KR950012971B1

KR950012971B1 - 비-A, 비-B 간염 비루스 게놈 cDNA 및 항원 폴리펩티드

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Publication number: KR950012971B1
Application number: KR1019910001478A
Authority: KR
Inventors: 히로또 오까야마; 이사오 후께; 지사또 모리; 아끼히사 다까미자와; 이와오 요시다
Original assignee: 자이단호오진한다이비세이부쓰뵤오겡뀨까이; 후까이 고노스께
Priority date: 1990-06-25
Filing date: 1991-01-29
Publication date: 1995-10-24
Anticipated expiration: 2011-01-29
Also published as: FI910127A0; FI910127L; HU910069D0; CN1057861A; AU650634B2; AU6860891A; EP0933426A1; EP0464287A1; HUT60772A; CA2045323C; CA2045323A1; FI910127A7; NZ236719A; NO910103D0; NO910103L

Abstract

내용 없음.

Description

비-A, 비-B 간염 비루스 게놈 cDNA 및 항원 폴리펩티드

제 1(1)도 및 제 1(2)도는 본 발명의 NANBV 유전자의 cDNA 클론들 사이의 관계를 나타낸 것이다.

제 2(1)도 내지 제 2 (16)도는 본 발명에 따른 NANBV 게놈 cDNA의 전영역의 뉴클레오타이드 서열 및 그에 의하여 코딩된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

제 3 도는 본 발명의 NANBV와 일본 뇌염비루스(JEV) 양자의 소수성 윤곽을 나타낸 것이다.

본 발명은 비-A, 비-B 간염 비루스 게놈 cDNA 및 비-A, 비-B 간염 비루스 항원 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 비-A, 비-B 간염비루스 항원 폴리펩티드를 생산하기에 유용한 비-A, 비-B 간염 비루수 게놈 cDNA 및 그의 발현 생성물인 비-A, 비-B 간염 항원 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 비-A, 비-B 간염비루스 게놈 cDNA는 또한 비-A, 비-B 간염을 유전학적으로 진단하기에 유용하다. 더나아가 본 발명의 비-A, 비-B 간염항원 폴리펩티드는 비-A, 비-B 간염용 백신, 면역글로불린, 다클론성 또는 단일클론성 항체, 면역학적 진단시약, 수혈용 혈액을 검사하기 위한 약품 및 수혈을 위해 혈액으로부터 비-A, 비-B 간염비루스를 제거하기 위한 친화성 크로마토그래피에 사용하기 위한약품을 제조하기에 유용하다.

비루스성 간염은 간염 비루스의 감염에 의해 발생하는 간 질환이다. 지금까지는, 간염 A 비루스, 간염 B 비루스 및 간염 D(델타) 비루스가 단리 및 확인되어 왔다. 간염 D 비루스(델타-간염 비루스)는 독자적으로 증식할 수 없고 그의 증식을 위해 헬퍼 비루스(helper virus)로서 간염 B 비루스의 공동-존재를 필요로 하는 결손 비루스이다.1974년에, 간염 A 비루스 또는 간염 B 비루스로 인한 감염외의 요소에 의해 발생한 다수의 간염 환자가 있음이 보고 되었다.

그러한 간염은 "비-A, 비-B 간염"으로 명명되었고, 비-A, 비-B 간염 비루스에 대한 연구가 전세계적으로 광범위하고 집중적으로 실행되어 왔다. 지금까지 많은 타입의 비-A, 비-B 간염 비루스가 존재한다는 것이 발견되었다. 현재까지의 연구결과는, 비-A, 비-B 간염비루스가 감염 경로에 따라 두 타입으로, 즉, 물 및 식품을 통하여 전파되는 전염성 간염, 즉 장으로 전염되는 비-A, 비-B 간염비루스; 및 수혈 등에 의해 혈액을 통해 전파되는 혈액-전염성 비-A, 비-B 간염비루스로 분류됨을 보여준다. 비-A, 비-B 간염비루스들중에서 아프리카, 인디아 및 서남아시아의 지역에서 만연하는 장-전염성 비-A, 비-B 간염비루스만이 비루스학적으로 확인되었지만, 혈액-전염성 비-A, 비-B 간염비루스는 아직 확인되지 않았다.

이후에, 혈액-전염성 비-A, 비-B 간염은 종종 간단히 "NANB 간염"으로서 언급되고, 혈액-전염성비-A, 비-B 간염비루스는 종종 간단히 "NANBV"로서 언급된다.

유행병학, 임상적 검사, 진단, NANB 간염의 치료 및 예방과 관련하여, 진단학, 조직병리학, 면역학, 분자 생물학 등의 지식을 기초로하여 NANBV와 다른 간염 비루스의 비교에 의한 비루스학적 연구가 세계적으로 실행되어 왔다. ["Japan Medical Journal", No. 3320, pp. 3∼10, 1987, "Igaku-no Ayumi(progress of medicine)", 151 (13), pp 735∼923,1989; "Kan Tan Sui(Liver, Gallbladder, Pancreas)", 21 (1), pp. 5∼113,1990; "Jikken Igaku(Experimental Medicine)", 8 (3), pp. 201∼233, 1990] NANB 간염과 관련하여, 하기의 발견들이 보고되었다.

(1) 유행병학 : 일본국에서는, 보건 후생성의 추정에 따르면, 약 60%의 만성 간염환자(즉, 약 72만 환자), 약 40%의 간 경변환자(즉, 약 10만 환자) 및 약 40%의 간암환자(즉, 약 7천 환자)가 NANB 간염환자이다. 더나아가, 상기에서 인급한 NANB 간염에 기인한 치사율은 1년에 1만 6천명에 달한다. 미합중국에서는, 수혈후 간염 환자의 수는 1년에 15만∼30만에 이르고 수열 후 간염 환자의 90%는 NANB 간염환자이다. 더나아가, 헌혈자의 1∼6%는 NANBV 보균자로 간주된다. 더나아가, 다른 나라에서도 역시, NANB 간염의 발병률 및 NANBV 보균자의 비율은 미합중국 및 일본국의 것과 동일하거나 더 높을 것으로 추정된다. 따라서, NANB 간염의 예방, 조기진단 및 조기치료는 전세계적으로 중요하다.

(2) 비루스학 : 지금까지 보고된 NANBV는 엔벨로프를 함유하며 직경 약 50nm의 구형을 갖는 비루스입자로 추정된다.

분류학적 관찰은 공지된 NANB가 토가비루스(togavirus) 또는 플라비 비루스(flavivirus)와 유사한 비루스이거나 토가비루스 또는 플라비 비루스와는 다른 신규 타입의 비루스임을 암시한다. 더나아가, NANBV 간염 환자의 혈청으로 주사한 다수의 침팬지의 간세포 원형질이 병리학적 관찰 결과는 몇몇 침팬지의 간세포 원형질에서 관상 구조들의 형성이 일어나지만 다른 침팬지의 간세포 원형질에서는 일어나지 않음과 몇 몇침팬지의 간세포 원형질에서 핵내 입자가 형성됨을 보여준다. 상기 결과 및 유행 병학적 관찰의 결과들, 클로로포름 민감성의 존재 여부에 대한 시험 및 면역학적 진단은 많은 타입의 NANBV들이 존재함을 암시한다[예를들면, "사이언스", 제 205권, pp. 197∼200,(1979), "전염병지(Journal of Infectious disease) : "제 148권, pp. 254∼265,(1983), 및 "비세이부쓰"(미생물) 제 5권, 제 5호, pp. 463∼457,(1989) 참조].

NANB 간염 환자의 혈액내에 존재하는 NANBV의 양은 간염 A 환자의 대변에 존재하는 간염 A 비루스의 양 또는 간염 B 환자의 혈액중에 존재하는 간염 B 비루스의 양 중 하나와 비교하여 극히 적다. 예를들면, 환자의 혈액중의 간염 B 비루스의 양은 침팬지 감염량(Chimpanzee Infectious Dose, CID)으로 ml당 10⁸∼10⁹인 반면, 환자의 혈액중의 NANBV의 양은 CID로 ml당 단지 10⁴∼10⁵이다[브라들리(Bradley, D.W.) ]: "감염, 면역성 및 수혈"중 수혈후 비-A, 비-B 간염에 있어서의 연구 전망, Dodd, R. Y ＆ Barker, L. F. 편집, Alan R. Liss사 출판, New york(1985) pp. 81∼97]. 더나아가, 인간을 제외하고는, 침팬지 외에는 NANBV 감염에 의해 간세포 원형질 중에 전형적인 관상 구조물이 형성된다는 것이 공지되어 있다. 침팬지만이 NANBV 간염의 실험용 동물로서 사용될 수 있기 때문에 NANBV의 연구를 위해서는 다수의 침팬지가 사용될 필요가 있다. 그렇지만 침팬지는 구하기가 쉽지 않고 비싸다.

따라서, 예를들면, NANBV에 의한 실험적 감염, NANBV의 확인 및 NANBV용으로 유용한 마커에 대한 탐색에 의한 NANBV의 연구는 필연적으로 제한되고 지연된다. 상기 문제를 해결하기 위하여, NANBV의 연구를 위해 각종 시도들이 실행되었다. 예를들면, 한 시도에서는, NANB 간염을 앓는 침팬지의 혈장으로부터 NANBV 게놈 cDNA["간염 C 비루스(HCV)"로서 언급됨]가 클론화되고(사이언스, 제 244권, pp. 359∼362, 1989), cDNA를 발현함으로써 수득된 항원("C-100"으로 언급됨)이 NANB 간염환자의 혈액중의 항체와 함께 항원-항체 반응을 나타냄이 확인되었다(사이언스, 제 244권, pp. 362∼364, 1989). 더나아가, 다른시도에서는, 침팬지가 사용되지 않고 NANBV 게놈 cDNA는 NANB 간염환자의 혈장으로부터 클론화되고, cDNA를 발현함으로써 수득된 항원이 NANB 간염환자의 혈청에 있는 항체와 함께 항원-항체반응을 나타냄이 확인되었다(Gastroentrologia Japonica, 제 24권, pp. 540∼544 및 pp. 545∼548, 1989).

(3) 임상적 관찰 : 간염은 통상적으로 간염 발생의 수 및 빈도에 따라 전염성 간염 및 산발성 간염으로 분류되거나, 위중함 및 간염환자의 단계에 따라, 급성 간염, 전격성 간염, 아급성 간염, 유존성 간염(persistent hepatitis) 및 만성간염으로 분류된다. NANB 간염의 잠복기는 2∼26주이다. 초기단계에 NANB 간염의 증상은 간염 B의 것에 비해 가볍다. 예를들면, NANB 간염 환자는 단지 열이 오르거나 무기력을 호소한다. 더나아가, 70%의 환자는 무황달성 증상을 갖는다. 따라서, NANB 간염은 빈번히 간과된다. 그렇지만, NANB 간염은 만성이 되기 쉽고 그리고나서 간 경변으로 진전하기 쉬우므로 매우 위험하다. 구체적으로 설명하면, 혈청이 증가된 아미노트랜스퍼라아제 활성을 나타내는 NANB 간염 환자의 40∼50%는 만성간염을 나타낸다. 만성간염 환자의 10∼20%는 간 경변을 앓는다. 더 나아가, 한해에 수혈자의 0.5∼1%는 자각 증상없이 간 경변 환자가 된다. 보다 심각하게는, 간 경변은 간암 또는 간 종양으로 더진전한다. 따라서, 수혈 및 출혈로 야기되는 생물학적 위험을 방지하기 위하여, 공중보건의 관점에서 NANB 간염의 근절은 세계적으로 중요한 문제이다.

(4) 진단학 : 상술한 바와 같이, NANBV(혈액-전염 타입)는 아직 확인되지 않았고 NANB 간염의 진단을 위해 유용한, NANBV 항원과 같은 비루스 마커(Viral marker)는 공지된 적이 없다. 따라서, NANB 간염의 진단은 간염 A 비루스, 간염 B 비루스, 거세포 비루스(Cytomegalovirus), EB 비루스, 수두비루스 및 단순포진 비루스(herpes simplexvirus)와 같은 각각의 공지된 병원성 비루스에 특이적인, 환자의 혈청중항체의 역가를 조사하고, 상술한 비루스 중 어느것에 특이적인 항체와 관련하여 혈청이 음성인 환자를 NANB 간염 환자로 진단함으로써 수행하거나, 간의 생검을 통하여 조직 병리학적 조사를 실행함으로써 수행한다("Disease of the Liver and biliany system", 8판, S. Shenlock, pp. 326∼333, 1989, Blackwell Scientific Publications) 동시에, 다른 진단법 이 또한 사용된다. 예를들면, GPT[글루타믹 -피루빅 트랜스아미나아제, "ALT"(알라닌 아미노트랜스아미나아제)로서도 공지됨], GOT[글루타믹-옥살로-아세틱 트랜스아미나아제, "AST"(아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제)로서도 공지됨] 및 구아닌 디아미나아제("구아나아제"로서도 공지됨)와 같은 혈청중 효소의 활성이 결정되는 방법이 사용된다("Kan Tan Sui(간, 담낭, 췌장"), 제 14권, pp. 519∼522, 1987). 상술한 혈청중 GPT 또는 GOT와 관련하여, GPT 및 GOT의 지속되고 비정상적으로 높은 활성이 NANB 간염의 진단을 위한 표준으로서 사용되는 NANB 간염의 진단용 표준물질이 일본국에서 사용된다(''Journal of Blood Transfusion Society in Japan", 제 31권 4호, pp.316∼320,1985 : 및 "Nippon Rinsho", 제 46권, p. 2635∼2638, 1988). 면역학적 진단에 관하여, NANB의 단리 및 확인이 어려운 현상황에서는, NANBV cDNA 클론의 발현에 의해 수득된 항원(유전공학의 기술 및 면역학의 지식을 사용하여 단리됨)과 NANB 간염환자의 혈청 사이의 항원-항체 반응이 표준으로서 사용된다.

공지된 항원의 예로는 NANB 간염 환자의 혈장으로부터 제조된 NANBV cDNA의 발현 생성물(유럽 특허출원 공고 제 363025호), NANB 간염의 증상을 갖는 침팬지의 혈장으로부터 제조된 "HCV"cDNA의 발현 생성물(유럽특허 출원 공고 제 318216호 및 일본국 특허출원 공개 제 2-500880호), NANBV-감염 침팬지의 간으로부터 유래된 NANBV cDNA의 발현 생성물(유럽 특허출원 공고 제 293274호, 일본국 특허공고 제 64-2576 및 일본국 특허 출원공개 제 1-124387호). 항원-항체 반응을 결정하기 위한 방법으로서는, RIA(방사성 면역 측정법) 및 EIA(효소 면역측정법)가 통상적으로 사용된다. 그렇지만, 상기 발현 생성물들은 항원성에 있어서 상이하다. HCV cDNA의 발현 생성물인 항원(즉, 상술한 C-100항원)은 HCV 감염에 의해 발생한 만성 간염의 훌륭한 표준 또는 척도가 될 수 있다. 그렇지만, 항원(C-100)이 그의 항원성을 나타내는 영역이 제한되어 있으므로("비세이부쓰(미생물)", 제 5권, pp. 463∼475, 1989 : Kan Tan Sui(간, 담낭, 췌장), 제 20권, pp. 47∼51, 1990 : 및 "이가꾸-노 아유미(의약의 진보)", 제 151권, p. 871,1989), 상기 항원은 NANB 간염 및 NANBV 간염의 정확한 진단이라는 관점에서 및 치료를 위한 만성 간염 및 급성 간염 환자의 경과의 정확한 결정이라는 관점에서 만족스립지 못하다. 따라서, NANB 간염의진단 및 예후를 위한 신뢰할만한 방법을 얻는 것이 소망되고 있다.

(5) 치료 및 예방 : 최근에, 만성 NANB 간염의 치료에 있어서 α- 및 β-인터페론의 유용함이 보고 되었다(Kan Tan Sui(간, 담낭, 췌장)"제 20권, pp. 59∼64, 1990 : "이가꾸-노 아유미(의약의 진보)" 제 515권, pp. 871∼876, 1989). 그렇지만, α- 및 β-인터페론의 적절한 1회 투약량 및 그의 투여를 위한 적절한 기간은 아직 확립되지 않았다.

다른 한편으로, NANB 간염의 예방을 위해서는, 상술한 NANBV cDNAs(유럽특허 출원 공고 제 363025호) 또는 HCV cDNAs 유럽 특허출원 공고 제 318216호)의 통상적인 발현 생성물이 항원으로서 사용되는 각종 백신이 사용된다. 그렇지만, 본 발명의 완성전에 NANBV 자체가 아직 단리 및 확인되지 않았던 사실로부터 분명한 것처럼, 각각 다양한 항원 결정기(epitopes)를 갖는 상술한 발현 생성물로부터 NANBV 백신용으로 유용한 항원을 지정하고, 항원이 임상적으로 사용될 수 있도록 그러한 특정 항원의 유효성 및 안전성을 결정하는 것은 불가능하다. 따라서, 유리하게 실제적으로 사용될 수 있는 NANBV 백신은 없다. 본 발명자들은 신규의 NANBV 게놈 cDNA를 개발함으로써 상술한 문제를 해결하기 위하여 광범위하고 집중적인 연구를 하였다. 결과로서, 본 발명자들을 놀랍게도, 공지된 NANBV cDNA에 비해 우수한 신빙성을 가질뿐만 아니라 어느 공지된 NANBV cDNA 보다도 더 길고, NANBV 게놈의 개방된 판독 프레임(open reading fram)의 완전한 영역을 포함하는 NANBV 게놈 cDNA를 클로닝하고, 상기 NANBV cDNA를 발현시킴으로써 만성 NANB 간염 환자 유래 혈청 뿐만 아니라 급성 NANB 간염 환자 유래 혈청에 대해서도 특이적인 항원-항체 반응을 신뢰성 있게 나타낼 수 있는 NANBV 항원 펩티드를 수득하는 것에 성공했다. 이러한 성공은, 확실한 NANBV 게놈을 수득하기 위하여, 비록 혈액 또는 절제된 간 중의 NANBV의 양이 극히 적더라도, 즉, 간염 A 비루스 또는 간염 B 비루스의 것의 약 1/10,000만큼 적더라도, NANBV의 단리를 어렵게 만드는 것으로 간주되는 미공지된 요소를 갖는 침팬지 내에서 NANBV를 증식시키지 않고, NANBV 및 그의 게놈이 NANBV 게놈을 위한 신선한 재료의 저장동안에 체액 또는 혈액 효소에 의한 절단 및/또는 분해를 겪지 않도록 조작방법에 세심한 주의를 하면서, NANB 간염 환자의 완전 혈액 또는 NANB 간염 및 간암을 함께 가진 환자의 절제된 간에 함유된 NANBV 입자로부터 직접 NANBV RNAs를 추출하는 것과 같은 본 발명자들의 독특한 기술에 기인한다.

신선한 인간 재료로부터 이렇게 하여 수득된 RNAs를 그리고나서 역전사 효소(reverse transcriptase)에 의해 이중-가닥 cDNA로 전환시켜 cDNA 라이브러리를 수득한다. cDNA 라이브러리로부터 NANBV 게놈을 가려내기 위하여, cDNAs를 각각 λgtll 파지 벡터내로 삽입하고 나서 파지플라크 위에 고농도로 발현시킨 후, 급성 NANB 간염을 갖는 회유기 환자로부터 얻은 혈청 및 만성 간염 환자로부터 얻은 혈청이 모두 사용되는 효소면역 측정법(EIA)을 반복적으로 수행함으로써 NANBV 게놈 cDNA의 스크리닝을 수행한다. 이렇게 하여, 생물학적 위험이 없이 저렴하게 대규모로 고순도의 NANBV 항원 폴리펩티드를 안전하게 생산하는 것이 재조합 DNA 기술에 의한 본 발명의 cDNA의 발현에 의해 최초로 실현되었다. 상기에 기초하여, 본 발명이 완성되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 NANB 간염 비루스 게놈 cDNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 NANB 간염에 대한 진단시약 및 백신을 위한 유효성분으로서 유용한 NANB 간염 비루스 항원 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 NANBV 항원 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 NANB 간염에 대한 진단시약을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 NANB 간염에 대한 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 및 다른 목적들, 특징 및 장점들은 첨부된 도면과 관련하여 하기 명세서 및 특허청구의 범위로부터 분명해질 것이다.

도면들 중, 제 1(1)도 및 제 1(2)도는 NANBV 게놈의 전영역에 관하여 나타낸, 본 발명의 NANBV 유전자의 cDNA 클론들 사이의 관계를 나타내는 도면이다.

제 2(1)도 내지 제 2(16)도는 본 발명에 따른 NANBV 게놈 cDNA의 전영역의 뉴클레오타이드 서열 및 그 뉴클레오타이드 서열에 의하여 코딩된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

제 3 도는 본 발명의 NANBV와 일본 뇌염 비루스(JEV) 양자의 소수성 윤곽을 나타낸 것이다. 도면에서, NANBVT의 소수성 지수가 JEV의 것과 비교된다.

필수적으로, 본 발명에 따르면, 여기서 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 첫번째∼9416번째 뉴클레오티드인 비-A, 비-B 간염 비루스 전체 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 포함하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 유전암호의 퇴화에 따라 상기 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 데옥시리보핵산(DNA)이 제공된다.

본 발명의 다른 국면에서는, 여기에서, 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 비-A, 비-B 간염 비루스 뉴클레오티드 서열의 333번째 내지 9362번째의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩된 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원 폴리펩티드가 제공된다.

본 발명에 있어서, 달리 지정되지 않는한, 데옥시리보뉴클레오티드의 왼쪽 말단 및 오른쪽 말단은 각각 5' 말단 및 3' 말단이다. 더나아가, 달리 지정되지 않는한 펩티드의 아미노산 서열의 왼쪽 말단 및 오른쪽 말단은 각각 N-말단 및 C-말단이다.

본 발명의 NANBV 게놈 cDNA 및 그의 발현 생성물로서 NANBV 항원 폴리펩티드는 하기 단계(I)내지 (Ⅶ)에 따라 제조 및 확인될 수 있다.

단계(I) : NANBV RNA를 추출하기 위한 재료의 선택 및 수집.

NANBV RNA의 추출을 위한 재료로서, 예를들면, NANBV 보균자 또는 NANB 간염을 앓는 인간 또는 침팬지의 혈액, 림프, 복수 및 간세포 및 NANB 간염 및 간암 또는 간종양을 함께 앓는 환자의 간세포가 사용될 수 있다.

침팬지로부터 유래된 재료는 인간으로부터 유래된 재료에 비해 비교적 소량의 NANBV를 함유할 수도 있고 침팬지는 NANBV의 단리를 어렵게 하는 것으로 간주되는 미공지의 요소를 가지기 때문에, 인간으로부터 유래된 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 유래의 혈액, 림프, 복수 및 간세포 중에서, 혈액이 가장 쉽게 대량으로 수득될 수 있다. 예를들면, 수혈용 혈액으로서의 사용이 허용될 수 없는 혈액은 혈액은행으로부터 대량으로 구입할 수 있다. 그러한 혈액은 NANBV RAN를 추출하기 위한 물질로서 유리하게 사용될 수 있다. 혈액이 재료로서 사용될때, 혈액은 혈장 및 적혈구로 분리된다. 이렇게 수득한 혈장을 간염 B 비루스의 표면 항원에 대하여 음성이고(WHO expert committee on viral hepatitis : Advances in viral hepatitis, WHO Technical Report Series, 602 28∼33, 1977) 간염 B 비루스의 게놈 DNA에 음성인지(Brechot, C., Hadchouel, M, Scotto, J., Degos, F., Charnay, P., Trepo, C., Tiollais, P., Detection of hepatitis B Virus DNA in liver and Serum : a direct appraisal of the Chronic carrier state. Lancet 2 : 765∼768, 1981) 여부를 결정하기 위해 검사한다. 더나아가, NANB 간염의 진단을 위한 표준으로서 사용되는 GPT(Wroblewski, F.＆ LaDue. J. S. : Serum glutamic-pyruvic transaminase in Cardiac and hepatic disease, proc. Soc. Exp. Biol. Med., 91, 569, 1956), GOT, 구아나아제 등과 같은 효소들의 활성에 대하여 혈장을 검사한다. 혈액을 혈장 및 적혈구로 분리하고 혈장을 검사하는 상술한 방법은 상이한 사람들의 혈액에 대하여 수행된다. 간염 B 비루스의 표면 항원 및 게놈 cDNA에 대하여 음성이고 상술한 효소의 극히 높은 활성, 예를들면, 35IU/ℓ 이상의 GPT 활성을 나타내는 혈장을 모은다.

혈액중 NANB 간염 비루스 입자의 수는 전술한 바와 같이 간염 B 비루스 입자의 수에 비해 극히 적다. 감염 실험의 결과로부터, 혈액중 NANB 간염 비루스 입자의 수는 간염 B 비루스 입자의 약 1/10,000로 추정된다(Bradley, D. W., (1985) : Research Perspectives in post-transfusion non-A, non-B hepatitis, in "Infection,Immunity and Blood Transfusion", Dodd. R. Y. ＆ Barker, L. F. 편집, Alan R. Liss, Inc. 출판, New York, p. 81∼97). 따라서, RNA의 추출을 위해서는 혈액을 대량으로, 예를들면 약 3∼10ℓ정도로 많은 양으로 사용하는 것이 바람직하다. NANBV 입자로부터 NANB RNA를 추출하기 위한 재료로서 사용되는 신선한 완전 혈액은 NANBV 및 그의 유전자가 변성되는 것을 방지하고 그의 유전자가 효소의 작용에 의해 절단 또는 분해되는 것을 방지하기 위해 1∼5℃에서 저장된다. 또한 신선한 완전 혈액의 수집으로부터 48∼72시간내에 단계(II)에 의해 NANBV RNAs의 분리를 마치는 것이 바람직하다. 간세포가 재료로서 사용될때, 만성 NANB 간염의 합병중인 간종양 또는 간암을 가진 환자로부터 절제된 간 조직의 비-암부위 또는 암부위 약 1∼3g이 유리하게 사용될 수 있다. 재료로서 사용되는 간세포는 -70℃에서 동결상태로 저장된다.

단계(II) : NANBV RNA의 제조

단계(I)에서 수득된 재료로부터, 통상적인 방법으로 RNA를 추출하고 정제할 수 있다. 예를들면, 신선한 완전 혈액이 재료로서 사용될때, 약 2∼10ℓ의 신선한 완전 혈액을 저속 원심분리하여 혈장분획을 상층액으로서 수거한다. 비루스 분획은 RNA의 추출 및 정제를 위한 이후의 방법에 사용하기 위해 정제를 통해 혈장으로부터 수득한다.

다른 한편으로, 간세포가 NANBV RNA를 추출하기 위한 재료로서 사용될때, 리보뉴클레아제 억제제를 함유하는 5∼30배 부피의 희석액을 간조직에 가한다. 그리고나서, 균질기(homogenizer)등을 사용하는 통상적인 방법에 따라, 간 조직을 분쇄하거나 부수어 간 세포의 균질물을 수득한다. 희석제로서는, 10∼150mM의 통상적인 완충액이 사용될 수 있다. 그리고나서, 균질물질을 저속 원심분리시켜 상층액을 수거한다. 수거된 상층액을 NANBV RNA의 추출 및 정제를 위한 원액으로서 사용한다. NANBV RNA의 추출 및 정제는 통상적인 방법, 예를들면, 헤파리, 디에틸피로카르보네이트 및 구아니딘 티오시아네이트와 같은 리보뉴클레아제 억제제와 단백질의 변성을 증가시킬 수 있는 계면 활성제, 킬레이트제 또는 환원제의 혼합물이 사용되는 추출법 ; 구배의 용매로서 슈크로오즈, 세슘 클로라이드, 세슘 트리콜로로아세테이트, 피콜(Ficoll, Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden)을 사용하는 밀도구배 원심분리에 의해 분획화가 수행되는 방법 ; mRNA가 특이적으로 가진 3'-말단 폴리(A) 쇄를 사용하는 친화력 킬럼에 의해 분리가 수행되는 방법 ; 폴리좀위에 합성된 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 면역 침전법에 의해 mRNA-결합된 폴리좀이 수득되는 분리법 ; 2-상 분리의 원리에 기초한 페놀 추출법 ; 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 설페이트, 알코올 등을 사용하는 침전법에 의해 수행될 수 있다. 상술한 방법들은 개별적으로 또는 공동으로 사용될 수 있다. NANBV RNA를 추출 및 정제하기 위한 상술한 방법들은 RNA의 비가역적 변성을 방지하기 위하여 pH 3∼10에서 바람직하게 수행될 수 있다.

단계(III) : NANBV RNA로부터 이중-가닥 cDNA의 제조

상술한 NANBV RNA를 주형으로서 사용하여, 통상적인 방법에 의해 cDNA를 제조할 수 있다. 즉, 올리고데옥시시티민 및 임의의 헥사뉴클레오티드 프라이머를 프라이머로서 사용하고 역전사 효소를 사용하여, 주형으로서 NANBV RNA를 사용하여 NANBV RNA에 상보적인 cDNA를 합성시켜 서로에게 상보적으로 결합된 cDNA 및 NANBV RNA를 포함하는 이중-가닥을 수득한다. 그리고나서, 이렇게 수득된 이중-가닥을 리보뉴클레아제와 반응시켜 NANB RNA가 분해되고 cDNA로부터 제거되도록 한다. 이리하여, 단일-가닥 cDNA가 수득된다. 수득된 단일-가닥 cDNA를 주형으로서 사용하여, DNA 신타아제에 의하여 이중-가닥 cDNA를 합성한다.

이중-가닥 cDNA 합성은 cDNA 합성을 위해 시판되는 키트, 예를들면, cDNA 합성 시스템 플러스^R(cDNA Synthesis System Plus^R, Amershsm 제조 및 판매, 영국), cDNA 시스템 키트^R(cDNA System Kit^R, 파마시아 LKB 제조 및 판매, 스웨덴), cDNA 합성 키트^R(cDNA synthesis Kit^R, 뵈링거 만하임(사) 제조 및 판매, 서독)등을 사용하여 쉽게 수행될 수 있다. 합성된 cDNA의 양이 적을때, cDNA는 AmpliTaq(퍼킨엘머세투스 제조 및 판매, 미국)와 같은 PCR 키트를 사용하여 PCR(폴리머라제 사슬 반응) 법("PCR Technology", H. A. Erlich 편집, Stockton Press출판,1989)과 같은 통상적인 방법을 사용하여 증폭될 수 있다.

단계(IV) : cDNA 라이브러리의 제조

단계(III)에서 제조된 cDNA를 사용하여, 통상적인 방법에 의하여 cDNS 라이브러리를 제조한다. 즉, 단계(III)에서 제조된 cDNA를 상이한 길이를 갖는 단편들로 자르고, 생성된 각종 cDNA 단편들을 각각 복제가능한 클로닝 벡터에 결찰시킴으로써 cDNA 라이브러리를 수득한다.

복제 가능한 클로닝 벡터로서는, 파지 유전자, 코스미드, 플라스미드, 및 동물 비루스 유전자와 같은 어떠한 공지된 또는 시판되는 벡터들도 사용될 수 있다. 각각의 cDNA 단편이 그안에 각각 삽입된 후, 벡터의 높은 안정성 및 높은 형질 전환 능력을 얻기 위하여 파지 유전자 또는 코스미드가 복제 가능한 벡터로서 사용될때 각각의 cDNA-삽입 벡터들의 인 비트로 포장("in" "vitro" packaging)은 통상적인 방법에 의해 수행된다. 이리하여, cDNA-삽입 벡터들은 제재조합 파지 입자의 형태로 수득된다. 수득된 파지 입자는 cDNA 클로닝을 위한 cDNA 라이브러리로서 사용된다. 다른 한편으로는, 플라스미드가 복제 가능한 벡터로서 사용될때, 상술한 cDNA 단편들은 개별적으로 플라스미드 벡터들에 삽입되고 생성된 cDNA-삽입 벡터들은 그리고나서 통상적인 방법에 따라 에스케리키아 콜리(Escherichia coil), 바실루스 서브틸리스( Bacillus Subtilis), 효모 등의 세포와 같은 숙주세포 내로 개별적으로 삽입된다. 이렇게 하여 수득된 형질전환체를 cDNA 클로닝을 위한 cDNA 라이브러리로서 사용한다. 더 나아가 동물 비루스 유전자가 복제 가능한 벡터로서 사용될 때, 상술한 cDNA 단편들은 개별적으로 비루스 유전자 벡터내로 삽입되고, 생성된 재조합 비루스 들은 그리고나서 표준 방법에 따라 민감한 동물 세포내로 개별적으로 형질감염되고 세포내에서 증식된다. 재조합 비루스의 경우에는, 그와같은 수득된 재조합 비루스가 cDNA 라이브러리로서 사용된다.

cDNA 라이브러리의 제조는 시판되는 키트, 예를들면, cDNA 클로닝 시스템 λ gt10 및 λgt11(Amersham, 영국 ; BRL Inc., 미국 : 및 Stratagene Inc., 미국에 의해제조 및 판매됨), 인 비트로 포장 시스템(Amersham, 영국 : BRL Inc., 미국 : 및 Stratagene Inc., 미국에 의해 제조 및 판매됨)등을 사용하여 쉽게 수행될 수 있다.

단계(V) : cDNA 라이브러리로부터 NANBV 유전자를 함유하는 cDNA의 클로닝 본 단계에서는 NANBV 유전자를 함유하는 cDNA 클론이 수득된다. cDNA 라이브러리가 형질전환체로 구성될때, 형질전환체는 표준 한천 배지 상에서 배양되어 콜로니들을 형성한다. 다른 한편으로는, cDNA 라이브러리가 재조합 파지 입자 또는 재조합 비루스로 이루어질때, 상기 파지 입자 또는 재조합 비루스는 에스케리키아 콜리, 바실루스 서브틸리스, 효모, 동물 세포 배양물 등과 같은 공지된 민감한 숙주 세포를 감염시키는데 사용되고, 플라크를 형성하거나 감염 세포를 증식시키기 위해 배양된다. 상기에서 수득한 형질전환 콜로니, 플라크 또는 감염된 세포들을 급성 NANB 감염에 걸린 회유기 환자로부터 얻은 혈청, 만성 NANB 간염 환자로부터 얻은 혈청 및 NANBV가 침팬지의 간 세포 원형질내에 관상 구조물이 형성되도록 만드는 타입의 NANBV 인가의 여부에 상관없이 NANBV로 감염된 침팬지로부터 얻은 혈청을 각각 사용하는 하나 이상의 표준 방법에 의해 면역 측정을 거치게 함으로써, 하나 이상의 상술한 혈청과 특이적으로 반응한 NANBV 항원을 생성한 콜로니, 플라크 또는 감염된 세포를 선택하고 단리한다. 콜로니, 플라크 및 감염된 세포의 엄격한 선택을 위해서는 상기 방법을 반복하는 것이 바람직하다. 이렇게 선택되고 단리된 각각의 콜로니, 플라크 또는 감염된 세포로부터 NANBV 유전자를 함유하는 cDNA 클론을 문헌[T. Maniatis etal., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Hatbor Laboratory 출판, 미합중국, pp.309∼433(1982)]에 기술된 표준 방법에 따라 단리한다. 면역 측정법은 예를들면, 퍼옥시다아제 및 알칼리 포스파타아제와 같은 효소로 표지된 항체가 사용되는 효소-표지된 항체 기술 ; 및 플루오레세인 이소티오시아네이트, 유료품 등으로 표지된 항체가 사용되는 형광 항체 기술에 의해 수행될 수 있다.

상술한 기술에 의한 면역 측정법은 간접법에 의해 수행되는 것이 바람직한데 그 이유는 간접법을 사용하면, 환자로부터 유래한 극히 소량의 혈청을 사용함으로써도 고감도의 면역 측정법이 달성될 수 있기 때문이다. 간접법에 사용되는 일차 항체로서는, NANB 간염에 걸린 환자로부터 얻은 혈청 또는 NANB 간염에 걸린 침팬지로부터 얻은 혈청이 바람직하게 사용될 수 있는데 그 이유는 상기 혈청들이 NANBV 항원에 특이적인 항체를 비교적 대량으로 함유하기 때문이다. 간접법에 사용되는 2차 항체로서는, 효소, 형광물질등으로 표지된 시판되는 항-인간 1g(면역글로불린) 항체가 사용될 수 있다.

면역 측정법을 거친 표본은 통상적인 방법, 예를들면, 콜로니, 플라크 및 감염된 세포의 핵산 및 단백질이 여과막에 흡착되는 블롯팅 법(blotting method), 현미경용 마이크로플레이트 또는 슬라이드 글라스(slide glass)가 사용되는 방법 등에 따라 제조될 수 있다. 블롯팅법이 간접, 효소-표지된 항체 기술과 공동으로 사용되면, 극히 많은 수의 원콜로니, 원플라크 또는 원 감염세포로부터 콜로니, 플라크 또는 감염세포의 선택을 쉽고 신속하게 수행할 수 있다.

상기 경우에, 블롯팅은 니트로셀룰로오즈, 초산 셀룰로오즈, 나일론 등으로 만들어진 시판되는 여과지를 콜로니, 플라크 또는 감염된 세포와 접촉시킴으로써 수행된다.

상기에서 수득된 cDNA 클론은 NANBV 유전자의 일부이다. 따라서, NANBV 유전단의 전영역을 포함하는 cDNA 클론을 수득하기 위해서는, cDNA 클론에 인접한 cDNA 단편이 cDNA 클론의 3'- 및 5'-말단을 탐침으로서 사용함으로써 단리되는 방법에 의해 cDNA 클론을 확장시키는 것이 필요하다. 이 경우에 "유전자 워킹 "("gene walking", "genomic walking" 또는 "Chromosome walking"이라고도 불림) 으로서알려진 기술이 사용될 수 있다("DNA Cloning Volume III", D. M. Glover 편집, pp. 37∼39, IRL Press, 1987; ''Molecular Coning-a laboratory manual" 2nd edit., T. Maniatis et al, 3.21∼3.23,1989). 클로닝 방법 및 유전자 워킹을 반복함으로서, NANBV 유전자의 전영역의 cDNA 클론의 형태로 수득될 수 있다.

본 단계에서는, 수득된 cDNA 클론 각각의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것이 바람직하다. cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열의 결정은 일반적으로 통상적인 방법, 예를들면, 막상-길버트(Maxam-Gilbert)법, 디데옥시 사슬 종결법(Analytical Biochemistry, 152. 232-238, 1986)등에 따라 수행될 수 있다.

결정된 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 아미노산 서열의 결정될 수 있다. 아미노산의 서열 분석은 개시코돈(cDNA 상의 ATG 또는 mRNA 상의 AUG)의 위치로부터 수행된다. 아미노산 서열의 중요부분, 예를들면 항원 결정기를 구성하는 것으로 간주되는 친수성 부분은 각 진수성 부분에 상응하는 펩티드를 합성하고 합성된 폴리펩티드를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제한 후, 정제된 펩티드를 효소면역측정법(EIA) 또는 방사성 면역 측정법(RIA)을 거치게 함으로써 확인할 수 있다.

클론들을 서로 구별하기 위하여, cDNA 클론들은 그 cDNA 클론에 의해 코딩된 NANBV 항원 폴리펩티드의 각각의 특성에 따라 바람직하게 군으로 분류된다. 이런 관계로, NANBV 유전자의 제한 지도상의 각 cDNA 클론의 위치로 분류의 척도로서 사용될 수 있다[제 1(1)도 및 제 1(2)도 참조].

더나아가, NANBV의 일부는 침팬지의 간세포 원형질 내에 관상 구조물이 형성되게 만드는 능력을 가지고, NANBV의 일부는 그러한 능력을 갖지 않음이 발견되었다(Science, 205, pp. 197∼200, 1979). 따라서 침팬지의 간세포 원형질 내에 관상 구조물이 형성되게 만드는 타입의 NANBV로 감염된 침팬지로부터 얻은 혈청 및 침팬지의 간세포 원형질내에 관상 구조물이 형성되게 하지 않는 타입의 NANBV로 감염된 침팬지로부터 얻은 혈청과 각 cDNA 클론의 혈청학적 반응성을 검사함으로써 cDNA 클론들을 확인 및 분류할 수 있다. 상기 혈청학적 반응성의 검사는 상술한 면역 측정법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에서는, 제 1(1)도 및 제 1(2)도에 나타낸 아와 같이, 본 발명의 NANBV 유전자의 cDNA 클론들은 접두사 "BK"로 확인된다.

제 1(1)도는 NANBV 유전자의 전영역에 관하여 나타낸, 본 발명의 NANBV 유전자의 cDNA 클론들 사이의 관계를 나타내는 도면이고, 제 1(2)도는 NANBV 유전자의 전영역에 관하여 나타낸, 유전자 워킹에 의해 수득된 cDNA 클론들 사이의 관계를 나타내는 도면이다.

상기 BK NANBV cDNA 클론으로는, 예를들면 에스케리카아 콜리 BK 108(FRI에 수탁번호 FERM BP-2971로 기탁), 에스케리카아 콜리 BK 129(FRI에 수탁번호 FERM BP-2972로 기탁), 에스케리카아콜리 BK 138(FRI에 수탁번호 FERM BP-2973로 기탁), 에스케리카아 콜리 BK 153(FRI에 수탁번호 FERM BP-2974로 수탁), 에스케리카아 콜리 BK 157, 에스케리카아 콜리 BK 166(FRI에 수탁번호 FERM BP-2975로 기탁), 에스케리카아 콜리 BK 172(FRI에 수탁번호 FERM BP-2976로 기탁)가 있다. 상기 7개의 BK NANBV cDNA 클론들은 적어도 NANBV 유전자의 개방된 판독 프레임의 전영역 및, 아마도 NANBV 유전자의 전영역을 포함할 것으로 생각된다.

상술한 BK NANBV cDNA 클론들에 포함되는 NANBV 유전자의 전영역의 뉴클레오티드 서열 및 이 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타나 있다. 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 전 NANBV 뉴클레오티드 서열 및 전 NANBV 아미노산 서열에 기초하여 다른 비루스 유전자의 뉴클레오티드, 서열 및 아미노산 서열에 대한 NANBV 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 상동성, 소수성 지수(소수성/지수성 윤곽), NANBV 유전자의 구조, 항원 결정기(epitopes)의 영역 등에 관하여 각종 연구와 관찰이 수행될 수 있다.

상동성에 관하여서는, NANBV 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 유전자가 잘 공지된 각종 비루스의 것들(일본국 특허 공개 제 62-286930호 및 "바이러스학", vol. 161, pp. 497∼510, 1987) 및 소비루스 설사-점막 질병 비루스("바이러스학", vol, 165, pp. 497~-510, 1988), 돼지 콜레라 비루스("바이러스학", vol, 171, pp. 555∼567, 1989), 담배 엽맥 반점 비루스("핵산연구", vol. 165, pp. 5417∼5430, 1986)등과 같은 다른 비루스의 것들과 비교함으로써 연구될 수 있다. 소수성 지수의 분석에 관해서는, 예를들면, 유전정보 처리 소프트 웨어 SDC-제네틱스(Genetyx)(SDS 소프트웨어(주) 제조 및 판매, 일본), 두리틀 프로그램(Doolittle's program, 분자 생물학지, vol. 157, pp. 105∼132, 1982)등을 사용하는 기술에 의해 연구될 수 있다.

제 3 도는 본 발명의 NANBV와 일본 뇌염 비루스(JEV) 양자의 소수성 윤곽을 나타내고, 여기에서 양비루스의 각각의 소수성 지수를 서로 비교하고 있다. 제 3 도에서, 가로좌표는 아미노산 수를 나타내고, 세로좌표는 소수성 지수를 나타내며, 빈 삼각형은 글리코실화 부위를 나타내고, 별표는 RAN 폴리머라제에 공통적인 아미노산 서열(Gly-Asp-Asp) 부위를 나타내며, C, PreM, M, E 및 NS는 각각 코어단백질, 전-매트릭스 단백질, 매트릭스 단백질, 엔벨로프 단백질 및 비구조 단백질을 나타낸다. NANBV 유전자의 유전자 구조와 JEV 유전자의 유전자 구조 사이에 상당한 유사성이 발견되었다. 제 3 도에 나타낸 바와같이, 본 발명의 NANBV의 폴리펩티드는 세개의 구조단백질, 즉, 코어 단백질(c), 매트릭스 단백질(M)으로 더 처리되는 전-매트릭스 단백질(preM) 및 엔벨로프 단백질(E) 및 7개의 비구조 단백질, NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b 및 NS5를 포함한다. 상기 단백질들은 각각 하기의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다

C 단백질 : 333번째 내지 677번째 뉴클레오티드

M 단백질 : 678번째 내지 905번째 뉴클레오티드

E 단백질 : 906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드

NS1 단백질 : 1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드

NS2 단백질 : 2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드

NS3 단백질 : 3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드

NS4a 단백질 : 5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드

NS4b 단백질 : 5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드

NS5 단백질 : 6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드

상기 뉴클레오티드 서열들은 NANB 간염의 진단에 유용하다. 상기 뉴클레오티드 서열들에 의해 각각 코딩되는 폴리펩티드들은 NANB 간염에 대한 백신 뿐만 아니라 진단시약을 위한 항원으로서도 유용하다.

상술한 세개의 구조 단백질들은 제 2(1)도 내지 제 2(3)도에 나타낸 첫번째(Met) 내지 389번째(Gly) 아미노산에 의해 표시된다. 첫번째 메티오닌 잔기는 개시 코돈에 의해 코딩된 잔기이다.

본 발명자들의 한층더한 연구에 의해, 하기 뉴클레오티드 서열들이 항-NANBV 항체에 대해 반응성 있는 항원 결정기를 포함함이 밝혀졌다. 각각 333번째 내지 422번째 뉴클레오티드, 333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드, 333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드, 474번째 내지 563번째 뉴클레오티드, 906번째 내지 953번째 뉴클레오티드, 1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드, 1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드,1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드, 1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드, 4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드 및 5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드 서열.

이후에 기술된 것과 같이, 상술한 뉴클레오티드 서열 또는 전 서열의 일부로서 그러한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성에 의해 NANBV 항원 폴리펩티드를 제조하기 위해서 뿐만 아니라 하이브리드화 또는 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해 NANB 간염을 진단하기 위해서도 효과적으로 사용될 수 있다.

더나아가, 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 첫번째 내지 9416번째 뉴클레오디트의 전영역의 적어도 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 첫번째 뉴클레오티드 서열이 NANB 간염의 진단에 있어서 하이브리드화를 위한 탐침으로서 또는 폴리머라제 사슬 반응을 위한 프라이머로서 유용하다는 것과 333번째 내지 9362번째 클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 적어도 12개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된, 적어도 4개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 NANB 간염을 위한 백신을 위해서 뿐만아니라, 진단시약을 위해서도 항원으로서 효과적임이 발견되었다. 또한, 당 분야에 공지된 바와 같이, 첫번째 뉴클레오티드 서열에 상보적인 두번째 뉴클레오티드 서열도 하이브리드화용 탐침으로 또는 NANB 간염 진단시 폴리머라제 사슬반응용 프라이머로서 유용하다. 더나아가, 유전 암호의 퇴화에 따라, NANBV의 첫번째 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역의 적어도 일부의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 뉴클레오티드 서열은 또한 재조합 DNA 기술에 의해 본 발명의 항원 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 단리된 데옥시리보 핵산은 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 첫번째 내지 9416번째 뉴클레오티드인 비-A, 비-B 간염 비루스 전체 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 포함하는 첫번째 뉴클레오티드 서열 및 첫번째 뉴클레오티드 서열에 상보적인 두번째 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 유전 암호의 퇴화에 따라 첫번째 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

데옥시 리보 핵산에 관한 본 발명의 바람직한 구현예에서, 첫번째 뉴클레오티드 서열은 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 첫번째 내지 9416번째 뉴클레오티드인 비-A, 비-B 간염 비루스 전체 뉴클레오티드 서열의 적어도 6개 뉴클레오티드를 포함한다.

데옥시 리보핵산에 관한 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 첫번째 뉴클레오티드 서열은 333번째 내지 422번째 뉴클레티드의 뉴클레오티드 서열, 333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 333번째 내지 6317번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 474번째 내지 563번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드서열, 1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 및 첫번째 내지 9416번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 단리된 항원 폴리펩티드는 여기서 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 비-A, 비-B 간염 비루스 뉴클레오티드 서열의 333번째 내지 9362번째 뉴클레오티이드인 코딩 영역을 포함하는 데옥시리보핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.

항원 폴리펩티드에 관한 본 발명의 한가지 바람직한 구현예에서, 항원 폴리펩티드는 333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 ; 서열 중 적어도 12 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 적어도 4개의 아미노산의 아미노산 서열을 하나 이상 포함한다.

항원 폴리펩티드에 관한 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 항원 폴리펩티드는 333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 474번째 내지 563번째 뉴클레티드의 뉴클레오티드 서열, 678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 및 333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함한다.

더나아가, 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타난 NANBV의 전 코딩 영역에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 전코딩 영역의 발현 생성물은 NANBV의 모든 단백질 입자를 포함하므로, 그러한 폴리펩티드는 넓은 항원-항체 반응 범위를 가지고, 따라서 단일 항원 결정기를 포함하는 항원에 비해 NANB 간염 비루스의 감염에 의해 생성된 각종의 항체에 반응할 수 있으므로 NANB 간염을 검출하는데 있어 고감도를 가짐에 주목해야한다.

단계(VI) : NANBV 게놈 cDNA 클론의 발현 및 NANBV 항원 폴리펩티드의 대량 생산

NANBV 항원 유전자의 클론화된 cDNA를 발현시켜 상업적 규모로 NANBV 항원 폴리펩티드를 생산하기 위해서는, cDNA 클론에 존재하는 클론화된 cDNA의 일부 또는 전체를 복제 가능한 클로닝 벡터로부터 꺼내어 복제 가능한 발현 벡터와 재조합시킨다. 상세히 말하면, 각 cDNA 클론의 cDNA의 일부 또는 전체를 제한 효소를 사용하여 잘라내어 NANBV 항원 유전자를 포함하는 DNA 단편(이후로는 "NANB VDNA 단편"으로 언급)을 수득한다. 그리고나서, NANBV DNA 단편을 통상적인 방법에 의해 복제 가능한 발현 벡터내로 삽입시킨다. 하나의 DNA 단편의 발현 벡터내로 삽입되면, 유전자 발현에 의해 한 타입의 하원 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 둘 이상의 상이한 DNA 단편들이 발현벡터 내로 차례로 삽입되면, 유전자 발현에 의해 삽입된 DNA 단편들에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 융합된 폴리펩티드의 형태로 항원 폴리펩티드가 생성될 수 있다.

더 나아가, 완전한 NANBV 입자는 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 개방된 판독 프레임(ORF)의 전영역이 삽입되어 있는 발현 벡터를 사용하여 생성될 수 있다.

더 나아가, RNA 게놈을 포함하지 않는 불완전한 NANBV 입자는 RNA 폴리머라제를 코딩하는 NS5영역만이 결여된 개방된 판독 프레임이 삽입된 발현 벡타를 사용하여 생산될 수 있다.

본 단계에서 사용될 수 있는 복제 가능한 발현 벡터로서는, 어떠한 통상적으로 공지된 또는 시판되는 발현 벡터도 사용될 수 있다. 발현 벡터의 예로는 엔테로박테리아를 위한 플라스미드 벡터 pSN508(미합중국 특허 제 4,703,005), 효모를 위한 플라스미드 벡터 pBH103 및 그 계열(일본국 특허 공개 제 63-22098), 플라스미드 pJMI05(일본국 특허 공개 제 62-286930), 감독된 수두 비루스 유전자(일본국 특허 공개 제 53-41202호), 감독된 마렉씨 병(Marek's disease) 비루스(일본 수의학회지, 27, 20∼24(1995) 및 Gan-Monograph on CanCer Research 10, 91∼107(1971) ), 플라스미드 pTTQ 계열(Amersham, England 제조 및 판매), 플라스미드 pSLV 계열(Pharmacia LKB, Sweden 제조 및 판매)등이 있다.

NANBV DNA-삽입된 발현 벡터들을 각각 통상적인 방법에 따라 벡터에 감응하는 숙주 세포내로 도입 또는 형질 감염시켜 형질 전환체를 수득한다. 그리고나서, 형질 전환체로부터, NANBV 항원 폴리펩티드 또는 NANBV 입자를 생산한 형질 전환제를 선택한다. NANBV 항원 폴리펩티드( 또는 NANBV 입자)의 생산은 단계(V)에서 상술한 면역 측정법에 의해 검출될 수 있다. 발현 벡터로서 동물 비루스 유전자가 사용되면, 표면에 NANBV 항원 폴리펩티드를 가진 재조합체 비루스가 수득될 수 있다. 그러한 재조합체 비루스는 비루스 벡터 고유의 항원성 뿐만 아니라 NANBV의 항원성도 갖는 다기능성 백신을 위한 조물질로서 유리하게 사용될 수 있다. 통상적인 방법에 따라 상기에서 수득된 형질 전환체 또는 재조합체 비루스를 배양함으로써, 상업적 규모의 형질전환체 또는 재조합체 비루스의 배양물로부터 NANBV 항원 폴리펩티드가 생산될 수 있다. 동물 비루스 유전자가 발현 벡터로서 사용되는 방법의 상세한 내용에 대해서는 유럽 특허 공고 제 0 334 530 Al을 참조할 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 국면에서는 하기의 공정으로 이루어진 비-A, 비-B 간염 비루스 항원 폴리펩티드의 생산 방법이 제공된다.

(a) 데옥시리보핵산을 플라스미드 및 동물 비루스 유전자로부터 선택된 복제 가능한 발현 벡터내로 삽입시켜 복제 가능한 발현 벡터가 플라스미드 일때는 플라스미드 및 삽입된 데옥시 리보핵산을 포함하는 복제가능한 재조합체 DNA를 수득하거나 발현벡터가 동물 비루스 유전자일때는 동물 비루스 유전자 및 삽입된 데옥시 리보핵산을 포함하는 재조합체 비루스를 수득하고, [상기의 데옥시 리보핵산은 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에서 나타낸 비-A, 비-B 간염 비루스 뉴클레오티드 서열의 1번째 내지 1499번째 뉴클레오티드인 코딩 영역의 적어도 일부 또는 1500번째 내지 9416번째 뉴클레오티드인 영역의 적어도 일부를 포함하는 첫번째 뉴클레오티드 서열 및 유전암호의 퇴화에 따라 첫번째 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함함] ; (b) 단계(a)에서 사용된 복제 가능한 발현 벡터가 플라스미드이면, 재조합 DNA로 미생물 세포 또는 진핵생물 세포 배양물을 형질감염시켜 형질전환체를 형성한 후 미생물의 모세포 또는 진핵생물 세포 배양물로부터 형질 전환체를 선택하고 ; (c) 단계 (b)에서 수득한 형질 전환체를 배양함으로써 데옥시리보핵산을 발수현시키고 비-A, 비-B 간염 비루스 항원 펩티드를 생산하거나, 단계(a)에서 수득한 재조합 비루스를 배양함으로써 데옥시리보핵산 및 동물 비루스 유전자를 발현시키고, 비-A, 비-B 간염 비루스 항원 펩티드를 동물 비루스 및 그의 표면에 포함된 비-A, 비-B 간염 비루스 항원 펩티드를 포함하는 증식된 재조합 비루스의 형태로 생산하고 ; (d) 비-A, 비-B 간염 비루스 항원 펩티드 단독으로 또는 증식된 재조합 비루스 형태로 단리함.

뉴클레오티드 서열의 333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 또는 333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이면, 완전 또는 불완전한 비-A, 비-B 간염 비루스 입자가 수득될 수 있다.

더나아가, 제 2(1)도 내지 제 2(16)도의 cDNA의 일부 또는 전체를 주형으로서 사용함으로써, 표준 방법에 따른 인 비트로 전사에 의해 그에 해당하는 RNA 또는 mRNA를 합성할 수 있다. 예를들면, 제 2(1)도 내지 제 2(16)도의 cDNA의 전영역에 해당하는 RNA 또는 mRNA는 플라스미드 pDM-18(실시예2에서 구축됨)을 제한 효소 Hind III로 소화시킨 후, T7 RNA 폴리머라제 및 캡(cap) 유사체를 이용하여 인 비트로 전자함으로써 제조된 cDNA의 전영역을 주형으로서 사용하여 합성할 수 있다. 이렇게 합성된 RNA 또는 mRNA는 NANBV 유전자의 전영역을 포함하며, 즉, RNA 또는 mRNA는 실질적으로 노출된(naked) NANBV 게놈이다.

따라서, mRNA가 동물 세포 내로 형질감염되면, 전염성 NANBV 입자가 수득될 수 있다. 상술한 mRNA는, 예를들면, 통상적인 방법으로 시판되는 mRNA 캡핑 키트(Capping Kit, Stratagene, 미합중국, 제조 및 판매)를 사용하여 합성될 수 있다. 합성을 위한 조작 방법의 자세한 점에 관하여는, 문헌("Cuttent Protocals in MoIecular Biology", 10. 17. 1∼10. 17. 5, John Wiley ＆ Sons 출판, 1989) 을 참조할 수 있다. 제 2(1)도 내지 제 2(16)도의 cDNA의 일부 또는 전체를 사용하여 수득될 수 있는 RNA 는NANBV 게놈의 일부 또는 전체이고, 따라서, 불완전한 NANBV 입자, 완전한 NANBV 입자 또는 NANBV 항원을 생산하기 위해서 뿐만아니라 NANBV 및 그에 의해 야기되는 전염성 질병을 연구하기 위해서도 유용하다.

단계(Ⅶ) : NANBV 항원 폴리펩티드의 정제

형질전환체 또는 재조합 비루스의 배양물에서 생성되는 NANBV 항원 폴리펩티드는, 예를들면, 염석 ; 실리카겔, 활성탄 등을 사용한 흡착 및 탈착 ; 유기 용매에 의한 석출 ; 한외원심분리에 의한 분획화 ; 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화력 컬럼 크로마토그래피에 의한 분리 ; 고성능 액체 크로마토그래피 또는 전기영동에 의한 분획화 등으로부터 선택된 통상적인 기술의 적절한 결합을 사용하여 정제될 수 있다.

NANBV 항원 폴리펩티드가 이. 콜리 형질 전환체 또는 효모 형질 전환체의 배양들로부터 정제될때, NANBV 항원 폴리펩티드의 최종 생성물의 질을 크게 저하시키는 이. 콜리 및 효모로부터 유도된 알레르겐(allergen)의 효과적인 제거라는 관점에서, 정제는, 예를들면 (1) 실리카겔을 사용한 흡착 및 탈착, 활성탄상의 흡착에 의한 불순물의 제거 및 (2) 밀도 구배 원심분리에 의한 분획화의 단계들을 순서대로 수행하는 것이 바람직하다(일본국 특허 공개 제 63-297). NANBV 항원 폴리펩티드가 재조합 비루스의 배양물,

예를들면, 재조합 비루스-감염된 세포의 배양물로부터 정제될 때, 고순도의 NANBV 항원 폴리펩티드는 항원을 포함하는 조용액을 한외 원심분리 및 밀도 구배 원심분리에 의해 반복적으로 정제시킴으로써 수득될수 있다.

이리하여, 본 발명의 정제된 NANBV 항원 폴리펩티드를 함유하는 용액이 수득된다. 원한다면, 용액을 동결 건조시켜 정제된 NANBV 항원 폴리펩티드를 건조 형태로 수득할 수도 있다.

본 발명의 혼합된 항원 폴리펩티드는 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 둘 이상의 상이한 타입의 cDNA의 유전자 발현에 의해 수득된 적어도 두개의 상이한 타입의 NANBV 항원 폴리펩티드를 혼합함으로써 수득될 수 있다.

상술한 바와 같이, NANBV의 코어 단백질(C 단백질), 매트릭스 단백질(M 단백질) 및 엔벨로프 단백질(E 단백질)은 제 2(1)도 내지 제 2(3)도에 나타낸 첫번째(Met) 내지 389번째(Gly) 아미노산인 영역에 포함된다. 따라서, 상기 영역에 포함된 상술한 항원 결정기, 특히 각각 906번째 내지 953번째 뉴클레오티드, 1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드 및 1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 항원 결정기는 항원으로서 극히 유용하다. 항원 결정기들은 폴리펩티드 합성에 의해 수득될 수있다. 폴리펩티드 합성은 폴리펩티드 합성기 COUPLER 2100(Du Pont, USA 제조 및 판매) 및 폴리펩티드 합성기(430A, Applied Biosystems, USA 제조 및 판매)와 같은 시판되는 폴리펩티드 합성기에 의해 수행될 수 있다. 합성된 항원 폴리펩티드는, 예를들면, 백신, 진단시약 및 항체를 생산하기 위해 사용될 수있다.

본 발명의 또다른 국면에서는, 플라스미드 및 동물 비루스로부터 선택된 복제 가능한 발현 벡터 및 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 비-A, 비-B 간염 비루스 뉴클레오티드 서열의 첫번째 내지 1499번째 뉴클레오티드인 코딩 영역의 적어도 일부 또는 1500번째 내지 9416번째 뉴클레오티드인 영역의 적어도 일부를 포함하는 첫번째 뉴클레오티드 서열 및 유전암호의 퇴화에 따라 첫번째 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 데옥시리보핵산을 포함하는 복제 가능한 재조합 DNA가 제공된다.

복제 가능한 재조합체는 본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드를 생산하기 위해서 뿐만 아니라 복제에 의해 본 발명의 NANBV 게놈 cDNA를 증폭하기 위해서도 사용될 수 있다.

복제에 의해 NANBV 게놈 cDNA를 증폭하기 위한 복제 가능한 재조합체에 관한 본 발명의 바람직한 구현예에서, 첫번째 뉴클레오티드 서열은 첫번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 적어도 6개의 뉴클레오티드 또는 1500번째 내지 9416번째 뉴클레오티드 서열의 적어도 6개의 뉴클레오티드를 포함한다.

NANBV 항원 폴리펩티드를 생산하기 위한 복제 가능한 재조합체에 관한 본 발명의 바람직한 구현예에서, 첫번째 뉴클레오티드 서열은 333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 적어도 12개의 뉴클레오티드 또는 1500번째 내지 9362번째 뉴클레오티드 서열의 적어도 12개의 뉴클레오티드를 포함한다.

NANBV 항원 폴리펩티드를 생산하기 위한 복제 가능한 재조합 DNA에 관한 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 첫번째 뉴클레오티드 서열은 333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 333번째 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 474번째 내지 563번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 및 6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 정제된 NANBV 항원 폴리펩티드는 NANB 간염을 검출하기 위한 진단시약으로서 유용하다. 본 발명이 NANBV 항원 폴리펩티드는 하기와 같이 진단시약으로 조성될 수 있다. 상기 수득된 정제된NANBV 항원 폴리펩티드 용액은 유리병 및 앰풀과 같은 용기 내에 분배되고 밀봉된다. 용기에 담은 항원폴리펩티드 용액은 상술한 것과 같은 방법으로 밀봉전에 동결건조될 수 있다. 용기에 담긴 NANBV 항원폴리펩티드의 양은 통상적으로 약 1μg 내지 약 10mg이다. 한편으로는, NANBV 항원 폴리펩티드는 또한 마이크로 플레이트, 폴리에틸렌 비이드, 여과지 또는 막과 같은 통상적으로 사용되는 지지체의 표면에 흡착될 수도 있다.

항원과 NANBV 항원 폴리펩티드의 반응성의 결정은 상술한 단계(V)에서 기술된 것과 실질적으로 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 즉, 반응성의 결정은 방사성 면역 측정법(RIA), 효소 면역 측정법(ELISA), 형광항체 기술(FA), 수동 혈구응집 반응(PHA), 역수동 혈구 응집반응(rPHA)등과 같은 통상적인 면역측정법에 의해 수행될 수 있다.

상기 면역 측정법을 위해 사용되는 NANBV 항원 폴리펩티드의 양은 통상적으로 약 0.1 내지 약 100mg/ml의 혈청이다. 특히, RIA, ELISA, FA, PHA 및 rPHA에 사용되는 NANBV항원 폴리펩티드의 양은 통상적으로 각각, 0.1∼1mg/ml, 0.1∼1mg/ml, 1∼100mg/ml, 1∼50mg/ml 및 1∼50mg/ml이다.

본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드는 또한 수혈을 위한 혈액을 가려내기 위해서도 사용될 수 있다. 스크리닝 방법은 하기와 같다 :

a) 완전 혈액으로부터 혈청을 단리하고 ; b) 미공지된 혈액의 혈청을 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 NANBV 뉴클레오티드 서열의 333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드인 코딩 영역을 포함하는 데옥시리보핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열의 최소한 일부를 포함하는 아미노산 서열의 적어도 하나를 포함하는 단리된 NANBV 항원 폴리펩티드와 접촉시키고 ; c) 혈청이 NANBV 항원 폴리펩티드와 반응하는지를 결정하고 ; d) 반응성에 기초하여 혈청을 비-A, 비-B 간염에 대한 양성 또는 음성으로 분류하고 ; e) 확인에 따라 혈액의 분리를 실행함.

미공지된 혈액의 혈청과 본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드의 접촉 및 혈액의 혈청과 NANBV 항원 폴리펩티드의 반응성이 결정은 NANB 간염의 진단법과 관련하여 상술한 것과 동일한 방법으로 수행될 수 있다.

상기 방법에 의하여, NANBV가 없는 수혈을 위한 혈액이 선택될 수 있다.

본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드에 특이적인 다클론성 항체 및 단클론성 항체는 수혈용 혈액으로부터 NANBV를 제거하기 위한 약제로서 사용될 수 있다. 즉, 혈액중에 존재하는 NANBV는 항원-항체 반응에 의해 디클론성 항체 및 단클론성 항체에 의해 효과적으로 제거될 수 있다.

더나아가, 본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드는 NANB 간염을 위한 백신의 유효성분으로서 유리하게 사용될 수 있다. NANB 간염을 위한 백신은 하기와 같이 제조될 수 있다. NANBV⁷항원 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 지니고 있는 재조합 파지 또는 플라스미드를 포함하는 형질 전환체, 또는 NANBV 항원 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 지니고 있는 재조합 비루스로 감염된 세포의 배양은 상술한 것과 동일한 방법으로 수행되고 그럼으로써 배양물 중에 NANBV 항원 폴리펩티드가 생성된다.

항원 폴리펩티드의 안전성을 보장하기 위하여 배양물 중의 NANBV 항원 폴리펩티드의 독성을 제거하기 위해서 및 항원 폴리펩티드의 면역원성 및 항원성을 안정시키기 위하여 항원 폴리펩티드를 고정시키기 위해서는, 통상적인 불활성화제를 형질 전환체 또는 재조합 비루스-감염된 세포의 배양물에 또는 형질 전환체세포 또는 재조합 비루스-감염된 세포를 제거함으로써 수득된 배양 배지에 가하는 것이 바람직하다. 예를들면, 포르말린과 같은 불활성화제를 0.0001 내지 0.001v/v%의 양으로 가한후 4∼37℃에서 5∼90일간 배양할 수 있다. 그리고나서, 생성된 배양물 또는 배양배지를 상술한 것과 동일한 방법으로 정제시킨다. 이리하여, 정제된 NANBV 항원 폴리펩티드를 함유하는 NANBV 간염 백신 원액이 수득된다.

NANB 간염 백신 원액은 용액을 멸균하기 위하여 표준 방법에 의해 마이크로필터를 사용하여 여과된다. 여액을 생리식염수로 희석하여 로우리법(Lowrwy method)에 의해 측정할 때 단백질 농도가 약 1∼약 500μg/ml가 되도록 한다. 그리고나서, 생성된 용액에 보조약으로서 수산화 알루미늄 겔을 첨가된 젤의 농도가 약 0.1∼약 1.0mg/ml가 되도록 가한다. 보조약으로서는, 인산칼슘겔, 인산 알루미늄겔, 황산 알루미늄, 알루미나 및 벤토나이트와 같은 침전하는 수탁 보조약 및 뮤라밀 펩티드 유도체, 폴리뉴클레오티드, 크레스틴^R(Kureha Chemical Industry Co., Ltd, Japan 제조 및 판매) 및 피시바닐과 같은 항체-생성 유도 보조약도 역시 사용될 수 있다(양자는 모두 항 종양제이다).

더나아가, 혼합물에 적어도 일종의 안정화제를 가할 수도 있다. 안정화제로서는, 어떠한 시판되는 안정화제도 사용될 수 있다. 안정화제의 예로서는 젤라틴 및 그의 가수분해물, 알부민, 글루코오즈, 프룩토오즈, 칼락토오즈, 슈크로오즈 및 락토오즈와 같은 당류 및 글리신, 알라닌, 리신, 아르기닌 및 글루타민과 같은 아미노산이 있다.

그리고나서, 이렇게 수득된 겔-흡수된 NANBV 항원 폴리펩티드를 함유하는 NANB 간염 백신 용액을 앰풀 및 유리병과 같은 작은 용기내에 분배하고 밀봉한다. 이리하여, 흡착된 NANBV 항원 폴리펩티드를 함유하는 정제된 흡착된 NANB 간염 백신이 수득된다.

이렇게 수득된 NANB 간염 백신 용액은 생성물이 혹독한 기후의 장소, 예를들면 열대지방의 지역으로 운반되고 저장될 수 있도록 건조형태로 NANB 간염 백신을 수득하기 위하여 동결건조 될 수 있다. 동결건조는 액체 흡착된 NANB 간염 백신이 유리병 및 앰풀과 같은 용기에 분배된 후 표준 방법에 따라 통상적으로 수행될 수 있다. 동결건조후, 건조된 백신을 포함하는 용기에 질소기체를 도입시킨 후 밀봉한다. 부수적으로, 생성된 백신의 질은 일본국 보건 후생성의 고시 제 159호 "생물학적 산물에 대한 최소 필요조건"에 제공된 "흡착된 간염 B 백신", "건조된 일본뇌염 백신" 및 "흡착된 백일해 백신"에 따라 검사된다.

NANB 간염 백신은 상술한 흡착된 NANBV 항원 폴리펩티드 및 본 NANBV 항원 폴리펩티드 이외의 항원을 적어도 종 함유하는 혼합된 백신의 형태로 제조될 수 있다.

본 NANBV 항원 폴리펩티드 이외의 항원으로서는, 그러한 다른 항원 및 NANBV 항원 폴리펩티드에 의해 야기된 부작용 및 역반응이 NANBV 항원 폴리펩티드 및 그러한 다른 항원의 배합 사용에 의해 부가적으로 또는 상승적으로 증가되지 않고, NANBV 항원 폴리펩티드 및 그러한 다음 항원의 항원성 및 면역원성이 NANBV 항원 폴리펩티드 및 다른 항원의 간섭에 의해 감소되지 않는 한 상응하는 백신이 유효성분으로서 통상적으로 사용되는 어떠한 항원도 사용할 수 있다. NANBV 항원 폴리펩티드와 혼합될 수 있는 항원의 수 및 타입은 부작용 및 역반응이 부가적으로 또는 상승적으로 증가하지 않고 NANBV 항원 폴리펩티드 및 그러한 항원의 각자의 항원성 및 면역원성이 상술한 바와 같이 감소되지 않는 한 제한되지는 않는다. 통상적으로 2∼6 타입의 항원이 NANBV 항원 폴리펩티드와 혼합될 수 있다. 본 NANBV 항원 폴리펩티드와 혼합될 수 있는 항원의 예로는, 제독된 항원, 일본 뇌염비루스로부터 유래한 불활성화된 항원 또는 유독소, HFRS(신장증후를 수반한 출혈열) 비루스, 인플루엔자 비루스, 파라인플루엔자 비루스, 간염B 비루스, 뎅그열 비루스, AIDS 비루스, 보르데텔라 페르투씨스, 디프테리아 바실루스, 파상풍 바실루스, 수막염균(meningococcus), 폐렴쌍구균등이있다.

통상적으로, 본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드를 함유하는 백신은 유리병, 앰풀 등에 담겨 밀봉될 수있다. 본 발명의 백신은 액체 또는 현탁액의 형태로 통상적으로 투여될 수 있다. 백신이 건조된 형태일 경우에는, 백신은 투약전에, 부피가 동결건조 건의 원부피가 될 정도의 양의 증류수가 용해 또는 현탁된다. 통상적으로, 백신은 피하로 투여될 수 있다. 1인당 백신의 1회 투약량은 통상적으로 약 0.5ml일 수 있다. 일반적으로, 어린이 한명당 백신의 1회 투약량은 성인 1인당 백신의 투약량의 거의 반이될 수 있다. 백신은 통상적으로 약 1주 내지 1개월의 간격으로 2회 투여하고나서, 약 6개월 후에 한번 더 투여된다.

더나아가, NANBV 항원 폴리펩티드는 NANBV 항원 폴리펩티드에 특이적인, 다클론성 항체 및 단클론성 항체와 같은 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를들면, NANBV 항원 폴리펩티드에 특이적인 다클론성 항체는 하기와 같은 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 정제된 NANBV 항원 폴리펩티드는 생쥐, 모르모트 및 토끼와 같은 동물에게, 피하적으로, 근육내로 복강내로 또는 정맥내로 접종된다. NANBV 항원 폴리펩티드의 접종은 통상적으로 1 내지 4주의 간격으로 수회 수행함으로써 동물이 완전히 면역되게 한다. 면역 효과를 증가시키기 위해, 통상적이고 시판되는 보조약이 사용될 수 있다. 그리고나서 면역된 동물로부터 혈청을 채취하고 항-NANBV 항원 폴리펩티드 다클론성 항체를 표준 방법에 따라 혈청으로부터 단리 및 정제한다.

다른 한편으로 NANBV 항원 폴리펩티드에 특이적인 단클론성 항체를 예를들면, 문헌 [Cell Technology,1 23∼29(1982) )]에 기술된 것과 같은 통상적인 방법에 따라 제조할 수도 있다. 예를들면, 정제된 NANBV 항원 폴리펩티드로 면역된 생쥐로부터 수득된 비장 세포를 세포 융합 기술에 의해 시판되는생쥐 골수종세포와 융합시켜 하이브리도마를 수득한다. NANBV 항원 폴리펩티드와 반응성 있는 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 수득하기 위하여 하이브리도마들을 가려낸다. 수득된 하이브리도마를 표준방법으로 배양한다. 배양물의 상층액으로부터 항-NANBV 항원 폴리펩티드 단클론성 항체를 표준 방법에 의해 단리 및 정제한다.

상술한 다클론성 항체 및 단클론성 항체는 또한 NANB 간염을 진단하기 위한 진단시약으로서도 사용될수 있다. 항체를 이용한 NANB 간염의 진단은 NANBV 항원 폴리펩티드를 이용한 NANB 간염의 진단과 관련하여 상술한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 면역 측정법에 의해 수행될 수 있다. 다클론성 항체 또는 단클론성 항체를 사용함으로써, 간 조직 및 혈액 중에 존재하는 NANBV 항원 폴리펩티드의 확인 및 정량이 수행될 수 있다.

본 발명의 NANBV 게놈 cDNA는 본 발명에서 규정된 NANBV 게놈 cDNA 클론을 적절한 제한 효소로 소화시킴으로써 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 NANBV 게놈 cDNA는 본 출원의 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 따라 DNA 합성 기술에 의해 제조될 수 있다.

DNA 합성을 통한 NANBV 게놈 cDNA의 제조는 DNA 합성기 모델 380B(Applied Biosystemm U.S.A. 제조 및 판매) 및 DNA 합성기 모델 8700(Biosearch, U.S.A. 제조 및 판매)와 같은 통상적인 DNA 합성기를 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 NANBV 게놈 cDNA는 NANBV 감염의 유전학적 진단을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 NANBV 게놈 cDNA는 환자로부터 얻은 체액 또는 세포에 있는 NANBV 유전자의 검출에 있어서 폴리머라제 사슬반응(PCR)을 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. 폴리머라제 사슬 반응에 의한 진단을 위해서, NANBV 게놈 cDNA는 10∼100ng의 양으로 사용된다.

본 발명의 NANBV 게놈 cDNA는 또한 하이브리드화 기술에 의해 NANB 간염을 진단하기 위해서도 사용될 수 있다. 즉, NANBV 게놈 cDNA는, 예를들면, 비오틴, 알칼리 포스파타아제, 방사성 동위원소 32p 등으로 표지하고 하이브리드화를 위한 탐침으로서 사용한다. 하이브리드화 기술에 의한 진단을 위해 사용되는 cDNA는 표준 방법에 의해 예를들면, 하기와 같이 제조될 수 있다. 상술한 단계(V)에서 수득된 NANBV cDNA를 포함하는 재조합 파지를 적절한 제한 효소로 소화시켜 NANBV cDNA를 포함하는DNA 단편을 절단해 낸다. 수득된 DNA 단편을 시판되는 복제 가능한 클로닝 플라스미드에 결찰시켜 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 수득한다. 재조합 플라스미드를 숙주세포내로 도입시켜 형질전환체를 형성하고 형질 전환체를 배양하여 재조합 플라스미드를 증식시킨다.

증식된 재조합 플라스미드는 형질 wjs환체로부터 단리되고 제한 효소로 소화된다. 생성된 소화물을 저-융점 아가로스겔 전기영동을 거치게하여 NANBV 항원 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 단리 및 정제한다. 이렇게 수득된 cDNA를 비오틴, 알칼리포스파타제, 방사성 동위원소³²P 등으로 표지한다. cDNA의 표지화는 시판되는 닉 번역 키트(nick translation kit) 또는 멀티프라임 DNA 표지화 시스템(multiprime DNA labeling system, 예를들면, Amersham, England ; Nippon Gene CO., Ltd., Japan : 등 제조 및 판매)을 사용함으로써 수행될 수 있다. 포지된 cDNA는 유리병 또는 앰플과 같은, 약 5∼20ml 부피의 용기에 담겨 밀봉된다. 용기에 담긴 표지된 cDNA의 양은 통상적으로 용기당 1∼100μg이다. 표지된 cDNA는 용액의 형태로 용기에 담을 수 있다. 다른 한편, 표지된 cDNA는 용기내에 동결건조 상태로 담을 수 있다. 표지된 DNA의 사용에 의한 NANB 간염의 진단은 표준 하이브리드화 방법에 의해 수행될 수 있다. 즉, 환자로부터 얻은 혈장, 혈청 또는 백혈구를 표지된 cDNA와 접촉하도록 두고 표지된 cDNA와 하이브리드화 하는 RNA를 검출한다. 표지된 cDNA와 하이브리드화한 RNA의 검출은 표준 방법에 의해 수행될수 있다. cDNA가 효소로 표지되면, 검출은 효소 면역 측정법에 의해 수행된다. cDNA가 방사성 동위원소로 표지되면, 검출은 예를들면, 신틸레이션 계수법(Scintillation Counting)에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 NANBV 게놈 cDNA는 신뢰성이 우수하고 NANBV 유전자의 개방된 판독 프FPDLA의 전영역을 포함한다.

본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드는 NANBV와 특이적으로 반응한다. 따라서, NANBV 항원 폴리펩티드가 진단시약으로서 사용되면, NANB 간염의 진단이 높은 신뢰도로 쉽게 수행될 수 있다. 또한 본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드가 수혈용 혈액을 스크리닝 하기 위해 사용되면, NANBV로 감염된 혈액은 높은 신뢰도로 쉽게 선택되고 NANBV에 의해 감염되지 않는 혈액으로부터 제거될 수 있다. 따라서 수혈후 NANBV 간염이 예방될 수 있다.

더나아가, 본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드는 NANBV 간염을 예방하기 위한 백신의 유효성분으로서 유리하게 사용될 수 있다.

더나아가, 본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드를 사용함으로써, NANBV에 특이적인 항체, 특히 단클론성 항체가 쉽게 제조될 수 있다. NANBV에 특이적인 항체는 NANB 간염을 검출하기 위한 진단시약으로서 뿐만 아니라 수혈용 혈액으로부터 NANBV를 제거하기 위한 약품으로서도 유리하게 사용될 수 있다.

더군다나, 본 발명의 NANBV 항원 폴리펩티드는 비루스에 의한 동물의 감염에 의해 생산되지 않고, 숙주세포 내에서 본 항원 폴리펩티드로 코딩하는 DNA의 유전자 발현에 의해 생산됨을 주목해야 한다. 따라서 본 항원 폴리펩티드의 생산을 위한 단계동안의 감염 가능성은 실질적으로 제거된다. 또한, 생산비가 감소될 수 있다. 더군다나, 생산 방법에 사용된 모든 재료들, 예를들면 배양 시스템을 위한 배지는 그의 조성에 대해 잘 공지되어 있으므로, 정제가 간편하고 고순도의 항원 폴리펩티드 생성물이 수득될 수 있다.

본 발명은 이제 하기 실시예와 관련하여 상세히 기술될 것이며, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

[실시예 1]

단계 1(NANBV 게놈 RNA에 상보적인 cDNA를 생산하기 위한 혈장 유래 RNA의 제조)

혈장으로부터 NANBV를 수득하기 위해, 35IU/1 이상의 글루타믹-피루빅 트랜스아미나아제(GPT) 활성[Wroblewski, F ＆ J. S. LaDue의 방법(Serum glutamic-pyruvic transaminase in cardiac and hepatic disease. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 91 : 569,1956)에 의해 측정]을 나타내는 4.8ℓ의 인간혈장을 30%(w/w) 슈크로오즈 수용액 위에 놓고 48,000×g하의 4℃에서 13시간동안 원심분리시켜 침전물을 수득한다.

침전물을 50mM 트리스, HCl(pH 8.0 및 1mM EDTA를 함유하는 수용액에 현탁시키고 250,000×g하의 4℃에서 3시간동안 한번 더 원심분리시켜 침전물을 수득한다. 수득된 침전물을 5.5M 구아니딘 티오시아네이트, 20mM 시트르산 나트륨(pH 70),0.05% 사르코실(소디움 라우릴 사르코시네이트) 및 0.1M 2-메르 캅토에탄올을 함유하는 75ml의 5.5M GTC 용액에 용해시킨다. 생성된 용액을 16ml의 CsTFA-0.1M EDTA 용액(P=1.51)위에 놓고, 140,000×g하의 16℃에서 20시간동안 원심분리시켜 RNA의 침전물을 수득한다. 단백질 및 DNA를 함유하는 상층액을 흡인(Suction)에 의해 제거하고, 침전물을 200μl의 TEmM트리스 HCl, pH 8.0 및 1mM EDTA 용액에 용해시킨다. 20μl의 3M 염화나트륨 및 에탄올을 용액에 가하고 -70℃에서 90분동안 가만히 방치한다. 혼합물을 12,000×g하의 4℃에서 30분동안 원심분리하여 침전물을 수득한다. 침전물을 TE에 용해시키고, 염화나트륨 및 에탄올을 상술한 것과 같은 방법으로 가한다. 혼합물을 비루스 -701℃에서 가만히 방치하여 침전을 수득한다. 침전을 10μl의 TE에 용해시킴으로써 정제된 RNA를 수득한다.

단계 2(NANBV 게놈 RNA에 상보적인 cDNA를 생산하기 위한 간-유래 RNA의 제조)

오까야마 등의 방법(H. Okayama, M. Kawaichi, M. Brownstein, F. Lee, T. Yokota 및 K. Arai : High-Efficiency Cloning of Full-Length cDNA : Construction and Screening of cDNA Expression Libraries for Mammalian CElls, Methods in Enzymology 154. 3∼28, 198참고)에 의하여 NANBV 간염 환자로부터 절단해낸 간 조직으로부터 NANBV 게놈 RNA를 제조한다.

상세히 말하면, 1g의 간조직을 작은 조작으로 자른다 : 작은 조각들을 단계 1에 사용된 것과 같은 100ml의 5.5M GTC 용액에 현탁시키고, 테프론-유리 균일화기에 의해 균일화한다. 이어서, 균질물을 #18 바늘을 가진 주사기에 도입시키고 바늘을 통해 주사기로부터 균질물을 방출시키는 것을 반복함으로써 기계적으로 DNA를 쪼갠다. 생성된 균질물을 1,500×g(낮은 원심력)하의 4℃에서 15분동안 원심분리함으로써 상층액을 수득한다. 상층액을 단계 1에 기술된 것과 실질적으로 동일한 방법으로 CsTFA 용액위에 놓고 원심분리함으로써 RNA 분획으로서 침전을 수득한다. 이렇게 수득된 침전물을 0.4ml의 4M GTC 용액에 현탁시킨다. 10μl의 1M 아세트산 및 300μl의 에탄올을 현탁액에 가하고 -20℃의 온도에서 적어도 3시간동안 가만히 방치함으로써 RNA의 침전anf을 수득한다. 12,000×g하의 4℃의 온도에서 10분동안 원심분리함으로써 침전물을 분리하고, 1ml의 TE의 용액에 용해시킨다. 100μl의 2M 염화나트륨 용액 및 3ml의 에탄올을 용액에 가하고, 혼합물을 -20℃에서 3시간동안 방치한다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수거하고 10μl의 TE에 용해시킴으로써 정제된 간-유래 RNA를 수득한다.

단계 3(cDNA 합성 키트를 사용한 이중-가닥 cDNA의 제조)

시판되는 cDNA 합성 키트(Amersham International, England 제조 및 판매)를 사용하여 이중-가닥 cDNA를 제조한다.

상세히 말하면, 단계 1 에서 수득된 0.75μg의 정제된 RNA 및 2μl의 무작위 헥사뉴클레오티드 프라이머 및 키드에 포함된 시약으로부터 취한 2μl의 역전사 효소를 반응관 내에 넣는다. 그리고나서, 생성된 혼합물의 총부피가 20μl가 될 정도의 양으로 증류수를 가한다. 혼합물을 42℃에서 40분동안 배양함으로써 cDNA의 첫번째 가닥을 제조한다.

이어서, 반응 혼합물을 빙수 내에 냉각하면서 하기와 같은 cDNA의 두번째 가닥을 합성한다. 20μl의 반응 혼합물에 키트에 포함된 시약으로부터 취한 두번째 가닥 합성 반응을 위한 37.5μl의 완충액, 1μl의 이. 콜리 리보뉴클레아제 H 및 6.6μl의 DNA 폴리머라제 I을 가한후 34.9μl의 증류수를 가한다. 혼합물을 12℃에서 60분간, 22℃에서 60분간 및 70℃에서 10분간 배양한다. 혼합들을 빙수로 다시한번 냉각시킨다. 1μl의 T4 DNA 폴리머라제를 가하고, 37℃의 온도에서 10분간 배양하고, 4μl의 0.25M EDTA(pH 8.0)을 가함으로써 반응을 종결시킨다. 반응 혼합물을 페놀 및 클로로포름의 혼합물과 잘 혼합하고 12,000×g 하에서 1분간 원심분리함으로써 수층을 분리한다. 수층을 다시 상술한 것과 동일한 추출을 거치게 하고 동량의 클로로포름을 가한다. 혼합물을 잘 교반하고 원심 분리하여 수층을 분리한다. 이어서, 동량의 4M 암모늄아세테이트 및 2배량의 에탄올을 수층을 가하고, 혼합물을 -70℃로 냉각시킴으로써 정제된 이중-가닥 cDNA의 침전물을 수득한다.

침전물을 50μl의 2M 암모늄 아세테이트에 용해시킨다. 혼합물에 100μl의 에탄올을 가하고, 생성된 혼합물을 -70℃에서 냉각시킴으로써 침전을 수득한다. 침전물을 12,000×g하에서 10분간 원심분리함으로써 수거한다. 수거된 침전물을 건조시키고나서 20μl의 TE에 용해시킨다.

단계 4(폴리머라제 사슬 반응(PCR) 방법에 의한 이중-가닥 cDNA의 제조).

단계 1 및 단계 2에서 제조된 RNAs를 주형으로서 사용하여 역전사효소에 의해 제조된 cDNAs를 PCR법(Saiki. R. K., Gelfand, D. H., Stoffer, S., Scharf, S. J., Higuchi R., Horn, G. T., Mullis,K. B., 및 Erlich, H. A., Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science 239 : 487∼491,1988참조)에 의해 각각 증폭한다. 즉, 5∼1,000ng의 RNA를 50mM 트리스 HCl(pH 8.3), 40mM KC1, 6mM MgC1₂, 1μl 3'-프라이머[제 2(14)도에서 뉴클레오티드번호 7949∼7973의 25 뉴클레오티드로 구성된 합성 올리고 뉴클레오티드], 10mM dNTP 및 0.5 단위의 역전사효소(New England BioLab, U. S. A. 제품)를 함유하는 20μl의 역전사 효소용액에서 37℃로 30분간 배양한다. 생성된 혼합물을 18mM 트러스 HCl(pH 8.3), 48mM KC1, 1.5mM MgCl₂, 각각 0.6μM의 5'-프라이머[제 2(13)도의 뉴클레오티드 번호 7612 내지 7636의 25뉴클레오티드로 구성된 합성 올리고뉴클레오티드], 및 상술한 3'-프라이머, 10mM dNTP 및 2.5 단위의 Tag DNA 폴리머라제(Perkin Elmer Cetus Co., Ltd., U. S. A. 제조 및 판매)를 함유하는 80μl의 PCR 반응용액을 가한다. 혼합물을 94℃에서 1분간, 50℃에서 2분간 및 72℃에서 3분간 배양한다. 상기 배양을 40회 반복한다. 생성된 혼합물을 아가로스 겔을 사용하여 전기 영동시킴으로써, 증폭된 cDNA를 수득한다. 증폭된 cDNA를 페놀처리, 에탄올 침전 및 건조 시킨다. 생성된 cDNA를 10μl의 TE에 용해시킨다.

단계 5(λ gt11을 사용한 cDNA 라이브러리의 제조)

시판되는 cDNA 클로닝 키드(Amersham International, England 제조 및 판매)를 사용하여, cDNA 라이브러리를 제조한다. 즉, 단계3에서 제조된 130ng의 cDNA에 클로닝 키드에 포함된 시약으로부터 취한 2μg의 L/K 완충액, 2μl의 EcoRI 어댑터(adapter) 및 2μl의 T4 DNA 리가아제를 가한다. 용액에, 생성된 혼합물의 총부피가 20μl가 될 정도의 양으로 증류수를 가한다. 혼합물을 15℃의 온도에서 16∼20시간의 기간동안 배양하고, 2μl의 0.25M EDTA를 거기에 가함으로써 반응을 종결시킨다. 이어서, 혼합물을 키드에 포함된 크기 분류 컬럼을 통과시킴으로써 cDNA에 결찰되지 않는 EcoRI 어댑터를 제거한다. EcoRI 어댑터가 결찰되어 있는 700μl의 cDNA에 83μl L/K 완충액 및 8μl의 T4 폴리뉴클레오티드키나아제를 가한다. 혼합물을 37℃의 온도에서 30분간 배양한다. 생성된 혼합물을 2회 페놀 추출하고, 부탄올에 의해 350∼400μl로 농축시키고, 에탄올 침전시킴으로써 침전물을 수득한다. 침전물을 5μl의 TE에 용해시킨다.

이어서, EcoRI 어댑터가 결찰되어 있는 cDNA를 클로닝 벡터 λ gt11의 EcoRI 위치에 삽입시키기 위하여, 1μl의 L/K 완충액, 2μl(1μg)의 λ gt11암(arm) DNA 및 2μl의 T4 DNA 리가아제를 EcoRI 어탭터가 결찰되어 있는 상술한 cDN 1μl(10ng)에 가한다. 혼합물에 혼합물의 총부피가 10μl가 될 정도의 양으로 증류수를 가한다. 혼합물을 15℃의 온도에서 16∼20시간의 기간동안 배양한다. 이리하여 재조합 λ gt11 DNA 용액을 제조한다. 더나아가, 기가팩 II 골드 용액 A 및 B(Gigapack III Gold Solutions A and B), SM 완충액 및 클로로포름을 포함하는 시판되는 인 비트로 포장 키트(Stratagpene Co., Ltd., U. S. A.제조 및 판매)를 사용하는 인 비트로 포장에 재조합 X 파지를 수득한다. 즉, 10μl의 기가팩 II 골드 용액A 및 15μl의 기가팩 II 골드용액 B를 4μl의 상술한 재조합 λ gt11 DNA 용액에 가한다. 혼합물을 22℃에서 2시간동안 배양한다. 배양후에, 470μl의 SM 완충액 및 10μl의 콜로로포름을 가함으로써 재조합 파지를 수득하고 4℃에 보관한다.

단계 6(이. 콜리 플라스미드 pUC 19를 사용한 DNA의 클로닝)

용액 A 및 B를 포함하는 시한되는 DNA 결찰 키트(Takara Shuzo Co., Ltd., Japan 제조 및 판매)를 사용하여, cDNA를 이. 클리 플라스미드 pUC 19(C. Yanishi-Perron. J. Vieira. J. Messing, Gene33, 103, 1985)에 삽입시키고, 이. 콜리 내에서 클론화 한다. 즉, 40μl의 용액 A 및 10μl의 B를 단계 4에서 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해 제조된 5μl의 cDNA 및 제한 효소 SmaI으로 소화되고 탈인된 5μl(50ng)의 플라스미드 pUC 19DNA에 가한다. 혼합물을 15℃의 온도에서 16시간동안 배양한다. 이.콜리균주 JM I09(Messing, J., Crea, R., 및 Seeburg, P. H. Nucleic Acids Res.9, 309, 1981 참조)를 염화 칼슘법(Mandel, M 및 A, Higa, J. Mol. Biol., 53, 154, 1970 참조)에 따라 상기에서 수득한 플라스미드 DNA로 형질전환시킨다. 이리하여, cDNA가 결찰되어 있는 플라스미드를 포함하는 형질 전환된 이콜리가 수득된다.

단계 7(cDNA 라이브러리로부터 NANBV 유전자를 갖는 클론의 스크리닝)

이. 콜리 균주 Y 1090(Richard A, Yolung and Ronald W. Davis, Science, 222, 778, 1983 참조)을 1% 트립토판, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨, 50㎕/ml암피실린 및 0.4% 말토오즈를 함유하는 50ml의 LBM 배지에서 37℃의 온도로 배양한다. 대수성장기의 이.콜리 세포를 얻음으로 냉각된 15ml의 10mM 황산 마그네슘에 현탁시킨다. 단계 5에서 수득된 파지 용액을 0.1M 염화나트륨, 8mM 황산 마그네슘, 50mM 트리스 HCl(pH 7.5) 및 0.01% 젤라틴을 함유하는 SM 완충액으로 희석한다. 0.1ml의 희석된 파지 용액을 동부피의 상술한 이.콜리 세포 현탁액과 혼합하고, 혼합물을 37℃의 온도에서 15분간 배양한다. 혼합물에 45℃로 가열되고 1% 트립토판, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 0.25% 황산마그네슘 및 0.7% 한천(pH 7.0)을 함유하는 4ml의 연질 한천 배지를 가한다. 혼합물을 1% 트립토판, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨, 1.5% 한천 및 100μg/ml 암피실린더(pH 7.0)을 함유하는 L-한천 플레이트에 깔고 42℃의 온도에서 3시간동안 배양한다. 이어서, 10mM IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드)를 니트로셀룰로오즈 여과지에 스며들게 하고 니트로셀룰로오즈 여과지를 건조시키고 L-한천 플레이트와 밀착시킨다. 플레이트를 37℃의 온도에서 3시간동안 배양한다. 여과지를 분리하고 TBS 완충액으로 3회 세척한다. 세척한 여과지를 2% 소 혈청 알부민 용액에 함침시키고 실온에서 한시간동안 배양한다. 시판되는 면역 스크리닝 키트(Amersham International, England 제조 및 판매)에 포함된 이. 콜리 분해물 용액의 1/20 부피를 NANB 간염 환자로부터 모은 혈청에 가하고, 실온에서 30분동안 배양한다. 그후에, 혈청을 0.2% 소 혈청 알부민-첨가된 TBS 완충액으로 50배 희석하고, 여과지를 희석된 혈청 용액에 함침시키고, 실온에서 한시간동안 배양한다.

생성된 여과지를 0.05% 트윈 20을 함유하는 TBS 완충액으로 4회 세척한다. 세척된 여과지를 퍼옥시다제-표지된 항-인간 IgG(Cappel Co., Ltd., Germany 제조 및 판매)를 1,000배 희석함으로써 제조된 항체 용액에 한시간동안 함침시킨다. 여과지를 상술한 트윈-TBS 완충액으로 세척하고 50μl의 TBS 완충액에 0.4ml의 DAB(3,3'-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드) 및 15μl의 30% 과산화수소를 가함으로써 제조된 용액에 함침시킨 후 실온에서 5∼30분동안 배양하여 발색되도록 한다. 생성된 여과지를 증류수로 완전히 세척하여 반응을 종결시킨다.

상술한 방법에 의하여, 수득된 플라크를 정제한다. 결과로서, 9개의 양성 클론들을 단리하고, 각각, BK102, BK 103, BK 105, BK 106, BK 108, BK 109, BK 110, BK 111 및 BK 112로서 명명한다. 이 모든 클론들은 건강한 사람으로부터 얻은 혈청과는 반응하지 않지만, NANB 간염을 앓는 환자로부터 얻은 혈청과는 반응한다. 표 1 참조.

[표 1]

NANB 간염 환자로부터 수득한 혈청과 재조합 λ gt11 파지 클론의 반응성

* 양성 시료의 수/표본의 수

단계 8(수득된 클론의 뉴클레오티드 서열의 결정)

클론 BK 102 내지 BK 112의 재조합 파지 DNA를 수거하고, 수거된 DNA를 제한 효소 EcoRI으로 소화 시킨다. 그리고나서, NANBV의 cDNA 단편을 단리하고, 단리된 cDNA를 각각 플라스미드 pUC 19의 EcoRI 위치내로 삽입시킨다. 플라스미드를 사용하여, 이. 콜리 균주 JM 109를 단계 7에서와 실질적으로 동일한 방법으로 형질 전환시킨다. 형질 전환된 이. 콜리로부터 플라스미드 DNA를 수득하고 정제한다. 각 NANBV cDNAs의 뉴클레오티드 서열은 7-DEAZA 서열 결정 키트(Takara Shuzo Co., Ltd 제조 및 판매 : Mizusawa, S., Nishimura, S. 및 Seela, F. Nucleic Acids Res., 14, 1319, 1986참조)를 사용하여 결정된다. 수득된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 사이의 관계는 제 1(1)도에 나타낸다.

단계 9(게놈 워킹에 의한 cDNA 라이브러리로부터 NANBV cDNA 클론의 클로닝)

단계 8에서 수득된 클론 BK 102, 클론 BK 106 및 클론 BK 112의 cDNA 단편을³²P-dCTP로 표시함으로써 탐침을 제조한다. 탐침을 사용하여, 단계 5에서 수득된 클로닝 벡터 λ gt11의 cDNA 라이브러리 및 상술한 탐침으로부터 하이브리드화에 의해 NANBV cDNAs를 포함하는 파지 클론들을 수득한다. 즉, 플라스미드 DNA는 단계8에서 수득된 클론 BK 102, 클론 BK 106 및 클론 BK 112로 형질 전환된 이. 콜리로부터 알칼리 법(T. Maniatis, E.F. Fritsch, and J. Sambrook : Isolation of Bacteriophage λand plasmid DNA : "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., pp.75∼96 참조)에 의해 제조된다. 클론 BK 102의 플라스미드 DNA를 제한 효소 Nco I HincII로 소화시키고, DNA의 5'-말단측에 있는 생성된 0.7kb 단편을 아가로스 겔로 전기 영동시키고 수거한다. 클론 BK 106 및 클론 BK 112의 플라스미드 DNA를 제한 효소 Nco I으로 소화시킨다. 상술한 바와같은 방법으로 1.1kb DNA 단편을 클론BK 106으로부터 수거하고, 3'-말단측에 있는 0.7kb 단편을 클론 BK 112로부터 수거한다. 시판되는 DNA 표지화 키트(Nippon Gene Co., Ltd. 제조)를 사용하여, 25mg∼1μg의 DNA 단편을 [α-³²P] dCTP(3000 Ci/m 몰 ; Amersham Co., Ltd., England 제조)와 함께 37℃의 온도에서 3∼5시간의 기간동안 배양한다. 이리하여, 하이브리드화를 위한 탐침을 제조한다. 이어서, 단계 5에서 수득한 cDNA 라이브러리 파지를, 단계 7에서 기술된 것과 같이, 42℃의 온도에서 L-한천 배지 내에서 3시간동안 배양한다. 더나아가, 파지를 37℃의 온도에서 3시간동안 배양하고 냉각시킨다. 혼합물 위에 니트로셀룰로오즈 여과지를 얻고 30∼60초의 기간동안 가만히 방치한다. 이리하여 파지를 여과지에 흡착시킨다.

여과지를 0.5N 수산화나트륨 및 1.5M 염화나트륨을 함유하는 수용액을 사용하여 1∼5분의 기간동안 알칼리 변성시키고 0.5M 트리스 HCl(pH 8.0) 및 1.5M 염화나트륨을 함유하는 수용액으로 1∼5분동안 중화시킨다. 여과지를 0.3M 염화나트륨 및 0.03M 시트르산 나트륨을 함유하는 2XSSC 용액으로 세척하고 공기 건조시키고, 80℃에서 2시간동안 가열건조 시킨다.

여과지를 42℃의 온도에서 6시간동안 50% 포름아미드, 5×SSC, 5× 덴하르트(Denhart)용액, 50mM 인산-시트르산 완충액(pH 6.5), 100μg/ml송어 정충 DNA 및 0.1% SDS를 함유하는 하이브리드화용 용액에서 배양한다. 그리고나서, 여과지를 약 4×10⁸cpm/ml의 상술한 탐침이 1ml 첨가되어 있는 300ml의 하이브리드화 용액에 함침시키고, 42℃의 온도에서 16∼20시간동안 배양한다. 여과지를 0.1%(W/V) SDS를 함유하는 2×SSC 용액 및 0.1%(W/V) SDS를 함유하는 0.1×SSC 용액으로 세척한다. 세척후에, 여과지를 건조시키고 방사선 사진술을 거치게 한다. 이리하여, 하이브리드화 양성 클론들이 단리된다. 결과로서, 클론 BK 102로부터 유래된 탐침과 반응하는 27 클론, 클론 106으로부터 유래된 탐침과 반응하는 14클론 및 클론 BK 112로부터 유래된 탐침과 반응하는 13 클론을 수득하고 이들을 각각 BK 114 내지 BK 169로서 명명한다.

클론 BK 114∼BK 169의 각각의 뉴클레오티드 서열을 단계 8에 기술된 방법에 따라 결정한 후, 각 클론에 대한 지도를 작성(mapping)한다. 결과로서, NANBV 게놈의 거의 전장으로 간주되는 약 9.5kb의 길이를 갖는 뉴클레오티드 서열의 지도가 수득된다[제 1(2)도 참조].

5'-말단측에 위치한 클론 BK 157을 제한 효소 Kpn I으로 소화시킴으로써 5'-말단측에 있는 0.5kb 단편을 수거한다. 또한, 3'-말단측의

극단에 위치한 클론 BK 116을 제한 효소 Hpa I 및 EcoR I으로 소화시킴으로써 3'-말단측에 있는 0.5kb단편을 수거한다.³²P로 표지된 탐침을 상술한 것과 동일한 방법으로 제조하고 단계 5에서 수득된 cDNA라이브러리 파지를 플라크 하이브리드화 한다. 결과로서, 클론 BK 157로부터 유래된 탐침에 의해 세개의 새로운 추가적 클론들이 분리된다. 이 새로운 클론들은, 각각, 클론 BK 170, BK 171 및 BK 172로 명명된다.

단계 10(cDNA의 뉴클레오티드 서열의 분석)

NANBV 유전자의 전 뉴클레오티드 영역은 단계 8 및 9에서 수득된 클론들의 뉴클레오티드 서열드로부터 결정되며, 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타나 있다. 도면으로부터, NANBV의 클론화된 게놈 cDNA가 3010 아미노산 잔기로 구성된 단백질을 코딩하는 9030 뉴클레오티드로 구성된 개방된 판독 프레임이 있는 9416 뉴클레오티드로 구성되어 있음이 추정된다. 상기 단백질의 친수성/소수성 패턴은 이미 보고된 플라비비루스의 것과 유사하다(H. Sumiyoshi, C. Mori, I. Fuke et al., 일본 뇌염 비루스 게놈 RNA의 완전한 뉴클레오티드 서열 비루스학, 161, 497∼510, 1987 참조), 제 2(1)도 내지 제 2(16)도의 클론 BK 157은 뉴클레오티드 번호 1∼1962를 포함하고, 쿨론 BK 172은 뉴클레오티드 번호 5∼366를 포함하며, 클론 BK153은 뉴클레오티드 번호 338∼1802를 포함하고, 클론 BK I 38은 뉴클레오티드 번호 1755∼5124를 포함하며, 클론 BK 129은 뉴클레오티드 번호 4104∼6973를 포함하고, 클론 BK 108은 뉴클레오티드 번호 6886∼8344를 포함하며 클론 BK 166은 뉴클레오티드 번호 8082∼9416를 포함한다. 그들은 에스케리키아콜리 BK 108(일본국 발효연구소(Fermentation Research Institute, Japan)에 수탁 번호 FERM BP-2971하에 기탁됨), BK 129(일본국 발효연구소에 수탁번호 FERM BP--2972하에 기탁됨), BK 138(일본국 발효연구소에 수탁번호 FERM BP-2973하에 기탁됨), BK 153(일본국 발효연구소에 수탁번호 FERM BP-2974로 기탁됨), BK 157, BK 166(일본국 발효연구소에 수탁번호 FERM BP-2975로 기탁됨) 및 BK 172(일본국 발효연구소에 수탁번호 FERM BP-2976으로 기탁됨)로서 각각 보존되어 있다.

단계 11(NANBV 감염에 수반하는 항체-반응과 관련된 NANBV-관련 항원의 이. 콜리내 생산)

단계 8에서 각각 수득된 클론 BK 106, 클론 BK 111 및 클론 BK 102의 각각의 cDNA 및 단계 9에서 수득된 클론 BK 147의 cDNA를 각각 플라스미드 내로 삽입시키고, 이렇게 수득된 플라스미드 DNA를 통상적인 알칼리법에 의해 수거한다. 이어서, 클론 BK l06의 수거된 DNA를 제한 효소 EcoR I 및 Cla I으로 소화시킴으로써 길이 0.34kb인 DNA 단편 0.5μg을 수득한다.

이렇게 수득된 DNA 단편을 67mM 트리스 HCl(pH 8.8), 6.7mM 염화 마그네슘, 16.6mM 황산 암모늄, 10mM 2-메르캅토에탄올, 6.7μM EDTA, 0.025 소 혈청 알부민, 0.3mM dNTP 및 2∼5 단위의 T4 DNA 폴리미라제를 함유하는 T4 DNA 폴리미라제 용액 내에서 37℃로 60분간 배양함으로써 양 말단을 무디게(blunt)한다. 클론 BK 102의 DNA를 제한 효소 BamH I으로 소화시킴으로써 길이 0.7kb의 DNA 단편 0.5μg을 수거하고, 상술한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 DNA 단편의 말단을 무디게 한다. 클론 BK 147의 DNA를 제한 효소 San3A I으로 소화시킴으로써 1kb 길이의 DNA 단편 0.5μg을 수득하고 상술한 것과 동일한 방법으로 DNA 단편의 말단을 무디게 한다. 또한 클론 BK 111의 DNA를 제한 효소 EcoR I으로 소화시킴으로써 길이 1kb의 DNA 단편 0.5μg을 수득하고 상술한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 DNA 단편의 말단을 무디게 한다. 이어서, 발현 벡터 pKK 233-2의 DNA(Amann, E. and J. Brossius, ATG Vector for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene, Vol. 40,183,1985)를 제한 효소 HindIII로 소화시킨다. 2μg의 생성된 DNA를 0.3M 염화나트륨, 50mM 아세트산 나트륨(pH 4.5), 1mM 황산 아연 및 100∼200단위의 S1 뉴클레아제를 함유하는 S1 뉴클레아제 용액에서 37℃로 20분동안 배양하고, 각각 1/10부피의 0.12M EDTA 및 1M 트리스 HCl용액(pH 9.0)을 가함으로써 반응을 종결시킨다. 그리고 나서, 페놀추출을 수행하고, 무딘 말단을 갖는 벡터 DNA를 에탄올로 침전시키고 수거한다.

다른 한편으로는 벡터 pKK 233-2의 DNA를 제한 효소 Pst I으로 소화시키고, 소화된 DNA를 페놀로 추출하고 에탄올로부터 침전시킴으로써 정제한다. 제한 요소 Pst I에 의해 절단된 2μg의 정제된 벡터 DNA의 말단을 상술한 T4 DNA 폴리머라제 반응에 의해 무디게 한다. 이렇게 수득된 클론 BK 106 및 클론 BK 111로부터 유래된 DNA 단편들을 각각 제한 효소 HidlII로 절단한다. 각각의 절단된 DNA 단편 0.5μg을 무딘 말단을 갖는 0.5μg의 벡터 DNA와 혼합한다. 클론 BK 102 및 클론 BK 147로부터 유래된 DNA 단편들을 제한 효소 Pst I으로 각각 절단한다. 각각의 절단된 DNA 단편 0.5μg을 무딘 말단을 가진 0.5μg의 벡터 DNA와 혼합한다. 각 혼합들의 부피를 500mM 트리스 HCl(pH 7.5),100mM 염화 마그네슘 100mM DTT 및 10mM ATP, 300∼400 단위의 T4 DNA 리가아제 및 증류수를 함유하는 10×결찰 용액 2μl를 가함으로써 20μl로 조정한다. 혼합물을 14℃에서 12∼18시간동안 배양함으로써, 플라스미드를 수득하고 각각 pCE-06, pE-11, pB-02 및 pS-09로 명명한다. 각각의 OP-플라스미드 DNA를 사용하여, 이. 콜리균주 JM 109를 단계 6에 기술된 것과 실질적으로 동일한 방법으로 형질 전환시킴으로써 형질전환된 이. 콜리를 수득한다. 형질 전환된 이. 콜리를 1(w/v)% 트립톤, 0.5(w/v)% 효모 추출물 및 1(w/v)% 염화나트륨을 함유하는 LB 배지(pH 7.5)에서 37℃로 배양하고, 그것이 대수성장기에 있을때, 1mM IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 배지에 가한다. 3시간동안 더 배양한다. 그리고나서, 원심분리(10,000×g,15분간)에 의해 이. 콜리세포를 수거하고, 수거된 세포를 50mM 트리스 HCl(pH 8.0)에 용해시킨다.

혼합물을 초음파 처리(20KHz, 600W, 5분)하고, 10,000×g에서 15분간 원심분리 함으로써 상층 분획 및 침전 분획을 수득한다. 각 분획을 20(v/v)% 글리세롤, 0.1M 트리스 HCl(pH 6.8), 2(w/v)% SDS, 2(v/v)% 2-메로캅토에탄올 및 0.02% BPB를 함유하는 시료 완충액에 용해시키고, 100℃에서 3분간 가열하고, 0.1% SDS-7.5% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동하여 단백질을 분리한다. 전기 영동후에, 트랜스 블롯 셀(BIO·RAD Co., Ltd., U.S.A. 제조 및 판매)에 의해 단백질을 니트로셀룰로오즈 여과지로 옮긴다. 여과지를 3% 젤라틴 용액에 함침시키고 60분동안 가만히 방치한다. 여과지를 NANB 간염환자로부터 얻은 100배 희석된 혈청과 함께 실온에서 2∼3시간동안 배양한다. 여과지를 증류수로 세척하고 나서 0.02M 트리스. HCl(pH 7.5), 0.5M 염화나트륨 및 0.05(v/v)% 트윈 20을 함유하는 TTBS 용액으로 세척한다. 이어서 세척된 여과지를 퍼옥시다아제-표지된 항-인간 IgG 항체의 2,000배 희석된 용액에 함침시키고, 실온에서 90분동안 배양한다. 여과지를 증류수 및 그리고나서 TTBS 용액으로 세척한다. 세척한 여과지를 단계 7에서 기술된 것과 같이, 첨가된 발색제 DAB 및 기질을 기준으로 30% 과산화수소를가진 완충액에 5∼30분동인 함침시킨 후, 물로 세척하여 반응을 종결시킨다.

결과로서, 표 2에 나타낸 것과 같이, 플라스미드에 의해 생산된 모든 항원은 NANB 간염 환자로부터 얻은 혈청과 특이적으로 반응함으로써, 플라스미드에 삽입된 cDNA에 의해 생산된 단백질이 임상적으로 중요함을 나타낸다.

[표 2]

각종 플라스미드에 의해 생산된 단백질과 NANB 간염 환자로부터 얻은 혈청 사이의 웨스턴 블롯 방법으로 평가된 반응성

S : 원심분리에 의한 상층액

P : 원심분리에 의한 침전물

+ : 양성

± : 약간 양성

- : 음성

단계 12(이. 콜리에 의해 생산된 NANBV-관련 항원의 정제 및 간염 환자로부터 얻은 혈청과 그의 반응성)

발현 벡터내로 삽입된 cDNA에 의해 생산된 단백질의 유용성은 단백질을 정제하고 정제된 단백질을 ELISA 또는 방사성 면역 측정법을 위한 항원으로서 사용함으로써 설명된다. 즉, 단계 11에서 수득된 형질전환된 이. 콜리의 분해물을 10,000×g에서 15분동안 원심분리함으로써 상층액 및 침전물을 수득한다. 예를들면, 형질 전환체 JM /pCE 066으로부터 수득된 침전들을 100mM 트리스·HCl(pH 8.0) 및 0.1% 트리스×-100의 용액에 현탁시키고, 생성된 현탁액을 20KHz(600W)의 주파수로 1분동안 초음파 처리한 후, 21,000×g에서 15분동안 원심분리함으로써 침전물을 수득한다. 침전물을 100mM 트리스·HCl(pH 8.0) 및 6M 요소의 용액에 재현탁시키고나서 초음파 처리한 후 원심분리한다.

생성된 상층액을 10mM 인산 완충액(pH 7.5) 및 6M 요소의 용액에 대하여 투석함으로써 항원용액을 수득한다. 20ml의 항원 용액을, 상술한 완충액으로 평형화된, 히드록시아피티트로 충전된 컬럼(21.5×250mm)을 통과시킴으로써 항원이 충전물질 위에 흡착되도록 한다. 컬럼을 농도가 선형농도 구배로 0∼2M로 변하는 염화나트륨이 첨가된 상술한 완충액을 사용하여 용출이 수행되는 고성능 액체 크로마토그래피를 거치게 함으로써 항원을 포함하는 분획을 수득한다. 수득한 분획을 50mM 탄산염 완충액(pH 9.6) 및 0.05% 소디움 도데실 술페이트(SDS)의 용액에 대하여 투석한다.

더나아가, JM 109/pB-02-10의 분해물의 원심분리(10,000g에서 15분동안)에 의해 수득된 상충액을 35% 진한 황산암모늄으로 처리하고 수득된 침전물을 50mM 트리스·HCl(pH 8.5) 및 100mM 2-메르캅토에탄올에 용해시킨다. 생성된 용액을 상술한 완충액에 대하여 투석한다. 이어서, 100ml의 투석된 용액을 상술한 완충액으로 평형화된, DEAE 셀룰로오즈로 충전된 컬럼(22.0×200mm)을 통과시킴으로써 항원이충전물질에 흡착되도록 한다. 컬럼을 농도가 선형농도 구배로 0∼2M로 변하는 염화나트륨이 첨가된 50mM트리스·HCl(pH 8.5) 및 100mM 2-메르캅토에탄올의 용액으로 용출이 수행되는 고성능 액체 크로마토그래피를 거치게 함으로써 항원을 포함하는 분획을 모은다.

분획을 10mM 인산염 완충액(pH 6.8) 및 10mM 2-메르캅토에탄올의 용액에 대하여 투석한다. 투석된 용액을, 상술한 완충액으로 평형화된 고성능 액체 크로마토그래피용 히드록시아파티트 컬럼을 통과시킴으로써 항원이 충전물질에 흡착되도록 한다. 컬럼을 10∼400mM의 선형농도 구배로 농도가 변하는 인산으로 용출이 수행되는 고속 액체 크로마토그래피를 거치게함으로써 항원을 포함하는 분획을 모은다. 결과로 얻은 분획을 50mM 탄산염 완충액(pH 9.6) 및 0.05% SDS의 용액에 대하여 투석한다.

형질 전환체 JM 109/pE-11-89의 분해물의 원심분리에 의해 수득된 침전물을 10mM 인산염 완충액(pH 5.5)에 현탁시킨다. 현탁액을 1분동안 상술한 초음파처리하고나서 21,000×g에서 15분동안 원심분리한다. 생성된 침전물을 100mM 탄산염 완충액(pH l0.5), 500mM 염화나트륨 및 10mM EDTA의 용액에 현탁시킨다. 생성된 현탁액을 다시 1분동안 초음파 처리한 후 원심분리한다. 생성된 상층액을 30mM 인산염 완충액 및 6M 요소의 용액에 대하여 투석한다. 이어서, 20ml의 투석된 용액을, 상술한 투석에 사용된 것과 동일한 완충액으로 평형화된, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)용 CM 셀룰로오즈 컬럼(22×200mm)을 통과시킴으로써 항원이 충전물질에 흡착되도록 한다. 컬럼을 농도가 성형농도 구배로 0~1.5M로 변하는 염화나트륨이 첨가된 상술한 완충액으로 용출이 수행되는 고성능 액체 크로마토그래피를 거치게 함으로써, 항원을 포함하는 분획을 수득한다. 분획을 50mM 탄산염 완충액(pH 9.6) 및 0.05% SDS를 함유하는 용액에 대하여 투석함으로써 항원을 함유하는 용액을 수득한다.

상기에서 수득한 항원은 비-A, 비-B 간염 비루스의 감염의 임상적 진단을 위한 ELISA를 위한 항원으로서 사용된다. 상술한 정제된 항원 각각의 단백질 농도를 1μg/ml로 조정하고, ELISA에 사용하기 위한 마이크로-여과지 이뮤론 600(Greiner, Co., Ltd., Germany 제조 및 판매)의 각 웰에 100μl의 양으로 넣고, 웰을 4℃에서 하룻밤동안 가만히 방치한다. 각 웰의 내용물을 10mM 인산염 완충액(pH 7.2), 0.8%염화나트륨 및 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS-T 완충액으로 3회 세척하고, PBS-T 완충액으로 희석된 시료 혈청을 100μl/웰의 양으로 가한 후,37℃에서 1시간동안 반응시킨다. 각 웰의 내용들을 PBS-T 완충액으로 3회 세척하고, 10% 소태아 혈청을 함유하는 PBS-T 완충액으로 8000-배 희석된 퍼옥시다아제-표지된 항-인간 IgG 항체(Cappel Co., Ltd., Germany 제조 및 판매)를 100μl/웰의 양으로 가한다. 각 웰의 내용물을 37℃에서 1시간동안 반응시키고, PBS-T 완충액으로 4회 세척한다. 9ml의 0.05M 시트르산-인산염 완충액 및 그에 함유된 0.5μg의 o-페닐렌디아민 및 20μl의 과산화수소수로 구성된 기질 발색제를 10μl/웰의 양으로 가한다. 여과지를 광을 차단하고 실온에서 60분간 가만히 방치한다. 75μl의 4N 황산을 각 웰에 가하고, 490nm에서의 흡광도를 측정한다. 결과를 표 3에 나타낸다. 표로부터 분명한 바와같이, 형질 전환체로부터 유래된 모든 항원은 NANB 간염환자로부터 얻은 혈청과 특이적으로 반응함으로써 형질 전환체에 의해 생산된 항원의 임상적 진단에서의 유용성을 입증한다.

[표3]

각종 형질 전환된 에스케리키아 콜리로부터 얻은 정제된 항원과 NANB 간염 환자로부터 얻은 혈청 사이의 ELISA에서의 반응성

수혈된 간염 환자로부터 얻은 혈청

* 양성시료의 수/검사된 시료의 수

표 3에 나타낸 것과 동일한 결과는 또한 상술한 항원을 사용하는 방사성 면역 측정법에 의해서도 수득될 수 있다. 즉, 직경이 1/4인치인 폴리스티렌구(Pesel Co., Ltd., Germany 제조 및 판매)를 1μg/ml 농도의 상술한 정제된 항원 용액 각 0.2ml에 넣고,4℃에서 하룻밤동안 가만히 방치한다. 그리고나서, 상술한 ELISA에서 사용된 것과 동일한 PBS-T 완충액으로 5회 세척하고, PBS-T 완충액으로 20∼2500배 희석된 시료 혈청을 200μl/구의 양으로 가한다. 37℃에서 60분간 반응을 수행한다. 폴리스티렌구를 PBS-T 완충액으로 5회 세척하고,¹²⁵I-표지된 항-인간 IgG 항체를 200μl/구의 양으로 가한다. 30℃에서 1시간동안 반응을 수행하고 구를 PBS-T 완충액으로 5회 세척한다. 폴리스티렌 구에 결합된¹²⁵I의 cpm을 측정함으로써, 표 3에 나타낸 것과 동일한 결과를 수득한다. 이리하여, NANB 간염 비루스의 감염의 임상적 진단에 있어서 상기에서 수득된 정제된 항원의 유용성이 설명된다.

[응용예 1]

[합성 폴리펩티드의 반응성의 측정]

항체 분자는 항원 분자에 존재하는 "에피토프(epitope)"로 알려진 특이한 영역 구조와 반응함으로써 그들 사이에 결합을 형성한다. 그러한 특이한 영역은 항원 분자의 친수성 영역에서 찾을 수 있다. 그러한 특이한 영역을 갖는 항원 폴리펩티드는 높은 반응 특이성을 가진 가치있는 임상적 진단시약을 쉽게 제조하기에 유용한 것으로 믿어진다. NANBV 에피토프는 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 NANBV 게놈 cDNA에의해 코딩된 아미노산 서열의 소수성/친수성 패턴으로부터 추정된다. 즉, 제 2(1)도에 나타낸 뉴클레오티드번호 333∼422, 제 2(1) 내지 제 2(2)도에 나타낸 뉴클레오티드 변호 474∼563, 제 2(8)도에 나타낸 뉴클레오티드 번호 4485∼4574 및 제 2(10)도에 나타낸 뉴클레오티드 번호 5544∼5633에 의해 코딩된 아미노산 잔기들로 각각 구성된 폴리펩티드 BKP-106-1, BKP-106-2, BKP-102-1 및 BKP-147-1이 제조된다. 제조된 폴리펩티드의 농도를 각각 1μg/ml로 조정하고, 단계 12에서 기술된 것과 같은 방법에 따라 ELISA용 마이크로여과지에 가함으로써 고상(Salid phase)을 형성하고, ELISA법에 의해 그와 NANB 간염 환자로부터 얻은 혈청의 반응성에 대하여 검사한다. 결과를 표 4에 나타낸다. 표로부터 분명한 것처럼, 모든 제조된 폴리펩티드는 NANB 간염 환자로부터 얻은 혈청과 특이적으로 반응함으로써, 상기에 기술한 뉴클레오티드 서열의 임상적 진단에 있어서의 중요성을 나타낸다.

[표 4]

합성 폴리펩티드와 NANB 간염 환자로부터 얻은 혈청의 반응성

더나아가, NANBV의 엔벨로프 단백질의 에피토르를 추정하여, 세가지 타입의 단백질을 제조한다. 즉, 제 2(2)도에 나타낸 뉴클레오티드 번호 906 내지 953, 제 2(2)도에 나타낸 뉴클레오티드 번호 1020 내지 1046및 제 2(2)도 내지 제 2(3)도에 나타낸 뉴클레오티드 번호 1194 내지 1232에 의해 코딩된 단백질들이 제조된다.

이렇게 제조된 모든 폴리펩티드는 NANB 균주의 타입에 따라 항원변이(antigenic voriation)가 일어나는 곳으로 믿어지는 엔벨로프의 영역에 해당하고, ELISA에서 그와 NANB 간염 환자로부터 얻은 혈청의 반응성이 확인된다. 이는 면역학적 검사, 임상적 진단 및 예방접종에 있어서 상술한 단백질의 중요성 및 유용함을 입증한다.

[응용예 2]

[PCR(폴리머라제 사슬 반응)법에 따른 NANBV 핵산의 검출]

수혈에 의해 야기된 NANB 간염을 예방하기 위해서는, 수혈을 위해 공급된 혈액내에 어떠한 NANBV 간염이라도 존재하는지의 여부를 결정하는 것이 중요하다. 더나아가, 간염을 진단하기 위해서는, 간 조직내에 어떠한 NANBV 감염이라도 존재하는지의 여부를 연구하는 것이 임상적으로 극히 중요하다. 본 발명의 NANBV cDNA는 NANB 간염을 검출하기 위해 유용한 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)을 위한 프라이머를생산하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 즉, 단계 1에서 기술된 것과 같이, RNA의 정제 및 cDNA의 제조는 1ml의 혈청으로부터 수행된다. 유사하게, cDNA는 단계 2에서 기술된 것과 같이 간세포로부터 제조된다. 이어서, 단계 4에서 기술된 바와 같이, PCR 및 전기영동을 수행한다. 통상적인 방법에 따라, 증폭된 cDNA가 NANBV로부터 유래된 것인지의 여부를, NANBV cDNA 클론 BK 108로부터 유래된 cDNA로부터 제조된³²P-표지된 탐침을 사용하여 서던 하이브리드화(southern hydridization)에 의하여 조사한다.

결과를 표 5에 나타낸다. 표로부터, 본 발명에 따라 수득된 NANBV cDNA의 뉴클레오티드 서열로부터 제조된 프라이머를 사용함으로써 및 클론화된 NANBV cDNA의 단편을 탐침으로서 사용함으로써 혈청중의 NANBV 핵산이 검출될 수 있고 NANBV에 의한 혈청 감염이 진단될 수 있음이 분명하다.

[표 5]

PCR에 의한 NANBV 핵산의 검출

[실시예 2]

(NANBV 게놈 cDNA의 전코딩 영역의 발현을 위한 플라스미드의 구축 및 이. 콜리내에서 NANBV 게놈 cDNA의 발현)

단계 8 및 9에서 수득된 클론 BK l12, BK 146, BK 147, BK 157 및 BK 166으로부터 cDNA를 단리하고, NANBV 유전자의 전 코딩 영역의 발현을 위한 플라스미드는 하기와 같이 단계 11에서 기술된 방법에따라 제조된다.

클론 BK 157의 플라스미드 DNA를 제한 효소 BamH I으로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동을 거쳐 1.3kb 길이의 DNA 단편을 수득한다. DNA 단편을 플라스미드 pUC 19 BamH I 위치에 삽입함으로써 플라스미드 pBam 157을 수득한다. 플라스미드 pBam 157을 제한 효소 Xba I 및 Nco I으로 소화시킴으로써 약 3.9kb 길이의 DNA 단편을 수득한다. 별도로, 39bp의 올리고뉴클레오티드(3'-말단측으로부터 삭제된 4-뉴클레오티드를 가짐)를 Xba I 링커 서열이 붙어 있는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제의 20bp(TAATACGACTCACTATAGGG)의 프로모터 영역의 서열을 Nco I 링커 서열이 붙어 있는 제 2(1)도에 나타낸 뉴클레오티드 번호 1 내지 73의 서열에 결찰시킴으로써 합성된다. 이렇게 수득된 올리고뉴클레오티드를 상술한 3.9kb의 DNA 단편에 결찰시킴으로써, 플라스미드 pDM-16을 수득한다.

그리고나서, pDM-16을 제한 효소 C1a I 및 EcoR I으로 소화시켜, 약 3.5kb의 DNA 단편을 수득한다. 별도로 클론 BK 146의 DNA를 제한 효소 Cla I 및 EcoR I으로 소화시켜 4.1kb 길이의 DNA 단편을 수득한다.

약 3.5kb의 상술한 DNA 단편을 이렇게 수득한 4.1kb의 DNA 단편에 결찰시켜 플라스미드 pDM-9를 수득한다. 그리고나서, 플라스미드 pDM-9를 SacII로 소화시킴으로써, 2.7kb의 DNA 단편 및 4.9kb의 DNA 단편을 수득한다. 4.9kb의 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제로 그의 SacII 위치에 결찰시키고 나서 BamII 및 EcoR l으로 소화시킴으로써 약 7.5kb의 DNA 단편을 수득한다. 별도로, 클론 BK 147의 DNA를 Bam I 및 EcoR I으로 소화시킴으로써 약 2kb의 DNA 단편을 수득한다. 이렇게 수득된 DNA 단편을 상술한 7.5kb의 DNA 단편에 결찰시킴으로써 플라스미드 pBE 147을 수득한다. 플라스미드 pBE 147을 SacII로 소화시킨다.

pDM-9로부터 유도된 상술한 2.7kb의 DNA 단편을 SacII-소화된 pBE 147에 삽입시킴으로써 플라스미드 pDM-B3을 수득한다. 플라스미드 pDM-B3을 Xba I 및 EcoR I으로 소화시킴으로써 6.7kb의 DNA 단편을 수득한다.

클론 BK 166의 DNA를 BamH I으로 소화시켜 1.3kb의 DNA 단편을 수득한다. 상기 단편을 pUC 19의 BamH I 위치에 삽입시켜 pBam 166을 수득한다. pBam 166을 Nde I 및 HindIII로 소화시킴으로써 2.8kb의 DNA 단편을 수득한다. 클론 BK l12의 DNA를 EcoR I 및 Nde I으로 소화시켜 약 1.6kb의 DNA 단편을 수득한다. pUC 19을 EcoR I 및 HindIII로 소화시켜 약 2.6kb의 DNA 단편을 수득한다. 상술한 세가지 타입의 DNA 단편들을 혼합하고 T4 DNA 러가아제와 반응시켜, 상기 단편들이 그들의 EcoR I 위치, Ned I 위치 및 HindIII 위치에서 함께 결찰된 프라스미드 pEN 112를 수득한다. 플라스미드 pEN 112을 EcoR I 및 Xba I으로 소화시켜 2.7kb의 DNA 단편을 수득한다. pSac 4629를 EcoRI 및 XbaI으로 소화시켜 6.7kb의 단편을 수득한다. 상술한 2.7kb의 단편을 6.7kb의 단편에 결찰시키고, 생성된 결찰된 DNA 단편을 pUC 19의 Xba I 위치에 삽입시킴으로써 플라스미드 pDM-22 및 pDM-18을 수득한다. 플라스미드 pDM-18은 동물세포등을 형질환시켜 세포가 NANBV 항원 폴리펩티드를 생산할 수 있도록 하기 위하여 사용될 수 있다.

형질 전환은 또한 인 비트로 전사 키드(Berlinger Manhein Yamanouchi, Japan 제조 및 판매)로 pDM-18을 전사함으로써 제조된 RNA를 사용하여 수행될 수도 있다.

cDNA 및 pDM-18이 반대방향으로 삽입되어 있는 플라스미드 pDM-22를 HindIII 및 Cla I으로 소화시켜 약 9kb의 DNA 단편을 수득한다.

클론 BK 106의 DNA를 BamH I으로 소화시켜 약 1.0kb의 DNA 단펀을 수득한다. 상기 단편을 플라스미드 pUC 19의 BamII 위치에 삽입시켜 플라스미드 pBam 106을 수득한다. 이렇게 수득된 플라스미드 DNA를 Nco I으로 소화시키고, 접착말단을 망빈 뉴클레아제(Mang Bean nulease, Takara Shuzo Co.,Ltd., 일본, 제조 및 판매)로 블런트 말단으로 만든다. 생성된 플라스미드를 Xba I으로 더 소화시킴으로써 약 3.6kb의 단편을 수득한다. 제 2(1)도에 나타낸 뉴클레오티드 번호 333 내지 372의 서열을 Xba I 링커의 하류에 결찰시킴으로써 제조된 합성 올리고뉴클레오티드를 상기 단편에 결찰시킴으로써 플라스미드 pXb 106을 수득한다. 플라스미드 pXb을 HindIII 및 Cla I으로 소화시켜 0.4kb의 DNA 단편을 수득한다. 상기 단편을 플라스미드 pDM-22로부터 유도된 약 9kb의 상술한 단편에 결찰시킴으로써 플라스미드 pORF-24를 수득한다. 플라스미드 pORF-24를 Xba I으로 소화시켜 약 9.0kb의 DNA 단편을 수득한다. 상기 단편을, T4 RNA 폴리머라제 유전자 프로머터가 결찰되어 있는 발현 벡터(F. William Studier 및 B. A. Moffatt, J. Mol. Biol.,189,113,1986)에 결찰시켜, 발현 플라스미드 pJF-22을 수득한다. 상기 플라스미드 DNA를 사용하여, 단계 6에서와 실질적으로 동일한 방법으로 에스케리키아 콜리 균주 JM109(DE 3)(Promega Co., U.S.A 제조 및 판매)를 형질 전환시킴으로써, 형질 전환체 JM 109(DE 3)/pJF-22를 수득한다.

형질 전환체 이. 콜리 JM 109(DE 3) pJF-22를 실시에 11에 기술된 것과 같은 이후의 방법을 거치게 한다. 즉, 이. 콜리를 LB 배양 배지상에서 배양하고 나서, 0.5mM IPTG를 거기에 가한 후 3시간 동안 더 배양한다. 그 기간 후에 배양된 세포를 수거하고 2% SDS 및 2% 2-메르캅토에탄올을 함유하는 완충액 내에서 100℃로 3분 동안 가열한다.

결과로 얻은 세포를 웨스턴 블롯팅 분석을 거치게 하여, 수득된 단백질을 확인한다. 웨스턴 블롯팅 분석에서는, 단계 11에서 수득된 형질 전환체로부터 제조된 NANB-관련 항원을 정제하고, 이를 사용하여 모르모트를 면역화함으로써 수득된 특이한 항혈청을 사용한다. 웨스턴 블롯팅 분석의 결과로서, 형질 전환체 JM 109(DE 3)/pJF-22에 의해 생성된 단백질이 모든 항 혈청과 반응함이 발견되었다. 이리하여 상기 형질 전환체에서, 코어 단백질을 코딩하는 게놈의 5'-말단 내지 비-구조 단백질 NS5를 코딩하는 게놈의 3'-말단인 NANBV 유전자의 전 코딩 영역의 발현이 달성됨이 증명된다. 상기 결과로부터, 상기 형질 전환체가 NANBV 감염에 대한 진단제 뿐만 아니라 NANBV에 대한 백신을 제조하기에 극히 유용한 항원을 제공할 수 있다는 것은 분명하다.

[실시예 3]

[동물세포 내에서 NANBV 게놈 cDNA의 발현에 의한 NANBV 입자의 생산]

실시예 2에서 수득된 플라스미드 pORF-24를 XbaI으로 특별히 소화시키고 저 융점 아가로스 겔 전기영동을 거치게하여 약 9kb 길이의 DNA 단편을 수득한다. 이렇게 수득된 DNA 단편을 Bal 31로 소화시키고, Xho I 링커를 거기에 결찰시킨다. 링커가 결찰되어 있는 각 DNA 단편을 Nhe I 및 Xho I으로 절단된 플라스미드 pMAM-네오(Clontech, U.S.A 시판)에 각각 삽입시켜 발현 플라스미드를 구축한다. 상기 발현 플라스미드로부터, 합성된 플라이머를 사용한 통상적인 서열화법에 의해 RNA 폴리머라제를 코딩하는 NS 5 영역의 결여를 확인함으로써 NS5 영역을 포함하지 않는 발현 플라스미드 pDEL-NS5를 선택한다. 이렇게 선택된 발현 플라스미드를 인산칼슘법에 의해 인간 간세포 챔 리버(Chan Liver)(ATCC CCL 13)및 침팬지 간세포(Dainippon Pharmaceutical Company, Ltd., Japan으로 부터 구입)의 세포내로 각각 형질 감염시킨다. 도입된 플라스미드 pDEL-NS5를 갖는 간세포를 아미노글리코시드 항생제 G418에 대한 내성을 갖도록 한다. 상기 내성을 표준으로 사용하여, 형질 전환체를 선택한 후, 클로닝한다. 각각의 상기에서 수득된 클론의 세포 배양물에 의해 생산된 폴리펩티드에 관하여, 실시예 2에서 사용된 특이적인 항 혈청을 사용하는 형광 항체 기술에 의해 항원성의 측정을 수행한다. 결과로서, G418 내성 세포 클론에서 생산된 폴리펩티드가 실시예 1의 단계 11에서 수득된 플라스미드 pE-11-89의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드로 면역된 모르모트의 항 혈청을 제외한 모든 항 혈청과 반응한다는 것이 발견되었다. 이 사실은 NS 5 영역을 제외한 NANBV 유전자의 코딩 영역, 즉, 코어 단백질로부터 NS 4까지의 영역의 발현되었음을 의미한다. 더나아가서, 상기 항원 펩티드는 부분적으로 응비하여 비루스-유사 입자, 즉, RNA-결핍 NANBV 입자를 형성한다고 믿어진다.

Claims

제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 이중가닥 뉴클레오티드 서열의 윗줄 서열인 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드 비-A, 비-B 간염 비루스 전 뉴클레오티드 서열중 하기 뉴클레오티드 서열 단편의 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열에 각각 상보적인 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 유전 암호의 도화에 따라 상기 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 데옥시리보 핵산 :

333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

474번째 내지 563번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

및 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열.
제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 이중가닥 뉴클레오티드 서열의 윗줄 서열인 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드 비-A, 비-B 간염 비루스 전 뉴클레오티드 서열중 하기 뉴클레오티드 단편의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원 폴리펩티드:

333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

474번째 내지 563번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 및

333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열.
(a) 제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 이중가닥 뉴클레오티드 서열의 윗줄 서열인 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드 비-A, 비-B 간염비루스 전 뉴클레오티드 서열중 하기 뉴클레오티드 단편의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 유전 암호의 도화에 따라 상기 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 데옥시리보핵산을, 복제가능한 발현 플라스미드 벡터 및 복제가능한 발현 동물 비루스 유전자벡터로부터 선택된 복제가능한 발현 벡터 내로 삽입시켜, 상기 복제가능한 발현 벡터가 복제가능한 발현 플라스미드 벡터인 경우는 데옥시리보핵산이 삽입된 복제가능한 발현 플라스미드 벡터를 포함하는 복제가능한 재조합 DNA 분자를 수득하거나 상기 복제가능한 발현 벡터가 복제가능한 발현 동물 비루스 유전자벡터인 경우는 데옥시리보핵산이 삽입된 복제가능한 발현물 비루스 유전자 벡터를 포함하는 복제 가능한 재조합 비루스 유전자 분자를 수득하고 :

333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

474번째 내지 563번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 및

333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 :

(b) 단계(a)에서 사용된 상기 복제 가능한 발현 벡터가 플라스미드인 경우는, 미생물 또는 진핵생물 세포 배양물의 세포를 상기 재조합 DNA 분자로 형질 감염시켜 형질 전환체를 형성한 후, 상기 형질전환체를 미생물 또는 진핵 생물 세포 배양물의 모세포로부터 선택하고 :

(c) 단계(b)에서 수득된 형질 전환체를 배양함으로써 상기 데옥시리보핵산을 발현시키고 비-A, 비-B 간염 비루스 항원 펩티드를 생산하거나, 단계(a)에서 수득된 재조합 비루스 유전자 분자를 배양함으로써 데옥시리보핵산 및 동물 비루스 유전자를 발현시키고 비-A, 비-B 간염 비루스 항원 펩티드 및 동물 비루스를 생한하고 :

(d) 상기 비-A, 비-B 간염 비루스 항원 펩티드를 단리함을 특징으로 하는 비-A, 비-B 간염 비루스 항원 폴리펩티드의 제조방법.
제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 이중가닥 뉴클레오티드 서열의 윗줄 서열인 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드 비-A, 비-B 간염 비루스 전 뉴클레오티드 서열중 하기 뉴클레오티드 단편의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 유전 암호의 퇴하에 따라 상기 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 뉴클레오티드 서열을 포함하는데옥시리보핵산 및 복제가능한 발현 플라스미드 벡터를 포함함을 특징으로 하는 복제 가능하는 재조합체 DNA 분자 :

333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

474번째 내지 563번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 및

333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열.
제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 이중가닥 뉴클레오티드 서열의 윗줄 서열인 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드 비-A, 비-B 간염 비루스 전 뉴클레오티드 서열중 하기 뉴클레오티드 단편의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 유전 암호의 퇴하에 따라 상기 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 데옥시리보핵산 및 복제가능한 발현 동물 비루스 유전자 벡터를 포함함을 특징으로 하는 복제가능한 재조합 비루스 유전자 분자 :

333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티느 서열,

474번째 내지 563번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1121번째 누클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 및

333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열.
제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 이중가닥 뉴클레오티드 서열의 윗줄 서열인 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드 비-A, 비-B 간염 비루스 전 뉴클레오티드 서열중 하기 뉴클레오티드 단편의 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열에 각각 상보적인 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 유전 암호의 퇴화에 따라 상기 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 데옥시리보핵산을 하이브리드화 또는 폴리머라제 사슬 반응을 위한 유효량을 함유하는, 하이브리드화 또는 폴리머라제 사슬 반응에 의한 비-A, 비-B간염의 검출용 진단시약 :

333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

474번째 내지 563번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴콜례오티드 서열,

906번쌔 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

l020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

2520번째 내지 3350번째 뉴쿨례오티드의 뉴클레오티드 서열,

3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 및

1번째 내지 9416번째 뉴클레오디드의 뉴클레오티드 서열.
제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 이중가닥 뉴클레오티드 서열의 윗줄 서열인 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드 비-A, 비-B 간염 비루스 전 뉴클레오티드 서열중 하기 뉴클레오티드 단편의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코팅된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원 폴리펩티드를 항원-항체 반응을 위한 유효량으로 포함하는, 항원-항체 반응에 의한 비-A, 비-B 간염의 검출용 진단시약 :

333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

474번째 내지 563번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 및

333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열.
제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 이중가닥 뉴클레오티드 서열의 윗줄 서열인 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드 비-A, 비-B 간염 비루스 전 뉴클레오티드 서열중 하기 뉴클레오티드 단편의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원 폴리펩티드의 유효 면역원량 : 및 적어도 1종의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 비-A, 비-B 간염을 위한 백신.

333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

474번째 내지 563번째 뉴클레오티드외 뉴클레오티드 서열,

678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 및

333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열.
제 2(1)도 내지 제 2(16)도에 나타낸 이중가닥 뉴클레오티드 서열의 윗줄 서열인 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드 비-A, 비-B 간염 비루스 전 뉴클레오티드 서열중 하기 뉴클레오티드 단편의 뉴클레오티드 서열 및 하기 뉴클레오티드 단편의 뉴클레오티드 서열에 각각 상보적인 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 유전 암호의 퇴화에 따라 상기 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 데옥시리보핵산을 주형으로서 사용하여 합성된 RNA :

333번째 내지 422번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 677번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

474번째 내지 563번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

678번째 내지 905번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 953번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

906번째 내지 1499번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1046번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1020번째 내지 1121번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1194번째 내지 1232번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1209번째 내지 1322번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

1500번째 내지 2519번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

2520번째 내지 3350번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

3351번째 내지 5177번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

4485번째 내지 4574번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5178번째 내지 5918번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5544번째 내지 5633번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

5919번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

6372번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열,

및 1번째 내지 9416번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열
일본국 미생물 공업기술 연구소에 FERM BP-2971로 기탁되어 있는, 비-A, 비-B 간염 비루스 게놈 cDNA를 가진 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 균주 BK 108.
일본국 미생물 공업기술 연구소에 FERM BP-2972로 기탁되어 있는, 비-A, 비-B 간염 비루스게놈 cDNA를 가진 에스케리키아 콜리 균주 BK 129.
일본국 미생물 공업기술 연구소에 FERM BP-2973로 기탁되어 있는, 비-A, 비-B 간염 비루스게놈 cDNA를 가진 에스케리키아 콜리 균주 BK 138.
일본국 미생물 공업기술 연구소에 FERM BP-2974로 기탁되어 있는, 비-A, 비-B 간염 비루스 게놈 cDNA를 가진 에스케리키아 콜리 균주 BK 153.
일본국 미생물 공업기술 연구소에 FERM BP-2975로 기탁되어 있는, 비-A, 비-B 간염 비루스 게놈 cDNA를 가진 에스케리키아 콜리 균주 BK 166.
일본국 미생물 공업기술 연구소에 FERM BP-2976로 기탁되어 있는, 비-A, 비-B 간염 비루스 게놈 cDNA를 가진 에스케리키아 콜리 균주 BK 172
제 3 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 333번째 내지 9362번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 또는 333번째 내지 6371번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이고, 그에 의하여 비-A, 비-B 감염 비루스로서 완전한 또는 불완전한 비-A, 비-B 간염 비루스 입자를 생산함을 특징으로 하는 방법.
제 16 항의 방법에 의하여 생산된 완전한, 또는 불완전한 비-A, 비-B 간염 비루스 입자.