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JP3136327B2 - Ｂ型およびｃ型肝炎同時診断用診断キットおよび方法 - Google Patents

Ｂ型およびｃ型肝炎同時診断用診断キットおよび方法

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JP3136327B2
JP3136327B2 JP06524113A JP52411394A JP3136327B2 JP 3136327 B2 JP3136327 B2 JP 3136327B2 JP 06524113 A JP06524113 A JP 06524113A JP 52411394 A JP52411394 A JP 52411394A JP 3136327 B2 JP3136327 B2 JP 3136327B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、Ｂ型およびＣ型肝炎の同時診断のための診
断キット、および前記診断キットを用いた診断方法に関
するものであり、さらに詳細には、Ｂ型およびＣ型肝炎
ウイルスの抗原を共に含むＢ型およびＣ型肝炎の同時診
断用診断キット、および前記キットを用いた診断方法に
関するものである。
発明の背景 一般的に、ウイルス性肝炎はＡ型、Ｂ型、デルタ型お
よびＥ型肝炎ウイルス、サイトメガロ（cytomegalo）ウ
イルスおよびエップスタイン・バー（Epstein−Barr）
ウイルスを含む多様な肝炎ウイルスによって誘発される
ものと知られている。
それらの中Ｂ型肝炎ウイルス（“HBV"）は、ヘパドナ
ビリデ（Hepadnaviridae）の一種で肝癌を始め多様な肝
疾患を引き起こすと知られている。HBVは、外皮（envel
ope）蛋白をコードするＳ遺伝子、コア蛋白をコードす
るＣ遺伝子、DNAポリメラーゼをコードするＰ遺伝子お
よび未確認のＸ蛋白をコードするＸ遺伝子とからなる４
個のオープンリーディングフレイム（open reading f
rame）を含む二重螺旋構造の3.2Kb DNAを有している
（Ganem,D.et al.,Ann.Rev.Biochem.,50,651−693（19
87）参照）。
HBV表面抗原、コア抗原およびｅ抗原を含むHBV抗原
は、HBV感染後に血清内に形成された抗体を検出するこ
とによってＢ型肝炎を診断することに使用されてきた。
特に、抗コア性抗体は、HBV感染直後に形成され、HBVに
よって感染された全ての患者の血清中に検出できるの
で、初期のＢ型肝炎を検出することにはコア抗原が有用
であり、抗表面抗原抗体はＢ型肝炎の回復段階で発見さ
れるので、表面抗原はＢ型肝炎が治療されたのか否かを
決定することに使用される。
またＣ型肝炎ウイルス（“HCV"）は、輸血によって発
生する肝炎の70乃至80％を占め（Alter,H.J.,et al.,L
ancet,２,838−841（1975）；およびDienstag,J.L.,et
al.,Seminar Liver Dis.,６,67−81（1986）参
照）、かかる輸血後肝炎は、しばしば肝硬変または肝細
胞癌へと進展する。前記ウイルスは、一本のRNAプラス
鎖からなるRNAウイルス中の一つであり、前記鎖の一つ
のオープンリーディングフレイム（ORF）から多蛋白前
駆体（polyprotein precursor）を生産する（Choo,Q.
L.,et al.,Science,244,359−362（1989）；およびCho
o,Q.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,2451−245
5（1991）参照）。
Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子構造は、フラビウイルス
（flavivirus）またはペスチウイルス（pestivirus）の
遺伝子構造と類似し（Miller,R.H.,et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,87,2057−2061（1990）；およびMuraiso,
K.,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,172,511−51
6（1991）参照）、前記の類縁関係を基にして、Ｃ型肝
炎ウイルスの多蛋白（polyprotein）は、Ｎ−末端から
Ｃ−末端まで、コア−外皮１（E1）−外皮2/非構造１蛋
白（E2/NS1）−非構造２蛋白（NS2）−非構造３蛋白（N
S3）−非構造４蛋白（NS4）−非構造５蛋白（NS5）のよ
うに構成されたものと推定される（Choo,Q,L.,et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,2451−2455（1991）;Takam
izawa,A.,et al.,J.Virol.,65,1105−1113（1991）；
およびKato,N.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,65
24−6528（1990）参照）。
Ｃ型肝炎ウイルスの感染の可否は、ポリメラーゼ連鎖
反応（polymerase chain reaction,PCR）を用いて血
液試料から直接Ｃ型肝炎ウイルスのRNAを検出すること
によって診断することができ（Hosoda,K.,et al.,Hepa
tology,15,777−781（1992）;Abe,K.,et al.,Hepatolo
gy,15,690−695（1992）；およびAlter,H.J.,Annals o
f Internal Medicine 115,644−649（1991）参
照）；この方法によれば、ウイルスのRNAを初期に、即
ち、感染後１−２週内に検出することができるが、大量
の試料を分析せねばならないので高い費用と長い時間が
所要される。他の診断の方法は、例えば、C100−３蛋白
を用いる酵素免疫測定法（enzyme−linked immunoassa
y）によって血清試料に存在するＣ型肝炎ウイルスに対
する抗体を検出するものである（Choo,Q.L.,et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,88,2451−2455（1991））；およ
びKuo,G.,et al.,Science,244,362−384（1989）参
照）。
しかし、コントレラスらは、ELISAを用いた前記診断
方法が、しばしばＣ型肝炎以外の肝疾患、例えば、胆汁
性肝硬変（biliary cirrhosis）、自己免疫病（autoim
mune disease）、特発性肝硬変（cryptogenic hepato
cirrhosis）等を患っている患者の血清に対して偽陽性
を示すということを明かにした（Contreras M.,et a
l.,Lancet,２,505（1989）;Cash J.D.,et,al.,Lancet,
２,505（1989）参照）。テイルマン（Theilmann）ら
は、慢性関節リウマチ患者の60％以上が、オルトダイア
グノスチックシステムス社（Ortho Diagnostic Syste
ms Inc.）の第１世代診断試薬および診断方法によって
診断する際、HCV陽性反応を示すと報告した（Lancet,33
5,1346（1990）参照）。前記の結果は、ELISAを使用す
る診断方法が偽陽性の結果をもたらすことがあり、した
がって、確認検査が必要であることを暗示する。
なお、米国のキロン社（Chiron Co.）と前記オルト
ダイアグノスチックシステムス社は、ELISAを使用して
得た診断結果を確認するために、組換え免疫ブロット分
析（RIBA）を用いることによって改善された診断方法を
開発した。前記改善された診断方法は、二つのHCV−特
異的抗原等、即ち、SOD−５−１−１およびSOD−C100−
３をニトロセルロースのフィルターにブロッチング（bl
otting）し、前記抗原をＣ型肝炎患者から得た血清と反
応させ、抗原−抗体複合体をペルオキシダーゼで標識さ
れた抗ヒトIgG抗体と反応させ、各抗原バンドの色濃度
を基にして血清中の抗HCV抗体の存在可否を決定するこ
とからなる。ボーダート（Baudart）らは、パラプロテ
イン血症患者等から取った184個の血清試料中で、ELISA
方法によって28個の試料がHCV陽性として診断された反
面、陽性血清試料等を前記RIBA方法を使用して確認した
際、唯一つの試料のみ陽性として診断され、３個の試料
については診断を保留したことを報告した（Lancet,33
6,63（1990）参照）。
また、米国のオルトダイアグノスチックシステムス社
は、既存の第１世代診断試薬にコア抗原C22−３および
非構造３抗原C33Cを添加することによって製造した、抗
HCV抗体に対して改善された感度を有する第２世代RIBA
診断試薬（RIBA II）を報告した。バラリ（Vallari）ら
は、C100−３蛋白のみを用いる方法に比べて、前記C22
−３、C33CおよびC100−３蛋白を含む診断試薬を用いた
ドット免疫ブロット分析法を使用して、抗HCV抗体をよ
り早期に、かつ高い感度で検出できると報告した（J.Cl
in.Microbiol.,30（３）,552（1992）参照）。
大部分の場合、高い費用と多量の試料を使っていくつ
かの診断キットを用いてＢ型とＣ型肝炎を別々に診断し
てきたが、既存の方法は特異性や正確性におい満足すべ
き結果をもたらしていない。
本発明者等は、既存のELISA方法やRIBA方法より高い
感度と特異性を有するＢ型およびＣ型肝炎同時診断用診
断キット、および／または該診断方法を開発するために
努力してきた。
発明の概要 したがって、本発明の主要目的は、Ｂ型およびＣ型肝
炎を同時に診断するための診断キットを提供することで
ある。
本発明の他の目的は、前記診断キットを用いてＢ型お
よびＣ型肝炎を同時に診断するための診断方法を提供す
ることである。
本発明の態様によって、Ｃ型肝炎ウイルスのコア蛋白
（core protein）、非構造３蛋白（non−structural
３ protein）、非構造４蛋白（non−structural ４
protein）、非構造５蛋白および外皮蛋白（envelope p
rotein）の一つ以上のエピトープを含む一つ以上のHCV
抗原蛋白、およびＢ型肝炎ウイルスのコア蛋白および表
面抗原蛋白の一つ以上のエピトープを含む一つ以上のHB
V抗原蛋白を含む診断キットが提供される。
本発明の他の態様によって、本発明の診断キットを用
いてＢ型およびＣ型肝炎を同時に診断するための診断方
法が提供される。
図面の簡単な説明 本発明の目的および特徴は添付された図面と共に記述
した好ましい態様の説明を参照することによって容易に
理解できる。添付された図面において、 図１は、KHCV CORE14蛋白をコードするヌクレオチド
配列、およびそこにコードされたポリペプチドのアミノ
酸配列を示し、 図２は、KHCV 897蛋白をコードするヌクレオチド配
列、およびそこにコードされたポリペプチドのアミノ酸
配列を示し、 図３は、KHCV NS4E蛋白をコードするヌクレオチド配
列、およびそこにコードされたポリペプチドのアミノ酸
配列を示し、 図４は、KHCV E1G、KHCV E2AおよびKHCV E2Eをコ
ードするそれぞれのヌクレオチド配列、およびそこにコ
ードされたポリペプチドのアミノ酸配列を示し、 図５は、KHCV NS5−1.2蛋白をコードするヌクレオチ
ド配列、およびそこにコードされたアミノ酸配列を示
し、 図６は、HBVコア遺伝子のヌクレオチド配列、および
そこにコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を示
し、 図７は、HBV表面抗原をコードするヌクレオチド配
列、およびそこにコードされたポリペプチドのアミノ酸
配列を示し、 図８は、ユビキチン遺伝子と融合されたKHCV CORE14
蛋白およびKHCV897蛋白をコードするヌクレオチド配列
の発現用ベクターを示し、 図9Aは、大腸菌（E.Coli）細胞内でKHCV UBCORE14蛋
白とKHCV UB897蛋白をコードするヌクレオチド配列を
それぞれ発現させた後SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）した結果を示し、 図9Bは、Ｃ型肝炎患者の血清を用いて図9Aのゲルをウ
ェスタンブロッチング分析した結果を示し、 図10は、ユビキチン遺伝子と融合されたKHCV NS4E蛋
白をコードするヌクレオチド配列の発現用ベクターを作
製する過程を示し、 図11Aは、大腸菌細胞内でKHCV UBNS4E蛋白をコード
するヌクレオチド配列を発現させた後SDS−PAGEした結
果を示し、 図11Bは、Ｃ型肝炎患者の血清を用いて図11Aのゲルを
ウェスタンブロッチング分析した結果を示し、 図12は、KHCV E1G、KHCV E2AおよびKHCV E2Eをコ
ードするDNA蛋白とユビキチン遺伝子を結合させ、結合
されたDNA（UB E1E2 DNA）の発現用ベクターを作製す
る過程を示し、 図13Aは、大腸菌細胞内でUB E1E2 DNAを発現させた
後SDS−PAGEした結果を示し、 図13Bは、Ｃ型肝炎患者の血清を用いて図13Aのゲルを
ウェスタンブロッチング分析した結果を示し、 図14は、ユビキチン、KHCV NS4E蛋白およびKHCV E1
E2蛋白を含むUBNS4E1E2蛋白をコードする組換えDNAの発
現用ベクターを作製する過程を示し、 図15Aは、大腸菌細胞内でUBNS4E1E2蛋白をコードする
組換えDNAを発現させた後SDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動（SDS−PAGE）した結果を示し、 図15Bは、Ｃ型肝炎患者の血清を用いて図15Aのゲルを
ウェスタンブロッチング分析した結果を示し、 図16は、ユビキチン遺伝子と融合されたKHCV NS5−
1.2蛋白をコードするヌクレオチド配列の発現用ベクタ
ーを作製する過程を示し、 図17Aは、大腸菌細胞内でKHCV UBNS5−1.2蛋白をコ
ードする組換えDNAを発現させた後SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDS−PAGE）した結果を示し、 図17Bは、Ｃ型肝炎患者の血清を用いて図17Aのゲルを
ウェスタンブロッチング分析した結果を示し、 図18は、HBV CORE遺伝子とユビキチン遺伝子の融合
遺伝子（UB HBV CORE DNA）の発現用ベクターを作製
する過程を示し、 図19Aは、大腸菌細胞内でUB HBV CORE DNAを発現
させた後SDS−PAGEした結果を示し、 図19Bは、Ｂ型肝炎患者の血清を用いて図19Aのゲルを
ウェスタンブロッチング分析した結果を示し、 図20は、酵母細胞内でHBV表面抗原をコードするDNA断
片の発現用ベクターを作製する過程を示し、 図21は、酵母細胞内でHBV表面抗原をコードするDNA断
片を発現させた後SDS−PAGEした結果を示し、 図22は、本発明の診断キットを使用した免疫測定法に
よって血清試料を診断した結果を示す。
発明の詳細な説明 本願に引用された参考文献はすべて本願の参考文献と
して引用されたものである。
本願に使用された下記用語は次のような意味を有す
る： 用語“Ｃ型肝炎ウイルス”は、非Ａ非Ｂ型肝炎または
Ｃ型肝炎の原因となるウイルスをいう。用語HCVと用語
Ｃ型肝炎は本願で交換的に使用する。
用語“韓国型Ｃ型肝炎ウイルス”または“KHCV"は、
韓国人Ｃ型肝炎患者から分離された新型HCVとして、そ
のcDNAは842、849および853番アミノ酸がそれぞれフェ
ニルアラニン、ロイシンおよびトレオニン、あるいはロ
イシン、フェニルアラニンおよびアラニンのアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列のオープンリーディン
グフレーム（ORF）を有する。
用語“エピトープ”は、免疫学的に能力のある宿主で
免疫反応を起こし得、および／または相補的抗体へ特異
的に結合できるポリペプチドの抗原決定基をいう。本発
明のエピトープは、一般的に少なくとも６個のアミノ
酸、好ましくは７個または８個のアミノ酸からなる。
本願に使用された他の用語は当該分野で正常的、かつ
通常的な意味を有する。
以後、HCV cDNAのヌクレオチド番号またはHCV蛋白の
アミノ酸番号は、韓国特許公開第93−683号に開示され
た全体KHCVヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を基に
する。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
1.HCV抗原蛋白内のエピトープの決定 HCV、例えば、KHCV（KHCV−LBC1、特許手続上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従っ
て、ATCC（American Type Culture Collection）に1
991年５月14日付受託番号ATCC 75008として寄託；韓国
特許出願公開第93−683号参照）のcDNA等のヌクレオチ
ド配列に対する情報を用いて、KHCV 897蛋白、外皮１
および外皮２蛋白、または非構造５蛋白をコードするcD
NA断片の５′−末端と３′−末端に該当するポリメラー
ゼ連鎖反応用プライマーを合成する。
前記プライマーおよび、鋳型として、KHCV897遺伝子
（ブダペクト条約に従ってATCCに1991年６月27日付受託
番号ATCC 68640として寄託）、KHCV外皮遺伝子（ATCC
に1991年12月11日付受託番号ATCC 68878、69866および
74117として寄託）およびKHCV NS5遺伝子（韓国特許出
願公開第93−683号参照）を用いてポリメラーゼ連鎖反
応を行うことによって、KHCV897遺伝子、KHCV外皮１お
よび２遺伝子、およびKHCV NS5遺伝子のcDNA断片を得
る。各cDNA断片をベクターに挿入し、発現ベクターによ
り大腸菌のような適当な宿主を形質転換させる。形質転
換された宿主細胞を使って産生したポリペプチドをポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動した後、Ｃ形肝炎患者
の血清を使用してウェスタンブロッチング分析を行うこ
とによって、どのポリペプチドがKHCV抗原のエピトープ
として抗KHCV抗体と特異的に反応するかを確認する。確
認されたエピトープのKHCV cDNA全配列での位置も加え
て調査する。
その結果、KHCV897蛋白のエピトープは、KHCV cDNA
の4348番目乃至4713番目のヌクレオチドに該当する366
塩基対から発現されたKHCV897蛋白のカルボキシ末端に
存在することが明らかになった（KHCV897蛋白のエピト
ープのアミノ酸配列、およびヌクレオチド配列は図２に
示している）。
外皮蛋白の場合、エピトープはKHCV cDNAの1201番目
乃至1509番目のヌクレオチドに該当する309塩基対から
発現されたKHCV外皮１蛋白のカルボキシ末端部（E1G蛋
白）;KHCV cDNAの1510番目乃至1749番目のヌクレオチ
ドに該当する240塩基対から発現されたKHCV外皮２蛋白
のアミノ末端領域（E2A蛋白）；およびKHCV cDNAの228
1番目乃至2529番目のヌクレオチドに該当する249塩基対
から発現されたKHCV外皮２蛋白のカルボキシ末端領域
（E2E蛋白）に存在するということが明らかになった（K
HCV E1G、KHCV E2AおよびKHCV E2E蛋白のアミノ酸配
列およびそれらをコードするヌクレオチド配列は図４に
示している）。
なお、NS5蛋白のエピトープは、KHCV403 cDNA断片を
含む6649番目乃至7284番目のヌクレオチドに該当する1,
200塩基対でコードされたNS5蛋白のアミノ末端に存在
し、KHCV403よりさらに高い感度でKHCV患者の血清と特
異的に反応する。
2.一つ以上のHCVエピトープを含む組換え蛋白 HCVまたはHBV抗原のエピトープは効果的、かつ経済的
である診断試薬の開発において非常に重要である。特
に、一つまたはそれ以上のエピトープを含む融合蛋白が
経済性、効能および正確性においてさらに好ましく、一
つ以上のエピトープを含む融合蛋白が最も好ましい。
一つ以上のHCVエピトープを含むHCV組換え蛋白として
は、好ましくは、KHCVコア蛋白およびNS3蛋白のエピト
ープを含む組換えKHCV CORE 518融合蛋白、およびKHC
V E1,E2およびNS4蛋白等のエピトープを含む組換えKHC
V NS4E1E2融合蛋白が含められる。
組換え蛋白等は、前記融合蛋白をコードするヌクレオ
チド配列を含む多様な発現ベクターシステムを用いるこ
とにより産生することができ；ベクターは、前記融合蛋
白および蛋白の発現率を増加させることができる他の特
定蛋白、好ましくはユビキチンを含む組換え融合蛋白を
直接産生することができる。KHCV融合蛋白のみでなく、
ユビキチンを含む組換え融合蛋白も、KHCV蛋白の必需的
な特性、例えば、HCVの抗原性を維持する限り、本発明
の目的のために使用できる。
前記発現システムは、ユビキチンがプロテアーゼ（pr
otease）の攻撃から目的蛋白を保護または安定させるこ
とができるので、目的蛋白が不安定であり宿主細胞内で
プロテアーゼによって容易に分解される場合に効果的に
使用できる。尚かつ、ユビキチンと融合された目的組換
え蛋白の発現は、抗ユビキチン抗体を使用して確認する
ことができ、前記蛋白はユビキチンの特性を用いて容易
に精製することができる。
3.HBV抗原蛋白 例えば、韓国特許公告第90−5959号に記載されたHBV
のcDNAのヌクレオチド配列に対する情報を用いて、それ
ぞれ一つ以上のエピトープの含むHBVコア抗原および表
面抗原を産生する。HBVコア抗原および表面抗原（Pra
S2 Ｓ Ag）のアミノ酸配列は図６および図７にそれぞ
れ例示されている。多いタイプのHBVが存在すると知ら
れているので、HBVコア抗原および表面抗原のアミノ酸
配列は各タイプのHBVにおいて少しづつ異なるとみら
れ、これらも本発明に使用することができる。
HBV抗原蛋白は、多様な発現ベクターシステムを用い
て、HBV抗原蛋白中一つをコードするDNA断片を発現させ
産生することができる。HBV抗原蛋白をコードするDNA断
片は、例えばHBVコア抗原および表面抗原をそれぞれコ
ードするcDNA断片の５′−末端および３′−末端に該当
する合成プライマーを使用したPCRを用いて産生するこ
とができる。
HBV抗原蛋白を、前記２項で記述したように、HBV抗原
蛋白、および蛋白の安定性を増加させるか精製過程を容
易にさせる他の特定蛋白、好ましくは、ユビキチンを含
む組換え蛋白の形態として産生することができる。
4.宿主微生物での抗原蛋白の発現 HCVまたはHBVエピトープを含む目的HCVまたはHBV蛋白
を得るためには、HCVまたはHBVエピトープをコードする
HCVまたはHBV cDNA断片を含む発現ベクターをもって適
当な宿主細胞を形質転換させ、形質転換された細胞を発
現を許す条件下で培養する。
適当な宿主は、当該分野でよく知られている多数の要
素を考慮して選択できる。このような要素は、例えば、
選択されたベクターとの適合性、組換えプラスミドによ
ってコードされた蛋白の毒性、目的蛋白の回収容易性、
蛋白の特性、生物学的安定性および費用を含む。前記要
素の均衡は必ず考慮すべきであり、特定組換えDNA分子
の発現において全ての宿主が同等に効果的でないことは
勿論である。
本発明に使用できる適当な宿主は大腸菌などの細菌お
よびサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces c
erevisiae）等の酵母を含むが、それらに限定されな
い。
宿主細胞で産生されたポリペプチドは、通常の方法、
例えば、細胞破壊、遠心分離、透析、塩析、クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過、電気泳動および電気溶出を組合わ
せて使用することによって分離精製できる。
本発明のポリペプチドはまた、適当な方法、例えば、
排他的な固相合成法（exclusive solid phase synth
esis）、部分固相法、断片縮合法または通常の液相合成
法によって化学的に合成できる。メリフィルド（Merrif
ield）によって開示された固相合成法（J.Am.Chem.So
c.,85,2149（1963）参照）が好ましい。
一方、蛋白において、生物学的および免疫学的な活性
を実質的に変化させないアミノ酸置換が起こることは広
く知られている（例えば、ニューラツの文献（Neurath
et al.,The Proteins,Academic Press,New York,
（1979）参照）。このような機能的に同等なアミノ酸置
換は、産生された蛋白が同一な抗原的特性を維持する限
り本発明の範囲に含まれる。
本願では、ヌクレオチドおよびアミノ酸を示すための
標準１文字または３文字略字を使用する。前記略字の意
味は通常の生化学教材に示されている（例えば、文献
（Lehninger,Principles of Biochemistrs,Worth Pu
blishers Inc.New York,pp.96,798（1984）参照）。
5.B型およびＣ型肝炎同時診断用の診断キットおよび方
法 本発明の診断キットは、好ましくは、KHCV NS4E蛋
白、KHCV E1G蛋白、KHCV E2A蛋白、KHCV E2E蛋白、K
HCV COREEPI蛋白、KHCV 518蛋白およびKHCV NS5−1.
2蛋白を含み、一つまたはそれ以上のHCVエピトープを含
有する少なくとも一つのHCV抗原蛋白、およびHBVコア蛋
白または表面抗原蛋白の一つまたはそれ以上のエピトー
プを含有する少なくとも一つのHBV抗原蛋白を含む。
さらに好ましくは、本発明の診断キットは、エピトー
プが他の蛋白、好ましくはユビキチンと融合された組換
え蛋白の形態のHCVまたはHBV抗原蛋白を含む。
最も好ましくは、本発明の診断キットは、KHCV CORE
14蛋白、KHCV UB897蛋白、KHCV UBNS4E蛋白、KHCV U
BNS4E1E2蛋白、KHCV UBNS5−1,2蛋白、HBV CORE蛋白
およびHBV S2 Ｓ Ag蛋白を含む。故に、前記キット
は、既存の他の診断キットを使用して感知できなかった
HCV外皮蛋白およびNS5蛋白に特異的な抗体を検出する能
力があるため、HCVを検出するにおいてさらに正確な診
断結果を示すことができる。また、本発明のキットに含
まれたHBV CORE蛋白およびHBV S2表面抗原は、Ｃ型肝
炎と同時にＢ型肝炎の診断を可能にする。
本発明の診断キットに含まれる各抗原蛋白の量は任意
的に調節することができ、各蛋白を同モル量で使用する
ことが好ましい。
ユビキチンと融合された抗原蛋白を使用する場合、ユ
ビキチンは対照蛋白としてキット内に含まれる。
また、本発明の診断キットは、キットと共に使用され
る診断方法によって、緩衝液、陽性対照群として人間免
疫グロブリン、支持物質、または他の必要試薬を含める
ことができる。
Ｂ型およびＣ型肝炎の診断は、本発明の診断キットと
共に当該分野に知られている任意の方法を使用して行う
ことができ、好ましくは免疫ブロット分析法を使用す
る。
本発明はまた、免疫ブロット分析法を用いて本発明の
診断キットを使用する診断方法に関するものである。本
発明の診断方法は肝炎患者の血清中の抗HBVおよび抗HCV
抗体を検出するにおいて、既存のいずれの診断方法より
もっと特異的かつ正確であり、したがって、Ｃ型肝炎の
診断方法および確認試験用として、またHBVおよびHCVを
同時に診断するための診断方法として使用することがで
きる。
抗原蛋白を使用する診断方法は下記段階を含めること
ができる： 第一に、一つまたはそれ以上のHBV抗原蛋白および一
つまたはそれ以上のHCV抗原蛋白をそれぞれ固体支持
体、例えば、ニトロセルロースのフィルターまたはマイ
クロリットルのウェル（well）に加え、前記抗原蛋白を
支持体の表面に吸着させ； 第２に、希釈剤で希釈された診断用試料を抗原−被覆
された固体支持体に添加するが、ここで、抗HBV抗体ま
たは抗HCV抗体が血清内に存在する場合には、抗原−抗
体複合体が生成することになり； 第３に、酵素、例えば、HRP（西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ）またはアルカリ性燐酸酸化酵素と結合された抗
ヒトIgGを支持物に添加して酵素が第２段階で形成され
た複合体の抗体に結合するようにし； 最終に、前記支持物に酵素の基質、例えば、ペルオキ
シダーゼの場合は、Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩
（OPD）および過酸化水素を添加して呈色反応をさせる
が、もし血清試料が抗HBV抗体または抗HCV抗体を含む
と、酵素と基質の反応結果として特定色が現れる。
色濃度は濃度測定機やミクロウェルリーダーで測定
し、その結果を基にして抗HCV抗体または抗HBV抗体の存
在を判定する。
第１段階で使用された固体支持物としては、ニトロセ
ルロース濾過膜、ビニル膜およびイモビロンPR（immobi
lon PR）、好ましくはニトロセルロース濾過膜が使わ
れる。HBV抗原蛋白などは混合物として、または別々に
固体支持物に吸着させ、HCV抗原蛋白などの場合も同じ
ようにする。
本発明の診断キットを使用する際、好ましい診断方法
は下記の工程から成る。
（Ａ）精製されたヒトイムノグロブリン、KHCV UB CO
RE14蛋白、KHCV UB NS5−1.2、HBV CORE、HBV Pre
S2 Ｓ Agおよびユビキチンがそれぞれ吸着されたニ
トロセルロースフィルターを遮断溶液（blocking soult
ion）で処理し； （Ｂ）遮断されたフィルターを支持膜に並べて付着し、
膜を切断して、同一面積の各フィルターが含まれる８個
の蛋白バンドを形成しているストリップを製造し； （Ｃ）ストリップを推定（putative）血清試料と反応さ
せ； （Ｄ）（Ｃ）で得たストリップを西洋ワサビペルオキシ
ダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼで標識された抗
ヒトIgG抗体と反応させ； （Ｅ）西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホ
スファターゼに対する基質を添加し； （Ｆ）（Ｅ）で得たストリップの上に呈色反応を起させ
た後、各バンドの色濃度を測定する。
一つ以上のエピトープを含有する本発明の組換え蛋白
を使用する本発明の診断試薬は、ただ一つのエピトープ
を有する既存の抗原を使用する場合よりさらに敏感で、
かつ正確な診断を可能にする。また、一つ以上のHBVま
たはHCVエピトープを含有する一つ以上の組換え蛋白を
含む本発明の診断キットは卓越な診断結果を示す。
下記実施例は、本発明の範囲を制限するものでなく、
本発明を詳細に説明するためのものであり、実施例に使
用された実験方法は、別に言及しない限り下記の参照実
施例による。
別に指摘しない限り、固体混合物中固体、液体中液体
および液体中固体について下記に示した％はそれぞれwt
/wt、vol/volおよびwt/volの基準である。
参照例1:制限エンドヌクレアーゼを使用したDNAの切断 滅菌された1.5mlエッペンドルフ（eppendorf）管に制
限エンドヌクレアーゼと反応緩衝溶液を50μ乃至100
μの反応容量になるように入れ、37℃で１乃至２時間
反応させた。反応が完了した後、制限エンドヌクレアー
ゼを不活性化するために反応混合物を65℃で15分間熱処
理した（または耐熱性エンドヌクレアーゼの場合はフェ
ノールで抽出し、エタノールで沈澱させた）。
本参照実施例で使用された制限酵素および反応緩衝溶
液はNEB（New England Biolabs,Jolla,MA,U.S.A.）か
ら購入した。
制限エンドヌクレアーゼの反応のための10倍反応緩衝
溶液の組成は次のようである： 10倍NEB反応緩衝溶液1:100mMビストリスプロパン−HC
l、100mM MgCl2、10mMジチオトレイトール（DTT）,pH
7.0 10倍NEB反応緩衝溶液2:100mMトリス−HCl、100mM Mg
Cl2、500mM NaCl、10mM DTT、pH7.0 10倍NEB反応緩衝溶液3:100mMトリス−HCl、100mM Mg
Cl2、1000mM NaCl、10mM DTT、pH7.0 10倍NEB反応緩衝溶液4:200mMトリス−酢酸塩、100mM
酢酸マグネシウム、500mM酢酸カルシウム、10mM DT
T、pH7.0 参照例2:フェノール抽出およびエタノール沈澱 DNAと酵素との反応が完了した後、酵素を不活性化す
るかDNAを回収するために反応混合物をフェノールで抽
出するが、この抽出には10mMトリス−HCl（pH8.0）およ
び1mM EDTAを含む緩衝液であらかじめ平衡されたフェ
ノールを使用した。
フェノールによる抽出は、同容量の試料とフェノール
を強く振って混合し、15,000rpmで５分間遠心分離した
後、水性層を新しい試験管に移す工程を３回繰返した。
次に、水性層を同容量のクロロホルム溶液（クロロホ
ルム：イソブタノール＝24:1）で抽出し、水性層をさら
に分離した後；ここに0.1容量の3M酢酸ナトリウムおよ
び2.5容量の無水エタノールを加え；これを−70℃で30
分間または−20℃で12時間以上静置した後、15,000rpm
および４℃で20分間遠心分離して核酸を回収した。
参照例3:連結反応 NEBから購入したT4 DNAリガーゼおよび10倍連結反応
緩衝溶液（0.5Mトリス−HCl、pH7.0、0.1M MgCl2、0.2
M DTT、10mM ATP、0.5mg/ml牛血清アルブミン（BS
A））を使用してDNAの連結反応を行った。反応容量は通
常的に20μであり、DNAの接着末端の連結のためには1
0単位、平滑末端を有するDNAの連結のためには100単位
のT4リガーゼを使用した。
前記反応は16℃で５時間行うか４℃で14時間以上行
い；反応が終了した後、反応混合物を65℃で15分間加熱
してT4 DNAリガーゼを不活性化させた。
参照例4:大腸菌の形質転換 大腸菌菌株（例えば、E.coli HB101（ATCC 3369
4）、E.coli W3110（ATCC 27325）またはE.coli JM1
05（ATCC 47016））の形質転換は当該分野で公知の方
法、例えば、マニアチスら（Maniatis,et al.,Molecul
ar Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Ha
rbor Press,N.Y.（1982））、またはコヘン（Cohen,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,69,2110（1972））による方
法を使用して行うことができる。
参照例5:オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは自動化された固相ホスホアミジ
ト法（solid phase phosphoamidite chemistry）を
用いてDNA合成機（Applied Biosystems,Inc.,model N
o.380B,U.S.A.）で合成した。
合成されたオリゴヌクレオチドを変性ポリアクリルア
ミドゲル（2M尿素、12％オクリルアミドおよびビス（2
9:1）、50mMトリス、50mMホウ酸、1mM EDTA−Na2）、
電気泳動、およびアセトニトリル：水（50:50）を溶出
剤として使用するC18 SEP−PAK（Waters Inc.,U.S.
A.）カラムクロマトグラフィーによって精製し、260nm
におけるO.D.を計測して量を測定した。
参照例6:ポリメラーゼ連鎖反応（PCR） 10ng乃至100ngの鋳型DNA、10μの10倍濃度Taqポリ
メラーゼ反応緩衝液（10mMトリス−HCl、pH8.3、500mM
KCl、15mM MgCl2、0.1％（w/v）ゼラチン）、10μ
のdNTPの混合溶液（各々10mMのdGTP、dATP、TTPおよびd
CTP）、２μｇの各々のプライマー（一般的に、二つの
プライマーが反応に使用され、三つのプライマーが使用
された場合、中間に位置したプライマーは0.02μｇの量
で使用した）および0.5μのAmpliTaq DNAポリメラー
ゼ（Perkin Elmer Cetus,U.S.A.）の混合物に蒸留水
を加え総容量を100μにし；反応混合物の蒸発を防止
するためにここに50μの鉱油を添加した。
PCRは温度サイクラー（Perkin Elmer Cetus,U.S.
A.）を用いて行い、温度サイクルは95℃で１分→55℃で
１分→72℃で２分間のサイクルを25回以上繰返し、最終
的に72℃で10分間反応させるようにプログラムされた。
反応が終了した後、混合物をフェノールで抽出し、エ
タノールで沈澱させることによってPCR産物を回収し、
沈澱物を20μのTE緩衝液（10mM Tris−HCl、1mM ED
TA、pH7.5）に溶かした。
参照例7:HRP−結合された抗ヒトIgG抗体の産生 ヒトIgGのFc領域に対する抗体（Immunovision Inc.,
Arizona,U.S.A.,Cat.No.GHF−1001）を、ヒトIgG−付着
されたセファロースCL−4B親和性カラムおよび蛋白−Ｇ
カラム（Pharmacia LKB,Sweden）を用いるクロマトグ
ラフィーによって精製して90％以上の純度を有する抗体
を得た。収得した抗体を過ヨウ素酸ナトリウム法（sodi
um periodate method,Nakane,et al.,J.Histochemcy
tochem,22,1084（1974））によって西洋ワサビペルオキ
シダーゼを用いて次のように標識した： 5mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ（Boehringer Man
nheim,Germany,Cat.No.814.393）を1.2mlの蒸留水に溶
かした溶液に、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）
を用いて調製した0.1M過ヨウ素酸ナトリウム溶液0.3ml
を添加し、混合物を室温で20分間反応させた。反応溶液
を1mM酢酸ナトリウム緩衝液で16時間透析した。
このペルオキシダーゼ溶液1.5mlを、精製抗体が10mg/
mlの濃度で含まれる20mM炭酸ナトリウム溶液（pH9.5）1
mlと混合し、混合物を室温で２時間反応させた。その
後、ここに、ホウ水素化ナトリウムの蒸留水溶液（4mg/
ml）100μを添加して還元反応によって未反応シッフ
塩基（Schiff's base）を除去した。この溶液をリン酸
塩緩衝食塩水で一晩の間透析した後、セファデックス
（sephadex）Ｇ−200カラムを通過させ未反応抗体また
はペルオキシダーゼを除去した。
実施例1.KHCV UBCORE14およびKHCV UB897蛋白の産生 ＜段階１＞KHCV CORE14およびKHCV 897 DNAの増幅 （１−１）プライマーの作製 KHCV CORE14およびKHCV 897 DNA（それぞれKHCV−
LBC1の343番目乃至726番目のヌクレオチドの領域および
3916番目乃至4713番目のヌクレオチドの領域から成っ
た）を増幅させ、これらをtrpプロモータの調節下にユ
ビキチン遺伝子を含有する大腸菌発現ベクターにクロー
ニングするために、下記プライマー等を合成した： プライマーPCOREUBI: ５′−CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTATGAGCACGAATCCTAAAC
C−３′（ユビキチン遺伝子の３′−末端領域と重複す
る５′−末端の25個のヌクレオチドおよびKHCV−LBC1の
343番目乃至360番目のヌクレオチドを含む）； プライマーPSALCORE14: ５′−GGGGTCGACTATTAGCATGTGAGGGTGTGGATGAC−３′（K
HCV−LBC1の726番目ヌクレオチドの後で翻訳を終止させ
る終止コドンおよびSal Ｉの認識部位を含む）； プライマーPK897SAL: ５′−GACTGGTCGACTATTAACACGTATTACAGTCGATCAC−３′
（KHCV−LBC1の4713番目ヌクレオチドの後で翻訳を終止
させる３′−末端の２個の終止コドン（TAATAC）および
Sal Ｉの認識部位を含む）： プライマーPK897UBI: ５′−CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGCGGTGGAATTCATACCCG
−３′（ユビキチン遺伝子の３′−末端領域と重複す
る、５′−末端領域の25個のヌクレオチドおよびKHCV−
LBC1の3916番目のヌクレオチドから翻訳を始めるように
設計した他のヌクレオチドを含む）。
（１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管ＡにはプライマーPCOREUBI ２μｇ、およびプ
ライマーPSALCORE14 ２μｇを、試験管Ｂにはプライマ
ーPK897SAL ２μｇおよびプライマーPK897UBI ２μｇ
を各々入れ、50ngのKHCV−LBC1 DNA（ATCC 75008）、
10μの10倍ポリメラーゼ緩衝液、10μの2mM dNTP
（2mM dGTP,2mM dATP,2mM TTP,2mM dCTP）、2.5単
位のTaqポリメラーゼを加えた後、蒸留水を加え総容量
を100μに調節した。
蒸発を防止するために鉱油50μを反応混合物に加
え、参照例６と同様な温度サイクルを25回繰返すことに
よってPCRを行った。
（１−３）PCR産物の分離および精製 前記（１−２）で得たPCR産物を５％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動した。その結果、試験管Ａでは約38
4bpのDNA、試験管Ｂでは約897bpのDNAが増幅したことを
確認した。DNA断片は前記（１−２）と同様なポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって精製し、それぞれ断片
K384およびK897と命名した。
＜段階２＞ユビキチン遺伝子の作製 （２−１）プライマーの作製 オズケイナクら（Ozkaynak,et al.,EMBO.J.,６,1429
−1439（1987））によるユビキチン遺伝子に対する情報
に基づき、次のような３種のオリゴヌクレオチドを設計
し、DNA合成機を用いて合成した。
UBI1は５′−末端のNde Iの認識部位（５′−CATATG
−３′）およびUBI2と重複する約20個のヌクレオチドを
持つように設計し、UBI3はその内にコードされたアミノ
酸配列にいかなる変化もなくSac IIの認識部位（５′−
CCGCGG−３′）を持つように設計した。
（２−２）ユビキチン遺伝子の作製 ２μｇのUBI1、0.02μｇのUBI2および２μｇのUBI3の
混合物に10μの10倍PCR緩衝液、10μの2mM dNTPの
混合物および2.5単位のTaqポリメラーゼを加え、蒸留水
で総容量を100μになるようにした。PCRは参照例６と
同様に実施した。反応産生物を５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動させて、約240bpのDNAを分離し、これを断
片Ubと命名し、分離した断片を20μのTE緩衝液に溶か
した。
＜段階３＞発現ベクターの作製 （３−１）ポリメラーゼ連鎖反応 二つの試験管を準備して次のようにプライマーを入れ
た： 試験管A:2μｇのプライマーUBI1および２μｇのプラ
イマーPSALCORE14;および 試験管B:2μｇのプライマーUBI1および２μｇのプラ
イマーPK897SAL。
鋳型として、試験管Ａには、50ngの断片K384および50
ngの断片UB、試験管Ｂには、50ngの断片K897および50ng
の断片UBをそれぞれ加えた後、10μの10倍ポリメラー
ゼ緩衝液、10μの2mM dNTPおよび2.5単位のTaqポリ
メラーゼを加え、蒸留水で総容量を100μに調節し
た。それぞれの反応混合物に蒸発を防止するために鉱油
50μを添加し、参照例６と同様な温度サイクルを25回
繰返すことによってPCRを行った。
（３−２）制限エンドヌクレアーゼを用いた断片および
ベクターDNAの完全切断 前記（３−１）で得た各々のPCR産生物をNEB緩衝液３
中でNde IおよびSal Iを用いて完全に切断した。
試験管ＡおよびＢから得た断片をそれぞれ断片KHCV
UBCORE14およびKHCV UB897と命名した。
２μｇのptrp322H−HGH（韓国特許公告第91−457号参
照）をNEB緩衝液３中でPst IおよびSal Iで完全に切断
し、２μｇのプラスミドをNEB緩衝液４中でPst Iおよび
Nde Iで完全に切断した。産物を0.7％アガロースゲルで
分離して約1.5kbおよび薬0.86kb断片を単離し、これら
をそれぞれ断片PLおよびPTと命名した。
（３−３）連結 前記段階（３−２）から得た断片を用いて次のように
連結反応を実施した： 連結反応試験管Ａには100ngのKHCV UBCORE14を、連
結反応試験管Ｂには100ngのKHCV UB897をそれぞれ加え
た。それぞれの試験管に100ngのPL、100ngのPT、２μ
の10倍連結反応緩衝液および10単位のT4 DNAリガーゼ
を加え、蒸留水で総容量を20μに調節した。16℃で12
時間前記反応を行った。連結されたベクターを各々単離
し、E.coli HB101（ATCC 33694）を各々をベクターで
形質転換させた。断片UBCORE14を含むベクターを単離し
てptrpH−UB−CORE14と、断片KHCV UB897を含むベクタ
ーを単離してptrpH−UB−KHCV897と各々命名した； ＜段階４＞KHCV UB CORE14およびKHCV UB897 DNAの
発現 E.coli W3110（ATCC 37339）細胞を前記＜段階３＞
で作製した各プラスミドで形質転換した。それらの中、
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペ
スト条約によって、ptrpH−UB−KHCV897で形質転換した
E.coli W3110はATCCに1991年６月27日付受託番号ATCC
69640で寄託し、ptrpH−UB−CORE14で形質転換したE.
coli W3110はATCCに1991年７月１日付受託番号ATCC 6
8642で寄託した。
プラスミドptrpH−UB−CORE14およびptrpH−UB−KHCV
897で形質転換したE.coli W3110（ATCC 37339）細胞
を50μg/mlのアンピシリンを含む液状LB培地（６％バク
ト−トリプトン、0.5％酵母抽出物、１％NaCl）で37℃
で12時間振盪培養した。5mlの培養液を１のM9培地（4
0mM K2HPO4、22mM KH2PO4、8.5mM NaCl、18.7mM NH
4Cl、１％グルコース、0.1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、
0.4％カザアミノ酸、10μ/ml Vit.B1、40μg/mlアン
ピシリン）に移し、37℃で３乃至４時間振盪培養した。
650nmでのO.D.値が0.5に至ると、インドールアクリル酸
（IAA）を最終濃度が1.4mMとなるように培養液に添加し
た。５時間後、生成した培養液を3,000rpmで25分間遠心
分離して大腸菌細胞沈降物を得た。
＜段階５＞発現された蛋白、およびそのＣ型肝炎患者か
ら得た血清との反応生確認 前記＜段階４＞で得た各細胞沈降物を緩衝液に懸濁し
た後、レムリ（Laemmli）の方法（Nature,227,680（197
0））を用いて15％SDS−PAGEすることによってKHCV UB
CORE14およびKHCV UB897蛋白の発現を確認した。そ
の結果は図9Aに示している。
図9Aで、Ｍ列は標準分子大きさのマーカーとして上か
ら72、43、29および18キロダルトンを示し;1列はKHCV遺
伝子を含まないプラスミドを有する大腸菌の産物を示
し;2列はptrpH−UB−CORE14で形質転換した大腸菌の産
物として約23kdの蛋白が産生したことを示し;5列はptrp
H−UB−KHCV897で形質転換された大腸菌の産物として約
40kbの蛋白が産生したことを示し;3、４および６列は他
のKHCV蛋白を示す。
ゲル上で分離された蛋白をトウビンの方法（Towbin,P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76,4750（1979））によって
ニトロセルロースフィルター（Bio−Rad Lab.,孔サイ
ズ22μm,CA,U.S.A）へ移した。このフィルターを0.2％
ツイーン（Tween）20を含むPBS（10mM燐酸塩、pH7.0,0.
15M NaCl）に入れ、室温で２時間振盪して蛋白に対す
るIgGの非特異的結合を遮断した。0.5％ゼラチンと0.05
％ツイーン20を含有する200倍容量のPBSをもって韓国人
HCV患者から得た精製IgGを希釈して調製したIgG溶液
に、前記フィルターを入れ、室温で１時間軽く振りなが
ら蛋白とIgGを反応させた。その後、フィルターを0.2％
ツイーン20を含有するPBSで５分づつ４回洗浄した。0.5
％ゼラチンと0.05％ツイーン20を含有する200倍容量のP
BSをもって西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された山
羊抗ヒトIgG（Bio−Rad Lab.,CA,U.S.A.）を希釈して
調製した抗ヒトIgG抗体溶液に、前記フィルターを入
れ、室温で１時間振盪した。フィルターを0.2％ツイー
ン20を含有するPBSで５分づつ４回洗浄した後、50mMト
リス緩衝液（pH7.0）で２回洗浄した。
このフィルターに400μg/mlの４−クロロ−１−ナフ
トールおよび0.03％過酸化水素を含む50mMトリス緩衝液
を加え呈色反応を起こした。前記ウェスタンブロッチン
グの結果は図9Bに示している。図9Bで、各列は図9Aと同
一な試料を示す。
前記結果は、組換え大腸菌で生産された蛋白がKHCV抗
体と特異的に結合することを確証する。
＜段階６＞KHCV UBCORE14およびKHCV UB897蛋白の精
製 ＜段階６−Ａ＞KHCV UBCORE14蛋白の精製 （６−Ａ−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 ＜段階４＞で得た大腸菌細胞沈降物4gを４℃で20mlの
緩衝液１（50mMトリス、pH7.5、5mM EDTA,10mM β−
メルカプトエタノール、1mMフッ化フェニルメチルスル
ホニル、１μg/mlペプスタチンＡ）に懸濁させた。懸濁
液に4mgのリゾチームを添加し、生成された溶液を氷の
上で30分間攪拌した後、超音波処理機（HEAT SYSTEMS
ULTRASONIC INC.,W225,U.S.A.）を使用して80％の出
力および50％の効率（duty cycle）で氷浴に20分間超
音波処理して細胞を破壊し大腸菌細胞のホモジネートを
得た。
（６−Ａ−２）：尿素処理 （６−Ａ−１）で得たホモジネートを遠心分離機（Be
ckman J2−21,Rotor JA 20）で12,000rpmで20分間遠
心分離して不溶性沈降物を除去し上澄液を得た。
上澄液に最終濃度が8Mになるように9M尿素を加え産生
物を室温で12時間攪拌した。
（６−Ａ−３）酸処理 （６−Ａ−２）で得た溶液に1M酢酸ナトリウム（pH4.
5）を最終濃度が10mMになるように添加した後室温で１
時間攪拌しながら1M酢酸を加え溶液のpHを5.0に調節し
た。遠心分離機（Beckman J2−21,Rotor JA 14）を
用いて11,000rpmで遠心分離して沈降物を除去し上澄液
を得た。
（６−Ａ−４）:CM−イオン交換クロマトグラフィー （６−Ａ−３）で得たKHCV UB−CORE14蛋白を含む溶
液を、緩衝液２（8M尿素、1mM EDTA、10mMβ−メルカ
プトエタノール、および10mM酢酸塩、pH5.0）によって
平衡化された25mlのCM−セファロース樹脂（Pharmacia,
Sweden）を充填したカラム（2.5cm×10cm）に1ml/分の
流速で通過させた。カラム内に遊離形態で残っている物
質を前記緩衝液を用いて完全に洗浄した後、０乃至0.5M
の塩化ナトリウム濃度勾配を有する500mlの前記緩衝液
２を3ml/分の流速で添加して、結合された蛋白を溶出さ
せた。溶出物をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
した結果、KHCV UBCORE14蛋白は約0.3Mで溶出した。KH
CV UBCORE14を含む分画を収集して次の段階で使用し
た。
（６−Ａ−５）:S−200ゲル浸透クロマトグラフィー （６−Ａ−４）で収集された分画をYM5限外濾過膜（A
micon,U.S.A.）で容量が10mlになるように濃縮した。濃
縮物を、6M尿素、1mM EDTAおよび1mMβ−メルカプトエ
タノールを含有するPBS溶液で平衡化したＳ−200セファ
クリル（Sephacryl）カラム（2.5cm×100cm、Pharmaci
a,Sweden）に0.5ml/分の流速で通過させ、蛋白を分子量
別に分離した。蛋白分画をSDS−ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動させ、KHCV UBCORE14蛋白を含む分画を収
集した。
（６−Ａ−６）:Mono−Ｓ クロマトグラフィー （６−Ａ−５）で得たKHCV UBCORE14蛋白を含む分画
を同容量の緩衝液３（6M尿素、1mM EDTA、1mMβ−メル
カプトエタノールおよび10mM燐酸塩、pH7.0）で希釈し
た後、緩衝液Ａで平衡化されたFPLC Mono−Ｓカラム
（HR 5/5、Pharmacia、Sweden）に通過させた。カラム
を前記緩衝液Ａで洗浄した後、6M尿素、1mM EDTA、1mM
β−メルカプトエタノール、10mM燐酸塩および0.4M塩化
ナトリウムを含む緩衝液Ｂを0.8ml/分の流速で、始めの
５分間は35％、次の55分間は70％、そして、最後の10分
間は100％の量で次第に加え、結合された蛋白を溶出さ
せた。KHCV UB−CORE14蛋白は緩衝液Ｂの量が60％に至
る際、即ち、塩化ナトリウムの濃度が0.25Mになるとき
溶出された。
分画を４℃でPBS溶液で透析して少なくとも90％の純
度を有するKHCV UBCORE−14蛋白4mgを得た。
＜段階６−Ｂ＞KHCV UB 897蛋白の精製 （６−Ｂ−１）：細胞破壊および溶解性蛋白の除去 ＜段階４＞で得た大腸菌細胞沈降物3gを＜段階６−Ａ
＞の（６−Ａ−１）と同様に処理して細胞破壊し、それ
から不溶性沈降物を得た。
（６−Ｂ−２）：トリトンＸ−100とトリス緩衝液を用
いた不溶性沈降物の洗浄 （６−Ｂ−１）で得た沈降物を１％トリトンＸ−100
を含む緩衝液４（50mMトリス、pH8.5、5mM EDTA、2mM
β−メルカプトエタノール）50mlに懸濁させた。懸濁液
を室温で30分間攪拌し遠心分離機（Beckman J2−21,Ro
tor JA 14）を用いて11,000rpmで25分間遠心分離して
上澄液を除去し不溶性沈降物を得た。次いで、沈降物を
50mlの緩衝液４にさらに懸濁させた。懸濁液を攪拌し、
さらに遠心分離して、上澄液を除去し不溶性沈降物を得
た。
前記の単純な洗浄過程を経て、少なくとも60％の純度
を有するKHCV UB897蛋白を得た。
（６−Ｂ−３）:8M尿素を用いた不溶性沈降物の溶解 （６−Ｂ−２）で得たKHCV UB897蛋白を含む不溶性
沈降物を8M尿素を含む50mlの緩衝液５（20mM燐酸塩、pH
6.0、2mM EDTA,2mMβ−メルカプトエタノール）に懸濁
させた。懸濁液を室温で１時間攪拌し遠心分離して不溶
性沈降物を除去し上澄液を得た。
（６−Ｂ−４）:S−セファロースイオン交換クロマトグ
ラフィー （６−Ｂ−４）で得た上澄液を、4M尿素を含有する緩
衝液５で平衡化されたＳ−セファロースカラム（Pharma
cia,FF,2.5cm×7cm,U.S.A.）に通過させ０乃至0.2Mの塩
化ナトリウム濃度勾配を有する600ml緩衝液で溶出させ
た。蛋白分画を電気泳動（SDS−PAGE）させ高純度で精
製されたKHCV UB897蛋白を含有する分画を収集した。
（６−Ｂ−５）：尿素除去およびFPLC−Mono Ｑイオン
交換クロマトグラフィー （６−Ｂ−４）で収集されたKHCV UB897蛋白を含有
する蛋白分画を緩衝液６（10mMトリス、pH8.5、2mM ED
TA、2mMβ−メルカプトエタノール）を使って透析して
尿素を除去し、前記緩衝液で平衡化されたFPLC−Mono
Ｑイオン交換樹脂カラム（Pharmacia,HR 5/5）に負荷
した後、０乃至0.4Mの塩化ナトリウム濃度勾配を有する
40mlの緩衝液で溶出させた。高度に精製されたKHCV UB
897蛋白を含有する分画を収集して少なくとも90％の純
度を有するKHCV UB897蛋白を得た。
実施例2:KHCV LB NS4E蛋白の産生 ＜段階１＞KHCV NS4E DNAの増幅 （１−１）プライマーの作製 KHCV NS4E DNA（KHCV−LBC1の5422番目乃至5547番
目のヌクレオチドの領域からなる）を作製し、これをtr
pプロモーターの調節下でユビキチン遺伝子を含む発現
ベクターにクローニングするために、次のようなプライ
マーを合成した： プライマーPNS4ET2:5′−TGAGACTCCGCGGTGGTATCATCCCCG
ATAGGGAAGTT−３′（Sac II認識部位およびKHCV−LBC1
の5422番目乃至5442番目のヌクレオチドを含む）；およ
び プライマーPNS4ESAL:5′−AAAAAAGTCGACTATTACAACCCGAG
CGCCTTCTGTTT−３′（KHCV−LBC1の5547番目ヌクレオチ
ドの後で翻訳を終了させる終了コドンおよびSal I認識
部位を含む。） （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管にプライマーPNS4ET2 ２μｇおよびプライマ
ーPNS4ESAL ２μｇを入れた。該管に50ngのKHCV−LBC1
DNA（ATCC 75008）、10μの10倍ポリメラーゼ緩衝
溶液、10μの2mM dNTP（2mM dGTP、2mM dATP、2mM
TTP、2mM dCTP）、2.5単位のTaqポリメラーゼを加
え、蒸留水を加えて総容量を100μに調節した。
蒸発を防止するために反応混合物に鉱油50μを入
れ、参照例６と同様な温度サイクルを25回繰返すことに
よってPCRを実施した。
（１−３）PCR産物の分離および精製 前記（１−２）で得たPCR産物を５％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動させた。その結果、約130bpのDNAが
増幅されたことを確認した。DNAを前記と同一なポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって精製して断片NS4Eと
命名した。
＜段階２＞発現ベクターの作製 ２μｇのプラスミドptrpH−UB−CORE14（ACTT 6864
2;大韓民国特許出願公開第93−683号参照）をNEB緩衝溶
液３中でSac IIおよびSal Iを用いて完全に切断した。
生成された混合物を７％アガロースゲルで電気泳動して
約2.7kbの断片を分離し、これを断片ptrpH−UB−T2/Lと
命名した。
一方、前記＜段階１＞の（１−３）で得た断片TS4E
２μｇを参照例１のようにNEB緩衝溶液３中でSac IIお
よびSal Iを用いて完全に切断した。
連結反応管に前記で得たDNA断片100ngを入れた。該管
に50ngの前記断片ptrpH−UB−T2/L、２μの10倍連結
反応緩衝溶液、10単位のT4 DNAリガーゼを入れて、蒸
留水を加え総容量を20μに調節した。連結反応は16℃
で12時間実施した。
連結反応混合物でE.coli W3110（ATCC 37339）を形
質転換させ断片NS4Eを含むプラスミドptrpH−UB−NS4E
含有組換え大腸菌細胞を得た（図10参照）。
＜段階３＞KHCV NS4E蛋白の産生 E.coli W3110（ATCC 37339）を前記＜段階２＞で得
たプラスミドptrpH−UB−NS4Eで形質転換させた。
形質転換させた大腸菌細胞を、50μg/mlのアンピシリ
ンを含有する液状ルリア培地（６％バクトートリプト
ン、0.5％酵母抽出物、１％ NaCl）に37℃で12時間振
盪培養した。3mlの前記培養液を300mlのM9培地（40mM
K2HPO4、22mM KH2PO4、8.5mM NaCl、18.7mM NH4Cl、
１％グルコース、0.1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、0.4％
カザアミノ酸、10μg/ml Vit.B1、40μg/mlアンピシリ
ン）に移して37℃で４時間振盪培養した。培養液の650n
mでのO.D.値が0.3に至ると、最終濃度が50μg/mlになる
ように培養液にインドールアクリル酸（IAA）を添加し
た。５時間後、生成された培養液を11,000rpmで25分間
遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。
＜段階４＞発現されたUB NS4E蛋白、およびそのＣ型肝
炎患者から得た血清との反応性の確認 前記＜段階３＞で得た細胞沈降物をレムリの方法（La
emmli、Nature,227,680（1970））を用いて15％SDS−PA
GEし、ゲルをクーマシブリリアントブルー（Coomassie
brilliant blue）R250で染色して組換え蛋白の発現
を確認した（図11A参照）。図11Aで、第１列は標準分子
大きさ標識を示し、第２列乃至13列はプラスミドptrpH
−UB−NS4Eで形質転換された大腸菌の産物を示し、第14
列はいかなるKHCV DNA断片も含まないプラスミドを有
する大腸菌の産物を示す。
ゲル上で分離された蛋白をトウビンの方法（Towbin,e
t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76,4750（1979））
によってニトロセルロースフィルター（Bio−Rad La
b.,孔の大きさ0.22μm,CA,U.S.A.）へ移した。前記フィ
ルターを0.5％ツイーン20を含有するPBS（10mMリン酸
塩、pH7.0,0.15M NaCl）に入れて、室温で２時間軽く
振盪して蛋白に対するIgGの非特異的結合を遮断した。
0.5％ゼラチンと0.05％ツイーン20を含有するPBSを用い
て韓国型Ｃ型肝炎患者から精製されたIgGを最終濃度16
μg/mlになるように希釈して調製したIgG溶液に前記フ
ィルターを入れ、室温で１時間軽く振盪して蛋白とIgG
を反応させた。次いで、フィルターを0.2％ツイーン20
を含むPBSで５分ずつ４回洗浄した。0.5％ゼラチンおよ
び0.05％ツイーン20を含むPBSを用いて西洋ワサビペル
オキシダーゼで標識された山羊抗ヒトIgG（goat anti
−human IgG−HRP、Bio−Rad Lab.,CA,U.S.A.）を500
倍希釈して調製した抗ヒトIgG抗体溶液に前記フィルタ
ーを入れて室温で１時間振盪した。フィルターを0.2％
ツイーン20を含むPBSで５分ずつ４回洗浄した後、50mM
トリス緩衝溶液（pH7.0）で２回洗浄した。このフィル
ターに400μg/mlの４−クロロ−１−ナフトールおよび
0.03％過酸化水素を含む50mMトリス緩衝液を加え呈色反
応を起こさせた。前記ウエスタンブロッチングの結果は
図11Bに示してあり、ここで第１列乃至４列はプラスミ
ドptrpH−UB−NS4Eで形質転換された大腸菌の産物を示
し、第５列はいかなるKHCV DNA断片も含んでいないプ
ラスミドを有する大腸菌の産物を示し、第６列は標準分
子大きさのマーカーを示す。
＜段階５＞UB NS4E蛋白の精製 （５−１）細胞破壊および不溶性蛋白の除去 前記＜段階３＞で得た3gの大腸菌細胞沈降物を40mlの
緩衝液７（20mMトリス、pH8.0、1mM EDTA、10mM β−
メルカプトエタノール、1mMフッ化フェニルメチルスル
ホニル、１μg/mlペプスタチンＡ）に懸濁させた。この
懸濁液に最終濃度が0.2mg/mlになるようにリゾチームを
添加し、生成溶液を30分間氷の上に放置した。産物を超
音波処理機（HEAT SYSTEMS ULTRASONICS INC.,W225,
U.S.A.）を用いて80％出力および50％効率で氷浴に15分
間超音波処理して細胞を破壊し大腸菌細胞のホモジネー
トを得た。
前記で得た細胞ホモジネートを遠心分離機（Beckman
J2−21,Rotor JA 20）を用いて15,000rpmで25分間
遠心分離して不溶性沈降物を除去し溶解された蛋白を得
た。
（５−２）DEAE−セファロースイオン交換クロマトグラ
フィー （５−１）で得た蛋白溶液に1M HClを加えて溶液がp
H9.0になるように調節した。結果物を緩衝液８（20mMト
リス、pH9.0、1mM EDTAおよび1mM β−メルカプトエ
タノール）で平衡化されたDEAE−セファロースカラム
（Pharmacia,2.5cm×3cm）に2ml/分の流速で通過させ、
同一緩衝液を加えカラム内に残っている遊離蛋白を溶出
した。その次に０乃至0.4M NaClの濃度勾配を有する30
0mlの緩衝液８を8ml/分の流速で加えて、結合された蛋
白を溶出させ、溶出物を4mlの分画として収集した。蛋
白分画を15％SDS−PAGEしてUBNS4E蛋白を含む分画を収
集した。
（５−３）Ｓ−200ゲル濾過クロマトグラフィー （５−２）で収集された蛋白分画をYM10限外濾過膜
（Amicon、U.S.A.）を用いて5ml容量に濃縮した後、PBS
で平衡化されたＳ−200樹脂カラム（Pharmacia,2.5cm×
90cm）に1ml/分の流速で通過させた。溶出した蛋白を3m
l分画として収集し、15％SDS−PAGEして高い純度のUBNS
4E蛋白を含有する分画を収集した。
（５−４）FPLC−フェニル−スペーロースクロマトグラ
フィー （５−３）で収集された蛋白分画に、2.0Mの最終濃度
になるようにNaClを加えた。これを、2.0M NaClを含有
するPBSで平衡化されたFPLC−フェニル−スペーロース
カラム（Pharmacia,HR5/5,0.5cm×5cm）に0.7ml/分の流
速で通過させ、同一緩衝液を加えカラムに残っている遊
離蛋白を溶出した。その後、2.0M乃至0M 塩化ナトリウ
ムの線形濃度勾配を有する40mlのPBS（10mMリン酸塩、p
H7.0）を加え結合された蛋白を溶出し、溶出物を1.4ml
分画として収集した。
蛋白分画を15％SDS−PAGEして少なくとも95％の純度
のUBNS4E蛋白を含む分画を収集し、精製された蛋白の抗
原性をウェスタンブロッチング分析法によって確認し
た。
実施例3.KHCV UBE1E2蛋白の産生 ＜段階１＞KHCV E1E2 DNAの増幅 （１−１）プライマーの作製 HCV外皮蛋白のエピトープを含有するKHCV E1E2遺伝
子を増幅し、これをtrpプロモーターの調節下でユビキ
チン遺伝子を含む発現ベクターヘクローニングするため
に下記プライマーを合成した： プライマーPE2ET2:5′−TGAGACTCCGCGGTGGTACTCGGGGAGA
GCGTTGTGAC−３′（Sac II認識部位およびKHCV−LBC1の
2281番目乃至2298番目のヌクレオチドを含む）； プライマーPE2EGE1G:5′−TTCCTTCTTCTGGCGGACGCGGTTTC
CCAGCTGTTCACCTTC−３′（E2E DNAの３′−末端領域の
KHCV−LBC1の2509番目乃至2529番目のヌクレオチド領域
およびE1G遺伝子の５′−末端領域のKHCV−LBC1の1201
番目乃至1221番目のヌクレオチド領域を含む）；および プライマーPE2AXHO;5′−AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGC
GAATGTATC−３′（KHCV−LBC1の1749番目のヌクレオチ
ドの後で翻訳を終了させる終了コドンおよびXho I認識
部位を含む）。
（１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管にプライマーPE2EGE1G ２μｇおよびプライマ
ーPE2AXHO ２μｇを入れた。この試験管に鋳型として5
0ngのKHCV−LBC1 DNA（ATCC 75008）、10μの10倍
ポリメラーゼ緩衝液、10μの2mM dNTP（2mM dGTP、
2mM dATP、2mM TTP、2mM dCTP）、2.5単位のTaqポリ
メラーゼを入れ、ここに蒸留水を加え総容量を100μ
に調節した。
反応混合物に蒸発を防止するために50μの鉱油を加
え参照例６と同一な温度サイクルを25回繰り返すことに
よってPCRを実施した。
（１−３）PCR産物の分離および精製 前記（１−２）で得たPCR産物を５％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動した。その結果、約550bpのDNAが増
幅されたことを確認した。DNAを前記と同一なポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片GE1GE2A
と命名した。
（１−４）第２ポリメラーゼ連鎖反応 試験管にプライマーPE2ET2 ２μｇおよびプライマー
PE2AXHO ２μｇを入れた。試験管に鋳型として50ngの
プラスミドpYLBC−A/G−UBE2C（ATCC 74117、韓国特許
出願公開第93−683号参照）および50ngの断片GE1GE2A、
10μの10倍ポリメラーゼ緩衝液、10μの2mM dNTP
（2mM dGTP、2mM dATP、2mM TTP、2mM dCTP）、2.5
単位のTaqポリメラーゼを入れ、ここに蒸留水を加え総
容量100μに調節した。
反応混合物の蒸発を防止するために鉱油50μを添加
し参照例６と同一な温度サイクルを25回繰り返すことに
よってPCRを実施した。
（１−５）PCR産物の分離および精製 前記（１−４）で得たPCR産物を５％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動した。その結果、約800bpのDNAが増
幅されたことを確認した。DNAを前記と同一なポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片E1E2と命
名した。
＜段階２＞発現ベクターの作製 前記（１−５）で得たDNA断片２μｇを、参照例１と
同様にNEB緩衝液３中でSac IIおよびXho Iを用いて完全
に切断した。
試験管に前記で得たDNA断片100ngを入れ、更に実施例
２の＜段階２＞で得た50ngの断片ptrpH−UB−T2/L、２
μの10倍連結反応緩衝液、10単位のT4 DNAリガーゼ
を入れ、蒸留水を加えて総容量が20μになるように調
節した。連結反応は16℃で12時間行った。
E.coli W3110（ATCC 37339）を連結反応混合物で形
質転換させ断片E1E2を含むプラスミドptrpH−UB−E1E2
を含有する組換え大腸菌細胞を得た（図12参照）。
＜段階３＞KHCV UBE1E2蛋白の発現 前記＜段階２＞で作製されたプラスミドptrpH−UB−E
1E2で形質転換されたE.coli W3110（ATCC 37339）細
胞を実施例２の＜段階３＞と同様な方法で培養した後、
遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。
＜段階４＞発現されたUBE1E2蛋白、およびそのＣ型肝炎
患者の血清との反応性確認 発現されたUBE1E2蛋白およびそのＣ型肝炎患者から採
取した血清との反応性は前記＜段階３＞の細胞沈降物を
用いて実施例２の＜段階４＞と同様な方法で確認し、そ
の結果を図13に示す。（ここで、ＡはSDS−PAGEの結果
であり、Ｂはウェスタンブロッチングの結果である）。
図13AおよびＢで、第１列および４列はいかなるKHCV
DNA断片も含まないプラスミドを有する大腸菌の産物
を示し、第２列および５列はptrpH−UB−E1E2で形質転
換された大腸菌の産物を示し、第３列は標準分子大きさ
マーカーとしてゲルの上から43、29、18および14キロダ
ルトンを示す。
＜段階５＞UBE1E2蛋白の精製 （５−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 前記＜段階３＞で得た大腸菌細胞沈降物3gを実施例２
の＜段階５＞の（５−１）と同様に処理して細胞を破壊
しそれから不溶性沈降物を得た。
（５−２）不溶性沈降物の洗浄 前記（５−１）で得た沈降物を１％トリトンＸ−100
を含む40mlの緩衝液８に懸濁させた。懸濁液を室温で30
分間攪拌して遠心分離機（Beckman J2−21、Rotor JA
20）を使用して15,000rpmで25分間遠心分離すること
によって溶解された蛋白を除去し不溶性沈降物を得た。
（５−３）4M尿素および0.5％トリトンＸ−100を用いた
洗浄 前記（５−２）の不溶性沈降物を8M尿素および0.5％
トリトンＸ−100を含む100mlの緩衝液９（20mMリン酸
塩、pH6.0、1mM EDTAおよび10mM β−メルカプトエタ
ノール）に懸濁させた。懸濁液を室温で２時間攪拌し遠
心分離して、溶解した蛋白を除去し不溶性沈降物を得
た。
（５−４）１％のSDSを用いた沈降物の溶解 （５−３）の不溶性沈降物を１％のSDSを含む10mlのP
BS（10mlリン酸塩、pH7.0、150mM NaCl）に懸濁させ
た。懸濁液を室温で12時間攪拌し遠心分離して、不溶性
沈降物を除去し上澄液を得た。
（５−５）Ｓ−200ゲル濾過クロマトグラフィー （５−４）で得た20mlの上澄液をYM10限外濾過膜（Am
icon,U.S.A.）を使用して4mlの容量に濃縮した後、遠心
分離機（Beckman J2−21、Rotor JA 20）を使用して
15,000rpmで25分間遠心分離して不溶性沈降物を除去し
上澄液を得た。上澄液を、0.1％SDSを含有するPBSで平
衡化されたＳ−200樹脂カラム（Pharmacia LKB,2.5cm
×90cm）に40ml/時の流速で通過させた。溶出した蛋白
を3ml分画として収集し、15％SDS−PAGEして、90％以上
の純度を有するUBE1E2蛋白を含む分画を収得した。
実施例4.KHCV NS4E1E2蛋白の生産 ＜段階１＞NS4E1E2遺伝子の増幅 （１−１）プライマーの作製 HCV外皮蛋白のエピトープをコードする遺伝子およびK
HCV NS4E DNAを増幅させ、これをtrpプロモーターの
調節下でユビキチン遺伝子を含有する発現ベクター内に
クローン化するために、下記プライマー等を合成した。
プライマーPNS4ET2:5′−TGAGACTCCGCGGTGGTATCATCCCCG
ATAGGGAAGTT−３′（Sac IIの認識部位およびKHCV−LBC
1の5422番目乃至5442番目のヌクレオチドを含む）； プライマーPNS4EGE2C3:5′−CAGAAGGCGCTCGGGTTGCCAGGA
GGAGGAGGTGGTACTCGGGGAGAGCGTTGT−３′（NS4E DNAの
３′−末端領域のKHCV−LBC1の5530番目乃至5547番目の
ヌクレオチドの領域、１個のプロリンコドン、６個のグ
リシンコドン、およびE2E遺伝子の５′末端領域のKHCV
−LBC1の2281番目乃至2298番目のヌクレオチドの領域を
前記順序のように含む）；および プライマーPE2AXHO:5′−AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGC
GAATGTATC−３′（KHCV−LBC1の1749番目のヌクレオチ
ドの後で翻訳を終了させる終了コドンおよびXho Iの認
識部位を含む）。
（１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーPNS4EGE2C3および２μｇ
のプライマーPE2AXHOを入れた。この試験管に、鋳型と
して50ngのptrpH−UB−E1E2（実施例３の＜段階２
＞）、10μの10倍ポリメラーゼ緩衝液、10μの2mM
dNTP（2mM dGTP、2mM dATP、2mM TTP、2mM dCT
P）、2.5単位のTaqポリメラーゼを加え、蒸留水を加え
て総容量を100μにした。
蒸発を防止するために50μの鉱油を前記反応混合物
に加え参照例６と同一な温度サイクルを25回繰り返すこ
とによってPCRを行った。
（１−３）PCR産物の分離および精製 前記（１−２）で得たPCR産物を５％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動した。その結果、約800bpのDNAが増
幅したことを確認した。DNAを前記と同一なポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって精製し断片GENVEP I−II
Iと命名した。
（１−４）第２ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーPNS4ET2および２μｇの
プライマーPE2AXHOを入れた。この試験管に、鋳型とし
て実施例２の＜段階２＞で得た50ngのプラスミドptrpH
−UB−NS4E、前記（１−３）で得た50ngの断片GENVEP I
−III、10μの10倍ポリメラーゼ緩衝液、10μの2mM
dNTP（2mM dGTP、2mM dATP、2mM TTP、2mM dCT
P）、2.5単位のTaqポリメラーゼを入れ、蒸留水を加え
て総容量を100μにした。
前記反応混合物の蒸発を防止するために50μの鉱油
を添加し、参照例６と同一な温度サイクルを25回繰り返
すことによってPCRを行った。
（１−５）PCR産物の分離および精製 前記（１−４）で得たPCR産物を５％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動した。その結果、約920bpのDNAが増
幅したことを確認した。DNAを前記と同一なポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片NS4E1E2と
命名した。
＜段階２＞発現ベクターの作製 ＜段階１＞の（１−５）で得た２μｇのDNA断片を参
照例１のようにNEB緩衝液３中でSac IIおよびXho Iを用
いて完全に切断した。
試験管に前記で得たDNA断片100ngを入れ、更に実施例
２の＜段階２＞で得た断片ptrpH−UB−T2/L 50ng、２
μの10倍連結反応緩衝液、10単位のT4 DNAリガーゼ
を入れ、蒸留水を加えて総容量を20μに調整した。連
結反応は16℃で12時間行った。
上記連結反応混合物を用いてE.coli W3110（ATCC 3
7339）を形質転換させて断片NS4E1E2を含むプラスミドp
trpH−UB−NS4E1E2を含有する組換え大腸菌細胞を得た
（図14参照）。
＜段階３＞断片NS4E1E2 DNAの発現 前記＜段階２＞で作製したプラスミドptrpH−UB−NS4
E1E2を含むE.coli W3110（ATCC 37339）形質転換体を
実施例２の＜段階３＞のような方法で培養した後、遠心
分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。
＜段階４＞発現したUBNS4E1E2蛋白、およびそのＣ型肝
炎患者から採取した血清との反応性確認 大腸菌内でUBNS4E1E2蛋白の生産およびＣ型肝炎患者
から採取した血清とそれとの反応性は実施例２の＜段階
４＞のような方法で＜段階３＞の細胞沈降物を用いるこ
とによって確認し、その結果は図15に示しており、ここ
でＡはSDS−PAGEの結果であり、Ｂはウェスタンブロッ
チングの結果である。
図15AおよびＢで第１列および第４列はいかなるKHCV
DNA断片も含まないプラスミドを有する大腸菌の産物
を示し、第２列および第５列はptrpH−UB−NS4E1E2で形
質転換した大腸菌の産物を示し、第３列は標準分子大き
さマーカーとしてゲルの上から92、70、43、29および18
キロダルトンを示す。
＜段階５＞UBNS4E1E2蛋白の精製 （５−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 ＜段階３＞で得た3gの大腸菌細胞沈降物を実施例２の
＜段階５＞のように処理して、細胞を破壊し、それから
不溶性沈降物を得た。
（５−２）不溶性沈降物の洗浄 前記（５−１）で得た不溶性沈降物を実施例３の＜段
階５＞（５−２）のように処理して、溶解した蛋白を除
去し不溶性沈降物を得た。
（５−３）4M尿素を用いた洗浄 前記（５−２）の不溶性沈降物を4M尿素を含む30mlの
緩衝液２に懸濁させた。この懸濁液を室温で２時間攪拌
し遠心分離機（Beckman J2−21、Rotor JA 21）を用
いて15,000rpmで遠心分離することによって溶解した蛋
白を除去し不溶性沈降物を得た。
（５−４）6M塩化グアニジンを用いた洗浄 前記（５−３）の不溶性沈降物を6M塩化グアニジン
（guanidine chloride）を含む30mlの緩衝液２に懸濁さ
せた。懸濁液を室温で２時間攪拌し遠心分離機（Beckma
n J2−21、Rotor JA 21）を用いて15,000rpmで遠心
分離することによって、溶解した蛋白を除去し不溶性沈
降物を得た。
（５−５）１％SDSを用いた沈降物の溶解 前記（５−４）の不溶性沈降物を１％SDSを含有する1
0mlのPBS（10mMリン酸塩、pH7.0、150mM NaCl）に懸濁
させた。懸濁液を室温で12時間攪拌し遠心分離機（Beck
man J2−21、Rotor JA 21）を用いて15,000rpmで遠
心分離することによって、不溶性沈降物を除去し上澄液
を得た。
（５−６）Ｓ−300ゲル濾過クロマトグラフィー 前記（５−５）で得た10mlの上澄液をYM10限外濾過膜
（Amicon,U.S.A.）を使用して4ml容量に濃縮した後、遠
心分離機（Beckman J2−21、Rotor JA 21）を用いて
15,000rpmで25分間遠心分離して、不溶性沈降物を除去
し上澄液を得た。上澄液を、0.1％SDSを含むPBSで平衡
化されたＳ−300樹脂カラム（Pharmacia LKB,2.5cm×9
0cm）に40ml/時の流速で通過させゲル濾過クロマトグラ
フィーを行った。溶出した蛋白を2mlの分画として収集
し、15％SDS−PAGEして90％以上の純度を有するUBNSE1E
2蛋白を含む分画を収集した後、精製した蛋白の抗原的
特異性をウェスタンブロッチング分析法を用いて確認し
た。
実施例5.KHCV NS5−1.2蛋白の産生 ＜段階１＞NS5−1.2DNAの増幅 （１−１）プライマーの製造 KHCV NS5−1.2 DNA（KHCV LBC1の6649番目乃至782
4番目のヌクレオチドの領域からなる）を増幅し、これ
をtrpプロモーターの調節下でユビキチン遺伝子を含む
発現ベクター内にクローン化するために、下記のプライ
マー等を合成した： プライマーPNS5T2:5′−TGAGACTCCGCGGTGGTACGGGCATGAC
CACTGACAAC−３′ （Sac IIの認識部位およびKHCV−LBC1の6649番目乃至66
69番目のヌクレオチドを含む）；および （KHCV LBC1の7824番目のヌクレオチドの後で翻訳を終
止させる終止コドンおよびSal I認識部位を含む） （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーPNS5T2および２μｇのプ
ライマーPNS51.2SALを入れた。この試験管に、鋳型とし
て50ngのKHCV−LBC1 DNA（ATCC 75008）、10μの10
倍ポリメラーゼ緩衝液、10μの2mM dNTP（2mM dGT
P、2mM dATP、2mM TTP、2mM dCTP）、2.5単位のTaq
ポリメラーゼを加え、これに蒸留水を加えて総容量を10
0μに調節した。
反応混合物に蒸発を防止するために50μの鉱油を加
え参照例６のような温度サイクルを25回繰り返すことに
よってPCRを実施した。
（１−３）PCR産物の分離および精製 前記（１−２）で得たPCR産物を５％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動した。その結果、約1.2kb DNAが増
幅されたことを確認した。DNAを前記と同一なポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって精製し断片NS5−1.2と
命名した。
＜段階２＞発現ベクターの作製 ＜段階１＞の（１−３）で得た２μｇのDNA断片を参
照例１のようにNEB緩衝液３中でSac IIおよびSal Iを用
いて完全に切断した。
試験管に前記で得たDNA断片100ngを入れた。この試験
管に実施例２の＜段階２＞で得た50ngの断片ptrpH−UB
−T2/L、２μの10倍連結反応緩衝液、10単位のT4 DN
Aリガーゼを入れ、蒸留水を加えて総容量を20μに調
整した。連結反応は16℃で12時間行った。
上記連結反応混合物を用いてE.coli W3110（ATCC 3
7339）を形質転換させて断片NS5−1.2を含むプラスミド
ptrpH−UB−NS5−1.2を含有する組換え大腸菌細胞を得
た（図16参照）。
＜段階３＞断片NS5−1.2 DNAの発現 前記＜段階２＞で製造されたプラスミドptrpH−UB−N
S5−1.2を用いて変質転換させたE.coli W3110（ATCC
37339）細胞を実施例２の＜段階３＞のような方法で培
養した後、遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。
＜段階４＞発現したKHCV UBNS5−1.2蛋白およびそのＣ
型肝炎患者から採取した血清との反応性確認 大腸菌内でUBNS5−1.2蛋白の生産およびそのＣ型肝炎
患者から採取した血清との反応性は実施例２の＜段階４
＞のような方法で＜段階３＞の細胞沈降物を使用して確
認し、その結果を図17に示す。ここでＡはSDS−PAGEの
結果であり、Ｂはウェスタンブロッチングの結果であ
る。
図17AおよびＢで、第１列はいかなるKHCV DNA断片も
含有しないプラスミドを有する大腸菌の産物を示し、第
２列および第３列はptrpH−UB−NS5−1.2で形質転換し
た大腸菌の産物を示す。
＜段階５＞UBNS5−1.2蛋白の精製 （５−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 ＜段階３＞で得た3gの大腸菌細胞沈降物を実施例２の
＜段階５＞の（５−１）のように処理して、細胞を破壊
し、それから不溶性沈降物を得た。
（５−２）不溶性沈降物の洗浄 前記（５−１）で得た不溶性沈降物を実施例３の＜段
階５＞（５−２）のように処理して、溶解した蛋白を除
去し不溶性沈降物を得た。
（５−３）不溶性沈降物の溶解 前記（５−２）の不溶性沈降物を8M尿素を含む100ml
の緩衝液３（50mM Tris、pH9.0、1mM EDTA、10mM β
−メルカプトエタノール）に懸濁させた。この懸濁液を
室温で１時間攪拌し遠心分離して不溶性沈降物を除去し
上澄液を得た。
（５−４）DEAE−セファロースイオン交換クロマトグラ
フィー 前記（５−３）で得た上澄液を、前記緩衝液３で平衡
化されたDEAE−セファロースカラム（Pharmacia,2.5cm
×3cm）に2ml/分の流速で通過させ、同一緩衝液を加え
カラムに残っている遊離蛋白を溶出させた。その後、０
乃至0.3M NaClの濃度勾配を有する300mlの緩衝液３を8
ml/分の流速で加えて、結合した蛋白を溶出し、溶出物
を4ml分画として収集した。蛋白分画を15％SDS−PAGEし
てUBNS5−1.2蛋白を含む分画を収集した。
（５−５）Ｓ−300ゲル濾過クロマトグラフィー 前記（５−４）で収集した蛋白分画をYM10限外濾過膜
（Amicon、U.S.A.）を用いて3mlの容量に濃縮した後、8
M尿素を含有する緩衝液３で平衡化されたＳ−300樹脂カ
ラム（Pharmacia,1.2cm×120cm）に10ml/分の流速で通
過させた。溶出した蛋白を0.5ml分画等として集め、15
％SDS−PAGEして高純度のUBNS5−1.2蛋白を含有する分
画を収集した。
（５−６）FPLC−フェニル−スペロース（superose）ク
ロマトグラフィー 前記（５−５）で収集した蛋白分画をYM10限外濾過膜
（Amicon、U.S.A.）を通過させ4mlの容量に濃縮した。
濃縮物を透析膜（Spectrum Medical Industries,In
c.,M.W.cut off 6,000−8,000）を使用してPBS（10mM
リン酸塩、pH7.0,15mM NaCl）で透析して尿素を除去し
た。この溶液に1.5Mの最終濃度となるように塩化ナトリ
ウムを添加した後、同一緩衝液で平衡化されたFPLC−フ
ェニル−スペロースカラム（Pharmacia,HR 5/5,0.5cm
×5cm）に0.7ml/分の流速で通過させ、同一緩衝液を加
えカラムに残っている遊離蛋白を溶出した。その後、1.
5乃至0Mの塩化ナトリウム線形濃度勾配を有したPBSを加
え結合された蛋白を溶出し、溶出物を0.7mlずつの分画
として収集した。蛋白分画を15％SDS−PAGEして95％以
上の純度を有するUBNS5−1.2蛋白を含む分画を収集し、
精製した蛋白の抗原的特異性はウェスタンブロッチング
分析法によって確認した。
実施例6:HBVCORE蛋白の産生 ＜段階１＞HBVCORE遺伝子の増幅 （１−１）プライマーの作製 HBVCORE DNA（韓国型Ｂ型肝炎cDNA（pHBVadr）の一
部分、韓国特許出願公告第90−5959号参照）を増幅し、
これをtrpプロモーターの調節下にユビキチン遺伝子を
含む発現ベクター内にクローン化するために、下記プラ
イマー等を合成した： （Sac IIの認識部位およびHBVCORE DNAの１番目乃至21
番目のヌクレオチドを含む）。
（HBVCORE DNAの３′−末端で翻訳を終止させる終止コ
ドンとSal Iの認識部位を含む）。
（１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーPCORET2および２μｇの
プライマーPCORESALを入れた。この試験管に、鋳型とし
て50ngのpHBVadr、10μの10倍ポリメラーゼ緩衝液、1
0μの2mM dNTP（2mM dGTP、2mM dATP、2mM TTP、
2mM dCTP）、2.5単位のTaqポリメラーゼを入れ、蒸留
水を加えて総容量を100μに調節した。
反応混合物に、蒸発を防止するために50μの鉱油を
添加し、参照例６のような温度サイクルを25回繰り返す
ことによってPCRを実施した。
（１−３）PCR産物の分離および精製 前記（１−２）で得たPCR産物を５％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動した。その結果、約550bpのDNAが増
幅したことを確認した。DNAを前記と同一なポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片HBVCOREと
命名した。
＜段階２＞発現ベクターの作製 前記＜段階１＞の（１−３）で得た２μｇのDNA断片
を参照例１のようにNEB緩衝液３中でSac IIおよびSal I
を用いて完全に切断した。
連結反応試験管に前記で得た100ngのDNA断片を入れ
た。この試験管に実施例２の＜段階２＞で得た50ngの断
片ptrpH−UB−T2/L、２μの10倍連結反応緩衝液、10
単位のT4 DNAリガーゼを入れ、蒸留水を加えて総容量
を20μに調整した。連結反応は16℃で12時間実施し
た。
連結されたベクターを用いてE.coli W3110（ATCC 3
7339）を形質転換して、断片HBVCOREを含むプラスミドp
trpH−UB−HBVCOREを有する組換え大腸菌形質転換体を
得た（図18参照）。
＜段階３＞HBVCORE DNAの発現 前記＜段階２＞で作製したプラスミドptrpH−UB−HBV
COREで形質転換したE.coli W3110（ATCC 37339）細胞
を実施例２の＜段階３＞のような方法で培養した後、遠
心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。
＜段階４＞発現したHBVCORE蛋白、およびＢ型肝炎患者
から採取した血清とその反応性確認 UB HBVCORE蛋白の発現および前記蛋白とＢ型肝炎患
者から採取した血清との反応性を、前記＜段階３＞の細
胞沈降物を使用して実施例２の＜段階４＞のような方法
で確認した。その結果を図19に示しており、ここでＡは
SDS−PAGEの結果であり、Ｂはウェスタンブロッチング
の結果である。
図19で、１列はいかなるHBV DNA断片も含まないプラ
スミドを有する大腸菌の産物を示し、２列および３列は
ptrpH−UB−HBVCOREで形質転換した大腸菌の産物を示
す。
＜段階５＞UB HBVCORE蛋白の精製 （５−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 前記＜段階３＞で得た3gの大腸菌細胞沈降物を実施例
２の＜段階５＞の（５−１）のように処理して、細胞を
破壊し、それから不溶性沈降物を得た。
（５−２）6M尿素を用いた処理およびDEAE−セファロー
スイオン交換クロマトグラフィー 前記（５−１）で得た不溶性沈降物に最終濃度が6Mに
なるように尿素を添加し、この懸濁液に最終容量が280m
lになるように1M NaOHを添加してpH9.0に調整した。
上記産生物を、6M尿素を含む緩衝液８で平衡化させた
DEAE−セファロースカラム（Pharmacia,1.25cm×5cm）
に3ml/分の流速で通過させ、同一緩衝液を加えてカラム
内に残っている遊離蛋白を溶出した。その後、０乃至0.
5M NaClの濃度勾配を有する100mlの緩衝液８を3ml/分
の流速で加えて結合した蛋白を溶出し溶出物を3mlずつ
の分画として収集した。蛋白分画を15％SDS−PAGEしてU
B HBVCORE蛋白を含む分画を収集した。
（５−３）Ｓ−300ゲル濾過クロマトグラフィー 前記（５−２）で得た蛋白分画をYM10限外濾過膜（Am
icon、U.S.A.）を用いて5mlの容量に濃縮した後、緩衝
液８で平衡化させたＳ−300樹脂カラム（Pharmacia LK
B,2.5cm×90cm）に1ml/分の流速で通過させた。溶出し
た蛋白を3mlずつの分画で収集し、15％SDS−PAGEして高
純度のUB HBVCORE蛋白を含む分画を収集した。
（５−４）透析による尿素の除去 前記（５−３）で収集した蛋白分画を透析膜（Spectr
a/por,No.1,M.W.cutoff:6,000−8,000）を使用して緩衝
液10（20mM Tris,pH8.0,1mM EDTA,10mM β−メルカ
プトエタノール）に対して４℃で透析した尿素を除去し
た後、遠心分離して95％以上の純度を有するUB HBV C
ORE蛋白を含む溶解性上澄液を得た。
実施例7:HBV Pre S2 Ｓ Ag蛋白の産生 ＜段階１＞発現ベクターの作製 HBV Pre S2 DNAを含有する10μｇのベクターpLBC
−PSAG14（韓国特許公告第90−5959号参照）を10単位の
制限酵素BamH Iで37℃で１時間処理した後、１％アガロ
ースゲル電気泳動してADH2プロモーター−前表面抗原
（pre−surface antigen）−表面抗原−GAPDHタミネー
ターをコードするDNA配列を含むBamH Iカセットを得
た。カセットを20μのTE緩衝液に溶解させた後、BamH
Iで切断したpYLBC中にクローン化し、細菌のアルカリ
性ホスファターゼで処理した。ヒネンの方法（Hinnen,P
roc.Natl.Acad,Sci.,U.S.A.,75,1929−1933（1978））
によってサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces
cerevisiae）X400−5B（Yeast Genetics Stock Ce
nter,U.S.A.）を形質転換し、それから組換え発現ベク
ターpYPSAG100を分離した（図20参照）。
＜段階２＞HBV Pre S2 Ｓ Ag蛋白の産生 前記＜段階１＞で得たベクターpYPSAG100でサッカロ
ミセス・セレビジエX400−5B（Yeast Genetics Stock
Center,U.S.A.）を形質転換し、形質転換した酵母細
胞を3mlのロイシン欠乏（deficient）培地（培地１当
たり6.7gのアミノ酸のない酵母窒素基質、182gのソルビ
トール、２％のグルコース、0.25gのLeu−補充物）で30
℃で24時間培養した。
遠心分離機（DYNAC,U.S.A.）を用いて培養液を3,000r
pmで５分間遠心分離して上澄液を除去した。沈降物を5m
lの培養培地（２％グルコース、１％酵母抽出物、２％
バクトペプトン（Bacto peptone））で８時間振盪し
た。培養液を3,000rpmで遠心分離して上澄液を除去し沈
降物を得、これを5mlのYEPE培地（５％エタノール、１
％酵母抽出物、２％バクトペプトン）で30℃で４時間培
養して、Ｂ型肝炎ウイルスの前表面抗原（pre−surface
antigen）および表面抗原の発現を誘導した。
＜段階３＞Pre S2 Ｓ Ag蛋白の精製 前記＜段階２＞で得た１の培養液を遠心分離機（Be
ckman rotor JA 4.2,U.S.A）を用いて3500rpmで10分
間遠心分離して酵母細胞沈降物を収集した。細胞沈降物
を50mlの緩衝液（10mM Tris−HCl,pH7.5,1mM EDTA,0.
1％トリトンＸ−100,1mMフッ化フェニルメチルスルホニ
ル）に溶解し同容量の直径0.45mmのガラスビーズを懸濁
液に添加した。生成された懸濁液をそれぞれ５分ずつ３
回強く振盪した後、遠心分離機（Beckman rotor JS−
13,U.S.A.）を用いて15,000rpmで30分間遠心分離して上
澄液を得た。
上澄液を、乾燥セファロースCL−4B 1g当り8mgの単
クローン性抗体を含有するHBV表面抗原に対する単クロ
ーン性抗体（CH II5−60、ラッキー中央研究所）と結合
されたセファロースCL−4B親和性カラム（Pharmacia,U.
S.A.）に通過させた。緩衝液（10mM Tris,pH7.5,1M N
aCl）を溶出させることによってカラムを十分に洗浄し
て活性化した。表面抗原を含有する上澄液を1ml/時の流
速で添加し、溶出剤のA280が０に至るまで10mM Tris−
1M NaCl緩衝液でカラムを継続洗浄した。緩衝液（10mM
Tris−HCl,pH7.5）をカラムに加えて非特異性蛋白を
除去し溶出物のA280を１になるように調整した。
A280が１に到達した後、緩衝液（3M NH4SCN,50mMト
リス、pH7.5）を加えて結合した表面抗原蛋白を溶出さ
せA280のピークで溶出された20mlを収集して、これを４
の緩衝液（50mMトリス,pH7.5）に対して４℃で24時間
透析した。
産生物をYM30限外濾過膜（Amicon,U.S.A.）に通過さ
せ1ml容量に濃縮した。50ml/時の流速で緩衝液（0.1Mリ
ン酸ナトリウム、pH7.0）を加えながらセファロースCL
−4Bカラム（1.5×90cm,Pharmacia Co.,U.S.A.）を通
過させ、結合した蛋白を溶出し溶出物を2mlの分画とし
て収集した。オスチームII（Oszyme II、Abott Co.）
を使用して、各試験管を試験し反応性を示す分画を収集
した。得られた溶液に最終濃度が1.2g/cm2になるように
CsCl2溶液を加えた。懸濁液を遠心分離機（Beckman ro
tor 41Ti,U.S.A.）を用いて35,000rpmで24時間遠心分
離して沈降物を得た。
レムリの方法（Nature,227,680（1970））を用いて沈
降物をSDS−PAGEして蛋白を含む分画を収集した（図21
参照）。
実施例8:イムノブロッチング分析キットの作製 ５種のHCV抗原蛋白（KHCV CORE14,KHCV NS4E,KHCV
NS4E1E2,KHCV 897およびKHCV NS5−1.2）、２種のH
BV抗原蛋白（HBV COREおよびHBV Pre S2 Ｓ A
g）、ユビキチンおよび人間免疫グロブリンＧ（hIgG）
をブロッチング緩衝液（100mM 炭酸ナトリウム、pH9.
5）で下記濃度になるように希釈した： hIgG:5μg/ml ＆ 0.1μg/ml; KHCV CORE14:10μg/ml; KHCV NS4E:20μg/ml; KHCV NS4E1E2:10μg/ml; KHCV 897:10μg/ml; KHCV NS5−1.2:20μg/ml; HBV CORE:10μg/ml; HBV Pre S2 Ｓ Ag:10μg/ml;および UB:5μg/ml。
抗原蛋白を含有する各希釈液を、スロットブロッチン
グ装置（Bio−Rad Lab.,Dot SFブロッチング装置、Ca
t.No.170−6542,U.S.A.）を使用してブロッチング緩衝
液にあらかじめ浸漬したニトロセルロースフィルター
（Schliescher ＆ Schlell,BA 83,孔の大きさ0.22μ
m,U.S.A.）のスロット（0.7×0.7mm）に下記順序および
量に従って添加した後、同一緩衝液で一度洗浄した。
スロット1:hIgG ５μg/ml,250μ； スロット2:KHCV CORE14 10μg/ml,250μ； スロット3:KHCV NS4E 20μg/ml,125μ；および KHCV NS4E1E2 10μg/ml,125μ； スロット4:KHCV 897 10μg/ml,250μ； スロット5:KHCV NS5−1.2 20μg/ml,250μ； スロット6:HBV CORE 10μg/ml,250μ； スロット7:HBV Pre S2 Ｓ Ag 10μg/ml,250μ
； スロット8:UB ５μg/ml,250μ；および スロット9:hIgG 0.1μg/ml,250μ。
ニトロセルロースフィルターに８乃至10Hgの真空圧力
を10乃至20分間加えて前記蛋白溶液を濾過することによ
って抗原蛋白をニトロセルロースフィルターにブロッチ
ングし、各スロットに250μのブロッチング緩衝液を
加えてもう一度濾過することによって濾過膜を一度洗浄
した。
ニトロセルロースフィルターをピンセットで取り除き
60℃で10分間乾燥した。乾燥したニトロセルロースフィ
ルターを0.1％ゼラチンを含有するリン酸塩緩衝食塩水
に入れ室温で30分間軽く振って、空いているブロッチン
グ部位に蛋白が非特異的に結合することを防止した。処
理されたフィルターを前記のような条件で乾燥させた
後、適当な方法で番号を付けるか番号で標識された支持
体に結合させた。フィルターをそれぞれ一つの抗原蛋白
を含有する全ての種類のスロットを含むストリップに切
った。
実施例9:イムノブロッチングキットを用いた診断 前記実施例８で作製した各ストリップを試験管（13×
100mm）に入れ、これに、５μg/mlのUBを含有するPBS
（0.25％ゼラチン、１％トリトンＸ−100、1mM EDTAお
よび0.02％チメロサル（Thimerosal））で50倍希釈され
た血清試料をストリップが充分に浸されるまで添加し
た。試験管（glass tube）をパラ−フィルム（para−fi
lm）で密封し室温で２時間軽く振ってストリップ上の抗
原と血清試料中の抗体を反応させた。
吸入装置を用いて血清を試験管（glass tube）から除
去した。各試験管に4mlの洗浄液（0.05％のツイーン20
を含有するPBS）を加え約４分間振盪した後洗浄液を除
去することによってストリップを１度洗浄した。
20mlの洗浄液を含む反応皿に10個のストリップを置い
て洗浄液で３度洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ
で標識された山羊抗ヒトIgG抗体（goat anti−hIgG
（γ）HRP）を、10μg/mlのUBを含む酵素−標識された
抗体希釈剤（10％牛胎血清、１％のフィコル（Ficol
l）、0.05％のツイーン20、0.02％チメロサルを含むPB
S）５乃至７μg/mlをもって希釈された溶液20mlを反応
皿に加えた。
産物を室温で40分間軽く振って反応させ各20mlの前記
洗浄緩衝液で４回洗浄した後、各20mlの反応緩衝液（50
mM Tris,pH7.5）で２回洗浄した。400μg/mlの４−ク
ロロ−１−ナフトールおよび0.03％の過酸化水素を含む
20mlの反応緩衝液をそこに加え、軽く振盪しながら室温
で20分間反応させた。
反応緩衝液を除去した後、濾過膜を蒸留水で２度洗浄
し、吸収紙に移した後室温で20分間乾燥させた。ストリ
ップに可視的なカラーバンドが現れた。
この結果は表１に示しており、ここで試料番号１乃至
18はオルト診断キット（Ortho Diagnostic kit）によっ
て陽性と診断された結果を示し、試料番号19乃至21はＢ
型肝炎患者から採取した血清を用いて得た結果を示す。
実施例10.試験結果の判定 各抗原蛋白の色濃度を二つの対照群の色濃度と比較す
ることによって、前記試験結果を次のように判定した。
１）始め、バンド１および９でhIgGが着色しているかと
バンド８でユビキチンに色がないかを検査した。
２）色濃度を基にして、各バンドの反応性を次のように
分類した： 各バンドでの色濃度 反応性 ０ − バンド９でのhIgGの色濃度＞ ＋／− バンド９でのhIgGの色濃度と類似 １＋ バンド１と９でのhIgG等の色濃度の間 ２＋ バンド１でのhIgGの色濃度＜ ３＋ ３）前記２）の分類によって、試験試料を次のように判
定した。
反 応 性 結果 １＋以上 ：陽性 −または＋／− ：陰性 １＋以上であるが、バンド８で ：保留 UBの濃度が１＋以上である場合 ４）Ｂ型肝炎の場合、HBVCOREとHBV Pre S2 Ｓ Ag
バンドとが＋であるかHBV Pre S2 Ｓ Agバンドのみ
＋であれば、患者がＢ型肝炎から回復中のことと判定
し、HBVCOREバンドのみ＋であれば、患者が急性Ｂ型肝
炎を患っていることと判定した。
前記基準による判定結果は表Ｉに示されている。オル
ト第一世代診断キットによって陽性と診断された18個の
血清試料中で、株式会社ラッキーのELISA方法（韓国特
許公開第93−683号）によって、ただ３個試料のみ陽性
として診断され１個の試料は中間として診断され、本発
明の診断キットを用いて５個の試料が陽性として診断さ
れた。
株式会社ラッキーのELISA方法によって中間と診断さ
れた４番試料は本発明の診断キットを用いるとき陰性と
診断された。
この結果は、本発明の診断キットがオルト診断キット
より実質的に少なく偽陽性結果を示し、誤診の可能性を
減らすため、ELISA方法によって陽性と診断された血清
試料を確認するのに有用であることを示す。
一方、肝炎患者の血清試料178個を本発明の診断キッ
トを用いた場合は136個の試料が、PCR法を用いた場合は
123個の試料が陽性と診断された。この試験結果を表II
および表IIIに示した。
また、前記試験結果を確認するため前記血清試料をRI
BA II（オルトダイアグノスチックシステムズ社、米
国）を用いて診断した。
その結果を本発明の診断キットを用いて得た結果と比
較して下記表IIIに示す。
表IIIに示したように、PCRで陽性と診断された123個
の試料全てが本発明の診断キットによって同一に診断さ
れた反面、RIBA II（オルトダイアグノスチックシステ
ムズ社）によれば10個の試料が中間と診断された。
この結果は、本発明の診断方法が実質的に誤診の可能
性を減らし２種の肝炎、即ち、Ｂ型およびＣ型肝炎を同
時に診断できることを示す。
また本発明の診断キットは多いエピトープ、即ち、KH
CV外皮蛋白、KHCV E1E2蛋白およびKHCV NS5−1.2蛋白
を含むので、HCV感染に対してさらに正確な診断が可能
である。
本発明を前記実施態様に対して記述したが、本発明と
関連した当該分野の専門家等は本発明を多様に変化およ
び変更でき、これらも、下記添付した請求の範囲で規定
した本発明の範囲に属することは勿論である。
フロントページの続き (72)発明者 チョイ デオグ ヨウング 大韓民国 301―140 ダエジェオン ジ ュング―ク ユチェオン―ドン 10―７ ヒュンダイ アパートメント 117― 1004 (72)発明者 キム チュン ヒュング 大韓民国 305―340 ダエジェオン ユ セオング―ク ドリオング―ドン 386 ―１ ラッキー ドーミトリー 219 (72)発明者 ソー ホング セオブ 大韓民国 305―340 ダエジェオン ユ セオング―ク ドリオング―ドン 386 ―４ ラッキー ドーミトリー 301 (72)発明者 ヤング ジャエ ヨウング 大韓民国 305―340 ダエジェオン ユ セオング―ク ドリオング―ドン 386 ―４ ラッキー アパートメント Ｂ― 304 (72)発明者 キム イン ソオ 大韓民国 305―345 ダエジェオン ユ セオング―ク シンスング―ドン 153 ラッキー ハナ アパートメント 102―402 (72)発明者 チョイ ドング セオブ 大韓民国 305―345 ダエジェオン ユ セオング―ク シンスング―ドン 153 ラッキー ハナ アパートメント 107―707 (56)参考文献 特開 平４−233461（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−148127（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−150466（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−228087（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−74991（ＪＰ，Ａ) 国際公開91／15771（ＷＯ，Ａ１) 国際公開92／11370（ＷＯ，Ａ１) 国際公開92／22655（ＷＯ，Ａ１) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ，30，Ｎｏ．３（1992）ｐ．522−556

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記アミノ酸配列を有するKHCV CORE 14
    蛋白、KHCV 897蛋白、KHCV NS4E蛋白、KHCV NS5−1.
    2蛋白、下記KHCV NS4E、KHCV E1G、KHCV E2AおよびK
    HCV E2E蛋白のアミノ酸配列がＮ末端からＣ末端方向に
    順次に連結されたアミノ酸配列を有するKHCV NS4E1E2
    蛋白；およびＢ型肝炎ウイルスCORE蛋白および／または
    Pre S2 Ag蛋白が、互いに独立的な領域を占めるよう
    に吸着されていることを特徴とするＢ型およびＣ型肝炎
    同時診断用の免疫ブロッティング用ストリップ。
  2. 【請求項２】HCV抗原蛋白またはHBV抗原蛋白が、１つの
    ポリペプチド分子内で１または複数のエピトープが他の
    蛋白と融合された組換え蛋白である請求項１に記載の診
    断ストリップ。
  3. 【請求項３】前記他の蛋白がユビキチンである請求項２
    に記載の診断ストリップ。
  4. 【請求項４】KHCV UB CORE 14蛋白、KHCV UB NS4E
    蛋白、KHCV UB NS4E1E2蛋白、KHCV UB 897蛋白およ
    びKHCV UB NS5−1.2のHCV抗原組換え蛋白;HBV CORE
    蛋白およびHBV Pre S2 Ｓ AgのHBV抗原組換え蛋
    白；陰性対照蛋白としてユビキチン；および陽性対照蛋
    白としてヒトイムノグロブリンを含む請求項３に記載の
    診断ストリップ。
  5. 【請求項５】請求項１乃至４中いずれか一項の診断スト
    リップを使用してＢ型およびＣ型肝炎ウイルスを同時に
    検出する方法。
  6. 【請求項６】（Ａ）精製されたヒトイムノグロブリン、
    KHCV UB CORE 14蛋白、KHCV UB NS4E1E2蛋白、KHC
    V UB 897蛋白、KHCV UB NS5−1.2、HBV CORE HBV
    Pre S2 Ｓ Agおよびユビキチンがそれぞれ吸着し
    た８個のフィルターを遮断溶液で処理し、 （Ｂ）遮断されたフィルターを支持膜に並べて付着し、
    膜を切断して８個の蛋白バンドを形成するように各フィ
    ルターの断片を含むストリップを製造し； （Ｃ）ストリップを推定血清試料と反応させ； （Ｄ）（Ｃ）で得たストリップを西洋ワサビペルオキシ
    ダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼで標識された抗
    ヒトIgG抗体と反応させ； （Ｅ）西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホ
    スファターゼのための基質を加え； （Ｆ）（Ｅ）で得たストリップ上に発色反応を起こした
    後、各バンドの色濃度を測定する段階 を含む、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスを同時に検出する
    方法。
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