DE69223562T2

DE69223562T2 - Verfahren und Reagenzien zum Nachweis von Hepatitis C

Info

Publication number: DE69223562T2
Application number: DE69223562T
Authority: DE
Inventors: Robert M Resnick; Karen K Y Young
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1991-08-27
Filing date: 1992-08-19
Publication date: 1998-06-04
Anticipated expiration: 2012-08-20
Also published as: NZ244071A; JP4164098B2; EP0529493B1; JP2006180884A; DE69233083D1; KR100280758B1; US5527669A; FI923840A0; CA2076793A1; HK1027868A1; IL102896A0; NO923341L; JPH0686700A; ATE161291T1; GR3026312T3; AU2121992A; US5580718A; IL102896A; DE69223562D1; CN1071512A

Description

Die vorliegende Erfindung liefert Reagenzien und Verfahren zum Nachweis des Hepatitis-C-Virus, dem verursachenden Prinzip der non-A, non-B-Hepatitis. Die Reagenzien enthalten insbesondere Oligonucleotidprimer sowohl für die reverse Transkription des viralen RNA-Genoms als auch für die nachfolgende Amplifizierung der so erzeugten cDNA mit der Polymerase- Kettenreaktion. Sequenzspezifische Oligonucleotidsonden werden zum Nachweis der amplifizierten HCV-Nucleinsäuresequenzen vorgesehen. Die Primer und Sonden sind geeignet für einen diagnostischen Test zum Nachweis einer HCV-Infektion. Dieser Diagnostiktest hat wichtige Anwendungen sowohl für den klinischen als auch den epidemiologischen Einsatz.
Das Hepatitis C-Virus (HCV) ist eines aus einer unbekannten Anzahl von Mitteln, die für die non-A, non-B-Hepatitis (NANBH) verantwortlich sind. Der prototypische HCV wurde in einem cDNA-Klon eines im Blut vorhandenen NANBH-Virus, der aus dem Plasma eines infizierten Schimpansen erhalten wurde, identifiziert, wie in Choo et al., 1989, Science 244: 359 bis 362 berichtet. Die Nucleotidsequenzen von Genen aus diesem HCV-Prototyp werden in den Europäischen Patentschriften Nr. 318 216, 388 232 und 389 748 beschrieben. Die Nucleotidsequenz des HCV-Genoms wurde in Choo et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451 bis 2455 angegeben und mit verwandten Viren verglichen.
Über Sequenzen aus anderen Stämmen wurde bereits berichtet. Das Genom von HCV weist einen hohen Grad an Nucleinsäuresequenzheterogenität zwischen den Isolaten auf. Die Isolierung von cDNA aus dem HCV-RNA-Genom wurde von Kuboet et al., 1989, Nuc. Acids Res. 17: 10367 bis 10372 berichtet. Die Autoren entwickelten einen Primer für die reverse Transkription auf Basis der von Choo et al., 1989, oben, angegebenen Sequenz. Das Fragment des isolierten HCV-Genoms zeigte 79,8% Homologie mit der Sequenz des HCV-Prototyps. Bei Takeuchi et al., 1990, Gene 91: 287 bis 291 wurde über Sequenzen aus drei verschiedenen Bereichen berichtet, die mit einem ähnlichen Protokoll erhalten wurden. Die Sequenzhomologie mit der Prototypsequenz wurde mit nur 73,5% für einen der Bereiche angegeben.
Über die genomische HCV-Sequenz aus einem Stamm, der bei japanischen Patienten isoliert worden war, wurde bei Kato et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9524 bis 9528 berichtet. Die Sequenz zeigte 77,4% Homologie mit dem Genom des HCV-Prototyps über den verglichenen Bereich. Eine Sequenz für den gesamten codierenden Bereich des HCV-Genoms über die bei Takamizawa et al., 1991, J. Virol. 65 (3): 1105 bis 1113 berichtet wurde, zeigte 77% Homologie mit dem HCV-Prototyp- Stamm.
In Japan wurden zwei Hauptstämme, die mit Stamm K1 und Stamm K2 bezeichnet wurden, beobachtet auf Basis eines Bereichs mit 400 Nucleotiden des Genoms. Diese Stämme haben eine Sequenzhomologie mit der HCV-Prototypsequenz von nur 67% (siehe Enomoto et al., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 170 (3): 1021 bis 1025). Der Stamm K2 könnte weiter in zwei Gruppen unterteilt werden, die mit Ka und Kb bezeichnet werden, mit einer Nucleotidvariation zwischen den Gruppen von etwa 20% und etwa 5% Nucleotidvariation innerhalb jeder Gruppe.
Ahnliche Homologiegrade bei der HCV-Prototypsequenz wurden in Kato et al., 1990, J. Clin. Invest. 86: 1764 bis 1767 berichtet. cDNA-Segmente von 15 Patienten wurden amplifiziert und sequenziert. Der amplifizierte Bereich, 37 Nucleotide entsprechend den Positionen 3525 bis 3561 in der Prototypsequenz, zeigten 68 bis 78% Homologie mit der HCV-Prototypsequenz.
Genomische RNA von HCV kann in Seren nachgewiesen werden, indem cDNA aus der genomischen RNA erzeugt wird, die cDNA mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wird und anschließend mit sequenzspezifischen Oligonucleotiden sondiert wird. Wegen der Sequenzheterogenität unter den HCV-Stämmen, sollten die Primer und Sonden stammspezifisch sein, wenn nicht ein Bereich, in dem die Sequenz bei allen Stämmen konserviert ist, gefunden werden kann. Ein solcher konservierter Bereich befindet sich am 5'-Ende des HCV-Genoms.
Über die 5'-terminale nicht codierende Sequenz des HCV-Genoms wurde zuerst von Okamoto et al., 1990, Japan J. Exp. Med. 60 (3): 167 bis 177 und in EP-A 461 863 berichtet. Ein Vergleich zwischen beiden Stämmen deutet daraufhin, daß die 5'-terminale nicht codierende Sequenz konserviert ist. Daß die 5'- terminale nicht codierende Sequenz des HCV-Genoms konserviert ist, wurde auch von Han et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1711 bis 1715 berichtet. Teilsequenzen eines Bereichs mit 341 Nucleotiden, die aus 11 HCV-Isolaten erhalten wurde, die von einzelnen Personen aus fünf Kontinenten gesammelt wurden, wurden verglichen. Sieben Sequenzen zeigten eine vollständige Homologie mit der Prototypsequenz; die verbleibenden vier zeigten 1 bis 5 Basenfehlpaarungen.
Bei Okamoto et al., 1990, Japan J. Exp. Med. 60 (3): 215 bis 222 wurden Primer für verschiedene Bereiche des HCV-Genoms, einschließlich der konservierten 5'-nicht codierenden Region beschrieben. Die aus konservierten Bereichen ausgewählten Primer amplifizierten Nucleinsäure aus den meisten der getesteten Stämme erfolgreich; Primer, die aus heterogenen Bereichen ausgewählt wurden, amplifizierten Nucleinsäure aus einer kleineren Untergruppe von Stämmen. Jedoch war die Amplifikationseffizienz mit diesen Primern gering. Die Literaturstelle beschreibt eine zweistufige PCR-Amplifizierung; die zweite Runde der Amplifizierung wurde an dem vorher amplifizierten Zielbereich durchgeführt unter Verwendung eines zweiten Satzes von Primern, die mit dem von dem ersten Satz von Primern amplifizierten Bereich verschachtelt sind.
In EP-A 485 209 werden mit dem non-A, non-B-Hepatitis-Virus verwandte Antigene der drei japanischen Isolate von HCV, d.h. HC-J1, HC-J4 und HC-J5 zur verfügung gestellt.
WO-92/03458 liefert eine Teil-Nucleotidsequenz des Genons des Hutch-Stammes von HCV.
GB 2 239 245 liefert die Sequenzinformation über ein weiteres HCV-Isolat.
Über eine PCR-Amplifizierung, die zwei Amplifizierungsrunden erfordert unter Verwendung von zwei Sätzen von Primern, wurde auch von Garson et al., 1990, Lancet 335: 1419 bis 1422 berichtet. Ein Bereich, der ein nichtstrukturelles Protein (NS5) codiert, wurde amplifiziert. Aufgrund der Sequenzheterogenität gibt es HCV-Sequenzen, die von diesen Primern nicht erkannt werden (siehe Garson et al., 1990, Lancet 336: 878 bis 879). Demzufolge wurden Primer in dem konservierten 5'- nicht codierenden Bereich ausprobiert, um aber eine ausreichende Empfindlichkeit zu erhalten, war immer noch eine zweistufige Amplifizierung unter Verwendung von Sätzen von ineinander gesetzten Primern notwendig. Die Amplifizierung des 5'- terminalen Bereichs unter Verwendung einer zweistufigen Amplifizierung mit ineinander verschachtelten Primern wurde auch von Kanai et al., 1990, Lancet 336: 245 berichtet.
Eine Amplifizierung unter Verwendung von zwei Amplifizierungsrunden mit ineinander geschachtelten Primern ist nicht nur ineffizient, sondern steigert die Wahrscheinlichkeit der Kontamination sehr stark. Die Probleme der Kontamination sind im Stand der Technik wohlbekannt; das Öffnen des Reaktionsröhrchens, um zwischen Amplifizierungsstufen Primer zu wechseln und Reagenzien zuzugeben, wird, wenn es irgendmöglich ist, vermieden. Das Kontaminationsproblem wird weiter erschwert durch die Notwendigkeit, die Reaktionsbedingungen zwischen der ersten reversen Transkriptionsstufe und der nachfolgenden PCR-Amplifizierung zu verändern.
Es besteht immer noch ein Bedarf für Primeroligonucleotide, um HCV-Sequenzen zu amplifizieren, die jeweils aus einem konservierten Bereich ausgewählt sind, sodaß alle, oder fast alle Stämme amplifiziert werden und für Amplifizierungsmethoden, die wirksam genug sind, daß die Amplifizierung mit einem Satz von Primern ausreichend ist. Es besteht auch ein Bedarf für Sondenoligonucleotide zum Nachweis der amplifizierten cDNA, die aus einem konservierten Bereich zwischen den zwei konservierten Bereichen, mit denen die Primer hybridisieren, ausgewählt wurde. Es sind ein Reaktionsprotokoll und Reagenzien notwendig, die eine reverse Transkription und PCR mit den gleichen Reagenzien zulassen, wodurch die Notwendigkeit, das Reaktionsröhrchen während des Amplifizierungsverfahrens zu öffnen, vermieden wird.
Außerdem reagieren 10% der NANBH-Fälle nicht mit den Capsidund Hüllantigenen des Prototyps, siehe Chaudhary et al., 1991, J. Clinical Microbiology, 29: 2329 bis 2330 und Hosein et al., 1991, PNAS 8: 3647 bis 3651. Daher wird die Entwicklung von Diagnostika auf PCR-Basis und von Antigenen, die von den neuen Isolaten codiert werden, die Zuverlässigkeit von serologischen Diagnosetests verbessern. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse, indem Primer, Sonden und Verfahren zum Nachweis von HCV bereitgestellt werden.
Die bereitgestellten spezifischen Primer und sequenzspezifischen Oligonucleotidsonden können in einer homogenen reversen Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) verwendet werden, die eine Amplifizierung und den Nachweis viraler RNA- Genomsequenzen zuläßt. Die Effizienz der Amplifizierung unter Verwendung von Primern und Verfahren der vorliegenden Erfindung vermeidet die Notwendigkeit für eine zweite Runde einer PCR-Amplifizierung mit ineinander geschachtelten Primern und die hohe Empfindlichkeit des Tests liefert einen zuverlässigen Nachweis der Nucleinsäure.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft spezifische Oligonucleotidprimer. Die Erfindung liefert Zusammensetzungen, die einen Oligonucleotidprimer zur Amplifizierung einer HCV-Nucleinsäure umfassen, wobei der Primer geeignet ist, um eine Nucleinsäureuntersequenz aus einem HCV-Stamm oder Isotyp, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Japan-, US- und C9- Stämmen, zu amplifizieren. Die bereitgestellten Primer wirken sowohl bei der reversen Transkription des viralen RNA-Genoms als auch der nachfolgenden Amplifizierung der erzeugten cDNA unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion. Die Primer hybridisieren mit Sequenzen aus konservierten Bereichen des HCV-Genoms und binden daher mit einer Vielzahl von Stämmen. Die Effizienz der Amplifizierung unter Verwendung der bereitgestellten Primer ist ausreichend, sodaß eine zweite PCR- Amplifizierungsrunde mit ineinander geschachtelten Primern nicht notwendig ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Sonden, die die Gegenwart von genomischen HCV-Nucleinsäuren unabhängig vom Stamm nachweisen können. Die Sonden sind komplementär zu in allen Stämmen konservierten Bereichen. Diagnostische Tests unter Verwendung der Sonden der vorliegenden Erfindung können eine große Anzahl von HCV-Stämmen nachweisen, ohne die Spezifität zu beeinträchtigen. Somit liefert die Erfindung Zusammensetzungen, die eine Oligonucleotidsonde zum Nachweis der Gegenwart von Nucleinsäuren aus Hepatitis-C-Virus umfassen, wobei die Sonde geeignet ist zum Nachweis der Nucleinsäure eines HCV-Stamms oder einer Variante davon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Japan-, US- und C9-Prototypstämmen.
Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft Kits. Diese Kits liegen in einer Anzahl von Formen vor und können ein oder mehrere Reagenzien für die reverse Transkription, Amplifizierung oder den Nachweis umfassen, z.B. Primer, Sonden, Polymerasen, Glycosylasen, Puffer und Nukleosidtriphosphate.
In einer Ausführungsform liefert die Erfindung einen Kit zum Nachweis einer Nucleinsäure, die für ein C9-Isolat des Hepatitis-Virus spezifisch ist, wobei der Kit ein Abteil umfaßt, das eine Nucleinsäuresonde enthält, die im wesentlichen an eine Nucleinsäureuntersequenz des HCV-C9-Virus bindet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Amplifizierung und zum Nachweis von HCV-RNA.
Zusätzlich betrifft die Erfindung Zusammensetzungen, die eine virale Nucleinsäuresequenz umfassen, die im wesentlichen homolog ist zu SEQ ID. Nr. 29. Ein cDNA-Klon, PHCV-C9, der eine solche virale Sequenz enthält, der hier als C9-Isolat bezeichnet wird, wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer 75265.
Die Erfindung liefert auch Oligonucleotidsonden und Primer zum Nachweis einer Nucleinsäuresequenz, die für das C9-Isolat und verwandte Varianten spezifisch ist. Die Sonden der Erfindung umfassen bevorzugt eine Untersequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
Die Erfindung liefert weiterhin Oligonucleotidprimer zur Amplifizierung von Nucleinsäuresequenzen, die für ein C9-Isolat spezifisch sind. Die Primer der Erfindung zur spezifischen Amplifizierung der C9-Variante und verwandter Isolate umfassen bevorzugt eine Nucleinsäuresequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe von stromaufwärts gerichteten Primern:
zur Verwendung mit einem der folgenden stromabwärts gerichteten Primer:
Die Erfindung liefert auch Sonden, die im wesentlichen mit Sequenzen des C9-Isolats und vorher identifizierter Hepatitis-C-Isolaten binden. Bevorzugte Sonden dieser Kategorie schließen ein:
Die Erfindung liefert weiterhin Sonden zum Nachweis von non-C9-HCV-Sequenzen.
Die Erfindung liefert ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von genomischer Hepatitis-C-Nucleinsäure, wobei die genomische Hepatitis-C-Nucleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Japan-, US- und C9-Protypstämmen, umfassend, daß man
(a) eine Untersequenz der Nucleinsäure amplifiziert;
(b) die amplifizierte Nucleinsäure mit einer Oligonucleotidsonde, die für die Untersequenz spezifisch ist, unter solchen Bedingungen vermischt, daß die Sonde mit der Untersequenz bindet unter Bildung eines stabilen Hybriddoppelstrangs und
(c) Hybride, die zwischen Untersequenz und Sonde gebildet wurden, nachweist.
In einer anderen Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines C9-Isolats des Hepatitis-Virus, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt, daß man:
(a) eine Probe, von der angenommen wird, daß sie eine HCV- C9-Nucleinsäuresequenz enthält, mit einer Nucleinsäuresonde mit einer Untersequenz, die komplementär zu einer HCV-C9-Nucleinsäuresequenz ist, in Kontakt bringt und
(b) die Hybridisierung der Sonde mit der Sequenz nachweist.
Das Verfahren kann weiterhin umfassen, daß vor Stufe (a) die Stufe einer Amplifizierung der Untersequenz der für den Virus spezifischen Sequenz durchgeführt wird. Die Amplifizierung wird bevorzugt unter Verwendung des Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens durchgeführt. Die Primer und Sonden oben werden bevorzugt in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.
Die Erfindung liefert auch Kits zum Nachweis von Nucleinsäuren, die spezifisch für ein C9-Isolat des Hepatitis-Virus sind. Der Kit umfaßt ein Abteil, das eine Nucleinsäuresonde enthält, die Im wesentlichen an eine Nucleinsäureuntersequenz der Nucleinsäuresequenz bindet. Die Sonde wird bevorzugt aus der oben aufgeführten Gruppe ausgewählt.
Andere Testmethoden basieren auf immunologischen Reaktionen, z.B. der Reaktion von Serumantikörpern mit Proteinen oder Virenlysaten aus C9-Isolat oder der Reaktion von Immunglobullnen, die gegen virale Antigene gezüchtet wurden mit einer biologischen Probe, die den Virus enthält. Die Erfindung liefert somit biologisch reine Immunglobuline, die gegen das C9- Isolat gezüchtet wurden. Die Immunglobuline sind bevorzugt monoklonale Antikörper.
Um das Verständnis der Erfindung zu fördern, werden unten verschiedene Ausdrücke definiert.
"Amplifizierungsreaktionsmischung" bezieht sich auf eine wäßrige Lösung, die die verschiedenen Reagenzien enthält, die verwendet werden, um die Zielnucleinsäure zu amplifizieren.
Diese schließen ein: Enzyme, wäßrige Puffer, Salze, die Zielnucleinsäure und Desoxynucleosidtriphosphate. Abhängig von dem jeweiligen Zusammenhang kann die Mischung entweder eine vollständige oder unvollständige Amplifizierungsreaktionsmischung sein.
"Amplifizierungsreaktionssystem" bezieht sich auf jede in- vitro-Einrichtung zur Vervielfältigung von Kopien der Zielsequenz der Nucleinsäure. Solche Methoden schließen die Polymerase-Kettenreaktionsamplifikation (PCR), DNA-Ligase, QB-RNA- Replikase, Amplifizierungssysteme auf Basis einer RNA- Transkription ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Diese beinhalten mehrere Amplifizierungsreagenzien und werden unten genauer beschrieben.
"Amplifizierungsreaktionsröhrchen" bezieht sich auf einen Behälter, der geeignet ist zur Aufnahme der Amplifizierungsreagenzien. Im allgemeinen ist das Röhrchen aus inerten Komponenten aufgebaut, um das zu verwendende Amplifizierungssystem nicht zu hemmen oder zu stören. Wenn das System Temperaturwechsel mit wiederholtem Erwärmen und Abkühlen erfordert, muß das Röhrchen die Wechselverfahren aushalten und typischerweise genau in die Vertiefungen des Temperaturwechslers passen.
"Amplifizierungsreagenzien" bezieht sich auf verschiedene Puffer, Enzyme, Primer, Desoxynucleosidtriphosphate (sowohl übliche als auch nicht übliche) und Primer, die verwendet werden, um das ausgewählte Amplifizierungsverfahren durchzuführen.
"Amplifizieren" oder "Amplifizierung", was sich typischerweise auf einen "exponentiellen" Anstieg der Zielnucleinsäure bezieht, wird hier verwendet, um sowohl einen linearen als auch exponentiellen Anstieg der Zahl der ausgewählten Zielsequenz der Nucleinsäure zu beschreiben.
"Bindet im wesentlichen" bezieht sich auf eine komplementäre Hybridisierung zwischen einem Oligonucleotid und einer Zielsequenz und umfaßt einen geringen Anteil an Fehlpaarungen, die ausgeglichen werden können, indem die Stringenz des Hybridisierungsmediums vermindert wird, um das gewünschte Primen für die PCR-Polymerasen oder den Nachweis des Hybridisierungssignals zu erreichen.
Der Ausdruck "biologisch rein" bezieht sich auf Material, das im wesentlichen frei von Komponenten ist, die es normalerweise begleiten, wenn es sich in nativem Zustand befindet. Z.B. liegen durch Affinität gereinigte Antikörper oder monoklonale Antikörper in einem biologisch gereinigten Zustand vor.
"Hybridisieren" bezieht sich auf die Bindung zweier einzelsträngiger Nucleinsäuren über eine komplementäre Basenpaarung.
"Nucleinsäure" bezieht sich auf ein Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidpolymer entweder in Einzelstrang- oder Doppelstrangform und, wenn nicht in anderer Weise beschränkt, umfaßt es alle bekannten Analoga natürlicher Nucleotide, die auf gleiche Weise wie natürlich vorkommende Nucleotide funktionieren.
"Nucleotidpolymerasen" bezieht sich auf Enzyme, die die Synthese von DNA oder RNA aus Nucleosidtriphosphatvorläufern katalysieren können. In den Amplifizierungsreaktionen der Erfindung sind die Polymerasen matrizenabhängig und typischerweise werden Nucleotide am 3'-Ende des Polymers, das gebildet wird, zugefügt. Es ist am meisten bevorzugt, daß die Polymerase thermostabil ist, wie in den U.S. Patenten Nr. 4 889 818 und 5 079 352 beschrieben.
Der Ausdruck "Oligonucleotid" bezieht sich auf ein Molekül, das zwei oder mehr Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide umfaßt, wie Primer, Sonden, nachzuweisende Nucleinsäurefragmente und Nucleinsäurekontrollen. Die genaue Größe eines Oligonucleotids hängt von vielen Faktoren und der endgültigen Funktion oder der Verwendung des Oligonucleotids ab. Oligonucleotide können mit irgendeiner geeigneten Methode hergestellt werden, einschließlich z.B. durch Klonierung und Restriktion geeigneter Sequenzen und direkte chemische Synthese mit einem Verfahren, wie dem Phosphotriesterverfahren von Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90 bis 99; der Phosphodiestermethode von Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109 bis 151; der Diethylphosphoramiditmethode von Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859 bis 1862 und der Festphasenmethode von U.S. Patent Nr. 4 458 066.
Der Ausdruck "Primer" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das natürlich oder synthetisch sein kann, das als Initiationspunkt für die DNA-Synthese dienen kann unter Bedingungen, unter denen die Synthese eines Primer-Extensionsproduktes, das komplementär zu einem Nucleinsäurestrang ist, induziert wird, d.h. in Gegenwart von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem Mittel für die Polymerisation (d.h. DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase) in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur. Ein Primer ist bevorzugt ein einzelsträngiges Oligodesoxyribonucleotid. Die geeignete Länge eines Primers hängt von der vorgesehenen Verwendung des Primers ab, liegt aber typischerweise in einem Bereich von 15 bis 25 Nucleotiden. Kurze Primer-Moleküle erfordern im allgemeinen kühlere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridkomplexe mit der Matrize zu bilden. Ein Primer muß nicht die genaue Sequenz der Matrize wiedergeben, sondern muß ausreichend komplementär sein, um mit einer Matrize zu hybridisieren.
In den offenbarten Ausführungsformen der Erfindung werden sequenzspezifische Primer und Sonden bereitgestellt. Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß versehen mit diesen Ausführungsformen zusätzliche sequenzspezifische Primer und Sonden hergestellt werden können, z.B. durch Zufügung von Nucleotiden entweder am 5'- oder 3'-Ende, wobei diese Nucleotide komplementär zu der Zielsequenz oder nicht komplementär zu der Zielsequenz sein können. Solange Primerzusammensetzungen als Initiationspunkt zur Extension der Zielsequenzen dienen und solange Primer und Sonden mindestens 14 aufeinanderfolgende Nucleotide umfassen, die innerhalb dieser beispielhaft ausgeführten Ausführungsformen enthalten sind, liegen solche Zusammensetzungen im Schutzbereich der Erfindung.
Der Ausdruck "Primer" kann sich auf mehr als einen Primer beziehen, insbesondere in dem Fall, wo es Unklarheiten bei der Information über ein oder beide Ende(n) des zu amplifizierenden Zielbereiches gibt. Wenn z.B. ein Bereich einen erheblichen Grad an Polymorphismus in einer Population zeigt, können Mischungen von Primern hergestellt werden, die abwechselnde Bereiche amplifizieren. Ein Primer kann, falls erwünscht, markiert werden, indem eine Markierung eingearbeitet wird, die mit einer spektroskopischen, photochemischen, biochemischen, immunochemischen oder chemischen Vorrichtung nachweisbar ist. Z.B. schließen geeignete Markierungen ³²P, fluoreszierende Farbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme (wie sie üblicherweise in einem ELISA verwendet werden), Biotin oder Haptene und Proteine, für die Antiseren oder monoklonale Antikörper verfügbar sind, ein. Eine Markierung kann auch verwendet werden, um den Primer "einzufangen", um die Immobilisierung entweder des Primers oder eines Primer-Extensionsproduktes, wie amplifizierte DNA, an einen festen Träger zu erleichtern.
"Sonde" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das über komplementäre Basenpaarung an eine Untersequenz einer Zielnucleinsäure bindet. Es versteht sich für den Fachmann auf diesem Gebiet, daß Sonden typischerweise im wesentlichen solche Zielsequenzen binden, die nicht vollständig komplementär mit der Sondensequenz sind, abhängig von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen. Die Sonden werden bevorzugt direkt markiert, z.B. mit Isotopen, oder indirekt markiert, z.B. mit Biotin, an das später ein Streptavidinkomplex binden kann. Indem man die Gegenwart oder Abwesenheit der Sonde nachweist, kann man die Gegenwart oder Abwesenheit des Ziels nachweisen.
"Rekombinant" bezieht sich, wenn es für eine Nucleinsäuresonde verwendet wird, auf ein Oligonucleotid, das frei von nativen Proteinen und Nucleinsäuren ist, die typischerweise mit Sonden verbunden sind, die aus der Zelle isoliert wurden, die natürlicherweise die Sondensequenz als Teil ihres nativen Genoms enthält. Rekombinante Sonden schließen solche ein, die mit Amplifizierungsmittelri, wie einer PCR und genetischen Klonierungsmethoden, bei denen Bakterien mit der rekombinanten Sonde transformiert wurden, hergestellt wurden.
Der Ausdruck "reverse Transkriptase" bezieht sich auf ein Enzym, das die Polymerisation von Desoxyribonucleosidphosphaten katalysiert unter Bildung von Primer-Extensionsprodukten, die komplementär zu einer Ribonucleinsäurematrize sind. Das Enzym startet die Synthese am 3'-Ende des Primers und schreitet zum 5'-Ende der Matrize fort, bis die Synthese endet. Beispiele für geeignete Polymerisierungsmittel, die die RNA-Zielsequenz in eine komplementäre, copy-DNA-(cDNA)-Sequenz umwandeln, sind reverse Transkriptase aus dem Vogel-Myeloblastosis-Virus und DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus, eine thermostabile DNA-Polymerase mit einer Aktivität als reverse Transkriptase.
Die Ausdrücke "sequenzspezifisches Oligonucleotid" und "SSO" beziehen sich auf Oligonucleotide, die eine Sequenz aufweisen, die "Hybridisierungsbereich" genannt wird, die exakt komplementär zu der nachzuweisenden Sequenz ist, typischerweise Sequenzen, die für ein spezielles Allel oder eine spezielle Variante charakteristisch sind, wie unter "sequenzspezifischen, stringenten Hybridisierungsbedingungen" nur mit der exakt komplementären Zielsequenz hybridisieren. Ein Vermindern der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen läßt es zu, daß Sequenzfehlpaarungen toleriert werden; der Grad der tolerierten Fehlpaarungen kann kontrolliert werden durch geeignete Einstellung der Hybridisierungsbedingungen. Abhängig von den zu analysierenden Sequenzen können ein oder mehrere sequenzspezifische Oligonucleotide angewendet werden. Die Ausdrücke "Sonde" und "SSO-Sonde" werden austauschbar mit SSO verwendet.
"Sequenzspezifisch für" ein spezielles Virenisolat ist eine Sequenz, die einzigartig für das Isolat ist, d.h. nicht mit vorher gekennzeichneten Isolaten geteilt wird. Eine Sonde, die eine Untersequenz enthält, die komplementär zu einer Sequenz ist, die spezifisch für ein Isolat ist, hybridisiert typischerweise nicht mit dem entsprechenden Anteil des Genoms anderer Isolate unter stringenten Bedingungen (z.B. Waschen des festen Trägers mit 2 x SSC, 0,1% SDS bei 70ºC).
Ein Antigen oder Epitop, das für ein spezielles Isolat spezifisch ist, ist eines, das für das Isolat einzigartig ist und nicht mit anderen bereits charakterisierten Isolaten geteilt wird. Ein Immunglobulin, das gegen das Antigen oder Epitop gezüchtet wird, ergibt keine Kreuzreaktion mit Antigenen von bereits charakterisierten Isolaten in Standardtests, wie ELISA.
Der Ausdruck "im wesentlichen identisch" bedeutet, daß zwei oder mehr Nucleotläsequenzen einen großen Anteil ihrer Sequenz gemeinsam haben. Im allgemeinen ist dies mindestens etwa 90% der Sequenz und bevorzugt etwa 95% der Sequenz. Ein anderer Hinweis, daß Sequenzen im wesentlichen identisch sind, ist, wenn sie mit der gleichen Nucleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1985). Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umständen verschieden. Im allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, daß die Temperatur etwa 5ºC unter dem Wärmeschmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegt. Die Tm ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% der zielsequenz mit einer genau passenden Sonde hybridisiert. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration mindestens etwa 0,2 molar bei pH 7 ist und die Temperatur mindestens etwa 60ºC ist.
"Untersequenz" bezieht sich auf eine Sequenz von Nucleinsäuren, die einen Teil einer längeren Sequenz von Nucleinsäuren umfassen.
Der Ausdruck "Zielbereich" bezieht sich auf einen Bereich einer zu analysierenden Nucleinsäure und kann einen polymorphen Bereich einschließen.
Der Ausdruck "thermostabiles Polymeraseenzym" bezieht sich auf ein Enzym, das relativ stabil gegenüber Wärme ist und die Polymerisation von Nucleosidtriphosphaten katalysiert unter Bildung von Primerextensionsprodukten, die komplementär zu einem der Nucleinsäurestränge der Zielsequenz sind. Das Enzym startet die Synthese am 3'-Ende des Primers und fährt fort hin zum 5'-Ende der Matrize, bis die Synthese endet. Ein gereinigtes thermostabiles Polymeraseenzym wird genauer in U.S. Patent Nr. 4 889 818 beschrieben.
Figur 1 liefert die neue Variante der HCV-Sequenz C9, vier verwandte Varianten und die Japan- und US-HCV-Prototyp-Isolate.
Der Hepatitis-C-Virus ist ein kleiner RNA-Virus, der ein einziges RNA-Molekül mit positiver Richtung von etwa 10 000 Nucleotiden Länge enthält. Das Genom enthält einen einzigen langen offenen Leserahmen, von dem angenommen wird, daß er in ein einziges großes Polyprotein übersetzt und anschließend prozessiert wird. Der offene Leserahmen beginnt bei Nucleotid 343 (unter Verwendung des Numerierungssystems für den Prototyp-Virus) im Anschluß an einen untranslatierten Bereich (UTR). Die 5'-UTR-Sequenz ist relativ konserviert und kann für die virale Replikation und Steuerung wichtig sein. Das 5'-Ende des codierenden Bereiches ist auch konserviert. Bestimmte Primer und Sonden der vorliegenden Erfindung hybridisieren mit dem konservierten Bereich am 5'-Ende des HCV- Genoms.
Die Oligonucleotidsequenzen der hybridisierenden Bereiche der Primer und Sonden der Erfindung sind unten angegeben. Der Fachmann erkennt, daß eine Oligonucleotidsequenz, die als hybridisierender Bereich eines Primers verwendet wird, auch als hybridisierender Bereich einer Sonde verwendet werden kann. Ob eine Primersequenz zur Verwendung als Sonde geeignet ist, hängt von den Hybridisierungseigenschaften des Primers ab. Genauso kann ein Oligonucleotid, das als Sonde verwendet wird, als Primer verwendet werden.
Die in Tabelle 1 gezeigten Oligonucleotide sind Positivesense-(stromaufwärts gerichtete)-Primer oder Sonden. Die Reihenfolge der Auflistung basiert auf der Position des 3'-Endes des Oligonucleotids, wenn es mit genomischer Nucleinsäure hybridisiert wird. Die Oligonucleotide, die am nächsten zu dem 5'-Ende des Genoms hybridisieren, sind zuerst aufgeführt. Tabelle 1
Tabelle 2 führt Oligonucleotide auf, die als Negative-sense- (stromabwärts gerichtete)-Primer oder als Sonden dienen. Es wird die gleiche Reihenfolge, wie in Tabelle 1, verwendet. Tabelle 2
Verschiedene Oligonucleotide haben hybridisierende Bereiche, die so modifiziert sind, daß eine Restriktionsstelle zum 5'- Ende des Moleküls hin enthalten ist. Die Restriktionsstelle wird in das amplifizierte Produkt eingeführt, wenn eines dieser Oligonucleotide als Primer verwendet wird. Die Anfangshybridisierungsbedingungen werden so ausgewählt, daß die Basenfehlpaarungen rund um die Restriktionsstelle toleriert werden. Fehlpaarungen in der Nähe des 5'-Endes werden besser toleriert als solche in der Nähe des 3'-Endes eines Primers. Die Oligonucleotide KY65 (SEQ ID Nr. 1), KY98 (SEQ ID Nr. 3), KY96 (SEQ ID Nr. 4) und KY67 (SEQ ID Nr. 10) sind stromaufwärts gerichtete Primer und enthalten eine HindIII-Stelle. Die Oligonucleotide KY95 (SEQ ID Nr. 20), KY99 (SEQ ID Nr. 26) und KY 68 (SEQ ID Nr. 27) sind stromabwärts gerichtete Primer und enthalten eine EcoRI-Stelle. Der Einbau solcher Restriktionsstellen in das amplifizierte Produkt erleichtert das Klonieren des amplifizierten Produktes.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein neues HCV-Isolat. Die meisten Isolate sind mit einem der beiden Stämme von HCV verwandt. Der erste ist ein US-Prototyp-Stamm, der in den Europäischen Schriften Nr. 318 216, 388 232 und 398 748 beschrieben wird. Der zweite ist ein Japanischer Stamm, der von Kato et al. oben beschrieben wird. Die zwei Stämme unterscheiden sich um bis zu 30% in Bereichen mit wahrscheinlich nicht strukturellen Genen, zeigen aber mehr als 98% Homologie in dem 5'-untransiatierten Bereich und 92% Homologie in dem 5'-Teil des Capsid- oder Kerngens.
Das Isolat der vorliegenden Erfindung, das hier als C9 bezeichnet wird, ist mit den beiden Stämmen weiter verwandt. Dieses neue Isolat ist 93% gleich in der 5'-untranslatierten Konsensusregion. Es hat nur etwa 85% Homologle im 5'-Bereich des Kerngenbereichs sowohl mit dem Prototyp als auch dem Japanischen Stamm (siehe Tabelle 3, unten).
Das C9-(SEQ ID Nr. 29)-Isolat und verwandte Isotypen, R45 (SEQ ID Nr. 31), R43 (SEQ ID Nr. 33), R110 (SEQ ID Nr. 32) und R116 (SEQ ID Nr. 30) (siehe Figur 1) wurden in die RI/HindIII-Restriktionsstellen in pBS(+) kloniert, der von Stratagene erhalten wurde, wie oben beschrieben. Die variierenden Viren wurden kloniert unter Verwendung von gereinigten viralen DNA-Zielsequenzen und PCR-Klonierungsmethoden, wie in U.S. Patent Nr. 4 800 159 beschrieben. Die entstehenden Plasmide wurden in den E. coli-Stamm DG101 (ATCC Hinterlegungsnummer 47043) transformiert.
Nucleotidsequenzen aus der 5'-untranslatierten Sequenz und dem 5'-Ende des Capsidgens des Prototyp-C9-Isolats und von 4 verwandten Isolaten werden in C9 (SEQ ID Nr. 29), R116 (SEQ Nr. 30), R45 (SEQ ID Nr. 31), R110 (SEQ ID Nr. 32) und R43 (SEQ ID Nr. 33) offenbart und unten gezeigt. Die gezeigten Sequenzen enthalten nicht die Primer KY96 (SEQ ID Nr. 4) und KY99 (SEQ ID Nr. 26), die verwendet wurden, um das Klonieren der Virensequenzen zu erleichtern.
Klone, die die Virensequenzen enthalten, wurden bei der American Type Culture Collection, Baltimore, Maryland, wie folgt hinterlegt:
Das Plasmid PHCV-C9 enthält die Sequenz der neuen Variante C9. Die Übereinstimmung der vier verwandten Varianten mit der C9-Sequenz ist in Figur 1 gezeigt&sub0; Die Quelle der Sequenzdaten für die bekannten Isolate war wie folgt: HCV-J1, HCV-J4 (Okamoto et al., 1990, Japan J. Exp. Med. 6(3): 167-177); HCV-J (Kato et al., 1990, Mol. Biol. Med. 7: 495-501); HCV-BK (Takamizawa et al., 1991, J. Virol. 65: 1105-1113) und HCV-1 US-PT (Han et al., 1991, Proc&sub0; Natl. Acad. Sci. USA 88: 1711- 1715). Die Numerierung erfolgt gemäß Kato et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9524-9528.

Tabelle 3

Bestimmung der Homologle der Nucleotid- und Aminosäuresequenz des C9-Isolats mit dem US-Prototyp (PT-HCV) und den Japanischen Isolaten (J-HCV).
Somit liefert die vorliegende Erfindung Materialien und Methoden für Tests, die für das C9-Isolat spezifisch sind und das Isolat von anderen Hepatitisisolaten unterscheiden. In einigen Ausführungsformen basieren die Methoden der Erfindung auf einer Nucleinsäurehybridisierung mit oder ohne die Verwendung von PCR, um die Zielsequenzen zu amplifizieren. In anderen Ausführungsformen werden für die Methoden Immunglobuline verwendet, die spezifisch für das C9-Isolat sind.
Die Oligonucleotidsequenzen der Primer und Sonden, die für C9 spezifisch sind, sind in Tabelle 4 unten angegeben. Tabelle 4
Das Numerierungssystem, das verwendet wurde, um die Nucleotide zu identifizieren, ist das von Kato et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. oben.
Ein Oligonucleotid, KY150 (SEQ ID Nr. 48) ist geeignet zum Nachweis sowohl des C9-Isclats als auch der bisher bekannten HCV-Prototypisolate. Dieses Oligonucleotid hat die folgende Sequenz:
5'-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT-3'.
Es ist für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich, daß jedes stromaufwärts/stromabwärts gerichtete Primerpaar, das in Tabelle 4 gezeigt ist, das C9-Isolat und verwandte Isotypen spezifisch amplifizieren kann. Es ist außerdem auch offensichtlich, daß eine C9-spezifische Sonde ausgewählt werden kann, die für die Hybridisierung der amplifizierten Nucleinsäureuntersequenz geeignet ist, unter Verwendung der in Tabelle 4 angegebenen Nucleotidpositionen als Leitlinie.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Primer zusammen mit einer Amplifizierung mit Polymerasekettenreaktion (PCR) der Zielnucleinsäure verwendet. Da HCV ein RNA-Virus ist, ist die erste Stufe der Amplifizierung die Synthese einer DNA-Kopie (cDNA) des zu amplifizierenden Bereichs. Die reverse Transkription kann als getrennte Stufe durchgeführt werden oder, wie unten beschrieben, in einer homogenen reversen Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT- PCR), einer Modifikation der Polymerasekettenreaktion zur Amplifizierung von RNA.
Obwohl das PCR-Verfahren im Stand der Technik wohlbekannt ist (siehe U.S. Patent Nr. 4 683 195; 4 683 202 und 4 965 188), werden einige allgemeine Informationen zur PCR unten angegeben, aus Gründen der Klarheit und damit diejenigen, die nicht mit dem PCR-Verfahren vertraut sind, die Erfindung ganz verstehen.
Um die Zielnucleinsäuresequenz in einer Probe mit PCR zu amplifizieren, muß die Sequenz für die Komponenten des Amplifizierungssystems zugänglich sein. Im allgemeinen wird diese Zugänglichkeit sichergestellt, indem die Nucleinsäuren aus der Probe isoliert werden. Eine Vielzahl von Techniken zur Extraktion von Ribonucleinsäuren aus biologischen Proben sind im Stand der Technik bekann:, wie z.B. die von Rotbart et al., 1989, in PCR Technology (Erlich ed., Stockton Press, New York) und Han et al., 1987, Biochemistry 26: 1617-1625 beschriebenen. Alternativ muß, wenn die Probe ziemlich leicht zerstörbar ist, die Nucleinsäure nicht vor der Amplifizierung mit der PCR-Technik gereinigt werden, d.h. wenn die Probe aus Zellen besteht, insbesondere peripheren Blutlymphocyten oder Monocyten, kann eine Lyse und Verteilung der intrazellulären Komponenten einfach erreicht werden, indem die Zellen in hypotonischem Puffer suspendiert werden.
Die erste Stufe jedes Zyklus der PCR betrifft die Auftrennung des Nucleinsäuredoppelstrangs. Wenn die Zielnucleinsäure einzelsträngig ist, d.h. einzelsträngige RNA, ist natürlich keine Anfangstrennung während des ersten Zyklus erforderlich. Sobald die Stränge getrennt sind, betrifft die nächste Stufe der PCR die Hybridisierung der getrennten Stränge mit Primern, die die Zielsequenz flankieren. Die Primer werden verlängert, um komplementäre Kopien der Zielstränge zu bilden. Für eine erfolgreiche PCR-Amplifizierung werden die Primer so ausgebildet, daß die Position, an der jeder Primer entlang einer Doppelstrangsequenz hybridisiert, so ist, daß ein Extensionsprodukt, das aus einem Primer synthetisiert wird, wenn es von der Matrize getrennt ist (Komplement), als Matrize für die Verlängerung des anderen Primers dient. Der Zyklus von Denaturierung, Hybridisierung und Extension wird so oft wiederholt, wie notwendig, um die gewünschte Menge an amplifizierter Nucleinsäure zu erhalten.
In der bevorzugten Ausführungsform des PCR-Verfahrens wird die Trennung des Strangs erreicht, indem der Ansatz auf eine ausreichend hohe Temperatur über einen ausreichend langen Zeitraum erhitzt wird, um die Denaturierung des Doppelstrangs, aber keine irreversible Denaturierung der Polymerase (siehe U.S. Patent Nr. 4 965 188) zu verursachen. Eine typische Hitzedenaturierung betrifft Temperaturen in einem Bereich von etwa 80 bis 105ºC über Zeiträume im Bereich von Sekunden bis Minuten. Die Trennung des Strangs kann jedoch mit jedem geeigneten Denaturierungsverfahren erreicht werden, was physikalische, chemische oder enzymatische Mittel einschließt. Die Trennung des Strangs kann durch eine Helicase induziert werden, oder ein Enzym, das eine Helicase-Aktivität aufweist. Z.B. hat das Enzym Reca eine Helicase-Aktivität in Gegenwart von ATP. Die Reaktionsbedingungen, die für die Trennung des Strangs durch Helicasen geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt (siehe Kuhn Hoffman-Berling, 1978, CSH-Quantitative Biology 43: 63-67 und Radding, 1982, Ann. Rev. Genetics 16: 405-436).
Die matrizenabhängige Verlängerung von Primern in der PCR wird katalysiert durch ein Polymerisierungsmittel in Gegenwart von entsprechenden Mengen der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate (typischerweise dATP, dGTP, dCTP und dTTP) in einem Reaktionsmedium, das aus geeigneten Salzen, Metallkationen und pH-Puffersystem aufgebaut ist. Geeignete Polymerisierungsmittel sind Enzyme, von denen bekannt ist, daß sie die matrizenabhängige DNA-Synthese katalysieren. Da Hepatitis C ein RNA-Virus ist, ist die Anfangsmatrize für die Primerextension RNA. Polymerisierungsmittel, die geeignet sind zur Synthese einer komplementären Copy-DNA(cDNA)-Sequenz aus der RNA-Matrize sind reverse Transkriptase (RT), z.B. Vogel- Myeloblastosis-Virus-RT, Moloney-Mäuseleukämie-Virus-RT oder Thermus thermophilus-(Tth)-DNA-Polymerase, eine thermostabile DNA-Polymerase mit einer Aktivität als reverse Transkriptase, die von Perkin Elmer vermarktet wird. Typischerweise wird die genomische RNA/cDNA-Doppelstrangmatrize hitzedenaturiert während der ersten Denaturierungsstufe nach der ersten reversen Transkriptionsstufe, wobei der DNA-Strang als Amplifizierungsmatrize verfügbar bleibt. Geeignete Polymerasen zur Verwendung für eine DNA-Matrize schließen z.B. E.-coli-DNA- Polymerase I oder das Klenow-Fragment, T&sub4;-DNA-Polymerase Tth- Polymerase und Taq-Polymerase, eine wärmestabile DNA-Polymerase, die aus Thermus aquaticus isoliert wird und von Hoffmann-La Roche entwickelt und vertrieben wird und im Handel erhältlich ist von Perkin Elmer, ein. Letzteres Enzym wird vielfach für die Amplifizierung und Sequenzierung von Nucleinsäuren verwendet. Die Reaktionsbedingungen für die Verwendung von Taq-Polymerase sind im Stand der Technik bekannt und werden in Gelfand, 1989, PCR Technology, oben, beschrieben.
Wenn RNA amplifiziert wird, wird eine erste reverse Transkriptions-(RT)-Stufe durchgeführt, um eine DNA-Kopie (cDNA) der RNA zu erzeugen. Die PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 91/09944, veröffentlicht am 11. Juli 1991, beschreibt eine reverse Transkription bei hoher Temperatur mit einer thermostabilen Polymerase, die auch für die PCR-Amplifizierung dient. Eine Hochtemperatur-RT liefert eine höhere Primerspezifität und eine verbesserte Effizienz. In einer "homogenen RT-PCR" genügen die gleichen Primer und die gleiche Polymerase sowohl für die reverse Transkription als auch für die PCR- Amplifizierungsstufen und die Reaktionsbedingungen werden so optimiert, daß beide Reaktionen ohne eine Veränderung der Reagenzien erfolgen. Thermus-thermophilus-DNA-Polymerase, eine thermostabile DNA-Polymerase, die als reverse Transkriptase dienen kann, wird für alle Primerextensionsstufen, unabhängig von der Matrize, verwendet. Beide Verfahren können erfolgen, ohne das Röhrchen zu öffnen, um Reagenzien zu verändem oder zuzugeben; nur das Temperaturprofil wird zwischen dem ersten Zyklus RNA-Matrize) und dem Rest der Amplifizierungszyklen (DNA-Matrize) eingestellt.
Es wird vorhergesagt, daß das 5'-terminale Ende des HCV- Genoms eine signifikante Sekundärstruktur hat, die die reverse Transkription mit einer reversen Transkriptase wie Moloney-Mäuse-Leukämievirus-RT hemmen könnte, indem sie die Primerhybridisierung stört. Unglücklicherweise inaktiviert eine Erhöhung der Reaktlonstemperatur, um diese Sekundärstruktur zu denaturieren, die meisten reverse Transkriptase-Enzyme. Die Verwendung der reverse Transkriptase-Aktivität der rekombinanten Thermus thermophilus-(rTth)-DNA-Polymerase läßt die cDNA-Synthese bei erhöhten Temperaturen ohne Enzyminaktivierung stattfinden. Die Primer der vorliegenden Erfindung bleiben mit der RNA-Matrize bei dieser erhöhten reversen Transkriptions-Temperatur hybridisiert.
Das PCR-Verfahren kann stufenweise durchgeführt werden, wobei nach jeder Stufe neue Reagenzien zugegeben werden, oder in einer solchen Art und Weise, daß alle Reagenzien gleichzeitig zugegeben werden, oder teilweise stufenweise, wobei frische oder verschiedene Reagenzien nach einer gegebenen Anzahl von Stufen zugegeben werden. Wenn z.B. eine Trennung des Strangs durch Wärme induziert wird und die Polymerase wärmeempfindlich ist, dann muß die Polymerase nach jeder Runde einer Strangtrennung zugegeben werden. Wenn jedoch z.B. eine Helicase zur Denaturierung verwendet wird, oder wenn eine thermostabile Polymerase für die Extension verwendet wird, dann können alle Reagenzien anfangs zugegeben werden, oder alternativ, wenn molare Verhältnisse der Reagenzien einen Einfluß auf die Reaktion haben, können die Reagenzien periodisch so, wie sie durch die Synthesereaktion verbraucht werden, wieder aufgefüllt werden.
Der Fachmann auf diesem Gebiet weiß, daß das PCR-Verfahren üblicherweise als automatisiertes Verfahren mit einem thermostabilen Enzym durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren wechselt die Temperatur der Reaktionsmischung über einen Denaturierungsbereich, einen Primerhybridisierungsbereich und einen Extensionsreaktionsbereich. Alternativ können die Hybridisierungs- und Extensionstemperatur gleich sein. Die in den Beispielen beschriebene RT-PCR verwendet einen solchen zweistufigen Temperaturwechsel. Ein Gerät, das spezifisch auf die Verwendung eines thermostabilen Enzyms angepaßt ist, ist im Handel erhältlich.
Der Fachmann auf diesem Gebiet kennt auch die Probleme der Kontamination einer PCR durch amplifizierte Nucleinsäuren aus vorherigen Reaktionen und durch nichtspezifische Amplifizierung. Bei einer Methode, um diese Probleme zu reduzieren, kann jede amplifizierte DNA aus vorherigen Reaktionen enzymatisch abgebaut werden, was die nichtspezifische Amplifizierung vermindert. Die PCR-Amplifizierung wird in Gegenwart von dUTP anstelle von dTTP durchgeführt. Das entstehende doppelsträngige, uracilhaltige Produkt wird dem Abbau durch Uracil- N-glycosylase (UNG) unterworfen, wohingegen normale thyminhaltige DNA nicht durch UNG abgebaut wird. Die Zugabe von UNG zu der Amplifizierungsreaktionsmischung, bevor die Amplifizierung gestartet wird, baut alle uracilhaltige DNA ab, die als Ziel dienen könnte. Da die einzige Quelle für uracilhaltige DNA das amplifizierte Produkt aus einer vorherigen Reaktion ist, sterilisiert diese Methode effektiv die Reaktionsmischung, wodurch das Problem der Kontamination aus vorherigen Reaktionen (carry-over) eliminiert wird. UNG selbst wird zeitweise durch Wärme inaktiviert, sodaß die Denaturierungsstufen in dem Amplifizierungsverfahren auch dazu dienen, die UNG zu inaktivieren. Neue Amplifizierungsprodukte werden daher, obwohl Uracil eingebaut wird, in einer tatsächlich UNG- freien Umgebung gebildet und nicht abgebaut.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung verwendet ein homogenes RT-PCR-Verfahren, das eine Sterilisierungsstufe beinhaltet. Diese Reaktion in einem Röhrchen ohne zusätzliche Zugabe dient dazu, den RT-PCR-Ansatz zu sterilisieren, um eine carry-over-Kontaminierung zu verhindern und ein amplifiziertes nachweisbares PCR-Produkt aus einer Probe, die eine Ziel-RNA enthält, zu liefern. Diese Methode ist in Beispiel 6 ausgeführt.
Obwohl die bevorzugte Ausführungsform die RT-PCR-Amplifizierung beinhaltet, kann die Amplifizierung von Zielsequenzen in einer Probe mit jeder bekannten Methode erreicht werden, z.B. einer Ligasekettenreaktion (LCR), Transkriptionsamplifizierung und einer selbstlaufenden Sequenzreplikation, die jeweils eine ausreichende Amplifizierung liefern, sodaß die Zielsequenz durch Nucleinsäurehybridisierung mit einer SSO- Sonde nachgewiesen werden kann. Alternativ können Methoden, die die Sonde auf nachweisbare Gehalte amplifizieren, verwendet werden, wie die Qβ-Replikase-Amplifizierung. Der Ausdruck "Sonde" beinhaltet die sequenzspezifischen Oligonucleotide, die in den obigen Verfahren verwendet werden; z.B. sind zwei oder mehr Oligonucleotide, die in der LCR verwendet werden, "Sonden" für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, auch wenn einige Ausführungsformen der LCR nur eine Ligierung der Proben erfordern, um die Gegenwart eines Allels zu zeigen.
Eine sequenzspezifische Sondenhybridisierung ist eine wichtige Stufe für eine erfolgreiche Durchführung der vorliegenden Methoden. Die sequenzspezifischen Oligonucleotidsonden der vorliegenden Erfindung hybridisieren spezifisch mit einem speziellen Segment des HCV-Genoms und haben destabilisierende Fehlpaarungen mit Sequenzen aus anderen Organismen. Unter ausreichend stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren die Sonden spezifisch nur mit exakt komplementären Sequenzen. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen kann geschwächt werden, um variierende Anteile von Sequenzfehlpaarungen zu tolerieren. Für den Nachweis des amplifizierten Produktes wird diese sequenzspezifische Hybridisierung verwendet, um sicherzustellen, daß nur die korrekt amplifizierte Zielsequenz nachgewiesen wird, wodurch die Chance für ein falsch positives Signal, das durch die Gegenwart von homologen Sequenzen aus verwandten Organismen verursacht wird, geringer wird.
Die Testmethoden zum Nachweis von zwischen SSO-Sonden und Nucleinsäuresequenzen gebildeten Hybriden können es erforderlich machen, daß die Sonden zusätzliche Merkmale zusätzlich zu der hybridisierenden Region enthalten. Wenn z.B. die Sonde zuerst immobilisiert wird, wie bei der unten beschriebenen Ausführungsform mit "reversem" Dot-Blot, kann die Sonde auch lange Stücke von Poly-dT enthalten, die an einen Nylonträger durch Bestrahlung gebunden werden können, eine Technik, die genauer in der PCT-Patentschrift Nr. 89/11548 beschrieben wird. Bei der Dot-Blot-Ausführungsform wird die immobilisierte Zielsequenz mit Sonden hybridisiert, die eine Verbindung enthalten, die in dem Nachweisverfahren verwendet wird, wie unten diskutiert.
Die erfindungsgemäßen Sonden können unter Verwendung der oben zur Synthese von Oligonucleotiden beschriebenen Techniken synthetisiert und markiert werden. Die Sonde kann am 5'-Ende mit ³²P markiert werden, indem die Sonde mit ³²P-ATP und Kinase inkubiert wird. Eine geeignete nicht radioaktive Markierung für SSO-Sonden ist Meerrettichperoxidase (HRP). Methoden zur Herstellung und zum Nachweis von Sonden, die diese Markierung enthalten, werden in den Beispielen unten und in den U(S. Patenten Nr. 4 914 210 und 4 962 029 beschrieben. Bezüglich weiterer Informationen zur Verwendung solcher markierter Sonden siehe U.S. Patent Nr. 4 789 630; Saiki et al., 1988, N. Eng. J. Med. 319: 537-541 und Bugawan et al., 1988, Bio/Technology 6: 943-9474 Nützliche Chromogene schließen roten Leukofarbstoff und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) ein.
Die erfindungsgemäßen Sonden können verwendet werden, um zu bestimmen, ob virale Sequenzen in einer Probe vorhanden sind, indem bestimmt wird, ob die SSO-Sonden mit viralen Sequenzen, die in der Probe vorhanden sind, binden. Geeignete Testmethoden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von Hybriden, die zwischen SSO-Sonden und Nucleinsäuresequenzen in einer Probe gebildet werden, sind im Stand der Technik bekannt. Z.B. kann der Nachweis erreicht werden unter Verwendung einer Dot-Blot-Ausführungsform, wie in den Beispielen beschrieben. Bei der Dot-Blot-Ausführungsform wird die unmarkierte amplifizierte Probe an einen festen Träger, z.B. eine Membran, gebunden, die Membran mit der markierten Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen inkubiert, die nicht hybridisierte Sonde durch Waschen entfernt und der Filter auf Gegenwart der gebundenen Probe untersucht. Wenn mehrfache Proben mit einer einzigen Sonde analysiert werden, ist die Dot-Blot-Ausführungsform ziemlich nützlich. Viele Proben können an verschiedenen Stellen einer einzigen Membran immobilisiert werden und gleichzeitig hybridisiert werden, indem die Membran in eine Lösung der Sonde eingetaucht wird.
Eine andere Methode, die recht nützlich ist, wenn eine große Anzahl verschiedener Sonden verwendet werden muß, ist eine "reverse" Dot-Blot-Ausführungsform, bei der die amplifizierte Sequenz eine Markierung elithält und die Sonde an den festen Träger gebunden ist. Diese Ausführungsform wäre geeignet, wenn der Test der vorliegenden Erfindung verwendet würde als eine Reihe von gleichzeitig durchzuführenden Tests. Bei dieser Ausführungsform werden die unmarkierten SSO-Sonden an die Membran gebunden und der markierten Probe unter entsprechenden stringenten Hybridisierungsbedingungen ausgesetzt. Die nicht hybridisierte markierte Probe wird dann durch Waschen unter geeigneten stringenten Bedingungen entfernt und der Filter dann auf die Gegenwart von gebundenen Sequenzen untersucht.
Sowohl die vorwärts gerichteten als auch die reversen Dot- Blot-Tests können in geeigneter Weise auf Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Die Sonden können z.B. an Rinderserumalbumin (BSA) gebunden werden, das an der Mikrotiterplatte haftet, wodurch die Sonde immobilisiert wird.
In einem anderen geeigneten Testsystem wird eine markierte Sonde während des PCR-Amplifizierungsverfahrens zugegeben. Jede SSO-Sonde, die mit der Ziel-DNA während jeder Synthesestufe hybridisiert, wird durch die 5'-3'-Exonuclease-Aktivität einer Polymerase, z.B. Taq-Polymerase, abgebaut. Das Abbauprodukt der Sonde wird dann nachgewiesen. So zeigt die Gegenwart des Abbauproduktes, daß die Hybridisierung zwischen der SSO-Sonde und der Ziel-DNA aufgetreten ist.
Die oben bereitgestellten Nucleotidsequenzen sind ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung. Obwohl nur ein Strang der Sequenz gezeigt ist, erkennt der Fachmann auf diesem Gebiet, daß der andere Strang der Sequenz aus der oben dargestellten Information abgeleitet werden kann. Diese Information ermöglicht die Konstruktion anderer Sonden und Primer der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits, Mehrbehältereinheiten, die geeignete Komponenten zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens umfassen. Ein nützlicher Kit kann SSO-Sonden zum Nachweis von Nucleinsäure von Hepatitis-C- Virus enthalten. In einigen Fällen können die SSO-Sonden an einer geeigneten Trägermembran gebunden sein. Der Kit kann auch Primer für RT-PCR enthalten, z.B. Primer, die für die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung geeignet sind. Andere fakultative Komponenten des Kits schließen z.B. reverse Transkriptase oder Polymerase, die Substratnucleosidtriphosphate, Mittel, die zur Markierung verwendet werden (z.B. ein Avidin-Enzymkonjugat und Enzymsubstrat und ein Chromogen, wenn die Markierung Biotion ist) und die geeigneten Puffer für die reverse Transkription, PCR oder Hybridisierungsreaktionen ein. Zusätzlich zu den obigen Komponenten kann der Kit auch Anleitungen zur Durchfuhrung der vorliegenden Methode enthalten.

Beispiel 1

Bei der homogenen RT-PCR dient die gleiche Polymerase sowohl als reverse Transkriptase als auch als DNA-Polymerase. Dadurch kann die anfängliche reverse Transkription der genomischen HCV-RNA und die anschließende Amplifizierung der cDNA im gleichen Röhrchen durchgeführt werden, ohne das Röhrchen zwischen den Stufen zu öffnen, um Reagenzien zu wechseln.
Die Nucleinsäuren wurden aus dem Serum oder Plasma isoliert unter Verwendung des Isoquick -Nucleinsäureextraktionskits von Microprobe. Alle Amplifizierungen erfolgten unter Verwendung eines TC9600 Thermocyclers und von Microamp -Röhrchen, beide von Perkin Elmer, bei einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 µl. Die Reagenzien für jede 20-µl-Reaktion sind in Tabelle 5 unten aufgeführt. Tabelle 5
Der TC9600 wurde so programmiert, daß er das folgende Reaktionstemperaturprofll lieferte. Nach einminütigem Vorerhitzen auf 70ºC wurde das Programm lange genug unterbrochen, um die Reaktionsröhrchen einzusetzen, das Programm wurde erneut gestartet und die Reaktion wurde 15 Minuten lang auf 70ºC gehalten, um die reverse Transkription zuzulassen. Die Reaktionstemperatur wurde dann 1 Minute lang auf 95ºC erhöht, um den RNA-cDNA-Doppelstrang zu denaturieren Als nächstes wurde die Reaktionstemperatur zwei Zyklen mit 15 Sekunden bei 95ºC und 20 Sekunden bei 60ºC unterworfen, woran sich 38 Zyklen mit 15 Sekunden bei 90ºC und 20 Sekunden bei 60ºC anschlossen. Schließlich wurde die Temperatur 4 Minuten lang auf 60ºC gehalten für die endgültige Extensionsstufe, auf 15ºC gekühlt und auf dieser Temperatur gehalten, bis die Analyse der amplifizierten Probe durchgeführt werden konnte.

Beispiel 2

Unter Verwendung der Dot-Blot-Nachweismethode, wird ein kleiner Anteil der amplfizierten DNA denaturiert und auf ein Nylonfilter aufgetragen, das dann mit einer markierten Sonde hybridisiert wird. Der hybridisierende Bereich der Sonde ist KY88 (SEQ ID Nr. 12) und die Sonde ist radioaktiv markiert mit ³²P. Alternativ kann die Sonde kovalent mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert sein, um ein Mittel für den nicht isotopischen Nachweis in Gegenwart eines chromogenen oder chemilumineszierenden Substrats zu liefern.
Die Amplifizierungsreaktion wird im allgemeinen durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das mit der PCR amplifizierte Produkt wird dann denaturiert durch Behandlung mit Alkali. Zu 5 µl PCR-Produkt werden 5 µl 0,5 M EDTA, pH 8,0, 8 µl 5 n NaOH und 82 µl H&sub2;O zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 10 Minuten lang stehengelassen, um die Denaturierung zu vollenden.
BioDyne -B-Nylonfilter (Pall Corp., Glen Cove, NY, USA) werden vorbereitet, indem sie 5 bis 10 Minuten lang in H&sub2;O eingeweicht werden und weiter mit 200 µl H&sub2;O gespült werden, nachdem der Dot-Blot-Verteiler (Bio-Dot von Biorad, Richmond, CA, USA) eingestellt worden ist. Nach der Denaturierung werden 100 µl der Probenmischung im Vakuum auf die Nylonmembran unter Verwendung der Dot-Blot-Vorrichtung aufgetragen. Jeder Napf wird dann mit 200 µl 0,4 n NaOH gespült und der gesamte Filter wird kurz mit 2X SSC gespült und an der Luft getrocknet, bis keine Flüssigkeitsansammlungen mehr da sind. Die DNA wird immobilisiert und mit dem Nylonfilter vernetzt durch Ultraviolett-Bestrahlung mit einer Induktion von 1200 mJ/cm² mit einer Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA, USA)-UV-Lichtbox ("Autovernetzungs"-Einstellung).
Die Filter werden "prähybridisiert", indem sie in dem Hybridisierungspuffer (5X SSPE, 5X Denhardt's Lösung, 0,1% SDS, 50 µg/ml Heringssperma-DNA) in heißsiegelfähigen Beuteln mit 50ºC (Luftschüttler) mindestens 30 Minuten lang eingeweicht werden. Der Puffer wird dann durch eine gleiche Menge der gleichen Lösung, die 1 bis 2 x 10&sup5; cpm/ml Sonde enthält, ersetzt und der Filter wird 2 Stunden lang bis über Nacht bei 50ºC hybridisieren gelassen.
Nach der Hybridisierung werden die Filter dreimal mit 2X SSPE/0,1% SDS, zweimal 20 Minuten bei Raumtemperatur und dann einmal 20 Minuten lang bei der hohen Stringenztemperatur von 60ºC gewaschen. Die Filter werden dann trockengeblottet, in Plastikfolie eingeschlagen und einem Röntgenfilm bei -70ºC mit ein oder zwei intensivierenden Schirmen ausgesetzt.
Ein anderes Verfahren zur Sichtbarmachung besteht darin, mit mit Meerrettichperoxidase konjugierten Oligonucleotidsonden zu hybridisieren, die hergestellt wurden, wie von Levenson und Chang, 1989, in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds., Academic Press, San Diego), Seiten 92-112 und Saiki et al., 1988, N. Eng. J. Med. 319: 537-541, beschrieben, die jeweils hier durch Bezugnahme eingeschlossen werden. Die Hybridisierung wird mit 2 pmol HRP- SSO-Sonde pro 5 ml Hybridisierungslösung durchgeführt.
Nach dem Waschen werden die mit einem chromogenen Farbsubstrat zu entwickelnden Filter in 100 mM Natriumcitrat, pH 5,0, gespült, dann in 100 mM Natriumcitrat, pH 5,0, das 0,1 mg/ml 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin pro ml (Fluka) und 0,0015% Wasserstoffperoxid enthält, gelegt und bei vorsichtiger Bewegung 10 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die entwickelten Filter werden mit Wasser gespült und sofort fotografiert. Das TMB-Nachweissystem wird hergestellt und verwendet, im wesentlichen wie in dem von Perkin Elmer vertriebenen AmpliType -DQαDNA-Typisierungskit beschrieben. In einer anderen Ausführungsform werden die Filter entwickelt mit dem Chemilumineszenzdetektionssystem (ECL; Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Die Filter werden 5 Minuten lang mit PBS gespült und 1 Minute lang bei vorsichtiger Bewegung in die ECL-Lösung gelegt. Die Filter werden dann bei Raumtemperatur einem Röntgenfilm 1 bis 5 Minuten lang ausgesetzt.

Beispiel 3

In dieser Ausführungsform der Erfindung wird die reverse Dot- Blot-Ausführungsform verwendet. Die Hybridisierungsregion der Sonde ist KY88 (SEQ ID Nr. 12), KYISO (SEQ ID Nr. 43) oder MY160 (SEQ ID Nr. 37) und die Sonde wird an eine Membran gebunden. Die amplifizierte Ziel-DNA wird mit der membrangebundenen Sonde hybridisiert, wie in Saiki et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 6230-6234 und dem Produktbeiblatt des von Perkin Elmer vertriebenen AmpliType DQalpha-DNA-Typisierungskits beschrieben. Die Amplifizierungsprimer sind biotinyliert, wie von Levenson und Chang, 1989, oben, beschrieben, sodaß jede amplifizierte DNA, die mit den membrangebundenen Sonden hybridisiert, leicht nachgewiesen werden kann.
In einer Ausführungsform wird der Nachweis durchgeführt, indem mit Streptavidin konjugierte Meerrettichperoxidase (SA- HRP) mit jeglicher biotinylierter, amplifizierter DNA, die mit der membrangebundenen Sonde hybridisiert ist, umgesetzt wird. Die HRP wird durch die SA-Biotin-Wechselwirkung an die amplifizierte DNA gebunden und kann verwendet werden, um ein Signal zu erzeugen durch eine Vielzahl von wohlbekannten Mitteln, z.B. die Erzeugung einer gefärbten Verbindung durch Oxidation von Tetramethylbenzidin (siehe U.S. Patent Nr. 4 789 630).
Obwohl die Sonde an der Membran mit irgendeinem Mittel gebunden werden kann, betriff eine bevorzugte Methode die "Schwanzbildung" der hybridlsierenden Region der Sonde mit einer viel längeren Sequenz von Poly-dT. Der entstehende Poly-dT-"Schwanz" kann dann mit Amingruppen auf einer Nylonmembran umgesetzt werden, um die Sonde kovalent an die Membran zu binden. Diese Reaktion kann durch UV-Bestrahlung erleichtert werden.
Terminale Desoxyribonucleotidyltransferase (TdT, Ratcliff Biochemicals; bezüglich der Reaktionen unten wird von einer Konzentration von etwa 120 Einheiten/µl ausgegangen, was 100 pmol/µl entspricht) kann verwendet werden, um einen Poly-dT- Schwanz an einer Sonde zu erzeugen, obwohl man auch die mit Schwanz versehene Sonde in einem im Handel erhältlichen DNA- Syntheseautomaten synthetisleren kann. Wenn man einen DNA- Syntheseautomaten verwendet, um die mit Schwanz versehene Sonde herzustellen, sollte an jedoch den Schwanz an das 5'- Ende der Sonde bringen, sodaß ein unerwünschter vorzeitiger Kettenabbruch nur in der Schwanzregion auftritt.
TdT-Reaktionen sollten in einem Volumen von etwa 100 µl durchgeführt werden, die 1X TdT-Salze, 200 pmol Oligonucleotid, 800 µM DTT und 60 Einheiten TdT enthalten. 10X TdT-Salze sind 1000 mM K-Cacodylat, 10 mM CoCl&sub2;, 2 mM Dithiothreitol, 250 mM Tris-Cl, pH 7,6 und werden hergestellt, wie von Roychoudhury und Wu, Meth. Enzymol. 65: 43-62 beschrieben. Eine 10X Vorratslösung von 8 mM dTTP kann der Einfachheit halber hergestellt werden (neutralisiert mit NaOH auf pH 7).
Die TdT-Reaktion sollte bei 37ºC 2 Stunden lang durchgeführt werden und dann durch Zugabe von 100 µl 10 mM EDTA, pH 8, gestoppt werden. Die Endkonzentration der mit Schwanz versehenen Oligonucleotide ist 1 µM (1 pmol/µl) und die Länge des Homopolymerschwanzes ist etwa 400 Reste. Die Schwanzlänge kann verändert werden, indem der molare Anteil von dTTP- Oligonucleotid eingestellt wird. Die mit Schwanz versehenen Sonden können bei -20ºC bis zu ihrer Verwendung aufbewahrt werden.
Die für die reverse Dot-Blot-Ausführungsform bevorzugte Nylonmembran ist Biodyne -B-Nylonmembran, Porengröße 0,45 µm, hergestellt von Pall und auch von ICN als BioTrans - Nylonmembran vertrieben. Die Sonden können auf die Membran sehr einfach mit der Bio-Dot -Dot-Blot-Vorrichtung, die von Biorad hergestellt wird, aufgetupft werden. Jede Sonde wird auf einen einzigen diskreten Ort auf der Membran aufgetupft. Etwa 2 bis 10 pmol jeder mit Schwanz versehenen Sonde wird mit 50 bis 100 µl TE-Puffer vor dem Auftragen auf die Dot- Blot-Vorrichtung, vorgemischt. Nach dem Dot-Blotting wird die Membran kurz auf ein absorbierendes Papier gelegt, um überschüssige Flüssigkeit abzuziehen. Die Membran wird dann in eine UV-Lichtbox gelegt, z.B. die von Stratagene hergestellte Stratalinker -Lichtbox und 50 bis 60 mJ/cm² Flux bei 254 nm ausgesetzt, um die mit Schwanz versehene Sonde an der Nylonmembran zu befestigen. Nach einem kurzen Spülen etwa 15 Minuten in Hybridisierungslösung, um nicht gebundene Sonde zu entfernen, ist die Membran dann fertig für die Hybridisierung mit dem biotinylierten PCR-Produkt.
Amplifizierte PCR-Produkte werden durch 3- bis 10-minütiges Erwärmen auf 95ºC denaturiert und 40 µl des denaturierten PCR-Produktes werden dann jeder Sondenreihe zur Hybridislerung zugegeben. Die Hybridisierung wird bei 57ºC 20 Minuten lang in einem Schüttelwasserbad in einem Hybridisierungspuffer durchgeführt, der aus 0,5X SSPE, 0,25% SDS und 5X Denhardt's Lösung (20X SSPE enthält 0,02 M EDTA, 0,2 M NaH&sub2;PO&sub4;, 3,6 M NaCl, 0,11 M NaOH, eingestellt auf pH 7,4) besteht. Der Hybridisierungspuffer wird durch 3 ml einer Lösung, die aus 25 µl SA-HRP in 3,1 ml Hybrldisierungspuffer besteht, ersetzt und 20 Minuten bei 57ºC in einem Schüttelwasserbad inkubiert.
Das Waschen wird mit einem Waschpuffer mit 2X SSPE und 0,1% SDS durchgeführt. Nach kurzem Spülen der Membran in 10 ml Waschpuffer, erfolgt 12 Minuten lang ein stringentes Waschen in 10 ml Puffer bei 57ºC. Dann wird weitere 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen und anschließend 5 Minuten lang in 10 ml 0,1 M Natriumcitrat, pH 5,0, gewaschen.
Die Bindung des Chromogens wird in 5 ml Chromogenlösung, die aus 5 ml 0,1 M Natriumcitrat, 5 µl 3% Wasserstoffperoxid und 0,25 ml Chromogen (TMB von Perkin Elmer) besteht, 25 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Es wird dreimal je 10 Minuten lang mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gewaschen. Ein 30-minütlges Nachwaschen mit 1X PBS bei Raumtemperatur kann die Signalqualität verbessern. Während dieser Stufen, die das Chromogen betreffen, sollte die Membran durch eine Aluminiumfolienbeschichtung vor Licht geschützt werden. Die entwickelte Membran sollte für die permanente Aufzeichnung fotografiert werden.

Beispiel 4

In dieser Ausführungsform der Erfindung werden Mikrotiterplatten verwendet. Die Sonde wird an einem Napf einer Mikrotiterplatte befestigt. Die amplfizierte Ziel-DNA wird mit der gebundenen Sonde, wie oben beschrieben, hybridisiert. Wie im vorherigen Beispiel werden die Amplifizierungsprimer biotinyliert, um den Nachweis von amplifizierter DNA, die mit den gebundenen Sonden hybridisiert, zuzulassen.
Die gewünschten mit BSA konjugierten Sonden werden zuerst an der Kunststoffoberfläche der einzelnen Näpfe adsorbieren gelassen. Die Näpfe werden dann mit Protein, z.B. Rinderserumalbumin, blockiert. Bevorzugt werden 96-Napf-Platten, die von Corning erhältlich sind, verwendet.
Sobald die Amplifizierung abgeschlossen ist, werden die PCR- Röhrchen aus dem Temperaturwechsler (erhältlich von Perkin Elmer) entnommen. 100 µl Denaturierungslösung werden zu jedem PCR-Röhrchen zugegeben. Für jedes Röhrchen wird eine neue Pipettenspitze verwendet. In einer Ausführungsform kann der Nachweis nicht sofort durchgeführt werden. In diesem Fall werden die PCR-Röhrchen über Nacht bei 2 bis 8ºC aufbewahrt. Denaturierte Amplifizierungsansätze werden bei einer Aufbewahrung bei 2 bis 8ºC viskos. Die Röhrchen werden kurz auf 25 bis 30ºC erwärmt, bevor die Röhrchen geöffnet werden, um das Pipettieren einfach zu machen.
Die geeignete Anzahl von Mikrotiterplattenstreifen mit 8 Näpfen (minimal 2 Streifen) wurde entnommen und in den Mikrotiterplattenrahmen eingesetzt. 100 µl Hybridisierungspuffer wurden in jeden Napf der Mikrotiterplatte pipettiert.
Die Denaturierungslösung enthält 0,4 M NaOH; 80 mM EDTA und 0,005% Thymolblau. Der Hybridisierungs/Neutralisierungspuffer enthält: 2,5 M NaSCN; 80 mM NaH&sub2;PO&sub4;; 10 mM NaH&sub2;PO&sub4; und 0,125% Tween -20. Vor der Verwendung wird der pH auf 5,0 ± 0,2 kontrolliert.
Unter Verwendung von mit Stöpseln versehenen Spitzen einer Mehrkanalpipette wurden 25 µl des denaturierten Amplifizierungsansatzes aus jedem PCR-Röhrchen auf dem Tablett in die entsprechende Napfposition der Mikrotiterplatte pipettiert. Die Platte wurde mit dem Mikrotiterplattendeckel bedeckt und vorsichtig zehn- bis fünfzehnmal an die Seite geklopft. Näpfe, bei denen das Pipettieren des Reagenzes richtig erfolgt ist, verfärben sich hellgelb. Wenn keine oder nur eine Abänderung zu Blau festgestellt wurde, wurde überschüssiges Amplicon zugegeben. Der Test wird fortgesetzt, wenn positive OD-Werte sich erhöhen, aber negative OD-Werte nicht beeinflußt werden. Die Platte wurde 60 Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die Platte fünfmal mit Waschlösung gewaschen. Das Waschen der Platte wurde manuell durchgeführt oder mit einem automatisierten Mikrotiterplattenwäscher, der entsprechend programmiert war. Für das Waschen wurde 1X PCR- Waschpuffer verwendet. Ein 10X Konzentrat von PCR-Waschpuffer wurde wie folgt hergestellt: 9,94 g/l dibasisches Natriumphosphat, 4,41 g/l Natriumphosphat (monobasisch), 3,722 g/l EDTA, 87,66 g/l Natriumchlorid, 13,7 g/l Tween 20 und 10 g/l Proclin 300 (Rohm und Haas, Philadelphia, PA). Der pH der Lösung wird mit Phosphorsäure eingestellt (pH 6,5 bis 7,1 ist bevorzugt).
Für das manuelle Waschen des Inhalts wurde die Platte geleert und trockengetupft. 300 µl Waschlösung wurden zu jedem Napf in der Platte, der getestet werden sollte, zugegeben und die Platte wurde 15 bis 30 Sekunden lang trocknen gelassen. Die Platte wurde wiederum geleert und trockengetupft. Dieses Waschverfahren wurde vier weitere Male wiederholt.
Bei einem automatisierten Mikrotiterplattenwäscher wurde folgendes Verfahren verwendet. Der Inhalt der Näpfe wurde abgesaugt. Der Wäscher war darauf programmiert, 350 µl Arbeitswaschlösung in jeden Napf der zu testenden Platte zuzugeben und 30 Sekunden einzuweichen und abzusaugen. Die Stufen wurden vier weitere Male wiederholt. Die Platte wurde dann trokkengetupft.
100 µl Konjugat wurden jedem zu testenden Napf in der Platte zugegeben. Das Avidin-HRP-Konjugat wird wie folgt hergestellt. Das Verdünnungsmittel enthält 0,1 molar 0,25% Emulsit 25 (DKS International, Inc., Tokio, Japan); 1,0% Kathon CG (Rohm und Haas, Philadelphia, PA); 0,1% Phenol; 1,0% Rindergammaglobulin. Die Lösung wurde auf einen pH von 7,3 mit konzentrierter HCl eingestellt. Zu diesem Verdünnungsmittel wurde 10 nM konjugiertes Avidin zugegeben (Vector Labs, Burlingame, CA). Die Platte wurde dann abgedeckt und 50 Minuten bei 37ºC inkubiert und wieder wie oben gewaschen. Das Arbeitssubstrat wurde hergestellt, indem 2,0 ml Substrat A und 0,5 ml Substrat B jeweils für 2 Mikrotiterplattenstreifen mit 8 Näpfen (16 Tests) vermischt wurden. Substrat A enthält 3 mM Wasserstoffperoxid, 6,5 mM Citrat und 0,1% Kathon CG. Substrat B enthält 4,2 mM 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und 40% Dimethylformamid. Das Arbeitssubstrat wurde nicht mehr als 3 Stunden vor der Verwendung hergestellt und vor direktem Sonnenlicht geschützt aufbewahrt.
100 µl Arbeitssubstrat (Mischung Substrat A und B) wurde zu jedem zu testenden Napf der Platte zugegeben. Die Platte wurde dann abgedeckt und im Dunkeln 10 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 25ºC) inkubiert. 100 µl Stopreagenz (5% H&sub2;SO&sub4;) wurden jedem zu testenden Napf zugegeben. Die Absorption jedes Napfs mit 450 mM wurde innerhalb einer Stunde nach Zugabe des Stopreagenzes abgelesen. Der Absorptionswert wurde für die Probe und die Kontrolle aufgezeichnet.

Beispiel 5

Die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung liefern zahlreiche Kombinationen von Primern und Sonden, die für die Amplifizierung von genomischen HCV-Sequenzen und zum Nachweis des amplifizierten Produktes verwendet werden können. Eine große Anzahl von Oligonucleotiden wurde bezüglich ihrer Effektivität als Primer in einer RT-PCR-Amplifizierung getestet.
Die PCR-Amplifizierungsreaktionen wurden mit verschiedenen Paaren von Oligonucleotiden unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methoden durchgeführt. Das amplifizierte Produkt wurde mit Standardmethoden der Agarosegel-Elektrophoresetrennung und Färbung nachgewiesen (siehe Sambrook et al., oben). Jeder der stromaufwärts gerichteten Primer KY65 (SEQ ID Nr. 1) und KY98 (SEQ ID Nr. 3) funktionierte effektiv mit jedem der stromabwärts gerichteten Primer KY68 (SEQ ID Nr. 27), KY95 (SEQ ID Nr. 20) und KY99 (SEQ ID Nr. 26) bei der Amplifizierung von HCV-S quenzen. KY67 (SEQ ID Nr. 10) funktionierte effektiv sowohl mit KY68 (SEQ ID Nr. 27) als auch KY99 (SEQ ID Nr. 26). Jeder der stromaufwärts gerichteten Primer KYBO (SEQ ID Nr. 5), KY83 (SEQ ID Nr. 7), KY84 (SEQ ID Nr. 8), KY85 (SEQ ID Nr. 9) und KY144 (SEQ ID Nr. 6) funktionierte effektiv mit jedem der stromabwärts gerichteten Primer KY78 (SEQ ID Nr. 18), KY95 (SEQ ID Nr. 20), KY145 (SEQ ID Nr. 19), KY148 (SEQ ID Nr. 17) und KY149 (SEQ ID Nr. 16). Schließlich funktionierte jeder der stromaufwärts gerichteten Primer KY80 (SEQ ID Nr. 5) und KY81 (SEQ ID Nr. 11) effektiv mit KY100 (SEQ ID Nr. 21).
Das Amplifizierungsprodukt der PCR-Amplifizierung unter Verwendung von KY78 (SEQ ID Nr. 18) und KYBO (SEQ ID Nr. 5) als Primer wurde nachgewiesen jeweils durch Sondierung mit KY88 (SEQ ID Nr. 12), KY84 (SEQ ID Nr. 8) und KY85 (SEQ ID Nr. 9) unter Verwendung der in Beispiel 2 oben beschriebenen Methoden.
Die Primer KY153 (SEQ ID Nr. 15), KY149 (SEQ ID Nr. 16) und KY148 (SEQ ID Nr. 17) können nicht mit irgendeinem der stromaufwärts gerichteten Primer, die stromabwärts von KY85 sind, verwendet werden. Das 3'-Ende von KY78 (SEQ ID Nr. 18) ist dem 3'-Ende von KY88 (SEQ ID Nr. 12) benachbart, sodaß obwohl diese zwei Primer als ein Primerpaar funktionieren könnten, das Fehlen irgendeiner dazwischenliegenden Sequenz ein unabhängiges Sondieren unmöglich macht. Der Primer KY86 (SEQ ID Nr. 13) kann nur mit KYLOO (SEQ ID Nr. 21), KY99 (SEQ ID Nr. 26), KY1O9 (SEQ ID Nr. 24) und KYILI (SEQ ID Nr. 25) gepaart werden. Der Primer KY87 (SEQ ID Nr. 14) kann nur mit KY99 (SEQ ID Nr. 26), KY109 (SEQ ID Nr. 24) und KY111 (SEQ ID Nr. 25) gepaart werden.
KY84 (SEQ ID Nr. 8), KY85 (SEQ ID Nr. 9), KY87 (SEQ ID Nr. 14) und KY148 (SEQ ID Nr. 17), die oben diskutiert wurden, sind geeignet zum Nachweis von anderen bekannten HCV-Isolaten außer dem C9-Isolat. Die Sonden und Primer, die in Tabelle 4 offenbart werden, sind spezifisch zum Amplifizieren und Nachweisen von HCV-C9 und verwandten Varianten und zum Ausschluß von japanischen und amerikanischen HCV-Prototypen.
Primer, um spezifisch japanische und amerikanische HCV- Prototypen und nicht HCV-C9 zu amplifizieren, sind beispielsweise KY84 (SEQ ID Nr. 8), KY85 (SEQ ID Nr. 9), KY148 (SEQ ID Nr. 17) und KY87 (SEQ ID Nr. 14). Primer, um japanische, US- amerikanische und C9-HCV-Prototypen zu amplifizieren, schließen KY67 (SEQ ID Nr. 10), KY78 (SEQ ID Nr. 18), KYBO (SEQ ID Nr. 5), KY81 (SEQ ID Nr. 11), KY83 (SEQ ID Nr. 7), KY86 (SEQ ID Nr. 13), KY88 (SEQ ID Nr. 12), KY95 (SEQ ID Nr. 20), KY100 (SEQ ID Nr. 21), KY144 (SEQ ID Nr. 6), KY145 (SEQ ID Nr. 19) und KY153 (SEQ ID Nr. 15) ein. Die Primer KY65 (SEQ ID Nr. 1), KY68 (SEQ ID Nr. 27), KY98 (SEQ ID Nr. 3), KY99 (SEQ ID Nr. 26), KY109 (SEQ ID Nr. 24), KY111 (SEQ ID Nr. 25) und KY149 (SEQ ID Nr. 16) sind geeignet, um japanische und US- amerikanische HCV-Prototypen und verwandte variierende Isolate zu amplifizieren und können geeignet sein, um HCV-C9 und verwandte Isotypen ebenso nachzuweisen.
Sonden zum Nachweis von japanischen, US-amerikanischen und C9-HCV-Prototypen und verwandten Varianten sind beispielsweise KY67 (SEQ ID Nr. 10), KY78 (SEQ ID Nr. 18), KY81 (SEQ ID Nr. 11), KY86 (SEQ ID Nr. 13), KY95 (SEQ ID Nr. 20), KY150 (SEQ ID Nr. 43) und KY145 (SEQ ID Nr. 19). Sonden zum Nachweis von japanischen und US-amerikanischen HCV-Prototypen und verwandten Varianten, wobei diese Sonden den HCV-C9-Prototyp nicht nachweisen, schließen KY83 (SEQ ID Nr. 7), KY87 (SEQ ID Nr. 14), KY84 (SEQ ID Nr. 8), KY88 (SEQ ID Nr. 12), KYBS (SEQ ID Nr. 9), KY100 (SEQ ID Nr. 21), KY148 (SEQ ID Nr. 17) und KY149 (SEQ ID Nr. 16) ein. Die Sonden KY65 (SEQ ID Nr. 1), KY68 (SEQ ID Nr. 27), KY82 (SEQ ID Nr. 28), KY99 (SEQ ID Nr. 26), KY109 (SEQ ID Nr. 24), KY111 (SEQ ID Nr. 25), KY80 (SEQ ID Nr. 5), KY144 (SEQ ID Nr. 6) und KY153 (SEQ ID Nr. 15) sind geeignet zum Nachweis von japanischen und US-amerikanischen HCV-Prototypen und verwandten variierenden Isolaten und können geeignet sein zum Nachweis von HCV-C9 und verwandten Varianten davon.

Beispiel 6

Die homogene RT/PCR-Amplifizierung von HCV-RNA in Gegenwart von UNG ist eine bevorzugte Methode.
Die homogene RT/PCR-Amplifizierungsmethode, die in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde modifiziert, sodaß sie eine Sterilisierungsstufe enthält. Das unten beschriebene Protokoll zeigt, daß die RT- und PCR-Reaktionen dUTP beinhalten. Die Sterilisierung erfolgt bei 50ºC vor der RT-Stufe. Bei den erhöhten RT/PCR-Reaktionstemperaturen ist UNG inaktiv und die dU-haltigen Produkte werden nicht abgebaut. 2 Einheiten UNG (Perkin Elmer) sterilisierten ein carry-over-Äquivalent von 0,25 µl aus einer 100-µl-Ampifizierung, die mit 10 000 Kopien von HCV-RNA erfolgt war, erfolgreich. Höhere Mengen von UNG, z.B. bis zu 6 Einheiten pro 100 µl Ansatz, sind auch geeignet. Die Reaktionsmischungskomponenten wurden in der folgenden Reihenfolge zugegeben:
* 1X Enzymvorratspuffer = (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1mM DTT, 0,5% Tween 20 [Pierce Surfactants], 50% Glycerin [V/V])
** 1 mg Poly-rA homopolymere RNA von Pharmacia (Nr. 27-PolyrA hat einen Durchschnitts-S20,w von 8,8 (Bereich 6 bis 13) oder einige nicht spezifische Produkte bei der Hybridisierungstemperatur, die bei weniger als 200 ng pro Reaktion verwendet wird. Kälberthymus-DNA, PBL-DNA, Humanplacenta- DNA und DNA aus der Zellinie K562 wurden untersucht und verhalten sich ähnlich.

Verfahren

1. TC9600-Thermocycler wird angeschaltet, um die Überzugsschicht vorzuwärmen.
2. Es wird eine Reaktionsmischung bei Raumtemperatur hergestellt.
3. Die Röhrchen werden in den Thermocycler gestellt und "Run" wird gedrückt, um den Thermocycler wieder zu starten.
4. Das Gerät wird bei File 8 gestartet.
5. Vorgeschlagene Temperaturwechselbedingungen:
File 1: Halten 2 Min. auf 50ºC (UNG-Sterilisierungsstufe)
File 2: Halten 15 Min. auf 70ºC (Reverse Transkriptionsstufe)
File 3: Halten 1 Min. auf 95ºC
File 4: Zwei Temperaturen PCR 15 Sek. bei 95ºC und 10-30 Sek. bei 60ºC 2 Zyklen lang
File 5: Zwei Temperaturen PCR 15 Sek. bei 90ºC und 10-30 Sek. bei 60ºC über 38 Zyklen
File 6: Halten 1 Std. auf 72ºC
File 7: Halten 15ºC unbeschränkt
File 8: Verbindet die Files 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7.
Auf Stufe 5, bei File 2, kann die Reaktionszeit von 15 Minuten auf 5 Minuten abgesenkt werden, ohne die Reaktionseffizienz zu vermindern. Bei Stufe 5, File 5 kann es für Matrizen mit hohem Anteil von G + C bevorzugt sein, die Denaturierungstemperatur auf 95ºC zu erhöhen.
Die Analyse der Reaktionsprodukte mit dem Mikrotiterplattentest führt im allgemeinen zu Absorptionswerten von mehr als 0,8 für positive Proben und ≤ 0,5 für negative Proben.

Claims

1. Eine Hepatitis C Nukleinsäure, die ün wesentlichen identisch ist mit einer Nukleotidsequenz ausgewahlt aus der Gruppe bestehend aus:

2. Ein rekombinanter Vektor, der eine Hepatitis C Nukleinsäure gemäss Anspruch 1 enthält.

3. Der rekombinante Vektor gemäss Anspruch 2, der der cDNA Klon pHCV-C9 (ATCG Nr.75265) oder der cDNA Klon PHCV-R110 (ATCC Nr. 75266) ist.

4. Ein Oligonukleotid, das mindestens 14 aufeinanderfolgende Nukleotide umfasst, wobei das Oligonukleotid fähig ist sequenzspezifisch an eine Untersequenz innerhalb einer Hepatitis C Nukleinsäure gemäss Anspruch 1 zu hybridisieren und nicht an die 5'-terminale Region des HCV Genoms der japanischen und US Prototypenstämme hybridisiert.

5. Das Oligonukleotid gemäss Anspruch 4, das zwischen 15 und 25 Nukleotide lang ist.

6. Das Oligonukleotid gemäss Anspruch 4, das exakt komplementär zu einer Untersequenz der Hepatitis C Nukleinsäure ist, wie sie in Anspruch 1 beansprucht ist.

7. Ein Oligonukleotid mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

8. Das Oligonukleotid gemäss einem der Ansprüche 4 bis 7 das markiert ist.

9. Ein Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäure eines Hepatitis C Virus, dadurch gekennzeichnet, dass als Primer ein Oligonukleotid wie es in einem der Ansprüche 4 bis 8 beansprucht ist, benutzt wird.

10. Ein Oh.gonukleotid mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

oder das Komplement davon.

11. Das Oligonukleotid mit der Sequenz:

12. Das Oligonukleotid gemäss einem der Ansprüche 9 bis 11, das markiert ist.

13. Ein Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure aus einem Hepatitis C Virus dadurch gekennzeichnet, dass ein Oligonukleotid wie es in einem der Ansprüche 10 bis 12 beansprucht ist, als Sonde verwendet wird.

14. Das Verfahren gemäss Anspruch 13 wobei eine Untersequenz der Hepatitis C Nukleinsäure in der Probe als erstes amplifiziert wird.

15. Ein Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure aus einem Hepatitis C Virus dadurch gekennzeichnet, dass ein Oligonukleotid wie es in einem der Ansprüche 10 bis 12 beansprucht ist, als Sonde verwendet wird und wobei eine Untersequenz der Hepatitis G Nukleinsäure in der Probe als erstes amplifiziert wird unter Verwendung eines stromaufwärts gerichteten Primers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

mit einem stromabwärts gerichteten Primer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

oder unter Verwendung des stromaufwärts gerichteten Primers:

oder unter Verwendung eines stromaufwärts gerichteten Primers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

mit dem stromabwärts gerichteten Primer:

oder unter Verwendung des stromaufwärts gerichteten Primers:

oder unter Verwendung des stromaufwärts gerichteten Primers

16. Ein Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure aus einem Hepatitis C Virus dadurch gekennzeichnet, dass ein Oligonukleotid gemäss einem der Ansprüche 10 bis 12 als Sonde verwendet wird und wobei eine Untersequenz der Hepatitis C Nukleinsäure in der Probe zuerst amplifiziert wird unter Verwendung eines stromaufwärts gerichteten Primers der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

mit einem stromabwärts gerichtet Primer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

17. Ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von genomischer Hepatitis C Nukleinsäure aus einem HCV Stamm oder Isotyp der C9 Prototypenstämme, umfassend:

(a) Amplifizierung einer Untersequenz der Nukleinsäure mit einem Oligonukleotid gemäss einem der Ansprüche 4 bis 8; und

(b) Mischung der amplifizierten Nukleinsäure mit einer sequenzspezifischen Oligonukleotidsonde; und

(c) Bestimmung von Hybriden die sich aus der Untersequenz und der Sonde gebildet haben.

18. Das Verfahren gemäss Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidsonde eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäuresequenzen:

oder dem Komplement davon.

19. Ein Kit zur Amplifizierung einer Nukleinsäure eines C9 Hepatitis C Virus Prototyenpstammes, wobei das Kit ein Abteil umfasst, das als Primer ein Oligonukleotid gemäss einem der Ansprüche 4 bis 8 und eine oder mehrere Umkehrtranskriptions- oder Amplifizierungsreagenzien enthält.

20. Der Kit gemäss Anspruch 19, der zusätzlich ein oder mehrere Reagenzien zur Bestimmung der Anwesenheit einer Nukleinsäure eines C9 Hepatitis C Virus Prototypenstaa:anes umfasst, wobei dieses Reagenz bevorzugt eine Sonde ist, die ein Oligonukleotid gemäss einem der Ansprüche 10 bis 12 ist.

21. Ein Kit zur Bestimmung der Anwesenheit von Nukleinsäure eines C9 Hepatitis C Virus Prototypenstammes, wobei das Kit ein Abteil umfasst, das als Sonde ein Oligonukleotid enthält, wie es in einem der Ansprüche 10 bis 12 beansprucht ist.

22. Verwendung eines Oligonukleotids gemäss einem der Ansprüche 4 bis 8 als Primer zur Amplifizierung einer 5'-terminalen Region des Genoms eines HCV Stammes der C9 Prototypenstämme.

23. Verwendung eines Oligonukleotids wie es in einem der Ansprüche 10 bis 12 beansprucht ist, als Sonde zur Bestimmung der Anwesenheit von genomischer Hepatitis C Nukleinsäure eines HCV Stammes der C9 Prototypenstämme.

24. Ein isolierter Hepatitis C Virus, der eine Hepatitis C Nukleinsäure gemäss Anspruch 1 enthält.