JPH06505164A - ＨＣＶのｃ３３ｃ領域のエピトープマッピング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＣＶのｃ３３ｃ領域のエピトープマッピング本発明の背景 非Ａ非Ｂ型肝炎の作因物質の決定的同定に対するコッホの推定は満足ではなかっ たけれども、肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶＩはこの病気の主要病因物質として関係し ているとの一般的合意が存在する．ＨＣ■ゲノムは、キャプシド、マトリックス およびエンベロープのためのＮ末端構造遺伝子と、カルボキ配向非構造遺伝子と を含んでいる単一の読みフレームを持ったワラビウイルスのように組織される． 非構造遺伝子に対するヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列はＥＰ０３１Ｂ ２１６　（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）に開示されテイる．構造遺伝子のための配列を含 むそれ以外の配列はＥＰＯ３８８２３２およびＥＰＱ３９Ｂ７４Ｂに開示されて いる．診断上関心あるＨＣＶタンパクの中には非構造遺伝子産物、すなわちアミ ノ酸残基約１０５０から１６４０までを含むＮＳ３である。特に関心があるのは 、アミノ酸残基１ｌ９２から１４５７までを含む、ＮＳ３内に含まれるｃ３３ｃ として知られる領域である。これは個人が診断学的に検出し得るそれに対する抗 体を生成することができる抗原決定子の存在のため、イムノアッセイにおいて潜 在的価値を持つとこれまで開示されていたからである．発明の概要 ウイルス感染における免疫応答の発生において、最も早いそして通常最も強い応 答が構造タンパクに対して誘発されることが期待されている、なんとなればこれ ら分子は細胞内増殖の途中で免疫系の細胞へ一般に曝されるからである。このた め、ＨＣＶの主要エピトープはキャプシド、マトリックスおよびエンプローブタ ンパクに含まれていることが予期されたであろう。

しかしながら非Ａ非Ｂ肝炎を示す患者からの血清の大きなパネルは、非構造遺伝 子産物についてのみ反応する有義な数を明らかにした。特に、一部の血清は、ポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅およびλｇｔｌｌライブラリーへのクローニ ングによるベータガラクトシダーゼ−ｃ３３ｃ融合産物として得られたＮＳ３部 分遺伝子に対してのみ陽性であった。

ｃ３３ｃの誘導体を利用する改良されたイムノアッセイを開発するため、ｃ３３ ｃ配列のタンパクの種々の構造がつくられ、テストされた。驚くべきことに、ｃ ３３ｃ全領域中に発見された免疫優性エピトープはすべて１０２個カルボキシ末 端アミノ酸中に含まれていることが発見された。

本発明においては、ＮＳ３遺伝子産物のｃ３３ｃＮＭのこの１０２個カルボキシ 末端部分中に含まれる抗原決定子を有する組換えタンパクが提供される。代替具 体例においては、組換え融合タンパクを実質的に同じ配列を含む合成ペプチドで 置換する。

前記アミノ酸配列、または実質的に同じ抗原性を示すＭ換えタンパクまたは合成 ペプチドは、患者血清標本中に含まれるＨＣＶに対する抗体と、固相支持体上に 被覆された、ＮＳ３遺伝子産物のｃ３３Ｃフラグメントの末端カルボキシ１０２ アミノ酸中に含まれる組換えタンパクまたは合成ペプチドさ、またはＨＣＶ　Ｎ Ｓ３遺伝子産物のｃ３３ｃフラグメントのカルボキシ末端１０２アミノ酸の抗原 決定子を実質的に持っている組換えタンパクまたは合成ペプチドと接触させるス テップと、ｃ３３ｃフラグメントに対し、さらに詳しくはそのカルボキシ末端１ ０２アミノ酸フラグメントもしくはその抗原的均等物に対し特異性の患者血清標 本中に含まれる抗体と結合することを許容するのに充分な時間インキュベートす るステップと、結合した抗体を未結合抗体から分離するステップと、そして結合 した抗体を検出するステップよりなる、イムノアツセイに利用される。

図１じＩ【肌 図１は、選定した制限フラグメントのクローニングから得られた種々の融合タン パクの末端を示すマツプである。

図２（配列同定Ｎ１１８およびＮ１１９）は、ＮＳ３の１０２個アミノ酸フラグ メントのヌクレオチドおよび対応する誘導されたアミノ酸配列である。

図３は、示したプライマ一対によって増幅された種々のフラグメントの位置を示 すヌクレオチドマツプである。

しい　の　な ＮＳ３のｃ３３ｃフラグメントは、ｃ３３ｃｔｉ域をフランキングする適切なプ ライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の後、既知の）（ＣＶ 源からλｇｔｌｌヘクローンされた。その後組換えｃ３３ｃフラグメントが創製 され、λｇｔｌｌおよびｐｃＥＸベクターへ発現された。融合タンパクは次に固 相支持体へ移され、抗原性についてＨＣＶ抗体含有血清のパネルに対してテスト された。これら融合タンパクの分子クローニングおよび発現の詳細は実施例に述 べられている。ｃ３３ｃなる術語により、ＥＰＯ３１８２１６の図１５に図示さ れているように、４８４番目のアミノ酸（バリン）から始まり７８５番目のアミ ノ酸（スレオニン）で終わっている１０２個アミノ酸配列配意味する。

ｃ３３ｃインサートの種々の長さを含む融合タンパクの比較は、すべての陽性血 清は最後の１０２カルボキシ末端アミノ酸だけを含むフラグメントに対し、比較 的高い信号において反応したことを示した。このことは、ＨＣＶ　ＮＳ３遺伝子 によってコードされる免疫優性エピトープはこのフラグメント内に存在すること を意味する、このことは、他のタンパクの抗原性は分子のＮ末端に晟も頻繁に関 連していたのでいくらか驚きである。

本発明のアッセイにおいて、組換えタンパクは、慣用のマイクロタイタープレー トのウェルの表面でよい、固相支持体へ被覆される、このタンパクは、慣用操作 に従って共有結合によって結合または受動的に被覆してもよい。このタンパクは また、Ｇｉｅｇｅｌ　ｅｔ　ａｌの米国特許ＮＣＬ４，５１７，２８８に記載さ れているように、放射状パーティシランフィーマット中のアッセイのための多孔 性タブへ固定化してもよい、このタンパクはまた、溶出、遠心、または沈陣によ って未反応分子種から分離し得る架橋ポリスチレンもしくはポリアクリルアミド のような粉砕した不溶性マトリックスへ付着させてもよい。

好ましい具体例においては、タンパクは米国特許Ｎ１１Ｌ７／７１６゜１４４に 記載されているように常磁性微粒子へ被覆されるか、またはボリジフッ化ビニリ デン膜およびニトロセルロース膜へ移されることができる。

このアッセイにおいては、これまで記載したような面相支持体は、被覆した抗原 に対して特異性の抗体が存在し得る患者標本と接触させられる。標本は通常、緩 衝液中に希釈された患者血清であるが、他の体液からの抗体のアッセイも可能で ある。抗原抗体混合物は、１５℃ないし４２°Ｃの温度において抗体の抗原被覆 固相支持体への完全な結合を確実にするのに充分な時間インキユベートされる。

これは一般に５ないし３０分を要する。

インキュベーション後の分層ステップにおいては、溶液中に残っている未結合抗 体は、前に述べたように、抗原被覆固相支持体へ結合した抗体から分離される。

常磁性粒子の場合、粒子は粒子をペレットへまたはアッセイが実施される反応容 器の側壁へ誘引するため磁場を印加することによって分離される。残りの液相は 吸引されるか、または他のように溶出または濾過によって除去される。

面相支持体が緩衝液でリンスされる洗浄ステップに続いて、結合抗体の量を測定 することができる。いくつかの検出方法のうちの任意の方法を選択することがで きる０例えば、固相支持体結合抗体に対し種特異性を有する第２の検出抗体結合 検出成分を固相支持体とインキユベートし、上に述べたように分離し、洗浄する ことができる。検出成分によって発生する信号の量は、固相支持体へ結合した抗 原指向抗体の量に正比例する。検出成分は、螢光、クロモフォル等の増加をもた らす適当な基質に作用する、検出抗体ヘコンジュゲートシた酵素でよい、それは 放射性分子または原子、またはケミルミネセンスを示す化合物でもよい。

この抗原はウェスタンプロットアッセイに使用することができる、この方法によ れば、抗原は１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルを通って電 気泳動され、そして膜へ転写される。

膜は最初ｃ３３ｃ反応抗血清と接触され、洗浄し、次に酵素コンジュゲート抗ヒ ト抗血清と接触され、そして基質で現像される。

合成ペプチドの形で抗原を製造するには、本発明においては任意の信幀できる合 成方法が考えられる。この抗原を合成する特に効果的な方法は、フルオレニルメ トキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保１計画およびジイソプロピルカルボジイミドカ ップリング化学を使用する、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　９６００ モデルペプチドシンセサイザーを利用する。合成したペプチドは、トリフルオロ 酢酸、チオアニソール、エタンジチオール、およびアニソールを９０：５：３： ２の体積比で含む試薬Ｒによって樹脂支持体から開裂し得る。

当業者には、このアッセイにおける標的としてエピトープに実質上影響しない、 ｃ３３ｃの１０２アミノ酸カルボキシ末端フラグメントに含まれるこの抗原の配 列の少しの変動は、本発明と均等であることが理解されるであろう、このような 変動は小さい欠損、挿入またはアミノ酸置換を含む、好ましい具体例においては 、組換えタンパクが合成ペプチドより好ましい。これは１０２個アミノ酸のペプ チドの合成困難性の故と、そして融合タンパクのβ−ガラクトシダーゼ−および グルタチオンｓ−トランスフェラーゼ誘導部分が抗原へいくらかの安定性とアク セシビリティ−を与え、そして精製プロセスに役立つからである。

この抗原のこれ以上の利益、およびその同定および使用の詳しい説明は以下の実 施例に述べられている。

実施例１ ＨＣＶ　ｃ３３ｃの ＨＣＶのプロトタイプ株、Ｂｒａｄｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、ＪＭｅｄ　Ｖユｏ１ ．．３：２５３　（１９７９）およびＣｈｏｏ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ 、２４４：３５９　（１９８９）で感染させたチンパンジーからの血漿を１５． ＯＯＯＸｇで４℃において２０分遠心することによって清澄化した。清澄化した 血漿を７８゜０００Ｘｇ、４℃において４時間遠心し、ＨＣＶビリオンヘペレフ ト化した。このウイルスペレットを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ａｎｄ　５ａｃ ｃｈｉ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１６２：１５６　（１９８７）のグアニ ジウムイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム法によって抽出し、担体 共沈剤としてグリコーゲンの存在下エタノールで沈澱された。エタール沈澱物を 洗い、逆転写の前に１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　）リス 。

ｐＨ８の溶液中へ再懸濁した。

ＨＣＶのｃ３３ｃｅｌ域は、フォスフオルアミダイト化学を使用し、Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　システムを使用する、第１のストランド合成のため のｃ３３ｃ特異性オリゴヌクレオチドプライマー、配列同定ｌ１ｌａ１ （５’　−ＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＧＴＡＴＴＧＣＡＧＴ ＣＴＡＴＣＡ−３″） を使用し、市販のＲＮＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏ ｒｗａｌｋ、ＣＴ）を使用して増幅された。逆転写。

Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡＳ、８６：９７１（１９８９）は、４２℃にお ける転写インキュベーションを１時間へ延長したことを除き、キットの指示書に 従って実施した。

特異的にプライムされたｃＤＮＡは、第２のオリゴヌクレオチドブライマー、配 列同定患２ （５’　−ＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＴ ＧＧＴＣ；ＧＡ−３’　） を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅された。９４°Ｃ１分、３７℃ ２分、および７２℃３分のプロフィルをもって増幅４０サイクルが実施された。

増幅産物は、フェノール／クロロホルムで抽出し、沈澱し、そして凝集端を末端 に形成するため、＃ｌｌＮ酵素ＥｃｏＲＩで消化した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｍｏ１ｅＣｏｌｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ （１９８９）、増幅したＤＮＡは次に１％アガロースゲル中でサイズ分画し、そ してｃ３３ｃの期待されるサイズ（８２７ｂｐ）のバンドを切り取り、Ｃｏ５ｔ ａｒ　５ｐｉｎ−Ｘフィルターを用いて精製した。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ａｎ ａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、）１６０：　１１５　（１９８７）。溶出したバンド は、ウシ腸すン酸塩処理λｇｔｌｌアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｓａｎ　Ｄ ｉｅｇｏ、ＣＡ）ヘリゲートされた。リゲートしたＤＮＡは商業的につくられた パフケージング混合物（Ｇｉｇａ−Ｐａｃｋ　ＧｏｌｄＩ［、Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ）を使用してファージ頭に導入され、そしてｃ３３Ｃコーディング配列を含 んでいるファージを、後でもっと完全に記載するように、ヒトＨＣＶ抗血清に対 する免疫スクリーニングによって同定した。

実施例２ ｃ３３ｃｍイブ−！−の　スクリーニングλｇｔｌｌは、Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｌ ｆ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１５２：４５８　（１ ９８７）に記載されているのと実質的に同じように免疫スクリーニングされた。

ブレーティング宿主バクテリア（Ｅ、Ｃｏ１１ａ　Ｙ１０９０　（ｒ−）Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｅｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｎｕａｌ 、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ 　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｏｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されているように調製し た。細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｄ）、マルトース（０，２％）およびＭｇ ＳＯ４（１０ｍＭ）を含有するＬＢ培地中で一夜生育させた。−夜培養物を上記 添加剤を有する新鮮なＬＢ培地へ加え、０．５の０Ｄ６００へ生育させた。細胞 は遠心し、ペレットを氷冷１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４の０．２容積中に再懸濁した。

λｇｔｌｌ　ｃ３３ｃライブラリーのタイターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）によって決定され 、５００ないし１０００ブラツク形成単位（ｐｆｕ）がＳＭＩＩ衝液１００μｆ ｆｉ中に希釈され、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｒｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）、そしてＹ１０９０　（ｒ−）細胞懸濁液の１５０ μ！へ加えられた。この懸濁液を緩和に混合し、３７°Ｃシニーカー９１５分間 インキュベートし、トップアガロース０．７％の３Ｈ１へ加え、Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃ ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）、そして ＬＢチアンピシリンプレート上産前した。プレートはブラックが見えるまで（約 ３時間）４２℃でインキュベートし、反転した、この間にニトロセルロースフィ ルターを１０ｍＭ　ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド ）で浸漬し、風乾した。ブラックが可視化した時、フィルターをプレート上に置 き、さらに３時間３７℃でインキュベート反転した。フィルターは次に配向のた めにマークル、トリス緩衝化食塩水（ＴＢＳ＝ｌＯｍＭトリス、１５０ｍＭ　Ｎ ａＣｌ、ｐＨ７，４）で洗い、非脂肪ドライミルク溶液（ＮＦＤＭ：ＴＢＳ、２ ％非脂肪ドライミルク、０．１％ＮａＮ５）と１５分間インキヱベートした。− 次抗体はＢｏｓｔ。

ｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡからの特徴化した血清、抗ＨＣＶ 混合タイタ　＃８　ＰＨＶ２０１　０Ｂであった。この血清はＢｏｓｔｏｎ　Ｂ ｉｏｍｅｄｉｃａ、ＲＩＢＡ　２　テスト、０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓ、Ｒａｒｉ　む　ａｎ、ＮＪによって決定されたように、ｃ３３ｃへ強く反応 性であり、特異性であった。−次抗体は５．ｃｏｌｉ溶解物１０倍容積とインキ ュベートし、不溶性Ｅ、ｃｏｌｔタンパクを除去するため遠心し、そしてＮＦＤ Ｍの他の１０倍容積中に希釈した。フィルターはこの一次抗体希釈液（１：　１ ００）１０ｄで一夜室温で緩和にふりながら処理された。−次抗体は除去され、 次にフィルターはＴＢＳ＋０．０５　Ｔｗｅｅｎ−２０で６×５分間洗い、そし てＮＦＤＭ中ｌ：３５００希釈したアルカリ性フォスファターゼコンジュゲート ヤギ抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ａｎｄ　Ｊａｃｋｓ。

ｎ、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で処理した。フィルターを室温で２．５時間イ ンキュベートし、二次抗体を除き、そしてフィルターを上記したように洗った。

フィルターは次に５０ｍＭ）リス−ＨＣ１、ｐＨ９，５で５分間２回リンスした 。各フィルターは、基質、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ９，５へ５−ブロ モ−４−クロロインドリルフォスフェート（ＢＣＩＰ、５０■／ｄＤＭＦ）３３ μｌおよびニトロブルーテトロゾリウム（ＮＥＴ、７５μｌｇ／ｄ　７０％ＤＭ Ｆ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ、ＭＤ）４４ａｉ！を加えたちの１０ｍで処理した０反応は基質を除去し、１ ％氷酢酸溶液添加により停止された。フィルターは水でリンスされ、風乾された ０反応性ブラックは対応する細菌学的プレートとの比較によって位置決定され、 ピペットで抜き取られた。ファージを含んでいるアガロース栓がクロロホルム１ 滴を含んでいるＳＭ緩衝液Ｌしｄ中に置かれ、そしてファージはアガロース栓か ら４℃で少なくとも４時間溶出することが許容された。溶出されたファージは、 反応性ファージが純粋になるまで（総計３ラウンド）免疫スクリーニングのその 後のラウンドのための新しい接種として使用された。ｃ３３ｃｍＩＡ、ｃ３３ｃ ｍ３Ａおよびｃ３３ｃｍ４Ａとして同定されたλｇｔｌｌの３クローンが、抗Ｈ ＣＶパネルを使用する免疫スクリーニングによって血清学的にさらにテストされ た。このパネルは、ｃ３３ｃに対し反応性であることが既知の抗ＨＣＶ血清と、 ｃ３３ｃに対して非反応性の血清で構成された。各クローンに対し約１０００ｐ ｆｕがプレートされ、各クローンからの円形フィルターがストリップにカットさ れ、そして各標本と個々にインキュベートされたことを除き、上に記載したよう に免疫スクリーニングされた。各クローンについての免疫反応性プロフィルは表 １および２に提示されている。クローンのすべては予期されたｃ３３ｃに対する 反応性パターンにマツチし、そしてｃ３３ｃ非反応性血清に対しては陰性であっ た。

表１ ＨＣＶ非反応性血清に対するｃ３３ｃクローンの免疫反応性プロフィル 本挿入なしのλｇｔｌｌは陰性対照として作用する。

表２ ＨＣＶｃ３３ｃ反応性血清に対する ｃ３３ｃクローンの免疫反応性プロフィル血清同定漱 実施例３ Ｃ３３ｃＤＮＡの　および　１゛ 特記しない限り、ここに記載した操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｏｒ　Ｐｒｅｓ ｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９） が参照される。推定λｇｔｌｌｃ３３ｃ組換え体、ｃ３３ｃｍＩＡ、ｃ３３ｃｍ ３Ａ、ｃ３３ｃｍ４Ａが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法、５ａｉｋｉ　 ｅｔ　ａｌ。

、Ｎａｔｕｒｅ、３２４　：　１６３　（１９８６）、および５ａｉｋｉｅｔ　 ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９：４８７　（１９８Ｂ）によってＣ３３ ｃインサートを単離するための鋳型として使用された。アガロース栓から溶出さ れたファージ（実施例２を見よ）２０μｌが直接各ＰＣＲ反応に使用された。λ ｇｔｌｌ　ＥｃｏＲＩクローニング部位の両側の約１００ｂｐに位置する配列に 対応するオリゴヌクレオチドプライマー、配列同定Ｎ１１３（５’　−ＣＡＴＣ ＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＧＧＡＡ−３°） および配列同定阻４ （５’　−ＴＣＧＧＴＧＧＣＣＣ；ＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＧＧＡ−３’が使用さ れた。ＰＣＲ反応は、１００ｕｌの総反応容積中プライマーＬｏｏｐモルを使用 し、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＣｅｔｕｓＰＣＲキットを使用して実施された ０反応は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＣｅＬｕ５　ＤＮＡ　熱サイクラ−中で 、１分９４℃溶融、２分５５℃アニーリングおよび３分７２℃ポリメリゼーシゴ ンステップにより、３０サイクルにおいてインキヱベートした。

各ＰＣＲ反応の１０μ２をＴＡＢアガロースゲル中で電気泳動した。すべてのク ローンは、Ｃ３３ｃおよびフランキングλｇｔｌｌの予期したサイズ（約８００ ｂｐ＋２００ｂｐ）と一致する約１゜００ｂｐのＤＮＡフラグメントを産出した 。これらのＰＣＢ産出ＤＮＡフラグメントは、ＤＥＡＥ　ＮＡ４５セルロース膜 、Ｄｒｅｔｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Δ１１ニーＢｉｏｃｈｅｍ、、１１２：２９ ５（１９８１）を用いてゲルから溶出され、フェノール／クロロホルムおよびエ タノール沈澱された。フランキングλｇｔｌｌ　ＤＮＡを消化によって除去し、 ＴＡＢアガロースゲル上で電気泳動された。３クローンすべてがＣ３３ｃの全長 と一致する８２９ｂｐバンドを与えた。

ＤＮＡフラグメントは上記のように単離され、精製された。ＥｃｏＲＩ末端を有 するＰＣＲ増幅ｃ３３ｃフラグメントの約０．５〜１ｕｇがＴ４　ＤＮＡリガー ゼを使用してＰＵＣＩ９のＥｃｏＲ１部位（５０ｎｇ）へクローニングされた。

リゲートされた材料はＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ有能細胞（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）５０＝１００ｕｊ！へ指示 書に従って形質転換された。形質転換反応はＸ−ｇａｌを含んでいるＬＢアンピ シリン寒天上にプレートされた。推定した組換え物のミニプレツブプラスミドＤ ＮＡがアルカリ性溶解法、Ｂｉｒｎｈｏｉｍ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

７：　１５１３　（１９７９）を使用してつくられ、ＥｃｏＲｉで消化され、そ して期待したインサートの存在を検証するためＴＡＢアガロースゲル中に電気泳 動された。

ＰＵＣ１９クローンを含んでいるＣ３３ｃの二本鎖配列決定は、ＴａｑＴｒａｃ ｋシーケンシングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌまたは５ｅ ｑｕｅｎａｓｅ　２．ＯＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃ１ｅｖ ｅｌａｎｄ、ＯＨ）で実施された。アルカリ変性鋳型および前方プライマー（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ　＃Ｉ２３３）の４■がアニールされ、ジ デオキシヌクレオチド配列決定にかけられた０両方の端からのこれらクローンの 部分配列決定は、ＨＣＶｃ３３ｃ４Ｎ域が成功してクローンされたことをｆｉ認 した。

３クローンのすべてからのＤＮＡ配列は同じであり、従って０３３ｃｍ４Ａのみ がさらに分析された。

実施例４ Ｐ　のＣ３３ｃ　１のλ　ｔｌｌへの 完全なＣ３３ｃ＠限エンドヌクレアーゼマツプは、ＤＮＡ　５ＴＲＩＤＥＲ１， １プログラム（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ　Ｍａｒｃｋ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｔｏｍｉｃ　Ｅｎｅｒｇｙ 、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してつくられた。Ｃ３３ｃ遺伝子フラグメント（図１） を発生するように特異性制限部位が選ばれた。制限部位を選ぶ基準は、ｌ）該部 位が独特であるか、またはＣ３３ｃ遺伝子または同伴するベクター（ｐＵｃ１９ ）中にまれに存在したこと、２）長さ約１００〜１８０ｂＰのフラグメントを与 えたことであった。実施例３で単離した０３３ｃｍ４ＡのＤＮＡ　（Ｐ　ＵＣ１ ９中のＣ３３ｃ）は、単一または複数制限酵素（Ｂｅｔｈｅｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ；Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ ｉｏ　Ｉａｂｓ、Ｂｅｖｅｒ　ｌｙ、ＭＡ）で総体積２０ｔｔｌ中、少なくとも ３時間製造者の指示書に従って（２〜５■）消化された。

制限されたＤＮＡは、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰミックスｌｕｆとＴ４ＤＮＡポリメ ラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

Ｂｅｗｅｒ　Ｉｙ、ＭＡ）１μ２を加えることにより平滑末端化され、そして１ ２°Ｃで１５分間インキュベートされた。ＤＮＡは次にフェノール／クロロホル ムで抽出され、エタノールで沈澱された。ＥｃｏＲＩ　５’　フォスフォリル化 リンカ−（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、Ｐａ１ｅ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）が、λｇｔｌｌのＥ ｃｏＲ１部位へのリゲーションを容易化するために平滑末端化されたＣ３３ｃ制 限フラグメントヘリゲートされた。適切な長さのＥｃｏＲＩリンカ−がλｇｔｌ ｌのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と、相中の開いた読み枠を復活させるためのリ ゲートされた。ＥｃｏＲＩリンカ−１μｇと、ｃ３３ｃ制限フラグメント２〜５ μｇが１０μｌの総容積中Ｔ４ＤＮＡリガーゼでリゲートされ、１２℃で一夜イ ンキヱベートされた。リゲーシッン混合物は、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ活性を破壊す るため６５°Ｃで１５分間熱不活性化され、５０〜１００ｕｊ！の体積でＥｃｏ ＲＩで消化された。消化反応中のＤＮＡは、１〜２％アガロースＴＡＥｊＩ製用 ゲ製甲ゲル中ズ分画され、期待されるサイズのＣ３３ｃが溶出され、Ｇｅｎｅ　 Ｃ１ｅａｎキツト（ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｃ、、Ｍｏｕｎｔ 　Ｐｒｏｓｐｅｃｔ。

［、）を使用して精製された。精製されたＤＮＡは、次にＰｒｏｔｏｃｌｏｎｅ 　λｇｔｌｌ　ｐｌｕｓ　Ｐａｃｋｇｅｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、 Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用し、λｇｔｌｌにクローンされた。要約すると、 λｇｔｌｌデフォスフォリル化ＥｃｏＲＩアームの０，５ｕｇ　（ＩＩｌｊりが 室温において３時間５μｌの総体積中Ｃ３３ｃ制限フラグメントの１μｇ（２μ りヘリゲートされた。ファージパッケージング抽出物（５０ｕｊりが混合物へ添 加され、２２℃でさらに２時間インキュベートされた。

パッケージング抽出物は５００μｌの体積とされ、保存剤としてクロロホルム２ ５μｌが添加された。産生されたＣ３３ｃフラグメントを含んでいる異なるλｇ ｔｌｌクローンは図１に示されている。

このインサートはｐＵｃ１９へサブクローンされ、それらのＤＮＡ配列がそれら の期待された組成をｆｆ！認するために決定された。

実施例５ ｃ３３ｃ　フラグメントの　スフ１−ニングλｇｔｌｌに発現されたｃ３３ｃの 制限フラグメントは、実施例２に記載した操作を使用する免疫スクリーニングに より、血清学的活性について分析された。正しいＤＮＡ配列のインサートを含ん でいた図１のクローンは、３種のＨＣＶ反応性標本のプールを使用して免疫スク リーニングされた。これらの結果は表３に呈示されている。これらクローンは１ ０種の抗ＨＣＶｃ３３ｃ反応性血清および７種のｃ３３ｃ／非反応性血清よりな る個々の血清でさらに免疫スクリーニングされた。このパネルの血清学的プロフ ィルは図４に示されている。この結果は、Ｂａｎ　Ｉ［／ＥｃｏＲＩフラグメン トは全長ｃ３３ｃ抗原と反応するパネルのすべてのメンバーによって認識される １以上のエピトープを含んでいることを指示する。ｃ３３Ｃ全長に対するパネル メンバーの免疫反応性は、ｃ３３ｃＲＩＢＡテスト（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｉｃｓ、Ｒａｒｉｔａｎ。

ＮＪ）により決定した同様な相対的免疫反応性を表わす。ＢａｎＩＩ／ＥｃｏＲ Ｉフラグメントの完全な配列は図２に提示しである。

表３ ｃ３３ｃ構成物の特徴化 １、　このクローンは配列決定しなかったが、しかし予期したサイズのＰＣＲフ ラグメントを提供した。

２、　これらのクローンはインサートの５′端にＥｃｏＲ１部位を含んでいる。

実施例６ ＰＣＲによるよ　ハ　いフーグメン　ｃ３３ｃＢＡＮＩＩ　ＲｃｏＲ■の１゛１ およ゛　スクＴ−ニング 合成オリゴヌクレオチドプライマーが小さいフラグメントを単離するためＰＣＲ によってＣ３３ｃＨＣＶ中に設計された。５′末端における追加の塩基およびＲ ｃｏＲＩ制限部位がクローニングおよびλｇｔｌｌβ−ガラクトシダーゼによる 正確なフレーム内発現を容易化するために追加された。

プライマーの配列は、（配列同定Ｎ１１５．　６．および７．ヌクレオチド５， ８および９．そして配列同定磁８（ヌクレオチド１，２゜３．４および７を含む ））であった、（ＥｃｏＲ１部位はアンダーラインしである。） ／ｉ　５１ＧＣＧＣＣＧΩΔΔエエ二ＣＧＴＡＴＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＣＡＣＣ ＧＡＧ−：ｌ’１２　５１ＧＣＧＴＡＴ弘肛：！！：ＴＣＣＧＴＣＡＣＴＧＴＧ ＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡ−３’１３　５１ＧＣＧＴＡＴ弘駈に品ＣＡＴＣＧＣＣ ＧσＧＧＴＣＧＧＧＡＴ−３ぜＩ７　５１ＧＣＧＴＡＴｆｉごシ：ＧにＴＣＡＴ ＧＡＧＧＧＣＡ’ｌ’ＣＧＧＴＴ−３１ｉｎ　５’ＧＣＧＴＡＴｎト二にＧＡＧ ＴＧＧＣＡＣＴＣＧＴＣＡＣＡＡＡＴ−：ｌ’１９　５　’　ＧＣＧＴＡＴｇＡ ＡＧＴＴＣＣＴＴＧＣＣＧＡＣＧＧＣ−３１ＰＣＨのために使用したプライマ一 対は、＃１と＃２　；＃２と＃３；＃１と；４４　；＃３と＃４　；＃２と＃７ 　ｉ＃４と＃７；；＃５と＃８；＃３と＃９　ｉ＃１と＃９であった。

Ｃ３３Ｃ頭域中のウィルス遺伝子産物の位置は図３に示しであるＰＣＲ反応は、 各プライマー８０ｐｍｏｌと、鋳型としてｐＵＣ１９ｃ３３ｃｍ４Ａ　５ｎｇを 使用して実施例３に記載したように実施した。ＰＣＲ産物の正確なサイズは、ゲ ルマトリックスシーンクリーンが濃縮検証した。精製したＰＣＲ産物は次にＥｃ ｏＲＩで消化され、実施例１および４に記載したようにλｇｕｌｌヘクローンさ れた。これらクローンは、ｃ３３ｃ反応性９メンバーおよびＣ３３ｃ非反応性ｌ 血清よりなる抗ＨＣＶ血清パネルを使って実施例２に従って免疫スクリーニング された。結果（表５）は、Ｂａｎｎ／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩより小さいクローン産 物はｃ３３ｃ反応性パネルの９メンバーすべてと反応しないことを示す、これら 結果は、Ｂａｎｆｆ／ＥｃｏＲＩは、免疫反応性の消失なしに、５゛末端におい てアミノ酸１２個以上または３″末端においてアミノ酸１３個以上短くすること ができないことを指示する。

実施例７ ＢＡＮＩ［ＥｃｏＲＩｃ３３ｃフーグメントの　ンバク　ＧＥＸベク　−へのク ローニングおよび　ンパクＢＡＮ　Ｉｆ／ＥｃｏＲＩ　ｃ３３ｃ　ＤＮＡｔ−Ｅ ｃｏＲｒ消化によって対応するｐＵｃ１９クローンから除去し、２％ＴＡＢアガ ロースゲル上にサイズ分画し、シーンクリーンによって精製した。このフラグメ ントを発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘａ、Ｓｍ１ｔｈ　＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎ ｅ、６７：３１　（１９８８）のＥｃ　ｏＲ１部位にクローンした。このベクタ ーはＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍからの２６ＫＤグルタチオンＳ −）ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端融合物として、フレーム内インサート を発現するであろう。この組換えプラスミドは、製造者のプロトコールに従って 、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ 、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中へ形質転換された。ＧＳＴ−ｃ３３ｃ　 Ｂａｎ１［／ＲｃｏＲＩ融合遺伝子が発現され、そしてタンパクはＳｍ１ｔｈ　 ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ、６７：３１　（１９８８）によって記載さ れた方法の以下の修正によって精製された。アンピシリン５０μｇ／ｄを含有す るＬＢプロス中で生育させた一夜培養物を新鮮な培地中に１：１０希釈し、０Ｄ ６００　０．４へ３７°Ｃで生育させた。この時点でイソプロピル−β−Ｄ−チ オガラクトピラノシド（ＩＰＴＯ）を０．１ｍＭの濃度へ加えた。培養物を３７ °Ｃでさらに２時間生育させ、細胞を遠心によりペレット化し、ＭＴＰＢＳ（Ｎ ａＣ１１５０ｍＭ、Ｎａｇ　ＨＰＯａ　１６ｍＭ、ＮａＨｔ　Ｐｏ４　４ｍＭ、 Ｐｈ７．３）の１１５０または１／１００培養物体積中に再懸濁した。細胞を氷 上で超音波処理によって溶解し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１％へ加えた。溶解 物を１０．ＯＯＯＸｇで４°Ｃにおいて５分間遠心した。遠心の上清をあらかじ め洗浄し、そしてＭＴＰＢＳ中に希釈した５０％グルタチオンアガロースビーズ （イオウ結合。

Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ９の１／１０ 容積と室温でローター上で混合した。２〜３分吸着の後、アガロースビーズを５ ００Ｘｇにおける２分間遠心によって集め、ベレットをＭＴＰＢＳで３回洗った 。融合タンパクを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０中の還元型グルタチ オン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）５ｍ Ｍとの競合により、ビーズ体積に対して２×２分洗液を使用して溶出した。

実施例８ ｃ３３ｃ　ＢＡＮ　Ｕ　ＥｃｏＲＩ　ム　ンパクのウェス　ンブロｌユ」■し幻 ζ注 実施例７で精製したＧＳＴ−ｃ３３ｃ　Ｂａｎ　ＩＩ／ＥｃｏＲＩ融合タンパク の反応性を決定するため、ウェスタンプロットを実施した。ＧＳＴ−ｃ３３ｃ　 ＢａｎＩ［／ＥｃｏＲＩ抗原を１２％ＳＤＳポリアクリルアミド調製用ゲル、Ｌ ａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０　（１９７０）を通して電気泳動 し、製造者が記載するように、Ｈｏｅｆｆｅｒ　ＴＥ５０エレクトロトランスフ ァータンクを使用してＩｍｍｏｂｉｌｉｏｎ　Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ ）へ移した。膜をＴＢＳ中５％ＭＦＤＭと室温で３分間インキュベートし、３ｗ ｍ片へカットした。この片をＮＦＤＭｉ液で１７１００希釈した血清標本（４６ 抗ＨＣＶｃ　３３　ｃ反応性血清および２９非反応性血清）と個々に室温で一夜 インキユベートした。これら片を３Ｍ　ＮａＣ＋１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８ ，０１０゜０１　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｎ　ｓ溶液中４×５分間洗浄し、アルカリ性フォ スファターゼヤギ抗ヒト抗体中でリンスした。これらの片を洗い、実施例２に記 載したように基質とインキュベートした。

ＧＳＴ−ｃ３３ｃ　Ｂａｎ１ｌ／ＥｃｏＲＩ融合タンパクのウェスタンプロット 分析は表６に示されている。

ｃ３３ｃ　Ｂａｎ　ｎ／ＥｃｏＲＩ融合タンパクはｃ３３ｃ反応性血清のすべて （４６／４６）と免疫反応性であった。これらＨＣ■標本はよく特徴化されてお り、非常に低い抗ＨＣＶタイター標本から高タイター標本までの範囲のものであ る。非反応性ｃ３３ｃ標本のどれも非反応性すなわち０／２９であった。これら の結果は、ｃ３３ｃのＢａｎ　ｆｆ／ＥｃｏＲＩフラグメントがｃ３３ｃタンパ ク全長の免疫反応性の全部を保持していることを示している。

表６ 全長ｃ３３ｃと比較したＢａｎ　ＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントのウェスタンプ ロット免疫反応性 ３３ｃ 実施例９ １　イムノア・セイ　るＧＳＴ−Ｂａｎ　■ＥｃｏＲＩの　・ ＧＳＴ−ＢａｎＩＩ／ＥｃｏＲＩ融合タンパクを全長ｃ３３ｃタンパクの免疫反 応性を常磁性微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＰアッセイ）によって比較した。こ のアッセイは、表面にＨＣＶ抗原を被覆した常磁性固相を使用することによって 抗ＨＣＶを検出した。常磁性微粒子（ＭＰ）はＢａｘｔｅｒ　Ｄｔａｇｎｏｓｔ ｉｃｓ　Ｉｎｃ、、Ｐａｎｄｅｘ、Ｍａｎｄｅｌｅｉｎ、ＩＬから得た。これら は螢光性ポリスチレン常磁性コアとポリスチレン表面からなっていた。すべての 粒子製剤は狭い粒度分布（平均直径は４．５μｍ）によって特徴化されていた。

Ｃ，５Ｔ−ＢａｎｌＩ／ＥｃｏＲＩおよびＣ３３ｃウイルス遺伝子産物を実施例 ７のように精製した。全長Ｃ３３ＣタンパクはｐＥＴ５ａシステム中の１６アミ ノ酸リーダー、５ｔｕｄｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔｔ、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏ ｌ。

１８９：１１３　（１９８２）によって発現された。Ｏ，１Ｍアセテートバッフ ァーｐＨ５，０中４００μｇタンパク／Ｍ１のウィルス抗原をＭＰ　（２，５％ ｗ　／　ｖ　）上へ、抗原とＭＰを室温で一夜ゆっくり混合することによって受 動的に被覆した。ＭＰは次にＰＢＳ　（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 　ＮａＣ１，ｐＨ７，４）で遠心（５０００ｒｐｍ、５分）を使用して良く洗っ た。抗原被覆ＭＰをＰＢＳ中０．０２５％（ｗ／ｖ）の作業濃度へ希釈した。

標本を１７１００へ希釈しく希釈バッファー＝１５％ウシ新生児血清、５００ｍ Ｍ　ＮａＣ１，１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、０．３％　Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ −４０，ｐＨ７，４）、そして５０μ２を黒色プラスチックマイクロタイタープ レートの各ウェルへ入れた０ＭＰ　（０，０２５％ｗ／ｖ）２０μｆを各ウェル へ加え、４２°Ｃで３０分間インキュベートした。各ウェル中の粒子を洗浄ステ ップの間各ウェルの底へとどめておくため磁場を使用し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ −２０を含むＴＢＳで５回洗った。コンジュゲート希釈液（８％ウシ新生児血清 、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、２００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＳＯ４， ｐＨ７，４）中へに８００希釈したヤギ抗ヒトＩ　ｇ　（Ｈ＋Ｌ）β−ガラクト シダーゼコンジュゲート（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ、Ｌａ　Ｍｉｒａｄ ａ。

ＣＡ）５０μｌを各ウェルへ加え、４２℃で１５分間インキュベートした。プレ ートを前記のように洗った。基質（４−メチルウンベリフェリルβ−ガラクトシ ド、ＭＵＧ：０．５ｍＭ　ＭＵＧ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ、０．０５％　Ｔ ｗｅｅｎ−２０，ｐＨ８゜５）５０μｉを各ウェルへ加え、生成物螢光を時間間 隔（２分および１４分）で測定した（３６５　ｎｍ励起および４５０　ｎｍ放出 ）。

標準曲線としてクマリンの希釈液を使用して、螢光値をｎＭクマリン値へ変換し た。基質転換の動力学値（１２分間に生成したｎＭで表したクマリンの量）をＱ ｕａｔｔｒｏ　Ｐｒｏ（ＢｏｒｌａｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、５ｃｏｔ ｔ　Ｖａｌｌｅｙ、ＣＡ）スプレッドシートソフトウェアプログラムを使用して 測定した。

動力学値の動力学的範囲はＯないし５．０００μＭクマリンであった。ランダム ボランティア−血液ドナーサンプルおよび血清変換の間モニターされた患者から の系統的血清サンプルのパネルをテストすることにより、カットオフ計算のため の予備アルゴリズムが確立された。このアルゴリズム（陽性キャリブレータ−の μＭクマリンｘＯ１７５）は約２００〜３００μＭクマリンのカットオフを与え た。

表７中の結果は、ＭＰアッセイを使用し、全長ｃ３３ｃ抗原に免疫反応性のすべ ての血清はＢａｎＩ［／ＥｃｏＲＩ産物にも反応性であることを示す、一部の血 清との全長ｃ３３ｃのより強い反応性は、ＭＰアッセイがＢ　ａ　ｎ　ＩＩ　／ 　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩウィルス産物のために最適化されなかった事実を表す。

Ｂａｎ１ｌ／ＥｃｏＲＩ産物をＭＰアッセイへ最適化するアプローチは、因子Ｘ 開裂、Ｓｍ１ｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ、６７：３１　（１９８ Ｂ）によりＧＳＴ融合をＢａｎＩＩ／Ｅｃ。

ＲＩから除去し、ＢａｎＩ［／ＥｃｏＲＩをｐＥＴ５ａ、５ｔｕｄｉｅｒ　ａｎ ｄ　Ｍｏｆｆａｔｔ、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、１８９：１１３（１９８６）へク ローニングするか、またはウィルス産物を他の態様で固相へ被覆することを含む 。

表７ 常磁性微粒子イムノアッセイを用いた Ｂａｎｆｆ／ＥｃｏＲＩ　ｐＧＥＸ融合の免疫反応性９＊結果はｎＭクマリンと して表される。

３００より大きい値が反応性である。

−【−一且一一麦一 （１）一般情報： （ｉ）出願人：Ｋｉｎｋ、Ｊｏｈｎ　ＡＲｙａｎ、Ｔｅｒｅｎｃ　Ｅ Ｔｏｄｄ、Ｊｏｈｎ　Ａ Ｓａｅｅｄ、Ｂａｄｒ （１、発明の名称：ＨＣＶのｃ　３３　ｃ　８５域のエピトープマツピング （ｉｔ）配列の数：９ （ｉｖ）連絡住所： （Ａ）名宛人：Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ。

（Ｂ）ストリート：Ｏｎｅ　Ｂａｘｔｅｒ　Ｐａｒｋｗａｙ。

（Ｃ）市：Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ （Ｄ）州：ｌ１１ｉｎｏｉｓ （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰコード＝６００１５ （ｖ）コンピュータ読取り形式： （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）：１７ビユータ：ＩＢＭ　ｐｃ　 コンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ５ （Ｄ）ソフトエエア：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ＃１．０バージ巧ン＃ １．２５ （ｖｉ）現行出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ （Ｂ）出願８二 （Ｃ）分類： （ｖｉ）代理人情報： （Ａ）氏名：Ｂａｒｔａ、Ｋｅｎｔ （Ｂ）登録番号：２９，０４２ （Ｃ）参照／ドケット番号：ＰＡ−４１６９（ｖｉ）テレコミュニケーシヲン情 報 （Ａ）電話：　７０８／９４８−３３０８（Ｂ）ファックス：　７０８／９４８ −２６４２（２）配列同定Ｎａｌについての情報 （ｉ）配列の特１！！［： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）タイプ＝１＄酸 （Ｃ）ストランド２１本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ＸＩ）配列の記述：配列同定阻１： ＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡ　ＣＧＴＡＴＴＧＣＡＧ　ＴＣＴＡ Ｔ（：＾３７（２）配列同定に２についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：１本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ　）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ＸＩ）配列の記述：配列同定阻２： ＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ　ＧＡＡＴ丁ＣＧＴＧＧ　ＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＴＧＴＧ ＧＡ　３６（２）配列同定阻３についての情報 （ｉ）配列の特徴； （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド２１本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子タイプ：ｃＤＮＡ （χり配列の記述：配列同定Ｎｌ１３：ＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣ ＧＣＧＧＡＡ　２４（２）配列同定ＮＩＩＬ４についての情報（ｉ）配列の特徴 ： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド２１本 （Ｄ）トポロジー：ＩＩ状 （ｉｉ）分子タイプ：ｃＤＮＡ （Ｘり配列の記述：配列同定Ｎ［Ｌ４：ＴＣＧＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＡＧＴＡＣ ＡＡ　ＴＧＧＡ　２４（２）配列同定Ｎ［Ｌ５についての情報（ｉ）配列の特徴 ： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド２１本 （Ｄ）トボロジ一二線状 （ｉｉ）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ＸＩ）配列の記述：配列同定Ｎａ５：ＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴ　ＴＣＣＣＡＧＴ ＡＧＴ　ＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＣＡ　３５（２）配列同定Ｎｌ１６につい ての情報（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：１本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ＸＩ）配列の記述：配列同定隘６： ＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴ　ＴＣＧＧＡＧＴＧＧＣＡＣＴＣＧＴＣＡＣＡ　ＡＡＴ　 ３３（２）配列同定階７についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：１本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ＸＩ）配列の記述：配列同定患７： ＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴ　ＴＣＡＡＧＴ丁ＣＣＴ　ＴＧＣＣＧＡＣＧＧＣ３０（２ ）配列同定黒８についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：２本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｊ）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位１１・・・・・３０６ （ＸＩ）配列の記述：配列同定阻８ ＧＴＣＡＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣＣＣＡＴ　ＣＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧ　ＧＡＧ　Ｇ ＴＴ　ＧＣＴ　：１５Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓ ｎ　工１ａ　ｃｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　入１ａ１　５　１゜ ＣＴＧ　ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣＣＣＴ　ＴｒＴ　ＴＡＣＧ ＧＣＡＡＧ　７２Ｌａｕ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ工１ａ　Ｐ ｒｏ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ１５　２゜ ＧＣＴ　ＡＴＣＣＣＣＣＴＣＧＡＡ　ＧＴ入　入ＴＣＡＡＧ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　 ＡＧＡ　ＣＡＴ　工０８人１ａ　工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　エ エａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　入ｒｇ　）ｌｉｓＬａｕ　工１ａ　Ｐｈａ　Ｃ ｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　ＧｌｕＣＴ ＣＧＣＴ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　、ＧＧＣＡＴＣ ＡＡＴ　ＧＣＣ１８０Ｌａｕ　Ａｌａ入１ａ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　入１ａ 　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　工１ａ　Ａｓｎ　ＡｌａＶａｌ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　 入ｒｑ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　工１ｅＣＣＧ　Ａ ＣＣＡＧＣＧＧＣＧＡＴ　ＧＴＴ　ＧＴＣＧＴＣＧＴＧ　ＧＣＡ　ＡＣＣＧＡＴ 　２５２ＧＣＣＣＴＣＡＴＧ　ＡＣＣＧＧＣＴＡＴ　ＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣ ＧＡＣＴＣＧ　２８８Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈ ｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　５ａｒＧＴＧ　ＡＴＡ　ＧＡＣＴＧごＡ ＡＴ　ＡＣＧ　コ０６Ｖａｌ　工１ａ　Ａｓｐ　ｃｙｓ　Ａｓｎτｈｒ（２）配 列同定Ｎａ９についての情報 （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：１０２アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線杖 （ｉｉ）分子タイプ：タンパク （ＸＩ）配列の記述：配列同定Ｎ［１９Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｈｉ ｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　工１ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌａｕ　５ａ ｒＧｌｕ　Ｖａｌ工１ａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ工 １ａ　Ｐｈａ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓａｒ、コＯ３５，４０ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌａｕ４５　・　５０５５ Ｇｌｙ　工１ａ　Ａｓｎ入１ａ　Ｖａｌ　入１ａ　’ｒｙｒ　？／ｒ　Ａｊ″ｑ 　ＧＩＹ　ｒ、、ａｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　５ａｒ６０　６５　、　７０ Ｖａｌ工１ａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｎ　Ｖａｌ　Ｖ ａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＡｓｐＡ！１Ｐ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ、　Ｔｈｒ ｌ　ｉズＸテ　６０ ・−−・−―・・拳◆−・・・−・玲・・舎・――・・−・−−◆・・・―・＋ ＋＋−Φ−＋−・・・―・・◆―・−＋畢−・・・◆ＡＶ？ＶＰｌｉＰ）ｉ！Ｋ 　冨　ＶＡ　ム　Ｓ　！　〒　Ｇ　ＩＥ！１２０６１　τ＝〒　１２０ コＡ　Ｆ　Ｙ　ＣＪ　Ｋ　Ａ　Ｘ　Ｐ　！、　！　Ｖ　Ｘ　Ｋ　Ｇ　ＯＩ　Ｎ　 ！、　Ｘ　Ｆ　Ｃ４０１２１ＣＡ　ｆｉｎ’！’ＣＡＡＴＧ！　ＡＩ。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＮＳ３のｃ３３ｃの領域のカルボキシ末端１０２アミノ酸を実質的に含んで いる組換えタンパクよりなる肝炎Ｃ　ＮＳ３遺伝子によってコードされる免疫優 性エピトープ。 ２．肝炎Ｃ遺伝子ＮＳ３のｃ３３ｃ領域のカルボキシ末端１０２アミノ酸フラグ メント中に含まれる抗原性決定子を有する組換えタンパク。 ３．肝炎Ｃ　ＮＳ３タンパクのｃ３３ｃ領域に対して特異性の抗体を検出するた めのアッセイ方法であって、前記ｃ３３ｃ領域のカルボキシ末端１０２アミノ酸 フラグメントに含まれる組換えタンパクで被覆した固相支持体を血清もしくは血 漿標本と接触させ、 前記標本と前記組換えタンパク被覆固相支持体とを、前記標本中に含まれる前記 フラグメントに対して特異性の抗体が前記被覆固相支持体へ結合するのを許容す るのに充分な時間インキュベートし、 前記結合した抗体を未結合抗体から分離し、そのように結合した抗体を検出する ことを特徴とする前記アッセイ方法。 ４．肝炎Ｃ　ＮＳ３タンパクのｃ３３ｃ領域に対して特異性の抗体を検出するた めのアッセイ方法であって、前記ｃ３３ｃ領域のカルボキシ末端１０２アミノ酸 フラグメントに含まれる組換えタンパクで被覆した固相支持体を患者標本と接触 させ、 前記標本と前記組換えタンパク被覆固相支持体とを、前記標本中に含まれる前記 フラグメントに対して特異性の抗体が前記被覆固相支持体へ結合するのを許容す るのに充分な時間インキュベートし、 前記結合した抗体を未結合抗体から分離し、そのように結合した抗体を検出する ことを特徴とする前記アッセイ方法。 ５．肝炎Ｃ　ＮＳ３タンパクのｃ３３ｃ領域に対して特異性の抗体を検出する方 法であって、 肝炎Ｃ　ＮＳ３タンパクのｃ３３ｃ領域のカルボキシ未端１０２アミノ酸フラグ メントに含まれるエビトープを有する組換えタンパクを電気泳動し、 前記電気泳動した組換えタンパクを膜へ移し、前記タンパクをｃ３３ｃタンパク に対する抗体を含んでいる患者血清標本と接触させ、 酵素コンジュゲート抗ヒト抗体と接触させ、洗浄し、基質で現像する ことを特徴とする前記アッセイ方法。 配列同定Ｎｏ．９に示した配列を実質的に有るす合成ペプチド。 前記固相支持体は常磁性粒子である請求項４および５のアッセイ方法。 ８．前記分離ステップは、常磁性粒子の磁気濃縮、そのように濃縮したペレット の洗浄、および緩衝液中への再懸濁によって実施される請求項４および５のアッ セイ方法。 ９．前記抗体検出は、信号発生手段へコンジュゲートされた抗ヒト抗体を利用す る請求項４および５のアッセイ方法。