LU87861A1 - Agent viral - Google Patents

Description

AGENT VIRAL

La présente invention a trait à la séparation et à lacaractérisation de l'agent viral responsable de l'hé¬patite non-A non-B post-transfusionnelle (PT-NANBH) eten particulier aux polypeptides viraux PT-NANBH, auxséquences d'ADN encodant ces polypeptides viraux, auxvecteurs d'expression contenant ces séquences d'ADN,et aux cellules hôtes transformées par ces vecteursd'expression. Elle se rapporte également à l'utilisa¬tion d'une séquence d'ADN dans un essai d'hybridationd'acide nucléique pour le diagnostic de la PT-NANBH.Elle a trait, en outre, à 3'uti ] i sation de pol ypept.i -des viraux PT-NANBH ou d'anticorps polyclonaux ou mo¬noclonaux contre ces polypeptides dans une immuno-analyse pour le diagnostic de PT-NANBH ou dans un vac¬cin pour sa prévention.

L’hépatite non-A, non-B (NANBH) est par définition undiagnostic d'exclusion et a généralement été utiliséepour décrire des cas d'infection hépatique virale chezl’être humain qui ne sont pas dus à des virus d'hépa¬tite A ou B. Dans la majorité de ces cas, la cause del'infection n'a pas été identifiée bien que pour desraisons cliniques et épidémiologiques, on ait pensé àun certain nombre d'agents qui pourraient être respon¬sables, cfr' Shih et al. (Prog. Liver Dis.. 1986, 8.,433-452). Rien qu'aux Etats-Unis d'Amérique, jusqu'à10% des transfusions sanguines peuvent avoir une NANBHcomme conséquence, ce qui en fait un problème d'impor¬tance. Même pour la PT-NANBH, il peut y avoir au moinsplusieurs agents viraux responsables de l'infection etau fil des années, les revendications quant à l'iden¬tification de l'agent n'ont pas manqué, mais aucunen'a été établie.

La demande de brevet européen 88310922.5 tend à décri¬re la séparation et la caractérisation de l'agent é-thiologique responsable de la PT-NANBH que l'on appel¬le également virus de l'hépatite C (HCV). Une biblio¬thèque d'ADNc a été préparée à partir d'acide nucléi¬que viral obtenu d'un chimpanzé atteint de PT-NANBH eta été sélectionnée au moyen d’antisérums humains. Unesérie de clones ont été isolés et mis en séquence. Lesdonnées de séquence d'acide nucléique et d'acide aminéen résultant et qui sont décrites dans la demande, re¬présentent approximativement 70% du génome viral lOkbet sont entièrement dérivées de son extrémité 3' cor¬respondant à la région de programmation non structu¬rée .

Les inventeurs ont à présent isolés et caractérisésles polypeptides viraux de la PT-NANBH par le clonageet l'expression de séquences d'ADN encodant ces poly¬peptides viraux. D'une manière surprenante, les don¬nées de séquence d'acide nucléique et d’acide aminéprésentent des différences considérables avec les don¬nées correspondantes rapportées dans la demande debrevet européen 88310922.5. Dans l'ensemble, ces dif¬férences sont d'environ 20% au niveau de l'acide nu¬cléique et de 15% au niveau de l'acide aminé, maiscertaines régions des séquences présentent même desdifférences plus importantes. Le niveau global de dif¬férence est plus important que ce que l’on attendraitpour deux isolats du même virus, même en tenant comp¬te de facteurs géographiques, et peut s’expliquer parl’une des deux raisons suivantes.

Tout d'abord, les inventeurs de la présente inventionet ceux de la demande de brevet européen susmentionnéeont utilisé des sources différentes pour l'acide nu¬cléique utilisé dans le clonage du cADN. En particu¬lier la demande de brevet européen décrit l’utilisa¬tion de plasma de chimpanzé comme source du matérielde départ de 3'acide nucléique viral, le virus ayantété transmis à un chimpanzé à deux occasions. La PT-NANBH est, bien sûr, une maladie humaine et le passagedu virus dans un hôte étranger, même s’il est procheparent de l'homme, se traduira vraisemblablement parune mutation intensive de l'acide nucléique viral. Dece fait les données de séquence que contient la deman¬de de brevet européen 8831022.5 peuvent ne pas êtreexactement représentatives de l'agent viral réel res¬ponsable de la PT-NANBH chez l'homme. Par contraste,les inventeurs de la présente invention ont utilisél’acide nucléique viral d'une source de plasma humaincomme matériel de départ pour le clonage du cADN. Lesdonnées de séquence ainsi obtenues sont plus suscepti¬bles de correspondre aux séquences natives d'acide nu¬cléique et d'acide aminé de la PT-NANBH.

Deuxièmement, il peut se faire que l’agent viral exis¬te sous la forme de plus d'un sous-type et que lesdonnées de séquence décrites dans la demande de breveteuropéen et celles élucidées par les inventeurs de laprésente correspondent à des sous-types séparés etdistincts du même agent viral. Alternativement il peutse faire que le niveau de différence entre les deuxgroupes de données de séquences soit dû à une combi¬naison de ces deux facteurs.

La présente invention donne un polypeptide viral PT-NANBH comprenant un antigène ayant une séquence d'aci- de aminé qui est pour au moins 90% homologue à la sé¬quence d'acide aminé indiquée dans les SEQ ID N°: 3,4,5,18,19,20,21 ou 22, ou en est un fragment antigèni¬que .

Les SEQ ID N° 3,4,5,18,19,20,21 ou 22 indiquent la sé¬quence d'acide aminé telle qu'on la déduit de la sé¬quence d'acide nucléique. La séquence d'acide aminésera de préférence homologue à au moins 95% ou même98% avec la séquence d’acide aminé indiquée en SEQ IDN° 3,4,5,18,19,20,21 ou 22. Facultativement l'antigènepeut être fondu avec un polypeptide hétérologue.

Deux antigènes ou plus peuvent facultativement êtreutilisés soit en combinaison soit fondus en un seulpolypeptide. L'utilisation de deux antigènes ou plusde cette manière dans un essai de diagnostic donne desrésultats plus fiables que l'utilisation de l'essai decriblage du sang pour le virus PT-NANBH. On obtiendrade préférence un antigène dans la région de programma¬tion structurée (l'extrémité 5') et un autre dans larégion de programmation non structurée (l'extrémité3'). La préférence est donnée en particulier à la fu¬sion des antigènes entre eux pour donner un polypep¬tide résultant de la recombinaison. Cette dernière ap¬proche présente une série d'avantages en ce sens que• les antigènes individuels peuvent être combinés dansun rapport fixe déterminé à l'avance (habituellementéquimolaire) et qu'il ne faut produire, purifier etcaractériser qu'un seul polypeptide.

Un fragment antigénique d'un antigène ayant une sé¬quence d'acide aminé homologue à au moins 90% avec cequi est indiqué dans les SEQ ID n° 3,4,5,18,19,20,21ou 22 contiendra de préférence un minimum de cinq,six, sept, huit, neuf ou dix, quinze, vingt, trente,quarante ou cinquante acides aminés. Les emplacementsantigéniques de ces antigènes peuvent être identifiésau moyen de procédures type. Celles-ci peuvent impli¬quer la fragmentation du polypeptide lui-même au moyend'enzymes protéolyptiques ou d'agents chimiques et ladétermination subséquente de l’aptitude de chaquefragment à se lier aux anticorps ou à provoquer uneréponse immune en cas d'inoculation à un animal oudans un système de modèle in vitro approprié (Strob-maier et al., J. Gen. Virol., 1982, 59., 205-306). Al¬ternativement 1'ADN encodant le polypeptide peut êtrefragmenté par digestion par des enzymes réducteurs oud'autres techniques réputées et ensuite introduit dansun système d’expression pour produire des fragments(facultativement fondus en un polypeptide généralementd’origine bactérienne). T.es fragments qui en résultent sont évalués comme décrit précédemment (Spence et. al,J. Gen. Virol . , 1989, 70, 2843-51 ; Smith et. al^, Gene, 1984, 29, 263-9). Une autre approche consiste à syn¬thétiser chimiquement de courts fragments de peptides(longueur de 3-20 acides aminés; conventionnellementlongueur de 6 acides aminés) qui couvrent la totalitéde la séquence du polypeptide long avec chaque peptidechevauchant le peptide adjacent. (Ce chevauchementpeut être à partir de 3-30 acides aminés, mais l'idéalest n-1 acides aminés, où n est la longueur du pepti¬de; Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sc., 1984, 81,3998-4002). Chaque peptide est alors évalué comme dé¬crit précédemment, si ce n'est qu'il est généralementd'abord couplé à une molécule porteuse pour faciliterl'induction d'une réponse immune. Enfin il y a desméthodes de prédiction qui comportent l'analyse de laséquence du point de vue de caractéristiques particu¬lières, par ex., 1'hydrophil ici té, dont on pensequ'elles ont un rapport avec des emplacements impor¬tants immunologiquement parlant (Hopp et Woods, Proc.Natl. Acad. Sc., 1981, 78, 3824-8; Rerzofsky, Science, 1985, 229, 932-40). Ces prédictions peuvent alors êtretestées par les approches du polypeptide ou du peptiderésultant de la recombinaison décrites précédemment.

Le polypeptide viral sera, de préférence, fourni sousune forme pure, c.à.d. avec une pureté supérieure à90%, voire 95%.

Le polypeptide viral PT-NANBH de la présente inventionpeut être obtenu au moyen d'un synthétiseur d'acideaminé, s'il s'agit d'un antigène n'ayant pas plusd'environ trente résidus ou par la technologie de1' ADN résultant de 1 a recombinaison.

La présente invention fournit également une séquenced'ADN encodant un polypeptide viral PT-NANBH tel quedéfini ici.

La séquence d'ADN de la présente invention peut êtresynthétique ou clonée. La séquence d'ADN sera, de pré¬férence, telle qu'indiquée dans la SEQ ID n° 3,4,5,18,29,20,23 ou 22.

Pour obtenir un polypeptide viral PT-NANBH comprenantde multiples antigènes, il est préférable de fondreles séquences de programmation individuelles en unseu3 cadre de lecture ouvert. La fusion devra, biensûr, se faire de manière à ce que l'activité antigéni¬que de chaque antigène ne soit pas compromise de ma¬nière importante par sa position par rapport à un au¬tre antigène. On accordera, bien entendu, une atten¬ tion particulière à la nature des séquences à 1'en¬droit de la jonction entre les antigènes. Les méthodesd'obtention de tels polypeptides simples sont bienconnues dans ce domaine.

La présente invention fournit également un vecteurd’expression contenant une séquence d'ADN telle quedéfinie ici, et capable, en présence d'un hôte appro¬prié, d’exprimer la séquence d'ADN pour produire unpolypeptide viral PT-NANBH.

Le vecteur d’expression contient normalement des élé¬ments de contrôle de l’ADN qui réalisent l'expressionde la séquence d'ADN dans un hôte approprié. Ces élé¬ments peuvent varier en fonction de l'hôte, mais com¬prennent généralement un activateur, un site de liai¬son aux ribosomes, des sites de démarrage et d'arrêttranslationnels, et un site d'arrêt de la transcrip¬tion. Des exemples de tels vecteurs sont les plasmideset les-virus. Les vecteurs d'expression de la présenteinvention comprennent à la fois des vecteurs extra¬chromosomiques et des vecteurs qui sont intégrés dansle chromosome de la cellule hôte. Pour utilisationdans des E.col.i, le vecteur d’expression peut contenirla séquence d'ADN de la présente invention facultati¬vement sous forme de fusion liée soit à 1'extrémité 5'•ou 3' de la séquence d'ADN encodant, par exemple, lap-galactosidase ou à l’extrémité 3' de la séquenced'ADN encodant, par exemple, le gène trp E. Pour uti¬lisation dans le système de bacillovirus de l’insecte(AcNPV), la séquence d'ADN est facultativement fondueavec la séquence de programmation de la polyhédrine.

La présente invention fournit également une cellulehôte transformée avec un vecteur d’expression tel quedéfini ici.

Des exemples de cellules hôte utilisées avec la pré¬sente invention comprennent les cellules procaryoti-ques et eucaryotiques, telles que cellules bactérien¬nes, de levure, de mammifères et d’insectes. Des exem¬ples particuliers de telles cellules sont les E.coli,les S.cerevisiae, les P.pastoris, des cellules d'ovai¬re - de hamster chinois et de souris, et la Spodopterafrnqiperda et la Tricoplusia ni. Le choix de la cellu¬le hôte peut dépendre d’une série de facteurs, mais si3a modification post-translationnelle du polypeptideviral PT-NANBH est importante, on choisira de préfé¬rence un hôte eucaryotjque.

La présente invention fournit également un procédépour préparer le polypeptide viral PT-NANBH qui com¬prend le clonage ou la synthétisation d’une séquenced'ADN encodant le polypeptide viral PT-NANBH, tel quedéfini ici, insérant la séquence d'ADN dans un vecteurd’expression capable, dans un hôte approprié, de s'ex¬primer, de transformer une cellule hôte avec le vec¬teur d'expression, de faire une culture de la cellulehôte transformée et d'isoler le polypeptide viral.

Le clonage de la séquence d'ADN peut être effectué aumoyen de procédures type bien connues dans ce domaine.Par ailleurs, il est particulièrement avantageux dansces procédures d'utiliser les données de séquence ré¬vélées ici de manière à faciliter l’identification etla séparation des séquences d'ADN clonées souhaitées.Ti'ARN sera isolé, de préférence, en pastillant le vi¬rus à partir du plasma d'humains contaminés identifiéspar implication dans la transmission de PT-NANBH.L'ARN isolé fait l'objet, d'une transcript.ase inversedans l'ADNe par amorçage sélectif ou par oligo-dT. Fa¬cultativement l'ARN peut être soumis à une étape depré-t.raitement pour en retirer toute structure secon¬daire qui pourrait interférer avec la synthèse ADNc,par exemple, par chauffage ou par réaction avec de1'hydroxyde mercurique de méthyle. L'ADNe est habi¬tuellement modifié par addition de linkers suivied'une digestion avec un enzyme réducteur. Il est alorsinséré dans un vecteur de clonage, tel que le pBR322ou un dérivé de celui-ci ou les vecteurs lambda gtlOet gtll (Huynh et. al., DNA Cloning, 1985, Vol. 1 : APractical Approach, Oxford, IRC Press), conditionné envirions le cas échéant, et les molécules d'ADN résul¬tant de la recombinaison utilisées pour transformerles E.coli et donc générer la bibliothèque souhaitée.

La bibliothèque peut être examinée de manière sélecti¬ve en utilisant une stratégie de sélection type. S'ils'agit d'une bibliothèque d'expression, elle peut êtreexaminée sélectivement au moyen d'une méthode immuno¬logique avec des anti sérums obtenus à partir de la mê¬me source de plasma que le matériel de départ de l’ARNet également avec des anti sérums provenant de sourceshumaines supplémentaires supposées positives pour desanticorps contre la PT- NANBH. Etant donné que les an¬tisérums humains contiennent généralement des anti¬corps contre les E.coli qui peuvent donner lieu à unimportant mouvement propre pendant la sélection, ilest préférable de les traiter d'abord avec un lysatd*E.coli non transformé de manière à retirer ces anti¬corps. Π est avantageux d'avoir recours à un contrôlenégatif au moyen d'anti sérums provenant de donneurs humains accrédités, c.à.d. des donneurs humains ayantété soumis à des tests répétés et ne présentant pasd’anticorps contre l'hépatite virale. Une stratégie desélection alternative serait d’utiliser un ou plu¬sieurs oligonucléotides marqué (s) comme sondes d'hy¬bridation. T. ' uti li sation d'oligonucléotides dansl'examen sélectif d'une bibliothèque cADN est généra¬lement plus simple et plus fiable que la sélectionavec des anti sérums. Les oligonucléotides seront syn¬thétisés de préférence en utilisant les informationsde la séquence d'ADN contenues ici. Un ou plusieurstours de criblage supplémentaires d'une sorte ou del'autre peuvent être effectués pour caractériser etidentifier les clones positifs.

Après avoir identifié un premier clone positif, la bi¬bliothèque peut être réexaminée sélectivement pour dé¬tecter des clones positifs supplémentaires en utili¬sant le premier clone comme sonde d'hybridation. Al¬ternativement ou en sus, d’autres bibliothèques peu¬vent être préparées et celles-ci peuvent être sélec¬tionnées au moyen d'immuno-sélecteurs ou de sondesd’hybridation. De cette manière, on peut obtenir d'au¬tres séquences d'ADN.

Alternativement, la séquence d’ADN encodant le poly¬peptide viral PT-NANRH peut être synthétisée au moyende procédures type et cette solution peut être préfé¬rée au clonage de l’ADN dans certaines circonstances(Gait. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Ap¬proach , 3984, Oxford, IRL Press).

Donc elonée ou synthétisée, la séquence d’ADN souhai¬tée peut, être insérée dans un vecteur d'expressionutilisant des techniques type connues. T.e vecteurd’expression est normalement coupé au moyen d'enzymesréducteurs et la séquence d’ADN insérée au moyen d'uneligature à extrémité émoussée ou en zigzag. La coupureest généralement réalisée en un site de restrictiondans une position adéquate dans le vecteur d’expres¬sion de manière à ce qu’une fois insérée, la séquenced'ADN soit sous le contrôle des éléments fonctionnelsde l'ADN qui réalisent son expression.

La - transformation d'une cellule hôte peut être effec¬tuée par des techniques type. Un marqueur phénotypiqueest habituellement utilisé pour faire la distinctionentre les transformants qui ont repris avec succès levecteur d'expression et les autres. La mise en culturede la cellule hôte transformée et la séparation du po¬lypeptide viral PT-NANBH peut également se faire pardes techniques type.

L'anticorps spécifique d'un polypeptide viral PT-NANBHde la présente invention peut être obtenu au moyen dupolypeptide. Il peut être polyclonal ou monoclonal.L'anticorps peut être utilisé pour les essais de con¬trôle de qualité de lots de polypeptides viraux PT-NANBH; la purification d'un polypeptide viral PT-NANBHou du lysat viral; la topographie des épitopes; lors¬qu'il est marqué, comme élément conjugué dans un essaitype compétitif, pour la détection des anticorps; etdans les essais de détection des antigènes.

L'anticorps polyclonal contre un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu en in¬jectant un polypeptide viral PT-NANBH, facultativementcouplé à un support pour promouvoir une réponse immu¬ne, dans une cellule de mammifère: souris, rat, moutonou lapin, et en récupérant l’anticorps ainsi produit.Le polypeptide viral PT-NANBH est généralement admi¬nistré sous forme d'une formulation injectable danslaquelle le polypeptide est mélangé à un diluant phy¬siologiquement acceptable. Des adjuvants tels quel'adjuvant complet de Freund (FCA) ou 1'adjuvant in¬complet de Freund (FIA) peuvent être inclus dans laformulation. La formulation est normalement injectéedans l’hôte sur une période de temps appropriée, deséchantillons de plasma étant prélevés à intervallesréguliers pour essai relatif aux anticorps viraux an¬ti -PT-NANBH. Lorsqu'un niveau d'activité approprié estobtenu, l’hôte fuit. L’anticorps est alors extrait duplasma sanguin et purifié par des procédures type, parexemple, par protéine A ou par chromatographie en ré¬sine échangeuse des ions.

L'anticorps monoclonal contre un polypeptide viralPT-NANBH de la présente invention peut être obtenu enfondant des cellules d'une lignée cellulaire immorta¬lisante avec des cellules produisant des anticorpscontre le polypeptide viral et en faisant une culturede la lignée cellulaire fondue rendue immortelle. Demanière typique, on inocule à un hôte mammifère nonhumain, tel que souris ou rat, le polypeptide viral.Après un temps suffisant pour que l'hôte ait pu élabo¬rer une réponse anticorps, des cellules produisant desanticorps, telles que les splénocytes, sont retirées.Les ceîIules d'une lignée cellulaire immortalisante,telle qu'une lignée cellulaire de myélome de souris oude rat, sont fondues avec ]es cellules produisant desanticorps et les fusions en résultant examinées demanière sélective pour identifier une lignée cellulai¬re, telle qu'un hydridome, sécrétant l'anticorps mono¬clonal souhaité. La lignée cellulaire fondue peut êtremise en culture et l'anticorps monoclonal purifié du milieu de culture de manière similaire à la purifica¬tion de l'anticorps polyclonal.

Les essais de diagnostic basés sur la présente inven¬tion peuvent être utilisés pour déterminer la présenceou l'absence d'infection PT-NANBH. ils peuvent égale¬ment être utilisés pour contrôler le traitement decette infection, par exemple dans une thérapie d'in¬terféron .

Dans un essai pour le diagnostic d'une Infection vi¬rale, il y a fondamentalement trois approches distinc¬tes qui peuvent être adoptées impliquant la détectionde l'acide nucléique viral, l’antigène viral ou l'an¬ticorps viral. L’acide nucléique viral est générale¬ment considéré comme le meilleur indicateur de 1 a pré¬sence du virus lui-même et identifierait des substan¬ces susceptibles d'être infectieuses. Par ailleurs, ladétection de l'acide nucléique n'est généralement pasaussi directe que la détection d'antigènes ou d'anti¬corps puisque le niveau cible peut être très bas.L'antigène viral est utilisé comme marqueur pour laprésence du virus et comme indicateur de l'infecti¬vité. En fonction du virus, la quantité d'antigènesprésente dans un échantillon peut être très faible etdifficile à détecter. La détection d'anticorps est re¬lativement directe car, en effet, le système immune del'hôte amplifie la réponse à une infection en produi¬sant d'importantes quantités d'anticorps qui circu¬lent. La nature de la réponse des anticorps peut sou¬vent être cliniquement utile, par exemble des anti¬corps de catégorie IgM plutôt qu’IgG indiquent une in¬fection récente, ou la réponse à un antigène viralparticulier associé à la clearance du virus. Doncl'approche exacte adoptée pour le diagnostic d'une in¬fection virale dépend des circonstances particulièreset de l’information recherchée. Dans le cas du PT-NANBH, une analyse de diagnostic peut incorporer n’im¬porte laquelle de ces trois approches.

Dans un essai pour le diagnostic de PT-NANBH impli¬quant. la détection d’acide nucléique viral, la méthodepeut comprendre l'hybridation de l'ARN viral présentdans un échantillon ou de l'ADNc synthétisé à partirde cet ARN viral, avec une séquence d'ADN correspon¬dant à la séquence de nucléotide de la SEQ ID n° 3,4,5,18,19,20,21 ou 22 et la sélection des hybrides d’a¬cide nucléique en résultant pour identifier tout acidenucléique viral PT-NANBH. L'application de cette mé¬thode est habituellement limitée à un échantillon d’untissu approprié, tel que biopsie du foie, où l’ARN vi¬ral est susceptible d’être présent dans de fortes pro¬ portions. La séquence d’ADN correspondant à ]a séquen¬ce de nucléotide de la SEQ ID nc 3,4,5,18,19, 20,21 ou22 peut prendre la forme d'un oligonucléotide ou d’uneséquence ADNc contenant facultativement un plasmide.La sélection des hybrides d’acide nucléique sera, depréférence, effectuée au moyen d'une séquence d'ADNmarquée. Un ou plusieurs tours de sélection supplémen¬taires d’un type ou de l'autre peuvent être effectuéspour mieux caractériser l’hybride et donc identifiertout acide nucléique viral PT-NANBH. Les étapes del’hybridation et de la sélection sont effectuées sui¬vant des procédures connues.

Par suite de l'application limitée de cette méthodedans l'essai de l'acide nucléique viral, une méthodeprivilégiée et plus pratique implique la synthèsed'ADNc à partir de l'ARN viral présent dans un échan¬tillon, l'amplification d’une séquence d'ADN présélec¬tionnée . correspondant à une sous-séquence de la sé¬quence de nucléotide de la SEQ ID n° 3,4,5,18,19,20,21ou 22, et l'identification de la séquence d’ADN présé¬lectionnée. L'échantillon pour essai peut être prélevédans tout tissu approprié ou fluide physiologique etsera de préférence concentré pour tout l'ARN viralprésent. Un exemple de tissu approprié est une biopsiedu foie. Des exemples de fluide physiologique appro¬prié sont: l'urine, le plasma, le sang, le sérum, lesperme, les larmes, la salive ou le fluide cérébrospi¬nal. Les exemples de premier choix sont le sérum et leplasma.

La synthèse de 1'ADNc s’effectue normalement partranscription inverse amorcée au moyen d’amorces sé¬lectives, définies ou oligo-dT. L'amorce la plus avan¬tageuse est un oligonucléotide correspondant à la sé¬quence nucléotide de SEQ ID n° 3,4,5,18,19,20,21 ou 22et conçu pour enrichir en ADNc contenant la séquenceprésélectionnée.

L’amplification de la séquence d’ADN présélectionnéeest de préférence effectuée au moyen d'une techniquede réaction en chaîne de polymérase (PCR) (Saiki etal, Science, 1985, 230, 1350-4). Dans cette technique,on' utilise une paire d'amorces oligonucléotides dontl'une correspond à une portion de la séquence de nu¬cléotide de SEQ ID n° 3,4,5,18,19,20,21 ou 22 et dont3'autre se trouve du côté 3' de la première et corres¬pond à une portion de la séquence complémentaire, lapaire définissant entre elles la séquence d’ADN présé¬lectionnée. Les oligonucléotides ont généralement unelongueur d'au moins 15, de manière optimale de 20 à 26 bases et bien que quelques erreurs puissent être tolé¬rées en variant les conditions de la réaction, l'ex¬trémité 3’ des oligonucléotides devrait être parfaite¬ment complémentaire pour pouvoir amorcer de manièreefficace. La distance entre les extrémités 3’ des oli¬gonucléotides peut être d'environ 100 à environ 2000bases. Pratiquement l'un des oligonucléotides de lapaire utilisée dans cette technique sert égalementpour amorcer la synthèse d'ÂDNc. La technique PCRelle-même est effectuée sur l’ADNc sous forme d’uneseule chaîne utilisant un enzyme tel que la polyméraseTaq, et un surplus d'amorceurs oligonucléotides deplus de 20-40 cycles conformément aux protocoles pu¬bliés (Saiki et al., Science, 1988, 239, 487-491).

Pour raffjner la technique, il peut y avoir plusieurstours d'amplification, chaque tour étant amorcé parune autre paire d'oligonucléotides. Donc, après lepremier tour d'amplification, une paire interne d'oli¬gonucléotides définissant une séquence d'ADN pluscourte (disons, de 50 à 500 bases) peut être utiliséepour un deuxième tour d'amplification. Dans ce raffi¬nement quelque peu plus fiable, auquel on se réfèresous le nom de "Nested PCR", c'est bien entendu, laséquence d'ADN amplifiée finale qui constitue la sé¬quence présélectionnée. (Kemp ert al, Proc. Natl. Acad.Sc., 1989, 86 (7), 2423-7 et Mullis et ai, Methods in

Enzvmoloqy, 1987, 155, 335- 350).

L'identification de la séquence d'ADN présélectionnéepeut se faire par analyse des produits PCR sur un gelagarose. La présence d'une bande au poids moléculairecalculé pour la séquence présélectionnée est une indi¬cation positive de la présence d'acide nucléique viraldans l’échantillon. Des méthodes alternatives d'iden¬tification comprennent celles basées sur le transfertSouthern, le transfert de points, la restriction oli-gomère et mise en séquence de l'ADN.

La présente invention fournit également un kit d'essaipour la détection de l’acide nucléique viral PT-NANBH,qui comprend i) ' une paire d’amorces oligonucléotides dont l’une correspond à une portion de la séquence de nuclé¬otides de SEQ TD n° 3,4,5,18,19,20,21 ou 22 etdont l'autre se trouve du côté 3' de la premièreet correspond à une portion de la séquence com¬plémentaire, la paire définissant entre elles uneséquence d'ADN présélectionnée; ii) un enzyme de transcriptase inverse pour 3a syn¬thèse de 3'ADNc à partir de 3.'ARN de l'échantil-lon en amont de l'amorce correspondant à la sé¬quence de nucléotides complémentaire de SEQ IDN° 3,4,5,18,19,20,23 ou 22; iii) un enzyme capable d'amplifier la séquence d'ADNprésélectionnée; et facultativement.

iv) des solutions de lavage et tampons de réaction.

Avantageusement le kit d’essai contient également unéchantillon de contrôle positif pour faciliter l’iden¬tification de l'acide nucléique viral.

les caractéristiques des amorces et des enzymes serontde préférence celles indiquées ci-dessus en rapportavec la technique PCR.

Dans un. essai pour le diagnostic de la PT-NANBH impli¬quant la détection d'antigènes viraux ou d'anticorpsviraux, la méthode peut comprendre la mise en contactd’un échantillon avec un polypeptide viral PT-NANBH dela présente invention ou un anticorps polyclonal oumonoclonal contre ce polypeptide, et la déterminationde l'existence ou non d'une liaison antigènes-anti¬corps contenue dans l'échantillon. L'échantillon peutêtre prélevé dans tout tissu ou fluide physiologiqueapproprié mentionné ci-dessus pour la détection del'acide nucléique viral. Si on obtient un fluide phy¬siologique, il pourra être concentré de manière opti-ma3e pour détecter tout antigène ou anticorps viralprésent.

Une série de formats d'analyse peuvent être utilisés.Le polypeptide viral PT-NANBH peut être utilisé pourcapturer les anticorps de manière sélective par rap¬port à 3a PT-NANBH dans 3a solution, pour marquer demanière sélective les anticorps déjà capturés ou à lafois pour capturer et pour marquer les anticorps. Deplus, le polypeptide viral peut être utilisé dans unevariété de formats d'analyse homogènes dans lesquelsl'anticorps réagissant avec l'antigène est détectédans la solution sans séparation de phases.

Les types d'essai dans lesquels on utilise le polypep¬tide viral PT-NANBH poux capturer les anticorps dansla solution impliquent l'immobilisation du polypeptidesur une surface solide. Cette surface devrait pouvoirêtre lavée d'une manière ou d'une autre. Des exemplesde surfaces adéquates sont des polymères de différentstypes {moulées dans des cupules de microtitrage; desperles; des tigettes de différents types; des pipettes de Pasteur; des électrodes; et des appareils opti-ques), des particules (par ex., latex; érythrocytesstabilisés; cellules bactériennes ou fongiques; spo¬res; sols contenant contenant de l'or ou d'autres mé¬taux; et gels protéinacés), la dimension habituelle dela particule étant de 0,02 à 5 microns, des membranes(par ex., de nitrocellulose; papier; acétocellulose;et des membranes haute porosité/haute surface d'un ma¬tériau organique ou inorganique).

La fixation du polypeptide viral PT-NANBH à la surfacepeut se faire par adsorption passive d'une solution decomposition optimale contenant des tensio-actifs, dessolvants, des sels et/ou des chaotropes; ou par liai¬son chimique active. La liaison active peut être ef¬fectuée au moyen d'une variété de groupes fonctionnelsréactif ou activables qui peuvent être exposés à lasurface (par exemple agents de condensation; estersacides .actifs, halogénures et anhydrides; groupes ami¬nés, oxhydrile ou carboxyle; groupes sulfydryle; grou¬pes carbonyle; groupes diazo; ou groupes insaturés).Facultativement ]a liaison active peut se faire viaune protéine (elle-même attachée à la surface passive¬ment ou par liaison active), telle l'albumine ou lacaséine, à laquelle le polypeptide viral peut être liéchimiquement par toute une série de méthodes.L'utilisation d'une protéine de cette manière peutconférer des avantages par suite d'un point isolélec-trique, d'une charge, de 1'hydrophilicité ou de touteautre propriété physico-chimique. Le polypeptide viralpeut également être attaché à la surface (générale¬ment, mais pas nécessairement, une membrane) suite àla séparation électrophorétique d'un mélange réaction¬nel, tel que la précipitation immune.

Après avoir mis en contact (avoir fait réagir) la sur¬face supportant le polypeptide viral PT-NANBH avec unéchantillon, en laissant le temps nécessaire pourqu'il y ait réaction, et le cas échéant, en retirantle surplus d'échantillon par l’un des nombreux moyensdisponibles (lavage, centrifugation, filtration, ma¬gnétisme ou action capillaire), l'anticorps capturéest détecté par n'importe quel, moyen qui donnera unsignal détectable. On peut, par exemple, y arriver enutilisant une molécule ou une particule marquée commeindiqué ci-dessus qui réagira avec l’anticorps capturé(par exemple, protéine A, protéine G, etc.; anti-espè¬ce ou sous-type d’anti-immoglobuline; facteur rhuma¬toïde; ou anticorps de l'antigène utilisé de manièrecompétitive ou bloquante), ou toute molécule contenantun épitope contenu dans le polypeptide.

Le signal détectable peut être optique, radioactif ouphysico-chimique et peut être fourni directement enmarquant la molécule ou la particule avec, par exem¬ple, un colorant, un marqueur radioactif, une espèceélectroactive, une espèce magnétiquement résonante oufluorogène, ou indirectement en marquant la moléculeou la particule au moyen d'un enzyme capable lui-mêmede donner lieu à un changement mesurable de n'importequel type. Alternativement le signal détectable peutêtre obtenu, par exemple, par agglutination ou par uneffet de diffraction ou de biréfringence si la surfaceest sous forme de particules.

Des essais dans lesquels un polypeptide viral PT-NANBHest utilisé lui-même pour marquer un anticorps déjàcapturé demandent une certaine forme de marquage del'antigène qui permettra sa détection. Le marquagepeut être direct en attachant chimiquement ou passive¬ment, par exemple, un marqueur radioactif, une espècemagnétiquement résonante, un marqueur sous forme departicule ou d'enzyme au polypeptide; ou indirect enattachant toute forme de marque à une molécule qui ré¬agira elle-même avec le polypeptide. La chimie deliaison d'une marque au polypeptide viral PT-NANBHpeut se faire directement via une moitié déjà présentedans le polypeptide, telle qu'un groupe aminé, ou parle biais d'une moitié intermédiaire, telle qu'un grou¬pe de maléimides. La capture de l'anticorps peut sefaire sur n’importe laquelle des surfaces déjà men¬tionnées par n'importe quel réactif y compris 1'ad¬sorption passive ou activée qui se traduira par laliaison de complexes spécifiques d'anticorps ou im¬munes. En particulier, la capture de l’anticorps pour¬rait se faire par une anti-espèce ou un sous-typed'anti-immoglobuline, par facteur rhumatoïde, protéi¬nes A, G, etc. ou par toute molécule contenant un épi¬tope contenu dans le polypeptide.

Le polypeptide PT-NANBH marqué peut être utilisé dansune liaison compétitive où la liaison à toute molécu¬le spécifique sur n'importe laquelle des surfaces don¬nées comme exemple ci-dessus est bloquée par l'anti¬gène dans l'échantillon. Alternativement, il peut êtreutilisé d'une manière non-compétitive dans laquellel'antigène dans l'échantillon est lié spécifiquementou non spécifiquement à l'une des surfaces ci-dessuset est également lié à une molécule spécifique bi- oupolyvalente (par ex., un anticorps), ses autres valen¬ces étant utilisées pour capturer le polypeptide mar¬qué .

Souvent, dans des analyses homogènes, le polypeptideviral PT-NANBH et un anticorps sont marqués séparémentde manière à ce que lorsque l'anticorps réagit avec lepolypeptide viral en solution libre, les deux marquesinteragissent pour permettre, par exemple, le trans¬fert non rayonnant d'énergie capturée par une marquevers l'autre marque avec détection appropriée de 1 adeuxième marque excitée ou de la première marqueéteinte (par ex., par fluorimétrie, résonance magnéti¬que ou mesure des enzymes). L'addition de polypeptideviral ou d'anticorps dans un échantillon se traduitpar une restriction de l'interaction de la paire mar¬quée et donc par un niveau différent du signal dans ledétecteur.

Un format d'essai convenant pour la détection de l'an¬ticorps PT-NANBH est le format de 1'immuno-dosage avecenzyme en sandwich (EIA). Un polypeptide viral PT-NANBH est appliqué sur des cupules de microtitrage. Unéchantillon et un polypeptide viral PT-NANBH auxquelssont couplés un enzyme, sont ajoutés simultanément.Tout anticorps PT-NANBH présent dans l'échantillon selie à 3a fois avec le polypeptide viral recouvrant lacupule et avec le polypeptide viral couplé à l'enzyme.De manière typique le même polypeptide viral est uti¬lisé des deux côtés du sandwich. Après lavage, l'enzy¬me lié est détecté au moyen d'un substrat spécifiqueimpliquant un changement de couleur. Un kit d'essaipour utilisation dans un tel EIA comprend: (1) un polypeptide viral PT-NANBH marqué d'un enzyme; (2) un substrat pour 3'enzyme; (3) un moyen procurant une surface sur laquelle unpolypeptide PT-NANBH est immobilisé; et (4) facultativement, des solutions de lavage et/outampons.

T.es polypeptides viraux de la présente invention peu¬vent être incorporés dans une formulation de vaccinpour induire l'immunité contre le PT-NANBH chez l'hom¬me. A cette fin, le polypeptide viral peut être pré¬senté en association avec un support acceptable dupoint de vue pharmaceutique.

Pour son utilisation dans une formulation de vaccin,le polypeptide viral peut facultativement être présen¬té comme un élément d’une particule née de la fusiondu noyau de l'hépatite B, telle que décrite dans Clar¬ke et al (Nature. 1987, 330, 381-384), ou un polymèreà base de polylysine, tel que décrit dans Tam (PNAS,1988, 85, 5409-5413). Alternativement, le polypeptide viral peut facultativement être attaché à une structu¬re particulaire telle que liposomes ou ISCOMS.

Les supports acceptables du point de vue pharmaceuti¬que sont, entre autres, des milieux liquides pouvantêtre utilisés pour véhiculer le polypeptide viral dansl'organisme d'un patient. Un exemple de tels milieuxliquides est la solution saline. Le polypeptide virallui-même peut être dissous ou mis en suspension sousforme de solide dans le support.

La formulation de vaccin peut également contenir unadjuvant pour stimuler la réponse immune et ainsi, ac¬centuer l'effet du vaccin. Des exemples d'adjuvantssont, entre autres: 3'hydroxyde d'aluminium et 3ephosphate d'aluminium.

La formulation de vaccin peut contenir une concentra¬tion finale du polypeptide viral allant de 0,01 à 5mg/ml,' de préférence de 0,03 à 2 mg/m3. La formulationde vaccin peut être incorporée dans un conteneur sté¬rile qui est alors scellé et stocké à basse températu¬re, par exemple, à 4°C, ou peut être lyophilisée.

Pour introduire l'immunité contre le PT-NANBH chezl’homme, on peut administrer une ou plusieurs doses dela formulation du vaccin. Chaque dose peut être de 0,1à 2 ml, de préférence de 0,2 à 1 ml. Une méthode pourinduire l'immunité contre le PT-NANBH chez l’hommeconsiste à administrer une quantité efficace de formu¬lation du vaccin comme il a été dit précédemment.

La présente invention fournit également 1'Utilisationd'un polypeptide viral PT-NANBH dans la préparationd’un vaccin pour utilisation dans l’induction de l'im¬munité contre le PT-NANBH chez l'homme.

Les vaccins de la présente invention peuvent être ad¬ministrés par toute méthode appropriée pour l'adminis¬tration de vaccins, y compris l'injection orale et pa¬rentérale (ex., intraveineuse, sous-cutanée ou intra¬musculaire) . Le traitement peut consister en une seuledose de vaccin ou en plusieurs doses réparties dans letemps.

Les souches de E. coll transformées suivantes ont étédéposées auprès de la National Collection of Type Cul¬tures (NCTC), Central Public Health Laboratory, 61,Colindale Avenue, Londres, NW9 5HT aux dates indi¬quées : i) E.coli TGI transformés par pDX113 (WD001); Dépôtn° NCTC 12369; 7 décembre 1989.

ii) E.coli TGI transformés par pDX128 (WD002); Dépôtn° NCTC 12382; 23 février 1990.

iii) E.coli TGI transformés par pl36/155 (WD003); Dé¬pôt n° NCTC 12428; 28 novembre 1990.

(iv) E.coli TGI transformés par pl56/92 (WD004}: Dé¬pôt n° NCTC 12429; 28 novembre 1990.

(v) E.coli TGI transformés par pi 29/164 (WD005); Dé¬pôt n° NCTC 12430; 28 novembre 1990.

(vi) E.col1 TGI transformés par pDX336 (WD006); Dépôtn° NCTC 12431; 28 novembre 1990.

Dans les figures, la figure 1 représente la productionde pDX122 décrite à l'Exemple 7, la figure 2 représen¬te deux séquences fondues alternatives décrites àl'Exemple 17, et la figure 3 représente des cartes derestriction, de SEQ ID n° 21 et 22.

Dans la liste de séquences, il y a des listes SEQ IDn° 1 à 25 auxquelles référence est faite dans la des¬cription et dans les revendications.

Les exemples suivants servent à illustrer l'invention.EXEMPLE 1. Synthèse de l'ADNc

Le plasma regroupé (160 mis) de deux personnes (appe¬lées A et L) connues pour avoir transmis la NANBH viades transfusions a été dilué (1:2,5) avec une solutionsaline tamponnée au phosphate (PBS) et ensuite centri¬fugé à 190.000g (par ex., 30.000 t/min dans un rotorMSE 8x50) pendant 5 heures à 4°C. Ce qui surnageait aété retenu comme source des anticorps spécifiques pourla sélection ultérieure des bibliothèques d'ADNc. Lapastille a été remise en suspension dans 2 mis de 20mMtris-chlorhydrate, 2mM EDTA 3% SDS, 0,2M NaCl (2xPK)extrait 3 fois avec un volume égal de phénol, 3 foisavec du chloroforme, une fois avec de l'éther, etensuite précipité avec 2,5 volumes d'éthanol à -20°C.Le précipité a été remis en suspension dans lOul delOmM tris-chlorhydrate, ImM EDTA à pH 8.0 (TE).

L'acide nucléique a été utilisé comme modèle dans unKit de synthèse d'ADNc (Amersham International pic,Amersham, Royaume-Uni) avec amorçage oligo-dT et hexa-nucléotide sélectif. Les conditions de la réactionétaient telles que recommandées par le fournisseur du kit. Spécifiquement lui d'acide nucléique a été utili¬sé pour une première réaction de synthèse de brin quia été marquée ( -32P) dCTP (Amersham; activité spé¬cifique 3000Ci/mmol) dans un volume final de 20 ul etincubé à 42°C pendant 1 heure. La totalité de premièreréaction de brin a ensuite été utilisée pour la deu¬xième réac- tion de synthèse du brin, contenant E. co-li RNaseH (0,8 U) et de la polymérase ADN I (23 U)dans un volume final de lOOul, incubé à 12°C pendant60 minutes, ensuite à 22°C pendant 60 minutes. L'en¬semble de la réaction a ensuite été incubé à 70°C pen¬dant 10 minutes, placé sur glace, 1 U de polymérased'ADN T4 y a été ajoutée et ensuite il a été incubé à37°C pendant 10 minutes. La réaction a été arrêtée enajoutant 5ul de 0,2M EDTA pH8.

Les nucléotides non incorporés ont été enlevés en pas¬sant la réaction dans une colonne NICK (Pharmacia Ltd,Milton Keynes, Royaume-Uni). L’ADNc a ensuite été ex¬trait deux fois avec du phénol, trois fois avec duchloroforme, une fois avec de l’éther et ensuite 20ugde dextran ont été ajoutés avant précipitation avec2,5 volumes d'éthanol 100%.

EXEMPLE 2. Production de bibliothèques d'expression

La pastille d’ADNc séchée a été remise en suspensiondans 5ul de TE stérile et ensuite incubée avec 500ngde linkers EcoRI (Pharmacia, GGATTC.C phosphorylé) et0,5 U de ligase d'ADN T4 (New England BioLabs, Bever¬ley, MA, USA) dans un volume final de 10 ul contenant20mM de tris-HCl pH7,5, 1OmM MgCl2, lOmM DTT, ImMATP pendant 3 heures à 15°C. La ligase a été neutrali¬sée en chauffant à 65°C pendant 10 minutes et l'ADNc aété digéré avec 180U d'EcoRI (BCL, T.ewes, U.K.) dansun volume final de lOOul à 37°C pendant 1 heure. De1'EDTA a été ajouté à une concentration finale de lOmMet l'ensemble de la réaction chargé sur une colonneAc A34 (LKB) . Des fractions (50ul) ont été collectéeset comptées. Le pic d'ADNc dans le volume exclu (980cpm) a été regroupé, extrait deux fois avec du phénol,trois fois avec du chloroforme, une fois avec de l'é¬ther et ensuite précipité à l'éthanol.

L'ADNc ds a été remis en suspension dans 5ul de TE etligaturé sur des bras lambda gtll EcoRI (Gibco, Pais¬ley, Ecosse) dans une réaction de 3 Ou] contenant 0,5Ude ligase d'ADN T4, 66 mM de tris-hydrochlorate, lOmMde MgCl2, 35mM de DTT pH 7,6 à 3 5°C pendant la nuit.Après neutralisation de la ligase par chauffage à 65°Cpendant 30 minutes, 5ul de la réaction ont été ajoutésà une réaction de repliage d’Amersham et incubés à 22°C pendant 2 heures. Le matériel replié a été titrésur le brin Y1090 E.coli (Huynh et. ai 1985) et conte¬nait un total de 2,6x1O4 résultant de la recombinai¬son.

Des cellules pour monocouches (Y0190) ont été prépa¬rées en inoculant 10 mis de bouillon-L avec une seulecolonie d'une plaque d'agar et en agitant pendant lanuit à 37°C. Le jour suivant, 0,5mls de la culture dela nuit ont été dilués avec lOmls de bouillon-L fraiset 0,1ml 3M MgS0< et 0,1.ml 20% (p/v) de maltose ont été ajoutés. La culture a été agitée pendant 2 heuresà 37 °C, les bactéries récoltées par centrifugation à5.000g pendant 10 minutes et remises en suspensiondans 5 mis de lOmM MgSO« pour produire le stock decellules pour monooouches. Une portion (lui) du maté¬riel replié a été mélangée avec 0,2ml de cellules pourmonocouches, incubée à 37°C pendant 20 minutes avantd'ajouter 3 mis de gélose de couverture et l'ensembledu mélange versé sur une plaque T.-agar de 90 mm. Aprèsincubation pendant la nuit à 47 °C, les plaques ont étécomptées et le nombre total de phages résultant de larecombinai son a été déterminé. Le matériel repliérestant (500 ul) a été stocké à 4°C.

Des bibliothèques supplémentaires ont été préparées demanière substantiellement similaire.

EXEMPLE 3. Sélection des bibliothèques d'expression

La bibliothèque, initiale décrite à l'Exemple 2 a étéplaquée sur le brin Y1090 E.coli à une densité d'envi¬ron 5xl03 pfu par plaque de 140mm et incubée à 37°Cpendant 2 heures jusqu'à ce que les plaques soient vi¬sibles. Des filtres de nitrocellulose stériles ayantété imprégnés d'IPTG (isopropyl-thiogalactoside) ontété laissés en contact avec la plaque pendant 3 heureset ensuite retirés. Les filtres ont d'abord été blo¬qués par incubation avec une solution de blocage(3%(p/v)BSA/TBS-Twee(3 OmM Tris-HCl pH8, 150mM NaCl,0,05%(v/v) Tween 20) contenant 0,05% bronidox) (2ûmls/filtre) et ensuite transférés vers la solution tamponde liaison (l%(p/v)RSA/TBS/Tween contenant 0,05% bro¬nidox) contenant des anticorps purifiés (par chromato¬graphie en résine échangeuse des ions) provenant duplasma regroupé de A & L (20ug/ml). Après incubation àtempérature ambiante pendant 2 heures, les filtres ontété lavés trois fois avec TBS-Tween et ensuite incubésdans la solution tampon de liaison contenant un sérumanti-humain de mouton biotinylé (3:250). Après 1 heureà température ambiante, les filtres ont été lavés 3fois avec TBS/Tween et ensuite incubés dans la solu¬tion tampon de liaison contenant un complexe de strep- tavidine/peroxydase (1:100). Le signal s'est développéavec DAB. Les signaux positifs sont apparus ous formede plaques (colorées).

Sur un total de 2,6 x ΙΟ4 plaques sélectionnées, 8signaux positifs ont été obtenus lors du premier tourde sélection. En utilisant les filtres comme calibre,les régions des plaques originales correspondant à cessignaux positifs ont été cueillies au moyen d'une pi¬pette de Pasteur stérile. Les bouchons agar ont étémis en suspension dans 0,1 ml de tampon SM et les pha¬ges ont pu se diffuser. Le titre de phages de chaquebouchon a été déterminé sur le brin Y1090 E.coli. Lestock de phages de chaque bouchon a ensuite été réexa¬miné de manière sélective comme auparavant sur desplaques séparées de 90 mm à une densité d'environ 1 x103 pfu par plaque. Sur les 8 signaux positifs dupremier tour, un était clairement positif au secondtour, c.à.d. >1% de plaques positives, il a été appeléJG2. Cela correspond à un taux positif de 40/106dans la bibliothèque.

Ceci et d'autres phages positifs identifiés de façonsimilaire dans d'autres bibliothèques d'ADNc décritesà l'Exemple 2 ont ensuite été purifiés par des toursrépétés d'examen sélectif de plaques à faible densité(1-200 pfu/plaque de 90 mm) jusqu'à ce que 100% desplaques soient positives avec la sélection d’anticorpsA&L. Trois phages résultant de cette recombinaisonsont JG3 , JG2 et JG3.

EXEMPLE 4. Sélection secondaire de JG1, JG2 et JG3avec un échantillonnage de sérum

Chacun des phages résultant de la recombinaison, JG1,JG2 et JG3, ont été purifiés sur plaque et stockéssous forme de stocks titrés dans un tampon SM à 4°C.Ces phages ont été mélangés (1:3) avec un stock dephages identifiés comme étant négatifs dans l'Exemple3 et le mélange utilisé pour contaminer le brin Y3090E.coli à 1000 pfu par plaque. Des décollements de pla¬que ont été effectués et traités comme décrit à l'Ex¬emple 3, si ce n'est que les filtres ont été divisésen ' quadrants et que chaque quadrant a été incubé avecun anticorps différent; il s’agissait des anticorpsA&L (20ug/ml); du plasma de A (1:500); du plasma de L(1:500) et d’IgG de H (20mg/ml). H est un patient pro¬bablement positif pour les anticorps PT-NANBH car ils’agissait d’un hémophile qui avait reçu un FacteurVIIJ n'ayant pas subi de traitement thermique. A lafin de la réaction, chaque filtre a été jugé à l’insu comme étant positif (lorsqu'il y avait manifestementdeux types de signal) ou négatif (lorsque toutes lesplaques donnaient le même signal). Ce pouvait être unjugement subjectif et les résultats ont donc été com¬parés et seuls les filtres pour lesquels un acord é-tait atteint à la majorité ont été considérés commepositifs. Les résultats sont présentés au tableau 1.

TABLEAU 1

A&L A LH

JG1 + + JG2 + + + + JG3 + + + + JGl est apparu comme réagissant uniquement avec desanticorps du patient A et non de I. ou H; ce n'est pasce qu'on attendrait d’un véritable polypeptide résul¬tant de la recombinaison lié à PT-NANBH et donc JGl aété écarté de l’analyse. Par ailleurs, JG2 et JG3 ontmontré des réactions positives nettes avec les troissérums PT-NANBH A, L et H; on a poursuivi leur analy¬se .

Le type d'analyse décrit ci-dessus a été répété pourJG2 et JG3, si ce n'est que les filtres ont été divi-sés en portions plus petites et que celles-ci ont étéincubées avec des panneaux de sérums positifs et néga¬tifs. L'échantillonnage de sérums positifs comprenaitles sérums de 10 hémophiles et de 9 drogués utilisantla voie intraveineuse (IVDA). Ceux-ci représentaientla meilleure source de sérums positifs même si le tauxpositif réel était inconnu. L’échantillonnage de sé¬rums négatifs a été obtenu de donneurs accréditésétroitement contrôlés pendant de nombreuses années parle North London Blood Transfusion Centre, DeansbrookRoad, Edgware, Middlesex, U.K. et n'ont jamais présen¬té aucun signe d’infection pour toute une série d'a¬gents y compris PT-NANBH. Les résultats sont présentésaux tableaux 2 et 3.

TABLEAU 2 I.D. JG2 JG3 IVDAs V19346 4/4 0/5 V27083 2/4 0/5 V29779 0/4 0/5 V12561 0/5 4/5 V15444 3/4 5/5 V18342 4/4 0/5 V8403 3/4 0/5 V20001 4/4 0/5 V21213 3/4 0/5 Hémophiles M1582 4/4 4/5

Ml 581 5/5 5/5

Ml575 - //5 0/5

Ml 579 5/5 5/5 M1585 3/5 0/5

Ml 576 2/5 1/5

Ml580 1/5 0/5

Ml 578 3/5 0/5 M1587 1/5 //5 M3 577 2/5 1/5 &

Les positifs sont soulignés.

TABLEAU 3

Donneur ac- IVDA Hémophile crédité JG2 6/9 (66%) 5/10 (50%) 0/10 (0%) JG3 2/9 (22%) 4/10 (40%) 0/30 (0%) JG2+JG3 1/9 (11%) 3/10 (30%) 0/10 (0%) JG2 ou JG3 7/9 (77%) 6/10 (60%) 0/10 (0%)

Ces données sont compatibles avec l’hypothèse selonlaquelle . les deux résultats de la recombinaison ex¬priment des polypeptides associés avec un agent res¬ponsable du PT-NANBH et que ces polypeptides ne sontpas identiques mais peuvent partager certains sitesantigèniques.

EXEMPLE 5. Cartographie de la restriction et mise enséquence de l’ADN de JG2 et JG3

Une portion (3Oui) des stocks de phages de JG2 et JG3a été bouillie pour dénaturer les phages et exposerl'ADN. Cet ADN a alors été utilisé comme modèle dansune amplification PCR en utilisant la polymérase Taq;chaque réaction contenait ce qui suit dans un volumefinal de 50ul:~ lOmM Tris-HCl, 50mM KC1, 3,5mMMgCl2, 0,01% de gélatine, pH 8,3 à 25°C plus des amorces oligonucléotides dl.9 et D20 (SEQ ID n° 1 et 2respectivement; 200ng chacun); ces amorces sont si¬tuées dans les séquences lambda flanquant le site declonage EcoRI et amorcent donc l'amplification de toutce qui est cloné dans cette région.

Une portion de la réaction a été analysée sur un gelagarose à 3% et comparée aux marqueurs. L'amplifica¬tion de JG2 a produit un fragment d'environ 2Kb; JG3un d'environ 1Kb. Le reste du mélange de la réaction aété extrait avec du phénol/chloroforme en présence delOmM EDTA et de SDS à 1% et 1'ADN récupéré par préci¬pitation par l'éthanol. Le matériel amplifié a alorsété digéré avec 20U d'EcoRI pendant 60 minutes à 37°Cet séparé sur un gel agarose 1% LGT dans TAE. Lesfragments ont diminué de taille comme prévu et ont étéélués et purifiés au moyen d'Elutips (S&S) . Les in¬serts JG2 et JG3 ont été ligaturés avec pUC13 digérépar EcoRI et transformés en brin TGI E.coli. Les élé¬ments résultant de la recombinaison ont été identifiéscomme colonies blanches sur des plaques X-gal/L-Amp(plaques L-agar complétées par 100ug/ml d'ampicilline,0,5 mg/ml X-gal) et ont été vérifiés par des prépara¬tions de plasmide à petite échelle et digestion d’en¬zymes réducteurs EcoRI pour déterminer la taille de1'insert ADN. Le plasmide résultant de la recombinai-son contenant 1'insert JG2 a été appelé DM415 et celuicontenant JG3, DM416.

La séquence de 1*insert JG2 a été déterminée par miseen séquence bicaténaire de 1'ADN plasmide et par sous-clonage en vecteurs de mise en séquence M13 tels quempl8 et mp!9 suivi d'une mise en séquence monobrin. Laséquence de 1'insert JG3 a été déterminée de la mêmemanière. L'ADN en résultant et les séquences d'acidesaminés qui en résultent sont indiqués dans SEQ ID n° 3et 4.

EXEMPLE 6. Expression du polypeptide PT-NANBH dans lesE.coli

Le plasmide pDM416 (5ug) a été digéré avec EcoRI (20U)dans un volume final de 20ul et 1’insert 1Kb récupérépar élution dans un gel agarose 1% LGT. Ce matériel aalors été "poli" en utilisant un fragment de Klenow etun' mélange dNTP pour remplir les extrémités en sur¬plomb de 1'EcoRI. L'ADN a été récupéré par précipita¬tion à l'éthanol après extraction avec du phénol/chloroforme. Le fragment à bord émoussé a été ligaturéen pDEV107 clivé/phosphatasé Smal (un vecteur qui per¬met le clonage à l'extrémité 3' de lac Z) et ensuitetransformé en cellules TGI E.coli. Il y a eu une aug¬mentation de l'ordre de 30 fois des colonies pendantun contrôle vecteur seul. Les transformants contenant le plasmide requis résultant de la recombinaison ontété identiés par hybridation au moyen d'une sonderadioactive produite par amplification PCR du produitde recombinaison JG3. Douze colonies ont été analyséespar digestion avec des enzymes réducteurs (Sali) desmini-préparations de plasmide pour déterminer l'orien¬tation de 1'insert- Un quart de ces produits de recom¬binaison étaient correctement orientés pour exprimerla séquence PT-NANBH sous forme d'une fusion avec ß-galactosidase. L'un de ceux-ci (pDX113) a été prispour continuer l'analyse.

Une colonie de pDXl13 a été utilisée pour inoculer SOmis de bouillon de L, incubé à 37°C et agité jusqu'àla phase "mid-log" et poussée à s’exprimer par addi¬tion de 20mM IPTG. Après 3 heures, les cellules ontété récoltées par centrifugation à 5.000g pendant 20minutes, remises en suspension dans 50 mis PBS et re¬pastillées. Des cellules pastillées ont été remises ensuspension dans 5 mis de solution tampon (25mM Tris-HC1, 1mM EDTA, Img/ml lysozyme, 0,2%(v/v) Nonidet-P40,pH8,0) par gramme de pastille et incubées à 0°C pen¬dant 2 heures. T.'ADN bactérien émis a été digéré paraddition de DNase I et de MgSO» pour atteindre desconcentrations finales de 40ug/ml et 2mM respective¬ment pour réduire la viscosité.

Ce lysat brut a été analysé par PAGE et le modèle desprotéines coloré au bleu Coomassie. Une protéine d'en¬viron 150kD a été induite dans pDX113 contenant desbactéries et on a estimé que cette protéine représen¬tait 10-15% de la protéine totale. Des gels similai¬res ont été transférés à la membrane PVDF (GRI, Dun-mow, Essex, Royaume-Uni) et les membranes incubéesavec des sérums PT-NANBH positifs et négatifs; la pro¬téine 150kD a. réagi avec les sérums A et L mais pasavec le sérum humain normal. Des traces de contrôlecontenant du lysat des E.coli exprimant la ß-galacto-sidase n'ont pas réagi avec les sérums A, L ou avec lesérum humain normal.

On a ajouté de 1'urée au lysat brut pour avoir uneconcentration finale de 6M et le matériel insoluble aété récupéré par centrifugation. L'extrait d'urée 6M aété utilisé pour recouvrir directement les cupules demicrotitrage pendant 1 heures à 37°C. Les cupules ontété lavées trois fois avec de l'eau distillée doubleet ensuite bloquées par addition de 0,25ml de BSA à0,2% par cupule contenant 0,02% NaN3 pendant 20 mi¬nutes à 37°C. La plaque a alors été aspirée. Des pla¬ques de contrôle recouvertes d'un lysat brut, d’un brinE.coli produisant de la ß-galactosidase (pXY461) ont été produites de la même façon. Ces plaques ont étéutilisées dans des analyses ELISA comme décrit àl'exemple 10.

EXEMPLE 7. Expression du polypeptide PT-NANBH dans descellules d'insectes

Ti’insert PT-NANBH de JG3, isolé comme décrit à l'Exem¬ple 5, a été cloné en châssis avec les 34 premiers nu¬cléotides de polyhédrine dans le vecteur pAc360 (Luck-ow et Summers, Biotechnology, 1988, 6, 47-55), en uti¬lisant notre connaissance du cadre de lecture du gènelacZ dans le vecteur gtll. Des oligonucléotides ontété synthétisés qui ont été en mesure de s'hybrider enséquences gtll flanquant le site de clonage EcoRI etqui permettraient l'amplification de 1'insert par PCR.Ces oligonucléotides comprenaient des sites de res¬triction BamHI convenablement placés pour permettre leclonage .direct dans le site BamHI de pAc360, en pla¬çant lé gène inséré en châssis avec les séquences ter¬minales aminées de la polyhédrine.

Une petite quantité de produit de recombinaison gtllJG3 a été bouillie pour exposer l'ADN et ensuite uti¬lisée dans une amplification PCR contenant les amorcesoligonucléotides d75 et d76 {SEQ ID n° 6 ry 7; 200 rog)et 0,5 U de polymérase Taq.

Après amplification, la réaction a été extraite avecun volume égal de phénol/chloroforme, précipitée avecde l'éthanol et digérée avec 10 U de BamHI dans un vo¬lume final de 30ul. Le fragment amplifié a été résoludans un gel agarose à 1%, élué et ligaturé dans lepAc360 digéré avec le BamHI pour produire le constructde transfert pDX119. Le plasmide résultant de la re¬combinaison (2ug) et l'ADN de type sauvage AcNPV (lug)ont été co-transfectés dans des cellules d’insectespar précipitation du phosphate de calcium. lie virusnégatif d'inclusion résultant de la recombinaison aété choisi par sélection visuelle. Après trois toursde purification de plaque, le virus résultant de larecombinaison (BHC-5) a foisonné et 1'expression de laprotéine résultant de la recombinaison dans les cellu¬les d'insectes a été évaluée par SDS-PAGE, transfertWestern et ELISA. Une protéine abondamment expriméed'environ 70kD est produite dans les cellules contami¬nées. Cette protéine réagit avec les sérums PT-NANBHsuivant transfert Western et ELISA.

Un autre produit de recombinaison du bacillovirus(BHC-7) a été construit pour inclure des séquences JG2en sus des séquences JG3 présentes en BHC-5, comme dé¬ crit à la figure 1. Les séquences PT-NANBH présentesdans JG2 ont été amplifiées et clonées dans le vecteurpAc360 comme dit ci-dessus pour produire pDX118 et lesfragments appropriés de BamHI/Sal I de pDX119 etpDX118 ont été liés ensemble dans cet ordre danspAc360 pour produire le construct de transfert pDX122.

Les plasmides résultant de la recombinaison ont étéidentifés par hybridation et l'orientation de 1'ADNinséré déterminée par analyse des enzymes réducteurs.Le virus résultant de la recombinaison a été produitcomme décrit ci-dessus et la protéine exprimée analy¬sée par SDS-PAGE, transfert Western et ELISA. Un poly¬peptide très abondant (40% du total de la protéine dela cellule) 95kDa réagissant avec les sérums PT-NANBHa été trouvé dans les cellules infectées.

EXEMPLE 8, Purification du polypeptide DX113

Le brin TGA E.coli contenant 3e plasmjde pDX313 (ap¬pelé brin WDL001) a été incubé et induit dans un fer-menteur de 1,5 litres (modèle SET002, SGI, Newhaven,East Sussex, Royaume-Uni) à 37°C pendant 5 heures. Lescellules ont été récoltées par centrifugation à 5.000gpendant 20 minutes et traitées comme suit.

a) Extraction.

Ties cellules humides sont remises en suspension (1:20,p/v) dans la solution tampon A (50mM Tris-HCl, 50mMNaCl, AmM EDTA, 5mM DTT, 10%(v/v) glycérol, ρΗΒ,Ο). Unlysozyme est ajouté à 5mg solide par ml de suspensionet le mélange est laissé à 4°C. Après 15 minutes, lemélange était soniqué (6um amplitude crête à crête)sur de la glace pendant 3 minutes au total (pousséesde 6 X 30 sec). De la DNase I a été ajoutée à raisonde 4 ug par ml de suspension et le mélange abandonnépendant 30 minutes. La suspension a été centrifugéependant 20 minutes à 18.000g(max) et le surnageantécarté.

La pastille a été remise en suspension dans la solu¬tion tampon B (25mM Hepes, 4mM urée, 5mM DTT, ph8,0)dans un rapport de 1:6 (p/v) pour obtenir une suspen¬sion fine. Celle-ci a été centrifugée à 18.000g(max)pendant 20 minutes et le surnageant écarté. La pas¬tille a été remise en suspension dans la solutiontampon C (25mM Hepes, 8M urée, 2mM DTT, pH 8,0) dansun rapport de 1:6 (p/v); avant la mise en suspension,on a ajouté:- de la leupeptine (lug/mil), de la pep-statine dug/ ml) et E64 (lug/ml). La suspension a étécentrifugée à 18.000g(max) pendant 30 minutes et lesurnageant décanté et conservé. La pastille a été re- mise en suspension dans 25 mM Hepes, SDS à 1% pH 8,0.

b) Chromatographie.

Le surganeant de la fraction de 8M d’urée a été dilué1:5 (v/v) dans 25mM Hepes, 8M urée, 2mM DTT, pH 8,0 etfractionnée sur une colonne de 7 ml Q-Sépharose. Lesprotéines ont été éluées vi a un gradi ent de sel de0-1M NaCl. La chromatographie et la manipulation desdonnées ont été contrôlées par un FPLC (Pharmacia). LeDX113 élue à environ 500 mM NaCl et est virtuellementhomogène suivant analyse SDS Page et transfertWestern.

EXEMPLE 9. Purification du polypeptide BHC-5

Des cellules Sf9 (2xl09) ont été contaminées par unstock de virus BHC-5 résultant de 1 a recombinaison(moi 5). Après incubation à 28°C pendant 2 jours, lescellules ont été récoltées par centrifugation et en¬suite traitées comme suit: a) Extraction.

La masse de cellules humides (1,2g) a été remise ensuspension dans 6msl de solution tampon A (25mM Hepes,5mM DTT, lug/ml de leupeptine, lug/ml de pepstatine,lug/mo d'E64 pH 8,0). Les cellules remises en suspen¬sion ont été placées sur de la glace et soniquées par3 secousses de 15 secondes (amplitude crête à crête 6um) séparées par des périodes de repos de 30 secondes.La suspension soniquée a été centrifugée à 18.000g(max) pendant 20 minutes et le surnageant écarté. Lapastille a été remise en suspension dans la solutiontampon A plus 4M d'urée (6mls) et centrifugée à18.000g(max) pendant 20 minutes. Le surnageant a étéécarté et la pastille ré-extraite avec la solutiontampon A plus 8M d’urée (6ml). Après centrifugation à18.000g (max) pendant 30 minutes, le surnageant a étéretenu et dilué 1:6 dans la solution tampon plus 8Murée. Cet extrait a été chromatographié sur une colon¬ne mono-Q équilibrée dans la même solution tampon. Lacolonne a été éluée au moyen d'un gradient de sel (0-1M NaCl) sur 12 volumes de colonne. Le BHC-5 a élué àenviron 0,45-0,55M NaCl et avait une pureté supérieureà -90% suivant l'estimation de SDS-PAGE. Le rendementétait d'environ 70%.

EXEMPLE 10.

Performance de DX113 et des polypeptides BHC-5 et 7dans une ELISA

Les plaques Microelisa (96 well, Nunc) ont été direc¬tement recouvertes de 50mm de solution tampon de bi¬carbonate (50mM bicarbonate de sodium et 50mM carbona- te de sodium, titrés à un pH de 9,5) avec soit un ly-sat brut de BHC-5 de 6M urée ou avec du pDX3l3 puri¬fié. Les plaques ont été bloquées avec BSA à 0,2% etensuite incubées pendant 30 minutes à 37°C avec dessérums dilués dans un rapport de 1:20 (bacille) ou1:100 (E.coli). Après lavage dans une solution saline'Tween (0,85% saline, 0,05% Tween 20, 0,0.1% Bronidox),les plaques ont été incubées avec de l*immuno-globuli-ne anti-humaine de chèvre en conjonction avec la péro-xydase (1:2000) pendant 30 minutes à 37°C. Les plaquesont alors été lavées dans une solution saline Tween etcolorées en ajoutant le substrat chromogénique TMB(tétraméthyl-benzidine-HCl) (lOOul/cupule) et en incu¬bant pendant 20 minutes à température ambiante. La ré¬action a été arrêtée avec 50 ul d'acide sulphurique 2Met 1’OD450 déterminée (Tableau 4).

TABLEAU 4

Format ELISA Ig anti-humain indirect pour ladétection des anticorps NANB

Les sérums de patients à haut risque d'infection PT-NANBH (IVDA's, hémophiles) ont été essayés comme dé¬crit; toutes les données sont exprimées sous forme delectures 0D450.

Le donneur accrédité sert de contrôle négatif. Dans cegroupe particulier de sérums, 10/19 sont positifs dansles deux phases solides.

En outre, le DX113 a été conjugé à une phosphatase al¬caline au moyen d'une réduction SATA/maléimide et uneanalyse immunométrique a été réalisée. Les sérums NANBpositifs et négatifs connus ont été dilués comme indi¬qué dans le sérum du donneur accrédité et ajoutés àune phase solide recouverte de BHC-7. Soit simultané¬ment ou après incubation (30 minutes à 37°C) , on aajouté le conjugué DX113 (50ul , 1:2000). Après incuba¬tion à 37°C pendant 30 minutes, les plaques ont étélavées avec une solution tampon de 50mM de bicarbonateet colorées au moyen d'un système d'amplification IQBio et l'OD 492 déterminé (Tableau 5).

TABLEAU 5

ELISA immunométrique (polypeptide marqué)pour la détection d'anticorps NANB

Positifs Négatifs Donneur ac- dans l'essai dans l'essai? crédité >2 0,217 0,234 0,823 0,252 >2 0,214 0,542 0,257 0,876 0,308 1,583 0,278 >2 0,296 >2 0,273 1,830 0,262 >2 0,251 EXEMPLE 11. Formulation de vaccin

Une formulation de vaccin peut être préparée par destechniques conventionnelles au moyen des constituantssuivants dans les quantités indiquées:

Polypeptide viral PT-NANBH > 0,36 mg

Thiomersal 0,04-0,2 mg

Chlorure de sodium < 8,5 mg

Ea u 1 ml EXEMPLE 12.

Production d'anticorps monoclonaux contre les polypep¬tides PT-NANBH

L'insert ADN du DM415 a été sous-cloné dans le vecteurp36C de transfert du bacillovirus et le virus résul¬tant de la recombinaison produit par une méthode es¬sentiellement similaire à celle décrite à l'Exemple 7.Tie virus résultant de la recombinaison a été appeléBHC-3 et présentait de très faibles niveaux de protéi¬ne spécifique à PT-NANBH. Des cellules Sf-9 (5xl07ce33ules/ml) contaminées avec BHC-3 ont été 3yséesdans du PBS contenant 1% (v/v) NP40 et centrifugées à13000g pendant 2 minutes. Le surnageant a été passésur Extraetigel-D (Pierce Chemicals) pour retirer ledétergent et ensuite mélangé sous forme d'émulsion 3:3avec un adjuvant complet de Freund. On a effectué uneinjection sous-cutanée de 0,1ml d'émulsion (équivalentà 5xl06· cellules) à des souris. 14 et 28 jours sui¬vant l’injection, on a fait aux souris une injectionintrapéritonéale de 0,1ml (équivalant à 5xl06 cellu¬les) d'un extrait exempt de détergent de cellules Sf-9contaminées par BHC-7; le BHC-7 contient un insert ADNproduit en ligaturant ensemble les régions de chevau¬chement de DM415 et DM416 (Exemple 7). Elles ont subi. une ablation de la rate trois jours plus tard.

Les cellules de rate ont été fondues avec des cellulesde myélome NSo en présence de PEG1500 en utilisant destechniques type. Les cellules d'hybridome en résultantont été choisies par croissance dans un milieu HAT(hypoxanthine, aminoptérine, thymidine). 10-14 jours après la fusion, le surnageant a été examiné de maniè¬re sélective par ELISA pour constater l'activité anti-PT-NANRH. Les cupules qui montraient une réactivité àla fois aux antigènes DX113 et BHC-7 (Exemple 10) ontété identifiées et 3es colonies individuelles ont ététransférées dans d'autres cupules, Incubées et re-tes-tées. Les cupules présentant une réactivité spécifiqueà ce stade ont été re-clonés à une dilution limitéepour assurer 3a monoclonalité.

EXEMPLE 13. Détection de l’acide nucléique viral PT-NANBH chez des patients séropositifs Sérums: Les échantillons de 1400 donneurs enrôlés dans une étude prospective sur l'hépatite post-transfu¬sionnelle ont été congelés à -20°C. Des échantillonsavant transfusion et après transfusion sériels des 260récipients ont été stockés de la même manière. Leséchantillons d'après la transfusion ont été prélevéstous les quinze jours pendant 3 mois, une fois par mois pendant 6 mois et 6 mois plus tard, jusqu'à 18mois. Les sérums gelés du donneur et du récipientrelatifs à trois incidents de PT-NANBH survenus en1981 étaient également disponibles pour étude. Lediagnostic de la PT-NANBH était basé sur une augmenta¬tion de la transférase de l'acide aminé alanine du sé¬rum (ALT), dépassant 2,5 fois la limite supérieure àla normale dans au moins deux échantillons séparésaprès transfusion. D'autres virus hépatotropes ont étéexclus par des essais sérologiques et les causes nonvirales de lésion hépatocellulaire ont été exclues pardes études conventionnelles cliniques et en laboratoi¬re.

Immuno-dosage: Des échantillons de sérum ont été tes¬ tés rétrospectivement afin de détecter la présenced'anticorps contre l'HCV (antigène C100) au moyen dukit Ortho Diagnostics ELISA utilisé d'après les ins¬tructions du fabricant. Des sérums réactifs à plu¬sieurs reprises ont été titrés jusqu'au point finaldans un sérum humain négatif pour 1'anti-C100.

Détection des séquences virales PT-NANBH: L'ARN du sé¬rum ou du plasma a été extrait, soumis à transcriptaseinverse et amplifié comme dit ci-dessous. Les amorcesoligonucléotides de la transcriptase inverse/PCR ontété dérivées de la séquence de nucléotide du clone JG2isolé dans 1'EXEMPLE 3, et synthétisées sur un synthé¬tiseur Applied Biosystems 383A. Les séquences des qua¬tre amorces oligonucléotides ont été les suivantes: Désignation SEQ IP N° Dimension du produit d94 sens 8 829bp d95 anti-sens 9 NI sens 10 402bp N2 anti-sens 11

(i) Extraction ARN

5-50ul de sérum (ou de plasma) ont été portés à 200ulen ' ajoutant de 1‘eau distillée stérile. L'échantillonde 200ul a été ajouté à un volume égal de solution tampon 2 x PK (2 x PK = 0. 2M TrisCl, pH 7,5, 25mMEDTA, 0,3M NaCl, 2% w/v SDS, protéinase K 200ug/ml),

mélangé et incubé à 37°C pendant 40 minutes. Les pro¬téines ont été enlevées en extrayant deux fois avec duphénol/chloroforme et une fois avec du chloroformeseulement. On a ajouté 20ug de glycogène à la phaseaqueuse et l'ARN a alors été précipité en ajoutant 3volumes d'éthanol absolu glacé. Après stockage à -70°C

pendant 1 heure, 1’ARN a été pastillé dans une centri¬fugeuse Eppendorf (15 minutes, 14000 t/min, 4^0) . Lapastille a été lavée une fois dans de l'éthanol à 95%,séchée sous vide et dissoute dans lOul d'eau distilléestérile. Les solutions d’ARN ont été stockées à -70°C.

(ii) Synthèse ADNc

Un mélange de lOul contenant 2ul de solution d'ARN,50ng d’oligonucléotide synthétique d95, lOmM Hepes-HC3pH 6,9 et 0,2mM EDTA pH8,0 a été préparé. Ce mélangede lOul a été recouvert de 2 gouttes d'huile minérale,chauffé pendant 2 minutes dans un bain d’eau à 90°c etrapidement refroidi sur de la glace. La synthèse del’ADNc s'est effectuée après ajustement de la réactionde manière à ce qu'elle contienne 50mM Tris-HCl pH7,5,75mM KC.l, 3mM Mg012 , lOmM DTT,0,5mM de dATP, dCTP,dGTP et dTTP, 20 unités d'inhibiteur RNase (Pharmacia)et 15 unités de transcriptase inverse MLV cloné (Phar¬macia) dans un volume final de 20ul. Le mélange de20ul a été incubé à 37°C pendant 90 minutes. Aprèssynthèse, l'ADNc a été stocké à -20°C.

(iii) "Nested" PCR

Tout au long de cette étude, des résultats de PCR po¬sitifs erronés ont été évités en appliquant stricte¬ment les mesures de prévention de la contamination deKwok et Higuchi (Nature, 1989, 339, 237-238).

a) Tour I

La réaction en chaîne de polymérase s'est effectuéedans un mélange de 50ul contenant lOmM Tris-HCl pH8,3,50mM KC1, l,5mM MgCl2, de la gélative à 0,1% p/v, 1unité de polymérase ADN Taq résultant de la recombi¬naison (Perkin Elmer Cetus), 200uM de dNTP, 30ng de chaque amorce "externe" (d94 et d95; SEQ ID n° 8 et 9respectivement) et 5ul de solution d'ADNc. Après unepremière dénaturation de 5 minutes à 94°C, 35 cyclesde 95°C pendant 1,2 minutes, 56°C pendant 1 minute,72°C pendant 1 minute ont été effectués, suivis d'uneextension finale de 7 minutes à 72°C (Techne PHC-1.Automated Thermal Cycler).

b) Tour 2

Le mélange réactionnel était comme décrit ci-dessuspour le Tour I, mais 125ng de chaque amorce "inter¬ne", NI et N2 (SEQ ID n° 10 et 11 respectivement) ontété utilisés au lieu des amorces "externes" d94 etd95. Un petit échantillon d'iul des produits PCR duTour J a été transiéré dans le mélange réactionnel de50ul du Tour 2. 25 cycles de 95°C pendant 1,2 minutes,46°C pendant 1 minute, 72°C pendant 1 minute, ont été effectués, suivis d'une extension à 72°C pendant 7minutes.

c) Analyse 20 ul des produits PCR du Tour 1 et du Tour 2 ont étéanalysés par électrophorèse sur un ge] agarose à 2%.Des bandes ont été visualisées par coloration au bro¬mure d'éthidium et photographiées à 302nm.

Valeur de prédiction de la sérologie anti-C100 et PCRdans l'étude prospective: Six des 1400 donneurs (0,43%) enrôlés dans l'étude prospective ont présentédes anticorps contre le C100 dans leur sérum. Parmices six donneurs aux anticorps positifs, un seulement(le donneur D6) s'est avéré être contaminé comme on apu l’apprécier par le développement de la séroconver¬sion PT-NANBH et HCV dans un récipient (récipient R6)- cfr tableau 6 ci-dessous.

Les séquences virales ont été détectées par PCR dansle sérum du donneur D6 mais pas dans les sérums descinq autres donneurs séropositifs. Le récipient R6 oùs'est développé la pT-NANBH avait également reçu dusang de sept autres donneurs (D7 à DI3). Les sérums deces donneurs ont été testés et se sont avérés négatifsà la fois pour les anticorps et pour le PCR.

TABLEAU 6 RESUME DES DONNEES DONNEUR/RECIPIENT:

ETUDE PROSPECTIVE

DONNEURS RECIPIENTS

Donneur anti-HCV PCR Récipient PT-NANBH Séro¬conver¬sionanti-HCV

D2 + - RI Non Non D2 + - R2 Non Non D3 + - R3 Non Non D4 + - R4 Non Non D5 + - R5 Non Non D6 + + D7 - D8 - D9 R6 Oui* Oui* D10DUD12DI 3 * Période d'incubation 1 mois+ Séroconversion 5 mois après la transfusion EXEMPLE 14.

Isolation et Expression de Séquences d'ADN PT-NANBHsupplémentaires

Les bibliothèques lambda gtll préparées à l'Exemple 2ont également été sélectionnées avec les sérums de pa¬tients à haut risque pour le PT-NANBH mais qui n'ontpas réagi aux antigènes viraux, DX113, BHC-5 et BHC-7,le raisonnement étant qu'ils pourraient bien contenirdes anticorps qui reconnaissent différents antigènes.Les sérums PJ-5 (The Newcastle Royal Infirmary, New¬castle) , Birm-64 (Queen Elizabeth Medical Centre, Bir¬mingham) , PO et Le (University College and MiddlesexSchool of Medicine, Londres) satisfaisaient à ce cri¬tère et ont été utilisés pour sélectionner les biblio¬thèques suivant une procédure identique à celle décri¬te dans les Exemples 3 et 4. Une série d'éléments ré¬sultant de la recombinaison ont. donc été identifiés,dont aucun ne s'est croisé avec des sondes de JG2 etJG3. L'un des produits de recombinaison, BRU, iden¬tifié par réaction avec PJ-5, a été choisi pour pour¬suivre l’analyse.

Le clone, BRU, contenait un insert d’environ 900bpqui a été amplifié par PCR au moyen des amorces d75 etd76 (SEQ ID n° 6 et 7) comme décrit à l'Exemple 7. Laséquence amplifiée a été directement clonée dans levecteur bacillovirus pAc360 pour former du pDX128 con¬tenant un cadre de lecture ouvert en phase avec les 11premiers acides aminés de la polyhédrine. Les stocksde bacillovirus résultant de la recombinaison (appelésBHC-9) ont été produits suivant la procédure décrite àl’Exemple 7. Des cellules d’insectes ont été contami¬nées avec un virus résultant de la recombinaison puri¬fié et un polypeptide d’environ 22kD a été obtenu dansdes extraits de cellule marqués radioactivement.

L’insert amplifié de BRU a également été cloné dansle vecteur phage pUC13 et M13 pour mise en séquence;l'ADN et les données de séquence des acides aminéssont présentés en SEQ ID n° 5. L'insert contient 834bp plus les linkers EcoRJ ajoutés pendant le clonage.

EXEMPLE 15.

Performance du polypeptide ΒΗΓ.-9 dans une ELISA

Une ELISA a été établie au moyen de cupules de micro¬titrage revêtues d'un extrait de cellule infectée RHC-9 et d'un système de détection de conjugué Ig ant.j-humain suivant la procédure décrite à l'Exemple 10.

Une panoplie de sérums à haut risque a été testée enparallèle avec BHC-7 et BHC-9 et a également été exa¬minée par PCR au moyen de la méthode décrite à l'Exem¬ple 13. Les résultats sont indiqués au Tableau 7 danslequel les échantillons positifs sont soulignés.

TABLEAU 7

Numéro PCR BHC-7 BHC-9 1 + 2,09 2,0 2 + 2,09 2,0 3 + 1,89 1,37 4 + 1,57 0,27 5 + 1,26 2,00 6 + 0,91 2,0 7 - 0,90 0,51 8 + 0.84 1,19 9 - 0,53 0,43 10 . - 0,45 2,0 11 + 0,37 1,07 12 - 0,32 2,00 13 0,23 0,30 14 - 0,15 0,43 15 + 0,16 0,76 36 - 0,09 1,74 17 - 0,27 2,00 18 - 0,15 2,00 19 - 0,12 2,00 20 - 0,08 0,05 coupure 0,27 0,29

De ces 20 échantillons, 50% sont manifestement posi¬tifs avec le BHC-7 alors que 85% sont positifs avec leBHC-9. Deux échantillons (11 & 12) qui sont à la limi¬te du positif avec le BHC-7 sont clairement positifsavec le BHC-9 et certains échantillons qui sont au ni¬veau de la coupure ou en-dessous avec le BHC-7 sontpositifs avec le BHC-9. De plus, deux échantillons (11 6 15) qui étaient à la limite ou négatifs avec le BHC- 7 mais positifs avec le BHC-9 sont PCR positifs.

Dans l'ensemble il n'y a que deux échantillons (13 &20) qui sont négatifs avec les deux polypeptides et lePCR.

EXEMPLE 16.

Isolation des séquences d'ADN PT-NANBH chevauchant desclones existants

La sélection immunologique des bibliothèques d'expres¬sion ADNc décrites aux Exemples 3,4 et 14 ne peutidentifier que les clones qui contiennent une régionimmuno-réactive du virus. Une autre approche de la production de clones spécifiques à la PT-NANRH estd'utiliser le PCR pour amplifier les molécules d'ADNoqui chevauchent les clones existants. Des jeux d'a¬morces peuvent être préparés lorsqu'un membre de lapaire se trouve dans des séquences clonées existanteset l'autre en-dehors; cette approche peut être étendueaux paires d'amorces "nichées" également.

L'ADNc préparé comme à l'Exemple 1 a été amplifié parPCR, avec des paires d'amorces simples ou "nichées",au moyen des conditions de réaction décrites à l'Exem¬ple 13. L'approche est illustrée par l'utilisation despaires d’amorces suivantes: dl64 (SEA ID n°: 12) etdl37 (SEQ ID n° 16); dl36 (SEQ ID n5: 14) et d355 (SEQID n°: 15); dl56 (SEQ ID n° 16) et d92 (SEQ n° 17). Unmembre de chaque paire est conçu pour amorcer dans lesséquences clonées existantes (dl37 et d136 amorcentrespectivement dans les extrémités 5‘ et 3) de BRU,d92 amorce l’extrémité 5’ de JG3). Les autres amorcessont basées sur des séquences disponibles pour d'au¬tres agents PT-NANBH. L’amorce d!64 correspond auxbases 10 à 33 de la figure 2 dans Okamoto et al, Ja¬pan , J. Exp. Med. , 1990, 60, 167-177). lies amorcesdl55 et d356 correspondent aux positions 462 à 489 et3315 à 3337 respectivement de la figure 47 de la de¬mande de brevet européen 88330922.5. Une ou plusieurssubstitutions de nucléotides peuvent se faire pour in¬troduire un site de reconnaissance EcoRI près de l'ex¬trémité 5' des amorces, sauf pour dl64 où un site dereconnaissance Bgl2 a été introduit; ces changementsfacilitent le clonage ultérieur du produit amplifié.

Les produits PCR ont été digérés par l'enzyme/lesenzymes réducteur(s) approprié(s), décomposés parélectrophorèse sur gel agarose et des bandes de ladimension attendue ont été excisées et clonées envecteurs plasmides et bactériophages tels que décritsà l'Exemple 5. Les séquences des ADN amplifiés 164/137(SEQ ID n° 38), 136/355 (SEQ ID n° 19) et 156/92 (SEQID n° 20) sont présentées dans la liste des séquences.Ces nouvelles séquences étendent la couverture du gé¬nome PT-NANBH au-delà de celle obtenue par immuno-sélection (SEQ ID n° 3,4 & 5). Ces séquences, ainsiqué d'autres qui se trouvent dans les régions déjàdécrites, peuvent être combinées en une séquence con¬tinue à l’extrémité 5' (SEQ TD n° 21) et à l'extrémité3' (SEQ JD n° 22) du génome PT-NANRH.

EXEMPLE 17.

Fusion de différents antigènes PT-NANBH en un seulpolypeptide résultant de la recombinaison

Les données présentés au Tableau 7 indiquent qu'alorsqu'on détecte plus d'échantillons de sérum anticorpspositifs en utilisant BHC-9 comme antigène cible(17/20) plutôt que BHC-7 (10/20), il y a certainséchantillons (par ex., #4) qui ne sont positifs qu’a¬vec BHC-7. Cette image est confirmée par la poursuitedes essais. De même, un construct de fusion a été in¬duit au moyen de la séquence à partir de BHC-7 etBHC-9.

Les séquences de RHC-7 et BHC-9 peuvent être combinéesde toute une série de manières: chaque séquence peutêtre positionnée au terminal de l'acide aminé de lafusion résultante et la nature de la séquence de liai¬son peut également varier. La figure 2 illustre deuxmanières possibles de combiner ces séquences.

Les fragments de restriction appropriés portant dessites d'enzymes réducteurs appropriés et des séquencesde linker ont été générés soit par PCR au moyen d'a¬morces spécifiques ou par digestion des plasmides ex¬istants par les enzymes de digestion. Le vecteur de•transfert DW] 43 consiste en un fragment BamHl/Pstl deDX122 (figure 1; le site Pst est à la position 1.504JG2, SEQ ID n° 3) lié à l'extrémité 5* de l'ensemblede la région de programmation de BRU (SEQ ID n° 7)qui a été amplifiée en tant que fragment de Pstl/BamHl

utilisant des amorces d24 (SEQ ID n° 23) et dl26 (SEQ

ID n° 24); la région de liaison consiste en six acidesaminés dérivés de l'amorce dl26 et en séquences lambdabactériophages résiduelles. Le vecteur de transfertDX136 diffère de DX143 en ce que le fragment BRU aété généré au moyen de d24 (SEQ ID n° 23) et dl32 (SEQ

TD n° 25) et ainsi la région de liaison contient cinq lysines. Ces vecteurs de transfert ont été utiliséspour co-transfecter des cellules Sf-9 d’insectes enculture avec 3'ADN AcNPV et des stocks purifiés deplaques de bacil!ovirus résultant de la recombinaisonont été produits comme décrit à l'Exemple 7. BHC-10 aété produit comme résultat de la transfection avecDX143; BHC-]3 comme résultat de la transfection avecDX136.

Les polypeptides résultant de la recombinaison expri¬més par ces deux virus ont été analysés par SDS-PAGEet transfert Western. Le BHC-10 a produit un polypep¬tide avec un poids moléculaire apparent de 118kDa. LeBHC-11 a produit un polypeptide avec un poids molécu¬laire apparent de 96kDa. Les deux polypeptides ont ré¬agi avec des sérums connus pour réagir dans ELISA uni¬quement avec RHC-7 (par ex., sérum A) ou uniquement avec BHC-9 (sérum B64, exemple 34). Les deux polypep¬tides ne diffèrent que dans la séquence de liaison et ceci peut affecter soit leur mobilité sur SDS-PAGE oula manière dont ils sont traités dans les cellulesinf ectées.

EXEMPLE 18.

Performance des antigènes de fusion PT-NANBH dans uneELISA

Une ELTSA a été établie au moyen de cupules de micro¬titrage recouvertes d’extraits de cellule infectées auBHC-9 et d'un conjugué Ig anti-humain suivant la pro¬cédure décrite à l’Exemple 10. Le tableau 8 présenteles données à partir d'une comparaison des deux fu¬sions avec les autres antigènes PT-NANBH résultant dela recombinaison BHC-7 et BHC-9 ainsi que la protéinerésultant de la recombinaison HCV, C-100-3 (Ortho Dia¬gnostic Systems, Raritan, New Jersey). Les sérums sontgroupés par modèle de réaction avec BHC-7, BHC-9 etC-100-3. Les sérums du Groupe I réagissent violemmentavec les trois antigènes? le Groupe II réagit violem¬ment avec BHC-7 uniquement; le Groupe III réagit vio¬lemment avec BHC-9 uniquement et le Groupe IV réagitviolemment avec seulement deux des trois antigènes.

TABLEAU 8 SERUM BHC-7 BHC-9 0100-3 BHC-10 BHC-11

Groupe I

AH >3,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 AC >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 57 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 77 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 34 1,4 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0

Groupe II 1 nQ ,* 805-6>2,0 0,261 0,1 1,78 805-17 . >2,0· 0,181 0,12 1,37 805-149' >2,0 0,651 0,084 1,57

Groupe III

JS 0,32 >2,0 0,17 >2,0 >2,0 805-57 0,069 1,403 0,25 1,9 +* •805-82 0,116 1,272 0,4 1,85 ++* 805-94 0,353 1,675 0,2 >2,0 +* PJ1 0,27 >2,0 0,2 >2,0 1,85

Groupe IV

A >2,0 0,14 >2,0 >2,0 >2,0 KT 3,57 0,27 >2,0 >,20 >2,0

Le 0,152 >2,0 >2,0 >,20 >2,0 PJ5 0,123 >2,0 >2,0 >,20 >2,0 303-923 >2,0 0,9 0,37 1,9 +* 303-939 >2,0 2,55 0,268 2,0 +* .

* Ces échantillons n'ont été testés que par transfert.Western sur RHC-13.

Ces données montrent, qu'à la fois BHC-10 et. BHOlt ont.une .réactivité similaire avec ces sérums et, ce quiest plus Important, que les deux activités antigèni¬ques semblent, avoir été retenues par les fusions. Tousles sérums des Groupes TT & ITT qui ne réagissent res¬pectivement qu'avec BHC-7 ou RHC-9, donnent, une réac¬tion claire avec les fusions. En outre .il sembleraitqu'avoir les deux antigènes ensemble donne un essaiplus sensible. Par exemple, l'échantillon KT donne desOD de 1,57 et 0,27 avec BHC-7 et BHC-9 respectivement-,alors qu'avec les fusions, l'OD est >2,0.

SEQ TD N°: 1

TYPE SEQUENCE: NucléotideLONGUEUR SEQUENCE: 21 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: bactériophage lambda gtj1SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo dl9 CARACTERISTIQUES: de 1 à 21 bases homologues à la partie amont du gènelacZ flanquant le site EcoRl dans le bactériophagelambda gtll PROPRIETES: amorce la synthèse de l’ADN à partir du vecteur phage dans l'ADNc inséré au site d'EcoRl.

" GGTGGCGACG ACTCCTGGAG C 21 SEQ ID N°: 2

TYPE SEQUENCE: NucléotideLONGUEUR SEQUENCE: 21 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: bactériophage lambda gtllSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo d20 CARACTERISTIQUES: de 1 à 21 bases homologues à la partie amont du gènelacZ flanquant le site EcoRl dans le bactériophagelambda gtll PROPRIETES: amorce la synthèse de 1'ADN à partir du vecteur phage dans l'ADNc inséré au site d'EcoRl.

'TTGACACCAG ACCAACTGGT a 21 SEQ ID N°: 3

TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondanteLONGUEUR SEQUENCE: 1770 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADNc à ARN génomique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone JG2 de biblio¬thèque ADNc dans lambda gtll CARACTERISTIQUES:

de 1 à 1770 bp portion de la polyprotéine PT-NANBH

PROPRIETES: encode probablement protéines virales non structurelles , CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG 48

Gin Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp 5 10 15 CGG CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAC, 96

Arg His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys 20 25 30 GTA GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG 144

Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu 35 40 45 CGG GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA TCC AAG AAA TTC 192

Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe 50 55 60 CCA CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC AAC CCT CCG CTG 240

Pro Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu 65 70 75 80 CTG GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG 288

Leu Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly 85 90 95 TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA 336

Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg 100 105 110 AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG 384

Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala 115 120 325 GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTT GGT AGC TCC GGA CCG TCG GCC GTC GAC 432

Glu Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp 130 135 140 AGC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA 480

Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gin Ser Ser Asp Asp Gly Gly 145 150 155 160 GCA GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG 528Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro lieu Glu Gly 165 370 175 GAG CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGT 576Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser180 185 190 GAG GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG TCC TAC ACA TGG 624Glu Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp195 200 205 ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA AGC AAG CTG CCC 672Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro210 215 220 ATC AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC AÀC ATG GTC TAC 720Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr225 230 235 240 GCT ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAG AAG GTC ACC TTT 768Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg Gin Lys Lys Val Thr Phe 245 250 255 GAC AGA CTG CAA ATC CTG GAC GAT CAC TAC CAG GAC GTG CTC AAG GAG 816Asp Arg Leu Gin Tie Leu Asp Asp His Tyr Gin Asp Val Leu Lys Glu260 265 270 ATG AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAG CTT CTA TCA GTA GAG 864Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu Leu Ser Val Glu275 280 285 GAA GCC TGC AAG CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA TCT AAA TTT GGC 932Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly290 295 300 TAT GGG GCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AAG GCC ATT AAC CAC 960Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys Ala lie Asn His305 310 315 320 ATC CGC TCC GTG TGG GAG GAC TTG TTG GAA GAC ACT GAA ACA CCA ATT 1008Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr Glu Thr Pro lie 325 330 335 GAC ACC ACC ATC ATG GCA AAA AAT GAG GTT TTC TGC GTC CAA CCA GAG 1056Asp Thr Thr Tie Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gin Pro Glu340 345 350 AGA GGA GGC CGC AAG CCA GCT CGC CTT ATC GTG TTC CCA GAC TTG GGG U04Arg Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Tie Val Phe Pro Asp Leu Gly355 360 365 GTC CGT GTG TGC GAG AAA ATG GCC CTC TAT GAC GTG GTC TCC ACC CTC H52Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val Val Ser Thr Leu370 375 380 CCT CAG GCT GTG ATG GGC TCC TCG TAC GGA TTC CAG TAT TCT CCT GGA 1200Pro Gin Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gin Tyr Ser Pro Gly385 390 395 400 CAG CGG GTC GAG TTC CTG GTG AAC GCC TGG AAA TCA AAG AAG ACC CCT 1248Gin Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro 405 410 415 ATG GGC TTT GCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA ACA GTC ACT GAG 1296Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu420 425 430 AAT GAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TGT TGT GAC TTG GCC 1344Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser lie Tyr Gin Cys Cys Asp Leu Ala435 440 445 CCC GAA GCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG CGG CTT TAT ATC 1392Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr lie450 455 460 GGG GGT CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AAC TGC GGC TAT CGC CGG 1440Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gin Asn Cys Gly Tyr Arg Arg465 470 475 480 TGC CGC GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT AAT ACC CTC ACA 1488Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr 485 490 495 TGT TAC TTG AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA AAG CTC CAG GAC 1536Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gin Asp500 505 510 TGC ACG ATG CTC GTG TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT ATC TGT GAG AGC 1584Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val lie Cys Glu Ser515 520 525 GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AGC CTA CGA GTC TTC ACG GAG GCT 1632Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val Phe Thr Glu Ala530 535 540 ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC CAA CCA GAA TAC 1680

Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gin Pro Glu Tyr 545 550 555 560 GAC CTG GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG TCG GTC GCG CAC 1728

Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His 565 570 575 GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT GAC CCG 1770

Asp Ala Ser G.ly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro580 585 590 SEQ ID N°: 4

TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondanteLONGUEUR SEQUENCE: 1035 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADNc à ARN génomique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone JG3 de biblio¬thèque ADNc dans lambda gtll CARACTERISTIQUES:

de 1 à 1035 bp portion de 1 a polyprotéine PT-NANBH

PROPRIETES: encode probablement protéines virales non structurelles ... ACA G AA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC GCT CCG GCG TGC AAA 48

Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Lys 5 10 15 CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC GGG CTC AAC CAA TAC 96

Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val Gly Leu Asn Gin Tyr 20 25 · 30 CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA CCG GAT GTA GCA GTG 144

Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val 35 40. 45 CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC ACA GCA GAG ACG GCT 192

Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala 50 55 60 AAG CG-C AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC TTG GCC AGC TCT TCA 240Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser65 70 75 80 GCT AGC CAG TTG TCT GGC CCT TCC TCG AAG GCG ACA TAC ATT ACC CAA 288

Ala Ser Gin Leu Ser Gly Pro Ser Ser Lys Ala Thr Tyr Ile Thr Gin 85 90 95 AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG CGG 336

Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg 100 105 110 CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG GTA 384

His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val 115 120 125 GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG CGG 432Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu Arg130 135 140 GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA TCC AAG AAA TTC CCA 480Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro145 150 155 160 CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC AAC CCT CCG CTG CTG 528Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu 165 170 175 GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG TGC 576

Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly Cys 180 185 190 CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA AAG 624

Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys 195 . 200 205 -AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG GAG 672Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala Glu210 215 220 CTT GCC ACA AAG GCT TTT GGT AGC TCC GGA CCG TCG GCC GTC GAC AGC 720Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp Ser225 230 235 240 GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA GCA 768Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gin Ser Ser Asp Asp Gly Gly Ala 245 250 255 GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG GAG 816Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu260 265 270 CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGT GAG 864Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Glu275 280 285 GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG TCC TAC ACA TGG ACA 912Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr290. 295 300 GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA AGC AAG CTG CCC ATC 960Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile305 310 315 320 AAC GCG· TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC. CAC AAC ATG GTC TAC GCT 1008Asn Ala Leu Ser Asn Ser I.eu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr Ala 325 330 335 ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG 1035

Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg340 345 SEQ ID N°: 5

TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondanteLONGUEUR SEQUENCE: 834 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADNc à ARN génomique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone BR11 de bibli¬othèque ADNc dans lambda gtll CARACTERISTIQUES :

de 1 à 834 bp portion de la polyprotéine PT-NANBH

PROPRIETES: encode probablement protéines virales structurelles AGA A AA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CTC CGC CCA CAG GAC GTC AGG TTC 48

Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Leu Arg Pro Gin Asp Val Arg Phe 5 10 15 CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG 96

Pro Gly Gly Gly Gin Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg 20 25 30 GGC CGC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG 144

Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser 35 40 45 CAA CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG 192

Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gin Pro Glu 50 55 60 GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC 240

Gly Arg Ala Trp Ala Gin Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn 65 70 75 80 GAG GGC ATG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT GGC TCC CGG 288

Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg 85 90 95 CCT AGT TGG GGC CCC ACT GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT 336

Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly 100 105 110 AAA GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC GAC TCT CAT GGG GTA 384

Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Ser His Gly Val 115 120 125 CAT TCC GCT CGT"CGG CGC TCC CTT AGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG 432

His Ser Ala Arg Arg Arg Ser Leu Arg Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala 130 135 140 CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT 480

His Gly Val Arg Va] Leu Glu Asp G]y Va3 Asn Tyr Ala Thr Gly Asn 145 150 155 160 TTA CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT 528

Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys 165 170 175 TTG ACC ATT CCA GCT TCC GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATC 576

Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile 180 185 190 TAC CAT GTC ACG AAC GAT TGC TCC AAC TCA AGC ATC GTG TAC GAG ACA 624

Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr 195 · 200 205 - GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGT GTG CCC TGT GTC CGG GAG 672

Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu 210 215 220 GGT AAT TCC TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC 720

Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala 225 ' 230 235 240 AAG GÀC GCC AGC ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG 768

Lys Asp Ala Ser Ile Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu 245 250 255 CTC GTT GGG GCG GCT GCC TTC TCG TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC 816

Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Ser Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu 260 265 270 TGC GGA TCT GTT TTC CCG 834

Cys Gly Ser Va] Phe Pro275 SEQ ID N°: 6

TYPE SEQUENCE: NucléotideLONGUEUR SEQUENCE: 31 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: bactériophage lambda gtllSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo d75 CARACTERISTIQUES: de 4 à 9 bases site BamHl de 10 à 31 bases homologues à la portion amont du gènelacZ flanquant le site EcoRl dans le bactériophagelambda gtll de 26 à 31 bases site EcoRl PROPRIETES: amorce la synthèse à partir du vecteur phage dans l'ADNc inséré au site d'EcoRl et introduit-un site BamHl approprié pour le clonage ultérieur envecteurs d'expression.

TAAGGATCCC CCGTCAGTAT CGGCGGAATT C 31 SEQ ID N°: 7

TYPE SEQUENCE: NucléotideLONGUEUR SEQUENCE: 30 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: bactériophage lambda gtllSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo d76 CARACTERISTIQUES : de 4 à 9 bases site BamHl de 10 à 30 bases homologues à la portion aval du gènelacZ flanquant le site EcoRl dans le bactériophagelambda gtll PROPRIETES: amorce la synthèse de 1'ADN à partir du vecteur phage dans l’ADNc inséré au site d'EcoRI et"introduit un site BamHl approprié pour le clonageultérieur en vecteurs d'expression.

TATGGATCCG TAGCGACCGG CGCTCAGCTG 30 SEQ ID N°: 8

TYPE SEQUENCE: NucléotideLONGUEUR SEQUENCE: 19 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo d94 CARACTERISTIQUES: de 1 à 19 bases homologues aux bases 914 à 932 du brinde sens de JG2 (SEQ ID n° 3} PROPRIETES: amorce la synthèse de 1'ADN sur le brin négatif de 1’ÄRN/ADN génomique de la PT-NANBH.

ATGGGGCAAA GGACGTCCG 1 9 SEQ ID N°: 9

TYPE SEQUENCE: NucléotideLONGUEUR SEQUENCE: 24 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo d95 CARACTERISTIQUES: de 1 à 24 bases homologues aux bases 1620 à 1643 dubrin anti-sens de JG2 (SEQ ID n° 3) PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH.

TACCTAGTC.A TAGCCTCCGT G AA G 24 SEQ ID N°: 10 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 17 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo NI

CARACTERISTIQUES : de 1 à 17 bases homologues aux bases 1033 à 1049 dubrin du sens de JG2 (SEQ ID n° 3) PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le brin négatif de 1IARN/ADN génomique de la PT-NANBH.

GAGGTTTTCT GCGTCCA 17 SEQ ID N°: 11 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 17 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo N2 CARACTERISTIQUES: de 1 à 17 bases homologues aux bases 1421 à 1437 dubrin anti-sens de JG2 (SEQ ID n° 3} PROPRIETES: amorce la synthèse de 1'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH.

GCGATAGCCG CAGTTCT 17 SEQ ID N°: 12 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 22 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo dl64 CARACTERISTIQUES :

de 1 à 22 bases homologues aux bases 10 à 31 de laséquence à la fig. 2 d'Okamoto et aJL, Japan, J♦ Exp.Med., 1990, 60, 166-167, base 22 changée de A en T

pour introduire un site de reconnaissance du Bg 12de 8 à 13 bases du site de reconnaissance Bgl2 PROPRIETES: amorce la synthèse de l’ADN sur le brin .négatif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in¬troduit un site Bgl2.

CCACCATAGA TCTCTCCCCT GT 22 SEQ ID N°: 13 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 30 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D’ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-Af non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo d!37 CARACTERISTIQUES: de 1 à 30 bases homologues aux bases 154 à 183 du brinnégatif de BRU (SEQ ID n° 5); bases 174, 177 et 178modifiées pour introduire un site de reconnaissanced’EcoRl.

de 5 à 10 bases de site de reconnaissance d'EcoRl.

PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in¬troduit un site EcoRl pour clonage.

GCGAGAATTC GGGATAGGTT GTCGCCTTCC 30 SEQ TD N°: 14 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 27 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D’ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo dl36 CARACTERISTIQUES: de 1 à 27 bases homologues aux bases 672 à 698 du brinpositif de BRU (SEQ ID n° 5); base 675 changée en Gpour introduire un site de reconnaissance d'EcoRl.de 5 à 10 bases de site de reconnaissance d'EcoRl.

.PROPRIETES: amorce la synthèse de 1'ADN sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in¬troduit un site EcoRl pour clonage.

GGGGAATTCC TCCCGCTGCT GGGTAGC 27 SEQ ID N°: 15 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 28 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: chimpanzé; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo dl55 CARACTERISTIQUES : de 1 à 28 bases homologues aux bases 462 à 489 du brinnégatif de la figure 47, demande de brevet européen88310922.5; bases 483 et 485 modifiées pour introduireun site de reconnaissance EcoRlde 5 à 10 basés site de reconnaissance d'EcoRl.

PROPRIETES: amorce la synthèse de 1’ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in¬troduit un site EcoRl pour clonage.

ACGGGÀATTC GACCAGGCAC CTGGGTGT 28 SEQ ID N°: 26 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 23 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: chimpanzé; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo dl56 CARACTERISTIQUES: de 1 à 23 bases homologués aux bases 3315 à 3337 dubrin positif de la figure 47, demande de brevet euro¬péen 88310922.5; base 323 changée en C pour introduireun site de reconnaissance EcoRlde 4 à 9 basés site de reconnaissance d*EcoRl.

PROPRIETES: amorce la synthèse de 2'ADN sur le brin négatif de l’ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in¬troduit un site EcoRl pour clonage.

CTTGAATTCT GGGAGGGCGT CTT 23 SEQ ID N°: 17 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 29 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D’ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo d92 CARACTERISTIQUES: de 1 à 29 bases homologues aux bases 36 à 64 du brinnégatif de JG2 {SEQ ID N° 3); bases 67, 58 et 60 chan¬gées pour introduire un site de reconnaissance EcoRlde 5 à 30 bas.es site de reconnaissance d'EcoRl .

, PROPRIETES : amorce la synthèse de 1'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et. in¬troduit un site EcoRl pour clonage.

CGCCGAATTC ATGCCGCCAC AGGAGGTTG 29 SEQ ID N°: 18

TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondanteLONGUEUR SEQUENCE: 504 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D’ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone 164/137 CARACTERISTIQUES: à partir de 308 h 504 bp, début de la poloyprotéinePT-NANBH.

PROPRIETES: encode probablement des protéines virales structure]1 es.

GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CÀGGACCCCC CCTCCCGGGA GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 120ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 300GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 349

Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn 5 10 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 397

Thr Asn Pro Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 445

Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 35 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 493

Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg 50 55 60 CAA CCT ATC CC 504

Gin Pro tie Pro65 SEQ ID N°: 39

TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondanteLONGUEUR SEQUENCE: 1107 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone 136/355 CARACTERISTIQUES: de 3 à 1107 bp portion de la poloyprotéine PT-NANBH.

PROPRIETES: encode probablement des protéines virales structurelles.

.„.TCC TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACT CGC ACG CTC GCG GCC AAG GAC 48

Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp 5 10 15 GCC AGC ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC GTT 96

Ala Ser Ile Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val 20 25 30 GGG GCG GCT GCC TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA 144

Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly 35 40 45 TCT GTT TTC CTC GTC TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CGA CAT 392

Ser Val Phe T.eu Val Ser Gin Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His 50 55 60 CAG ACG GTA CAG GAC TGC AAT TGT TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTA TCA 240

Gin Thr Val Gin Asp Cys Asn Cys Ser lie Tyr Pro Gly His Val Ser 65 70 75 80 GGT CAC CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA GCA 288

Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala 85 90 95 GCC CTA GTG GTA TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC 336

Ala Leu Val Val Ser Gin Leu Leu Arg Ile Pro Gin Ala Val Val Asp 100 105 110 ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT 384

Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr 115 120 125 TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT 432

Ser Met Va] Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe 130 135 340 GCC GGC GTT GAO GGG GAA CCT TAC ACG ACA GGG GGG ACA CAC GGC CGC 480

Ala Gly Val Asp Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Gly Thr His Gly Arg 145 150 155 160 GCC GCC CAC GGG CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT GGG CCG GCT CAG AAA 528

Ala Ala His Gly Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ala Gin Lys 165 170 175 ATC CAG CTT GTA AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC AGA ACT GCC 576

Ile Gin Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala 180 185 190 TTG AAC TGC AAT GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC 624

Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gin Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe 195 200 205 , TAC ACG CAC AGG TTC AAT GCG TCC GGA TGC TCA GAG CGC ATG GCC AGC 672

Tyr Thr His Arg Phe Asn Ala Ser Gly Cys Ser Glu Arg Met Ala Ser 210 215 220 TGC CGC CCC ATT GAC CAG TTC GAT CAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT TAT 720

Cys Arg Pro lie Asp Gin Phe Asp Gin Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr 225 · 230 235 240 AAT GAG TCC CAC GGC TTG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCA 768

Asn Glu Ser His G3y Leu Asp Gin Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala 245 250 255 CCT CAA CCG TGT GGT ATC GTG CCC GCG TTG CAG GTG TGT GGC CCA GTG 836

Pro Gin Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Leu Gin Val Cys Gly Pro Val 260 265 270 TAC TGT TTC ACT CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC 864

Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe 275 280 285 GGC GCC CCT ACG TAC AGA TGG GGT GAG AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTT 912

Gly Ala Pro Thr Tyr Arg Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu 290 295 300 CTC AAC AAC ACG CGG CCG CCA CGG GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG 960

Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp 305 310 315 320 ATG AAT AGC ACC GGG TTC ACC AAG ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC 1008

Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn 325 330 335 ATC GGG GGG GTC GGC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC 1056

Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu lie Cys Pro Thr Asp Cys Phe 340 345 350 CGG AAG CAT CCC GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG 1104

Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp 355 360 365

TTG

1107

Leu SEQ ID N°: 20

TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondanteLONGUEUR SEQUENCE: 2043 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-R post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone 156/192 CARACTERISTIQUES: de 1. à 2043 bp portion de la poloyprotéine PT-NANBH.

PROPRIETES: encode probablement des protéines virales non structurelles.

^ TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC TTC CTG 48Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala Hls Phe Leu 5 10 15 TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC 96Ser Gin Thr Lys Gin Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr20 25 30 CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT 144Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp35 40 45 CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT CTG CGC GGG CCA 192Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro50 55 60 ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC 240Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly A]a Val Gin Asn Glu Val Thr Leu65 70 75 80 ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG 288Thr His Pro Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu 85 90 95

GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT 336Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala100 105 HO

CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA ACA GGC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG 384Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg115 120 125 ATC ATC TTG TCC GGG CGG CCG GOT ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC 432Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu130 135 140 TAC CAG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC GCG TCG CAC CTC CCT TAC 480

Tyr Gin Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Al a Ser His Leu Pro Tyr145 150 155 160 ATC GAG CAG GGA ATG CAG CTC GCC GAG CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC 528Ile Glu Gin Gly Met*Gln Leu Ala Glu Gin Phe Lys Gin Lys Ala Leu 165 170 175 GGG TTG CTG CAG ACA GCC ACC AAG CAA GCG GAG GCC GCT GCT CCC GTG 576Gly Leu Leu Gin Thr Ala Thr Lys Gin Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val180 185 190 GTG GAG TCC AAG TGG CGA GCC CTT GAG ACC TTC TGG GCG AAA CAC ATG 624Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met195 · ' 200 205 TGG AAC TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA GCA GGC TTG TCC ACT CTG 672Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu210 215 220 CCT GGG AAT CCC GCG ATT GCA TCA CTG ATG GCG TTC ACA GCC TC T GTC 720Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met A.la Phe Thr Ala Ser Val225 230 235 240 ACT AGC CCG CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTG CTT AAC ATC CTG GGG 768Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly 245 250 255 GGA TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT CCC CCC AGT GCT GCT TCA GCT TTC 816Gly Trp Val Ala Ala Gin Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe260 265 270 GTA GGC GCC GGC ATT GCT GGT GCG GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG 864Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly275 280 285 AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTG GCG GGC TAT GGA GCA GGA GTG GCA GGC 912Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly290- 295 300 GCG CTC GTG GCC TTT AAG GTC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG 960Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu305 310 315 320 GAC CTG GTT AAC TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG GTC 1008Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val 325 330 335 GTC GGG GTC GTG TGC GCA GCG ATA CTG CGT CGG CAC GTG GGT CCA GGG 1056Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly340 345 350 GAG GGG GCT GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCG TTC GCC TCG CGG 1104Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg355 360 365 GGT AAC CAT GTT TCC CCC ACG CAC TAT GTG CCA GAG AGC GAC GCC GCA 1152Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala370 375 380 GCA CGT GTC ACT CAG ATC CTC TCC GAC CTT ACT ATC ACC CAA CTG TTG 1200

Ala Arg Val Thr Gin Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gin Leu Leu 385 390 395 400 AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAC GAG GAC TGC TCC ACG CCC TGC TCC 1248Lys Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser 405 410 415 GGC TCG TGG CTA AGG G AT GTT TGG GAC TGG ATA TGC AC A GTT TTG GCT 1296Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Ala420 425 430 GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC CTG CCG CGA TTA CCG GGA 1344Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly435 440 445 GTC CCC TTT TTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC AAG GGG GTC TGG CGG GGA 1392Val Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly450 455 460 GAC GGC ATC ATG CAG ACC ACC TGC TCA TGT GGA GCA CAG ATC ACC GGA 1440

Asp Gly .Ile Met Gin Thr Thr Cys Ser Cys Gly Ala Gin Ile Thr Gly 465 470 475 480 CAT GTC AAA AAC GGT TCC ATG AGG ATC GTT GGG CCT AAG ACC TGT AGT 1488His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr Cys Ser 485 490 495 AAC ATG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC 1536Asn Met Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro500 505 510 TGC ACG CCC TCC CCA GCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG 1584Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Va] 515 520 525 GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTT ACG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC 1632Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr530 535 540 GTG ACG AGC ATG ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCG TGC CAG GTT CCA 1680

Val Thr Ser Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys Gin Val Pro 545 550 555 560 GCC CCC GAA TTC TTC ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC 1728

Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr 565 570 575 GCT CCG GCG TGC AAA CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC 1776

Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val 580 585 590 GGG CTC AAC CAA TAC CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA 3824

Gly Leu Asn Gin Tyr T.eu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu 595 600 605 CCG GAT GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC 1872

Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile 610 615 620 "ACA GCA GAG ACG GCT AAG CG-C AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC 1920

Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro625 630 635 640 TTG GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG TTG TCT GCG CCT TCC TCG AAG GCG 1968

Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro Ser Ser Lys Ala 645 650 655 ACA TAC ATT ACC CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC 2016

Thr Tyr Ile Thr Gin Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala 660 665 670 AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATG GGC 2043

Asn lieu lieu Trp Arg His Glu Met Gly675 680 SEQ ID N°: 21

TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondanteLONGUEUR SEQUENCE: 2116 PAIRES DE RASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: conti g formé par desclones d’ADNc à partir de l'extrémité 5' du génome CARACTERISTIQUES: de 308 à 2116 bp début de la poloyprotéine PT-NANBH.

PROPRIETES: protéines virales structurelles et non structurelles GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC CCTCCCGGGA GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 120ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ÀCCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 300GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 349Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn 5 30 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 397

Thr Asn Pro Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly G]y Gly Gin Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 445

Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 35 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 493

Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg 50 55 60 CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG 541

Gin Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gin Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gin 65 70 75 CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC GAG GGC ATG GGG TGG GCA 589

Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala 80 85 90 GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACT 637

Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr100 105 110 115 GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAA GTC ATC GAT ACC CTC 685Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu 120 125 130 ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCT 733Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala135 140 145 CCC TTA GGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG 781Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu150 155 160 GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT TTA CCC GGT TGC TCT TTC 829Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe165 170 175 TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG ACC ATT CCA GCT TCC 877

Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Tie Pro Ala Ser180 185 190 195 GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATC TAC CAT GTC ACG AAC GAT 925Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp 200 205 210 TGC TCC AAC TCA AGC ATC GTG TAC GAG ACA GCG GAC ATG ATC ATG CAC 973Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr Ala Asp Met Ile Met His215 220 225 ACC CCC GGG TGT GTG CCC TGT GTC CGG GAG GGT AAT TCC TCC CGC TGC 1021Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ser Ser Arg Cys230 235 240 TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AAG GAC GCC AGC ATC CCC 1069Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp Ala Ser Ile Pro245 250 255 ACT GCG. ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCC 1117

Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala260 265 270 275 TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA TCT GTT TTC CTC 1165Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu 280 285 290 GTC TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CGA CAT CAG ACG GTA CAG 1233

Val Ser Gin Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Gin Thr Val Gin 295 300 305 GAC TGC AAT TGT TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTA TCA GGT CAC CGC ATG 1261

Asp Cys Asn Cys Ser lie Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 310 315 320 GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA GCA GCC CTA GTG GTA 3309

Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val 325 330 335 TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG 1357

Ser Gin Leu Leu Arg Ile Pro Gin Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly 340 345 350 355 GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG 1405

Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly 360 365 370 AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC 1453

Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp 375 380 385 GGG GAA CCT TAC ACG ACA GGG GGG ACA CAC GGC CGC GCC GCC CAC GGG 3501

Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Gly Thr His Gly Arg Ala Ala His Gly 390 395 400 CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT GGG CCG GCT CAG AAA ATC CAG CTT GTA 1549

Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ala Gin Lys Ile Gin Leu Val 405 410 415 AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC AGA ACT GCC TTG AAC TGC AAT 3597

Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn 420 425 430 435 GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACG CAC AGG 1645

Asp Ser Leu Gin Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr H3s Arg 440 445 450 TTC AAT GCG TCC GGA TGC TCA GAG CGC ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT 3693

Phe Ash Ala Ser Gly Cys Ser Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro He 455 460 465 GAC CAG TTC GAT CAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT TAT AAT GAG TCC CAC 1741

Asp Gin Phe Asp Gin Gly Trp Gly Pro He Thr Tyr Asn Glu Ser His 470 475 480 GGC TTG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCA CCT CAA CCG TGT 3 789

Gly Leu Asp Gin Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gin Pro Cys 485 490 495 GGT ATC GTG CCC GCG TTG CAG GTG TGT GGC CCA GTG TAC TGT TTC ACT 1837

Gly Ile Va] Pro Ala Leu Gin Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr 500 505 510 515 CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGC GCC CCT ACG 3885

Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr 520 525 530 TAC AGA TGG GGT GAG AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTT CTC AAC AAC ACG 1933

Tyr Arg Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr 535 540 545 CGG CCG CCA CGG GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG ATG AAT AGC ACC 1981

Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr 550 ' 555 560 GGG TTC ACC AAG ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC ATC GGG GGG GTC 2029

Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val 565 570 575 GGC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAT CCC 2077

Gly Asn Asn Thr Leu Tie Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro580 585 590 595 GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG TTG 2116

Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu 600 605 SEQ ID N°: 22

TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondanteLONGUEUR SEQUENCE: 3750 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté parhépatite non-A, non-B post-transfusionelleSOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: contig formé par desclones d'ADNc à partir de l'extrémité 3* du génome CARACTERISTIQUES: de 1 à 3750 bp portion de la poloyprotéine PT-NANBH.

PROPRIETES: protéines virales non structurelles.

v-TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC TTC CTG 48

Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala Hi s Phe Leu 5 10 15 TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC 96

Ser Gin Thr T.ys Gin Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr 20 25 30 CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT 144

Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp 35 40 45 CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT CTG CGC GGG CCA 192

Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro 50 55 60 ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC 240

Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gin Asn Glu Val Thr Leu 65 70 . 75 80 ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG 288

Thr His Pro Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu 85 90 95 GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT 336

Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala 100 105 110 CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA ACA GGC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG 384

Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg 115 120 125 ATC ATC TTG TC.C GGG CGG CCG GCT ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC 432

Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu 130 135 140 TAC CAG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC GCG TCG CAC CTC CCT TAC 480

Tyr Gin Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr 145 150 155 160 ATC GAG CAG GGA ATG CAG CTC GCC GAG CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC 528

Ile Glu Gin Gly Met Gin Leu Ala Glu Gin Phe Lys Gin Lys Ala Leu 165 .170 175 GGG TTG CTG CAG ACA GCC ACC AAG CAA GCG GAG GCC GCT GCT CCC GTG 576

Gly Leu Leu Gin Thr Ala Thr Lys Gin Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val 180 185 190 GTG GAG TCC AAG TGG CGA GCC CTT GAG ACC TTC TGG GCG AAA CAC ATG 624

Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met 195.' 200 205 - TGG AAC TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA GCA GGC TTG TCC ACT CTG 672

Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu 210 215 220 CCT GGG AAT CCC GCG ATT GCA TCA CTG ATG GCG TTC ACA GCC TCT GTC 720

Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Val225 230 235 240 ACT AGC CCG CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTG CTT AAC ATC CTG GGG 768

Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly 245 250 255 GGA TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT CCC CCC AGT GCT GCT TCA GCT TTC 816

Gly Trp Val Ala Ala Gin Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe 260 265 270 GTA GGC GCC GGC ATT GCT GGT GCG GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG 864

Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly 275 280 285 AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTG GCG GGC TAT GGA GCA GGA GTG GCA GGC 912

Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly 290 295 300 GCG CTC GTG GCC TTT AAG GTC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG 960

Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu305 310 315 320 GAC CTG GTT AAC TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG GTC 1008

Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val 325 330 335 GTC GGG GTC GTG TGC GCA GCG ATA CTG CGT CGG CAC GTG GGT CCA GGG 1056

Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly 340 345 350 GAG GGG GCT GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCG TTC GCC TCG CGG 1104

Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Asn Arg Leu Tie Ala Phe A3 a Ser Arg 355 360 365 GGT AAC CAT GTT TCC CCC ACG CAC TAT GTG CCA GAG AGC GAC GCC GCA 1152

Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala 370 375 380 GCA CGT GTC ACT CAG ATC CTC TCC GAC CTT ACT ATC ACC CAA CTG TTG 1200Ala Arg Val Thr Gin Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gin Leu Leu385 390 395 400 ..AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAC GAG GAC TGC TCC ACG CCC TGC TCC 1248

Lys Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser 405 410 415 GGC TCG TGG CTA AGG GAT GTT TGG GAC TGG ATA TGC ACA GTT TTG GCT 1296

Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Ala 420 425 430 GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC CTG CCG CGA TTA CCG GGA 1344

Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly 435 440 445 GTC CCC TTT TTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC AAG GGG GTC TGG CGG GGA 3392

Va3 Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg G3y 450 455 460 GAC GGC ATC ATG CAG ACC ACC TGC TCA TGT GGA GCA CAG ATC ACC GGA 1440

Asp Gly Ile Met Gin Thr Thr Cys Ser Cys Gly Ala Gin Ile Thr Gly465 470 475 480 CAT GTC AAA AAC GGT TCC ATG AGG ATC GTT GGG CCT AAG ACC TGT AGT 1488

His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr Cys Ser 485 490 495 AAC ATG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC 1536

Asn Met Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro 500 505 510 TGC ACG CCC TCC CCA GCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG 1584

Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val 515 520 525 GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTT ACG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC 1632

Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe Hls Tyr 530 535 540 GTG ACG AGO ATG ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCG TGC CAG GTT CCA 1680

Val Thr Ser Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys Gin Val Pro545 550 555 560 GCC CCC GAA TTC TTC ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC 1728

Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr 565 570 575 GCT CCG GCG TGC AAA CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC 1776

Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val 580 585 590 GGG CTC AAC CAA TAC CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA 1824

Gly Leu Asn Gin Tyr Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu 595 · ' 600 605 '"CCG GAT GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC ACC G AC CCC TCC CAC ATC 1872

Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser Hjs Ile 610 615 620 ACA GCA GAG ACG GCT AAG CG-C AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC 3920

Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg lieu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser625 630 635 640 TTG GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG TTG TCT GCG CCT TCC TCG AAG GCG 1968

Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro Ser Ser Lys Ala 645 650 655 ACA TAC ATT ACC CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC 2016

Thr Tyr Ile Thr Gin Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala 660 665 670 AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG 2064

Asn Leu Leu Trp Arg Hls Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu 675 680 685 TCA GAG AAC AAG GTA GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG 2112

Ser Glu'Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala 690 695 700 GAG GAG GAT GAG CGG GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA 2160

Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys705 710 7.15 720 TCC AAG AAA TTC CCA CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC 2208

Ser Lys Lys Phe Pro Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr 725 730 735 AAC CCT CCG CTG CTG GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA 2256

Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro 740 745 750 GTG GTA CAT GGG TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA 2304

Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro lie Pro 755 760 765 CCT CCA CGG AGG AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT 2352

Pro Pro Arg Arg Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser 770 775 780 TCT GCC CTG GCG GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTC GGT AGC TCC GAA CCG 2400

Ser Ala Leu· Ala Glu Leu A3 a Thr Lys Ala Phe G3y Ser Ser G3u Pro785 790 795 800 TCG GCC GTC GAC AGC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA CCC TCC 2448

Ser Ala Val Asp Ser G3y Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gin Pro Ser 805 810 815 GAC. GAC GGC GGA GCA GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC 2496

Asp Asp Gly Gly Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro 820 825 830 CCC CTT GAG GGG GAG CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG 2544

Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp 835 840 845 TCT ACC GTG AGT GAG GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG 2592

Ser Thr Val Ser Glu Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met 850 855 860 TCC TAC ACA TGG ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA 2640

Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala T.eu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu865 870 875 880 AGC AAG CTG CCC ATC AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC 2688

Ser Lys Leu Pro Ile Asn A3 a Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg Hds His 885 890 895 AAC ATG GTC TAC GCT ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAG 2736

Asn Met Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg Gin Lys 900 905 930 AAG GTC ACC TTT GAC AGA CTG CAA ATC CTG GAC GAT CAC TAC CAG GAC 2784

Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gin Ile Leu Asp Asp His Tyr Gin Asp 915 920 925 GTG CTG AAG GAG ATG AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAG CTT 2832

Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Al.a Ser Thr Val Lys A] a Lys Leu 930 935 940 CTA TCA GTA GAG GAA GCC TGC AAG CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA 2880 fieu Ser Val Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys945 950 955 960 TCT AAA TTT GGC TAT GGG GCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AAG 2928

Ser Lys Phe G]y Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys 965 970 975 GCC ATT AAC CAC ATC CGC TCC GTG TGG GAG GAC TTG TTG GAA GAC ACT 2976

Ala Ile Asn His Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr '980 985 990 GAA ACA CCA ATT GAC ACC ACC ATC ATG GCA AAA AAT GAG GTT TTC TGC 3024

Glu Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys 995 1000 1005 GTC CAA CCA GAG AGA GGA GGC CGC AAG CCA GCT CGC CTT ATC GTG TTC 3072

Val Gin Pro Glu Arg Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe 1010 1015 1020 CCA GAC TTG GGG GTC CGT GTG TGC GAG AAA ATG GCC CTC TAT GAC GTG 3120

Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val1025 1030 1035 1040 GTC TCC ACC CTC CCT CAG GCT GTG ATG GGC TCC TCG TAC GGA TTC CAG 3168

Val Ser Thr Leu Pro Gin Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gin 1045 1050 1055 TAT TCT CCT GGA CAG CGG GTC GAG TTC CTG GTG AAC GCC TGG AAA TCA 3216 .

Tyr Ser Pro Gly Gin Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp Lys Ser 1060 1065 1070 AAG AAG ACC CCT ATG GGC TTT GCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA 3264

Lys Lys Thr Pro Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser 1075 1080 1085 ACA GTC ACT GAG AAT GAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TGT 3312

Thr Val Thr Glu Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gin Cys 1090 1095 1100 TGT GAC TTG GCC CCC GAA GCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG 3360

Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu1105 1110 1115 1120 CGG CTT TAT ATC GGG GGT CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AAC TGC 3408Arg Leu Tyr Tie Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gin Asn Cys1125 1130 1135 GGC TAT CGC CGG TGC CGC GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT 3456Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly1140 1145 1150 AAT ACC CTC ACA TGT TAC TTG AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA 3504Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala1155 1160 1165 AAG CTC CAG GAC TGC ACG ATG CTC GTG TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT 3552Lys Leu Gin Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val1170 1175 1180 ATC TGT GAG AGC GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AGC CTA CGA GTC 3600

Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val1185 1190 1195 1200 TTC ACG GÄG GCT ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC 3648Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro1205 1210 1215 CAA CCA GAA TAC GAC CTG GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG 3696Gin Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val1220 1225 1230 TCG GTC GCG CAC GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT 3744Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg1235 1240 1245 GAC CCG 3750

Asp Pro1250 SEQ ID N°: 23 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 23 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: baculovirus Autographa californica Nuclear Polydedrosis virus (AcNPV) SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo d24 CARACTERISTIQUES : de 1 à 23 bases homologues à la portion de gène poly-hédrine AcNPV en aval du sj te de clonage BamHl dansles vecteurs pAc360 et similaires.

PROPRIETES: amorce la synthèse de 1’ADN à partir des - séquences du vecteur de transfert du baculovirus quiflanquent 1'ADN inséré au niveau du site BamHl.

CGGGTTTAAC ATTACGGATT TCC 23 SEQ ID N°: 24 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 31 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: baculovirus Autographe californica Nuclear Polydedrosis virus (AcNPV) SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo d.126 CARACTERISTIQUES : de 1 à 31 bases homologues aux séquences de jonctionen amont produite lorsque l'ADNc amplifié par d75 (SEQID n° 5) est cloné dans le site de clonage BamHl dansdes vecteurs pAc360 et similaires; des déséquilibresau niveau des bases 13 et 14 introduisent un site Pstlvde 1 à 10 bases homologues à la région du site BamHldans des vecteurs pAc360 et similairesde 4 à 9 bases site BamHlde 12 à 17 bases site Pstl.

PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN à la jonction des 'séquences du vecteur de transfert du baculoviruset des séquences amplifiées précédemment par 1'oligod75; introduit un site de reconnaissance Pstl pour letravail de clonage ultérieur.

TAAGGATCCC CCT GCA GTA TCG GCG GAA TTC 31

Ser Ala Val Ser Ala Glu Phe 5 SEQ ID N°: 25 TYPE SEQUENCE: Nucléotide

LONGUEUR SEQUENCE: 45 BASES

ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: N/A

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo¬nucléotide; oligo dl32 CARACTERISTIQUES: de 5 à 10 bases site de reconnaissance Pst] de 13 à 27 bases codage de liaison pour cinq résidus

Lys de 28 à 45 bases homologues aux bases 4 à 21 de BRU(SEQ ID 7). .

-PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN à l'extrémité 5' de BRU et introduit une séquence synthétique quicode 5 lysines ainsi qu'un site de reconnaissance Pstlpour le travail de clonage ultérieur.

CTGCCTGCA GTA AAG AAG AAG AAG AAG AAA ACC AAA CGT AAC ACC A 45

Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Lys Arg Asn Leu 5 10

Claims (20)

1. Un polypeptide viral PT-NANBH comprenant un anti¬gène ayant une séquence d'acide aminé qui est aumoins homologue à 90% avec la séquence d'acide a-miné dont question à la SEQ ID n° 3,4,5,18,19,20,21 ou 22, ou en est un fragment anti génique.

2. Un polypeptide viral PT-NANBH comme dit en ü, danslequel la séquence d'acide aminé est au moins ho¬mologue à 90% avec la séquence d'acide aminé dontquestion à la SEQ ID n° 3,4 ou 5 ou en est unfragment antigénique.

3. Un polypeptide viral PT-NANBH comme dit en 2, danslequel la séquence d’acide aminé est au moins ho¬mologue à 90% avec la séquenc d'acide aminé dontquestion à la SEQ ID n° 3 ou 4 ou en est un frag¬ment antigénique.

4. Un polypeptide viral PT-NANBH comme dit en 2, danslequel la séquence d'acide aminé est au moins ho¬mologue à 90% avec la séquence d'acide aminé dontqestion à la SEQ ID n° 5 ou en est un fragment an¬tigènique.

5. Un polypeptide viral PT-NANBH suivant l'une desrevendications précédentes, dans laquelle la sé¬quence d'acide aminé est au moins homologue à 95%avec la séquence d'acide aminé dont question à laSEQ ID n° . , ou en est un fragment antigénique.

6. Un polypeptide viral PT-NANBH comme dit en 5, danslaquelle la séquence d'acide aminé est au moinshomologue à 98% avec la séquence d'acide aminédont question à la SEQ ID n° . , ou en est unfragment anti génique-

7. Un polypeptide viral PT-NANBH comprenant un anti¬gène provenant de la région de programmationstructurée du génome viral et un antigène prove¬nant de la 2one de programmation non structurée dugénome viral.

8. Un polypeptide viral PT-NANBH comme dit en 7, danslequel l'antigène de la région de programmationstructurée a une séquence d’acide aminé qui est aumoins homologue à 90% avec la séquence d'acide a-miné dont question à la SEQ ID n° 5, ou en est unfragment antigénique, et l’antigène de la régionde programmation non structurée a une séquenced'acide aminé qui est au moins homologue à 90%avec la séquence d’acide aminé dont question à la SEQ ID n° 3 ου 4, ou en est un fragment antigèni¬que.

9. Une séquence d'ADN encodant un polypeptide viralPT-NANBH suivant l'une des revendications 1 à a.

10. Une séquence d'ADN conformément à la revendica¬tion 9 telle qu'indiquée à la SEQ ID n° 3,4,5,18,19,20,21, ou 22.

11. Un vecteur d'expression contenant une séquenced'ADN, conformément à l'une des revendications 9ou 10, et capable en présence d'un hôte appropriéd’exprimer la séquence d'ADN pour produire un po¬lypeptide viral PT-NANBH.

12. Une cellule hôte transformée avec un vecteur d'ex¬pression conformément à la revendication 11.

13. Un procédé pour la préparation d'un polypeptideviral PT-NANBH comprenant le clonage ou la synthé¬tisa ti on d’une séquence d'ADN encodant un polypep¬tide viral PT-NANBH conformément à 1'une des re¬vendications 1 à 8, l'insertion de la séquenced'ADN dans un vecteur d'expression telle qu'ellepuisse, en présence d'un hôte approprié, s'expri¬mer et transformer une cellule hôte au moyen duvecteur d'expression, de mettre en culture la cel¬lule hôte transformée et d'isoler le polypeptideviral.

14. Un anticorps polyclonal ou monoclonal contre unpolypeptide viral PT-NANBH, conformément à l'unedes revendications 1 à 6.

15. Une méthode pour la détection d'acide nucléiqueviral PT-NANBH comprenant: i) l'hybridation de l’ARN viral présent dans unéchantillon, ou l'ADNc synthétisé à partir decet ARN, avec une séquence d'ADN correspondantà la SEQ ID n° 3,4,5,18,19,20,21 ou 22, et lasélection des hybrides d’acide nucléique enrésultant pour identifier tout acide nucléiqueviral PT-NANBH; ii) la synthétisation d'ADNc à partir de l’ARN vi¬ral présent dans un échantillon, l'amplifica¬tion d'une séquence d'ADN présélectionnée cor¬respondant à une sous-séquence de la SEQ ID n°3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22 et l'identifica¬tion de la séquence d'ADN présélectionnée.

16. Un kit d'essai pour la détection d'acide nucléiqueviral PT-NANBH comprenant: i) une paire d'amorces oligonucléotides dontl'une correspond à une portion de la séquencede nucléotide de SEQ ID n° 3,4,5,18,19,20,21ou 22 et dont l'autre se trouve du côté 3' dela première et correspond à une portion de laséquence complémentaire, la paire définissantentre elles une séquence d'ADN présélection¬née; ii) un enzyme de transcriptase inverse pour lasynthèse de l'ADNc à partir de l’ARN de l'é¬chantillon en amont de l'amorce correspondantà la séquence de nucléotide complémentaire dela SEQ ID n° 3,4,5,18,19,20,21 ou 22; jji) un enzyme capable d'amplifier la séquenced'ADN présélectionnée; et en option iv) des solutions de lavage et tampons de réac¬tion .

17. Une méthode pour la détection de l'antigène viralPT-NANBH ou de l'anticorps viral, comprenant lamise en contact d'un échantillon avec un polypep¬tide viral PT-NANBH conformément à l’une des re¬vendications 1 à 8, ou un anticorps polyclonal oumonoclonal conformément à la revendication 34, etla détermination de la présence ou non d'une liai¬son antigène-anticorps au sein de l’échantillon.

18. Un kit d'essai pour la détection d'antigène viralPT-NANBH ou d’anticorps viral comprenant un poly¬peptide viral PT-NANBH conformément .à 1'une desrevendications 1 à 8, ou un anticorps polyclonalou monoclonal suivant la revendication 14, et desmoyens pour déterminer l’existence ou non d'uneliaison antigène-anticorps au sein de l’échantil¬lon.

19. Une formulation de vaccin comprenant un polypepti¬de viral PT-NANBH conformément à l'une des reven¬dications 1 à 8, en association avec un supportacceptable du point de vue pharmaceutique.

20. Une méthode pour induire l'immunité contre la PT-NANBH chez l'homme, comprenant 1'adminsitrationd'une quantité efficace de formulation de vaccinconformément à la revendication 19.