（配列番号21）。HCV NS3/C100コーデ
ィング領域を含むCla I/BamH Iフラグメント（HCV a.a.
1454−1599及び1621−1931）をpHCV−69から切断し、pH
CV−29のCla I/BamH I部位に挿入した。pHCV−73と命名
した得られたクローンはHCV CKS−C200抗原（HCV a.a.1
192−1599及び1621−1599）を発現する。配列番号17
は、pHCV−73によって産生された抗原のアミノ酸配列を
示す。図48Aは、大腸菌中でのHCV CKS−C200抗原の発現
を示す。図48Bは、pHCV−73から産生された抗原のイム
ノブロットを示す。レーン1,2及び３には、それぞれ誘
導前並びに誘導の２及び４時間後の、HCV CKS−C200抗
原を発現するpHCV−72を含有する大腸菌溶解物が含まれ
ている。レーン4,5及び６には、それぞれ誘導前並びに
誘導の２及び４時間後の、HCV CKS−C200抗原を発現す
るpHCV−73を含有する大腸菌溶解物が含まれている。異
なるHCV CKS−C200構築物（HCV a.a.1192−1599及び160
2−1931）を次のように構築した。まずHCV CKS−C100A
領域（HCV a.a.1569−1599及び1602−1677）をpHCV−20
2から352塩基対のCla I/Nco Iフラグメントとして得、
次いで、NS3−１抗原（HCV a.a.1454−1568）を、pHCV
−72から352塩基対のCla I/Nco Iフラグメントとして得
た。最後に使用したフラグメントは、C100 BCD（HCV a.
a.1678−1931）を含むpHCV−72由来の792塩基対のフラ
グメントであった。これら３つのフラグメントをCla I/
Nco I/Sal I/BamH Iで相互に連結し、HCV CKS−33C抗原
（HCV a.a.1192−1453）を与えるベクター主鎖pHCV−29
Cla I/BamH I中に連結した。pHCV−205と命名したHCV
CKS−C200構築物をpJO200中でCKS融合体として発現さ
せ、クーマシー染色ゲル及びウェスターンブロット分析
によって判定すると、高レベルで発現したことが判っ
た。配列番号18は、pHCV−205によって産生された抗原
のアミノ酸配列を示す。図49Aは、HCV CKS−C200抗原の
大腸菌中での発現を示す。図49Bは、pHCV−205によって
産生された抗原のイムノブロットを示す。レーン１に
は、誘導前の、HCV CKS−C200抗原を発現するpHCV−205
を含有する大腸菌溶解物が含まれており、レーン２に
は、誘導２時間後のものが含まれている。

本発明は、HCVに暴露された個体由来の試験試料中の
抗体及び抗原を検出及び／又は確認するための試薬とし
て使用し得る、HCVゲノムの明らかな抗原域に対応する
固有の抗原を提供する。NS4域の正確な機能は未知であ
るが、本明細書に記載の抗原は、HCVゲノムの免疫優勢
と推定される領域中に位置する。

組換え抗原は、本明細書に記載し、実施例で説明した
アッセイ・フォーマットにて、単独で、あるいは組合せ
て使用できる。これら組換え抗原を使用して、ウィルス
複製の特異的阻害剤を開発し、例えばワクチンのような
治療目的に利用することも可能である。これら抗原の使
用及び本明細書に記述した様な本発明の特定の具体例の
他の応用や変形は、当業者には明白であろう。したがっ
て、本発明は、添附の請求項の範囲によってのみ制限さ
れることを意図している。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人:DESAI,SURESH M. CASEY,JAMES M. RU
PPRECH,KEVIN R. DEVARE,SUSHIL G. （ii）発明の名称:C−100領域に対する組換え抗原を
利用したＣ型肝炎アッセイ （iii）配列の数:51 （iv）宛先 （Ａ）宛名:ABBOTT LABORATORIES CHAD377/AP6D （Ｂ）通り:ONE ABBOTT PARK ROAD （Ｃ）市:ABBOTT PARK （Ｄ）州:ILLINOIS （Ｅ）国:USA （Ｆ）郵便番号:60064−3500 （ｖ）コンピューター読取り可能型式： （Ａ）メディア・タイプ：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換型 （Ｃ）オペレーション・システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフト・ウエア:Patentln Release ＃1.0
バージョン＃1.25 （vi）現出現データ： （Ａ）出願番号:US 07/748,565 （Ｂ）出願日:1991年８月21日 （Ｃ）分類： （viii）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名:POREMBSKI,PRISCILLA E. （Ｂ）登録番号:33,207 （Ｃ）参照／事件番号:4843PC.04 （ix）通信情報 （Ａ）電話:708−937−6353 （Ｂ）ファックス:708−937−9556 （２）配列番号:1 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:342 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列:SEQ ID NO:1: （２）配列番号:2 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:344 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列:SEQ ID NO:2: （２）配列番号:3 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:352 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列:SEQ ID NO:3: （２）配列番号:4 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:357 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列:SEQ ID NO:4: （２）配列番号:5 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:362 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列:SEQ ID NO:5: （２）配列番号:6 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:365 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列:SEQ ID NO:6: （２）配列番号:7 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:363 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列:SEQ ID NO:7: （２）配列番号:8 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:364 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラプレツチ，ケビン・アール アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グ レイズレイク、ダラム・レーン・720 (72)発明者 デイベア，サシル・ジー アメリカ合衆国、イリノイ・60062、ノ ースブルツク、フアーンズワース・レー ン・2942 (56)参考文献 特開 平２−35089（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開388232（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/51 C07K 14/18 C07K 19/00 G01N 33/53 G01N 33/576 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号12を有する組換え融合タンパク
   質。
2. 【請求項２】配列番号13を有する組換え融合タンパク
   質。
3. 【請求項３】配列番号17を有する組換え融合タンパク
   質。
4. 【請求項４】配列番号18を有する組換え融合タンパク
   質。
5. 【請求項５】配列番号12の融合タンパク質中に含まれる
   HCV配列に相当するHCV配列を含むポリペプチドであっ
   て、前記ポリペプチド中の前記HCV配列がより長いHCV配
   列の部分を形成せず、前記ポリペプチドが、大腸菌CMP
   −KDOシンテターゼ遺伝子（CKS）にコードされるポリペ
   プチドとの融合体としての発現を介する方法以外の組換
   え方法により調製される前記ポリペプチド。
6. 【請求項６】配列番号13の融合タンパク質中に含まれる
   HCV配列に相当するHCV配列を含むポリペプチドであっ
   て、前記ポリペプチド中の前記HCV配列がより長いHCV配
   列の部分を形成せず、前記ポリペプチドが、大腸菌CMP
   −KDOシンテターゼ遺伝子（CKS）にコードされるポリペ
   プチドとの融合体としての発現を介する方法以外の組換
   え方法により調製される前記ポリペプチド。
7. 【請求項７】配列番号17の融合タンパク質中に含まれる
   HCV配列に相当するHCV配列を含むポリペプチドであっ
   て、前記ポリペプチド中の前記HCV配列がより長いHCV配
   列の部分を形成せず、前記ポリペプチドが、大腸菌CMP
   −KDOシンテターゼ遺伝子（CKS）にコードされるポリペ
   プチドとの融合体としての発現を介する方法以外の組換
   え方法により調製される前記ポリペプチド。
8. 【請求項８】配列番号18の融合タンパク質中に含まれる
   HCV配列に相当するHCV配列を含むポリペプチドであっ
   て、前記ポリペプチド中の前記HCV配列がより長いHCV配
   列の部分を形成せず、前記ポリペプチドが、大腸菌CMP
   −KDOシンテターゼ遺伝子（CKS）にコードされるポリペ
   プチドとの融合体としての発現を介する方法以外の組換
   え方法により調製される前記ポリペプチド。
9. 【請求項９】液体試料においてHCV抗原に免疫学的反応
   性を示す抗体の存在を同定するためのアッセイであっ
   て、 前記試料を、配列番号12、配列番号13、配列番号17又は
   配列番号18を有する組換えタンパク質、及び 配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番号18の
   融合タンパク質に含まれるHCV配列に相当するHCV配列を
   含むポリペプチドから選択される少なくとも１種のポリ
   ペプチドと、 前記抗体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適し
   た条件下に接触させ、ここで該ポリペプチド中の該HCV
   配列がより長いHCV配列の部分を形成せず、該ポリペプ
   チドが大腸菌CMP−KDOシンテターゼ遺伝子（CKS）にコ
   ードされるポリペプチドとの融合体としての発現を介す
   る方法以外の組換え方法によって調製され、 次いで、前記抗体−ポリペプチドの複合体を検出するこ
   とからなるアッセイ。
10. 【請求項１０】液体試料においてHCV抗原に免疫学的反
    応性を示す抗体の存在を同定するための確認アッセイで
    あって、前記試料を使用して免疫学的に等価の第１アリ
    コート及び第２アリコートを調製し、前記第１アリコー
    トを、配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番
    号18を有する組換えタンパク質、及び、 配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番号18の
    融合タンパク質中に含まれるHCV配列に相当するHCV配列
    を含むポリペプチドから選択される少なくとも１種のポ
    リペプチドと、 前記抗体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適し
    た条件下に接触させて第１の抗体−抗原複合体を検出
    し、ここで該ポリペプチド中の該HCV配列がより長いHCV
    配列の部分を形成せず、該ポリペプチドが大腸菌CMP−K
    DOシンテターゼ遺伝子（CKS）にコードされるポリペプ
    チドとの融合体としての発現を介する方法以外の組換え
    方法によって調製され、 更に、前記第２アリコートを、配列番号12、配列番号1
    3、配列番号17又は配列番号18を有する組換えタンパク
    質、及び、 配列番号12、配列番号13、配列番号17及び配列番号18の
    融合タンパク質中に含まれるHCV配列に相当するHCV配列
    を含むポリペプチドから選択されるポリペプチドと、第
    ２の抗体−抗原複合体を形成するのに適した条件下に接
    触させ、ここで該ポリペプチド中の該HCV配列がより長
    いHCV配列の部分を形成せず、該ポリペプチドが大腸菌C
    MP−KDOシンテターゼ遺伝子（CKS）にコードされるポリ
    ペプチドとの融合体としての発現を介する方法以外の組
    換え方法によって調製され、 次いで前記第２の抗体−抗原複合体を検出することから
    なり、 前記第１アリコートにおいて選択されたポリペプチドが
    前記第２アリコートにおいて選択されたポリペプチドと
    同じではないことを特徴とする前記確認アッセイ。
11. 【請求項１１】液体試料においてHCV抗原に免疫学的反
    応性を示す抗体の存在を同定するイムノドットアッセイ
    であって、前記試料を、各々がHCV抗原の別個のエピト
    ープを含み且つ固体支持体の別個の領域に個々に結合さ
    せた少なくとも２種のポリペプチドと、前記抗体と該ポ
    リペプチドとが複合体形成するのに適した条件下で同時
    に接触させ、次いで抗体−ポリペプチド複合体を検出す
    ることからなり、 前記ポリペプチドが、 配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番号18を
    有する組換えタンパク質、及び、 配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番号18の
    融合タンパク質に含まれるHCV配列に相当するHCV配列を
    含むポリペプチドから選択され、ここで該ポリペプチド
    中の該HCV配列がより長いHCV配列の部分を形成せず、該
    ポリペプチドが大腸菌CMP−KDOシンテターゼ遺伝子（CK
    S）にコードされるポリペプチドとの融合体としての発
    現を介する方法以外の組換え方法によって調製されるイ
    ムノドットアッセイ。
12. 【請求項１２】液体試料においてHCV抗原に免疫学的反
    応性を示す抗体の存在を同定するための競合アッセイで
    あって、前記試料を使用して免疫学的に等価の第１アリ
    コート及び第２アリコートを調製し、前記第１アリコー
    トを、固体支持体に結合させたポリペプチドと、前記抗
    体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適した条件
    下で接触させ、検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を
    形成させ、次いで前記第２アリコートをまず未結合のポ
    リペプチドと接触させ、次いで前記結合ポリペプチドと
    接触させることからなり、 前記ポリペプチドが、配列番号12、配列番号13、配列番
    号17又は配列番号18を有する組換えタンパク質、及び、 配列番号12、配列番号13、配列番号17及び配列番号18の
    融合タンパク質に含まれるHCV配列に相当するHCV配列を
    含むポリペプチドから選択され、ここで該ポリペプチド
    中の該HCV配列がより長いHCV配列の部分を形成せず、該
    ポリペプチドが大腸菌CMP−KDOシンテターゼ遺伝子（CK
    S）にコードされるポリペプチドとの融合体としての発
    現を介する方法以外の組換え方法によって調製される競
    合アッセイ。
13. 【請求項１３】液体試料においてHCV抗原に免疫学的反
    応性を示す抗体の存在を同定するための競合アッセイで
    あって、前記試料を使用して免疫学的に等価の第１アリ
    コート及び第２アリコートを調製し、前記第１アリコー
    トを、固体支持体に結合させたポリペプチドと、前記抗
    体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適した条件
    下で接触させ、検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を
    形成させ、 更に、前記第２アリコートをまず未結合のポリペプチド
    と接触させ、次いで前記結合ポリペプチドと接触させる
    ことからなり、 前記ポリペプチドが、配列番号12、配列番号13、配列番
    号17又は配列番号18を有する組換えタンパク質、及び、 配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番号18の
    融合タンパク質中に含まれるHCV配列に相当するHCV配列
    を含むポリペプチドから選択され、ここで該ポリペプチ
    ド中の該HCV配列がより長いHCV配列の部分を形成せず、
    該ポリペプチドが大腸菌CMP−KDOシンテターゼ遺伝子
    （CKS）にコードされるポリペプチドとの融合体として
    の発現を介する方法以外の組換え方法によって調製さ
    れ、 前記第２アリコートを未結合及び結合ポリペプチドと同
    時に接触させる競合アッセイ。
14. 【請求項１４】液体試料においてHCV抗原に免疫学的反
    応性を示す抗体の存在を同定するための中和アッセイで
    あって、前記試料を使用して免疫学的に等価の第１アリ
    コート及び第２アリコートを調製し、前記第１アリコー
    トを、固体支持体に結合させたポリペプチドと、前記抗
    体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適した条件
    下で接触させ、検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を
    形成させ、ここで前記結合ポリペプチドが、配列番号1
    2、配列番号13、配列番号17又は配列番号18を有する組
    換えタンパク質、及び、 配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番号18の
    融合タンパク質中に含まれるHCV配列に相当するHCV配列
    を含むポリペプチドから選択され、ここで該ポリペプチ
    ド中の該HCV配列がより長いHCV配列の部分を形成せず、
    該ポリペプチドが大腸菌CMP−KDOシンテターゼ遺伝子
    （CKS）にコードされるポリペプチドとの融合体として
    の発現を介する方法以外の組換え方法によって調製さ
    れ、 更に、前記第２アリコートをまず未結合のポリペプチド
    と接触させ、次いで前記結合ポリペプチドと接触させ、
    ここで前記未結合ポリペプチドが、配列番号12、配列番
    号13、配列番号17又は配列番号18を有する組換えタンパ
    ク質、及び、 配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番号18の
    融合タンパク質中に含まれるHCV配列に相当するHCV配列
    を含むポリペプチドから選択され、ここで該ポリペプチ
    ド中の該HCV配列がより長いHCV配列の部分を形成せず、
    該ポリペプチドが大腸菌CMP−KDOシンテターゼ遺伝子
    （CKS）にコードされるポリペプチドとの融合体として
    の発現を介する方法以外の組換え方法によって調製さ
    れ、 前記選択した結合ポリペプチドが前記選択した未結合ポ
    リペプチドと同じではない中和アッセイ。
15. 【請求項１５】液体試料においてHCV抗原に免疫学的反
    応性を示す抗体の存在を同定するための中和アッセイで
    あって、前記試料を使用して免疫学的に等価の第１アリ
    コート及び第２アリコートを調製し、前記第１アリコー
    トを、固体支持体に結合させたポリペプチドと、前記抗
    体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適した条件
    下で接触させ、検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を
    形成させ、ここで前記結合ポリペプチドが、配列番号1
    2、配列番号13、配列番号17又は配列番号18を有する組
    換えタンパク質、及び、 配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番号18の
    融合タンパク質中に含まれるHCV配列に相当するHCV配列
    を含むポリペプチドから選択され、ここで該ポリペプチ
    ド中の該HCV配列がより長いHCV配列の部分を形成せず、
    該ポリペプチドが大腸菌CMP−KDOシンテターゼ遺伝子
    （CKS）にコードされるポリペプチドとの融合体として
    の発現を介する方法以外の組換え方法によって調製さ
    れ、 更に、前記第２アリコートをまず未結合のポリペプチド
    と接触させ、次いで前記結合ポリペプチドと接触させ、
    ここで前記未結合ポリペプチドが、配列番号12、配列番
    号13、配列番号17又は配列番号18を有する組換えタンパ
    ク質、及び、 配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番号18の
    融合タンパク質中に含まれるHCV配列に相当するHCV配列
    を含むポリペプチドから選択され、ここで該ポリペプチ
    ド中の該HCV配列がより長いHCV配列の部分を形成せず、
    該ポリペプチドが大腸菌CMP−KDOシンテターゼ遺伝子
    （CKS）にコードされるポリペプチドとの融合体として
    の発現を介する方法以外の組換え方法によって調製さ
    れ、 前記選択された結合ポリペプチドが前記選択された未結
    合ポリペプチドと同じではなく、 前記第２アリコートを未結合及び結合ポリペプチドと同
    時に接触させる中和アッセイ。
16. 【請求項１６】配列番号12、配列番号13、配列番号17又
    は配列番号18を有する組換えタンパク質、及び、 配列番号12、配列番号13、配列番号17又は配列番号18の
    融合タンパク質に含まれるHCV配列に相当するHCV配列を
    含むポリペプチドから選択される少なくとも１種のHCV
    抗原を含むポリペプチドであって、ここで該ポリペプチ
    ド中の該HCV配列がより長いHCV配列の部分を形成せず、
    該ポリペプチドが大腸菌CMP−KDOシンテターゼ遺伝子
    （CKS）にコードされるポリペプチドとの融合体として
    の発現を介する方法以外の組換え方法によって調製され
    るポリペプチドと、 １種以上の試料調製試薬と、 １種以上の検出及びシグナル生成試薬 とを含むイムノアッセイキット。
17. 【請求項１７】前記ポリペプチドが固体支持体に結合さ
    れている請求項16に記載のキット。