CN102043050A - 乙肝病毒c抗体的体外检测方法 - Google Patents

Abstract

一种乙肝病毒C抗体的体外检测方法，使用具有两个以上抗体识别表位的乙肝病毒C抗原，与待测抗体和结合有标记物的抗体同时结合，直接检测标记物或加入反应底物后检测能确定待测抗体。检测结果与人的认识习惯相一致，更便于操作和判断。本方法还提高了检测的灵敏度和重复性，增强了检测特异性。

Description

乙肝病毒C抗体的体外检测方法

技术领域

本发明涉及一种乙肝病毒抗体的检测方法，尤其涉及一种乙肝病毒C抗体的体外检测方法。用该方法检测乙肝病毒C抗体能使检测更准确，且结果更直观。

背景技术

乙型(病毒性)肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者超过2.8亿。我国约占9300万，大多数人无症状，但其中的1/3会出现肝损害的临床表现。

目前通过三种途径对乙型肝炎进行诊断，如：检测病毒的抗原、检测体内抗体以及检测病毒的DNA。临床上，通常使用五种标识物进行判断，如：乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙肝表面抗体(antibodies to hepatitis B surface antigen，HBsAb)、乙肝e抗原(hepatitis B core antigen，HBeAg)、乙肝e抗体(antibodies to the′e′antigen，anti-Hbe/HBeAb)和乙肝核心抗体(antibodies to the core antigen，anti-Hbc/HBcAb)，又称“两对半”。乙肝病毒DNA则用来诊断和观察慢性乙型肝炎。当血液中病毒DNA数量稳定或增加较少时，说明病情较为稳定；当病毒DNA数量不断增多，则说明病情正在恶化。

HBsAg出现于乙肝患者血清中谷丙转氨酶升高之前，直至恢复期时，HBsAg的滴度才会逐步降低乃至消失，但有部分患者HBsAg可持续存在。在绝大多数乙肝病毒感染者的外周血中，含有5ng-600μg/ml的HBsAg。血清中的HBsAg仅仅是个体受到HBV感染的标志，并不反映病毒复制与否、病毒复制程度以及病毒的传染性强弱等。急性乙肝病人恢复期后，随着HBsAg逐步降低乃至消失，血清中会出现对HBV感染具有保护性免疫作用的HBsAb。一般情况下，血清中的HBsAb和HBsAg不会被同时检出。

HBV的前核心(pre-core)/核心(core)基因直接编码两种多肽，其为组成病毒核壳体的21kD亚基p21c和经分泌过程产生的17kD亚基肽p17e(切去定位于内质网的29个氨基酸的pre-core信号肽)。p21c即为血清学上定义的HBcAg，p17e即为血清学上定义的HBeAg。也有文献报道在血清分离出带有-10--1前核区段的HBeAg(Virology 1988，163，268-275)和含有全部29个氨基酸的HBeAg(J.Immunol.，1991，147，3156-3160)。HBeAg和HBcAg约有75％的同源性，其在血清中的出现时间稍晚于HBsAg。一般情况下，若HBeAg检测为阳性时，HBsAg检测亦为阳性，HBeAg阳性结果还表明病毒的传染性强。若这种情况持续3个月以上，则有慢性化倾向。当血清中的HBeAg标识物检测结果为阴性后，体内会出现HBeAb。血清检测HBeAb阳性结果表明病毒复制减少，传染性减弱。因此，对乙肝病人血清中HBeAg和HBeAb标识物的准确测定对乙型肝炎的诊断、预防和治疗具有重要的指导作用。

HBcAb是判断乙肝病情的重要指标。随着急性乙肝的恢复，HBcAb滴度会降低乃至消失。若该标识物在血清中持续高滴度，则表明乙肝病情有向慢性化发展的倾向。在慢性乙肝患者中，HBcAb的检出率及滴度较高说明乙肝病毒复制活跃，还表明了病毒的传染性强。

在乙肝的临床诊断和治疗过程中，通常采用将HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb等五种标识物中的几种相结合的方式来判断乙肝病情。若病人血清中HBsAg、HBeAg和HBcAb三种标识物检测均为阳性时，就可以确定该患者正受到乙肝病毒感染，且病毒正在活跃复制，病毒数量较多，传染性也较强。若病人血清中HBsAg、HBeAb和HBcAb三种标识物检测均阳性时，表明乙肝病情好转，病毒复制数量减少。

酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是目前用于HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb五种标识物体外检测的常用方法。其中，HBsAg、HBsAb和HBeAg采用ELISA双抗体(双抗原)夹心法，如：中国发明专利申请200610030783.3公开的对乙肝病毒核心抗原的体外检测，HBeAb和HBcAb均采用ELISA竞争法，即在抗体结合抗原的过程中，待测样品中的抗体与标记抗体相竞争。使用“夹心法”检测时，溶液显色则表明该标识物检测结果呈阳性(+)，溶液无色表明检测结果呈阴性(-)。这种判断方式与人们的习惯相一致。而在“竞争法”中，其是待测样品中的抗体与标记抗体对结合抗原的竞争，当标记抗体的浓度大于待测样品中的抗体时，溶液色深，表明标识物呈阴性(-)；当待测样品中的抗体的浓度大于标记抗体时，溶液无色或色浅，表明检测结果为阳性(+)。在应用于ELISA检测的酶标记结合物由于温度、湿度或化学氧化等原因而使蛋白酶发生变性、失活或降解时，就无法实现酶促反应使底物生色，这对于采用ELISA竞争法检测的HBeAb和HBcAb而言，其将直接导致假阳性(+)的检测结果。这妨碍了医生对患者采用正确的方法或药物进行治疗，使医疗资源无法高效配置。此外，对受试者的心理状态也会产生较大影响，还会对其日常生活产生种种影响。另外，ELISA竞争法在检测HBeAb和HBcAb标识物中检测灵敏度较低，因此，不能准确检测待测标本中HBeAb和HBcAb标识物的含量。

一方面，ELISA竞争法在检测HBeAb和HBcAb标识物中存在诸多问题与缺陷。另一方面，也由于HBeAg和HBcAg这两种抗原的分子量比较小(小于20kDa)，当应用于ELISA时很难通过物理吸附的方式有效包被于酶标板表面，而对相应抗体的准确检测产生影响。目前这些问题主要可以通过两种方法进行解决，如：雅培(Abbott)公司推出了一款将化学发光技术应用于免疫检测的系列产品——ARCHITECT。检测过程中，先将稀释的样品和HBc/HBe抗原包被的顺磁颗粒混合，使样品中的抗HBc/抗HBe与包被于微球的HBc/HBe抗原结合。清洗后，加入对水解更为稳定的吖啶(acridinium)(US5,468,646)标记的抗人IgG抗体结合物。之后，再次清洗，向反应容器中加入预触发(Pre-Trigger)和触发(Trigger)溶液。最后检测化学发光反应产生的相对光单位(relative light units，RLUs)。该检测的专一性可以达到99.37％-99.73％。中国发明专利申请200510033411.1和200610107394.6也公开了几种化学发光法定量检测乙肝病毒抗体的方法，比较后发现，其各自的原理是相一致的。由于这类方法需要重新配置专用仪器，不仅将对现有仪器造成空置，该仪器也不能适用于其它检测。因此，其可替代性、通用性和普及性等诸多方面都存在一些缺陷。

CORNING公司目前提供一种检测表面处理技术(

AssaySurface)，对普通的聚苯乙烯酶标板表面进行处理，使其表面产生官能基团，如：羧基、巯基或氨基等，然后再与特定的分子通过共价键、疏水相互作用或氢键等方式包被抗原。此外，还有NUNC公司销售的丹麦ExiqonA/S公司许可的Immobilizer^TM酶标板，其上共价固定有谷胱甘肽(glutathione，GST)、链霉亲和素(Streptavidin)或鳌合镍(Nickel-Chelate)等。这些技术目前仅能满足于科学研究的需要，还无法满足于医疗和临床观察上大批量体外检测的需要。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种抗体的体外检测方法，该方法无需事先在检测介质，如：96孔聚苯乙烯检测板，表面包被抗原或抗体。避免了生产后对试剂盒检测产生的影响，更有利于在日常检测中大规模应用。

本发明的另一个目的在于提供一种乙肝病毒C抗体的体外检测方法，根据ELISA“夹心法”原理，当HBcAb检测溶液显色时，则表明HBcAb呈阳性(+)，反之则为阴性(-)，使检测结果与人的认识习惯相一致，更便于操作和判断。

本发明的又一个目的在于提供一种抗体，如：乙肝病毒C抗体的体外定量检测方法，通过测定标准溶液所得曲线，对血清中特定抗体，如：HBcAb，实现定量检测。

本发明抗体的体外检测方法，使用具有两个以上抗体识别表位的抗原，与待测抗体和结合有标记物的抗体同时结合，直接检测标记物或加入反应底物后检测能确定待测抗体。

抗原，或称目标抗原，应当具有两个以上相同或不同的抗体识别表位(Epitope)。该识别表位可以是由不相同抗体识别表位构成的蛋白或多肽；也可以是两个以上相同抗体识别表位构成的蛋白或多肽；还可以在有两个以上相同抗体识别表位的抗原中加入一个以上另一种或几种抗体识别表位组成。对于第三种方式，本领域技术人员可以选择，但不仅限于，在两个以上相同抗体识别表位组成的抗原的N末端或C末端加入一个以上另一种抗体识别表位，或在所述两个以上相同抗体识别表位之间加入一个以上另一种抗体识别表位，或者使一种抗体识别表位与另一种抗体识别表位互相间隔。

组成抗原的蛋白或多肽可以是生物体中自身存在的，也可以是通过人工方式合成的，还可以是将生物体中的抗原经水解得到的多肽。基因工程重组表达是一种可选择的，通过人工合成得到所述目标抗原的方式。即将不同或相同抗体识别表位的DNA序列连接于表达载体上(如：表达质粒)，再转导或转化入基因工程菌后，再由发酵或细胞培养等方式进行表达，最后经过分离和纯化步骤得到。组成目标抗原的基因大小不同，所适用的表达载体亦有不同。不同的表达载体也适用于不同的菌种或菌株。常用的基因工程表达体系如：大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母菌(Saccharomycescerevisiae)和动物细胞等。本领域普通技术人员根据教科书、实验手册、设备手册(如：GE Healthcare为AKTA系列纯化系统配置的纯化指导手册或光盘)、试剂手册和相应的载体设计软件(如：DNAMAN和Vector NTISuite)及其使用说明就能够实现对目标重组抗原的制备。本领域技术人员所公知，一个具备一般生物学常识的技术人员根据“《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002”一书所记载的各种方法，就能够实现基因工程领域的分子生物学各项操作和相应的分离纯化。

本发明所述抗原还可以采用化学方式(如：有机合成)合成或连接。抗原的化学合成可以参照多肽合成的常规方法实现。抗原的化学连接是将不同或相同抗体识别表位连接在一起而得到。由于抗体识别表位的分子量较小，将两个相同或不同的抗体识别表位通过化学方式连接于高分子聚合物所得到的抗原，其能够避免分子间空间构想的干扰，更有利于特异抗体与抗体识别表位的结合。

检测可以选择单独或结合使用肉眼观察和仪器测定的方法实现。如：当结合于抗体的标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶时，加入显色反应物后溶液会显色，再通过肉眼观察或仪器检测即可以确定样品中是否存在待测抗体；当结合于抗体的标记物为β-半乳糖苷酶时，加入反应底物后成荧光，则需要通过仪器测定确定样品中是否存在待测抗体；当结合于抗体的标记物为化学发光物时，通过仪器检测测得标记物，表明样品中存在待测抗体。

本发明所述的抗体的体外检测方法，先将抗体结合蛋白包被于检测板表面；然后加入待测样品，使抗体结合蛋白与血清中抗体相结合；接着将抗原和结合有标记物的抗体(或称：标记抗体)同时加入，直接检测标记物或加入反应底物后检测能确定待测抗体。

抗体结合蛋白能与抗体共价或非共价结合，如：但不仅限于，抗人IgG抗体；葡萄球菌蛋白A(Protein A)，其来自于葡萄球菌的细胞壁，分子量42kD，能够与抗体的Fc非共价结合；大消化链球菌蛋白L(Protein L)，其能与抗体轻链非共价结合。此外，还可以使用链球菌蛋白G(Protein G)，如：65kD的G148蛋白G和58kD的C40蛋白G，或葡萄球菌蛋白A和链球菌蛋白G的融合蛋白A/G(Protein A/G)。抗体结合蛋白选自于这些蛋白之一种或其组合。

检测板为固相介质，选自于塑料或玻璃。

塑料应当理解为全部或部份由碳与氧、氢、氮及其它有机及无机元素化合而成，在制造的最后阶段成为固体，在制造中某些阶段是液体(塑料材料在成为最终产品以前，在某些阶段必需要能够流动)，因而可以加热或加压力，或二者并用的方式，使其形成各种形状，此庞大而变化多端的材料族类中的任何一种，如树脂、热固性树脂、纤维素衍生物等，在一条长链的分子结构中存在众多的重复原子或分子。塑料包括人工合成或自然界有机材料。制成载体介质的所用的塑料或使用一种塑料材料，或使用几种塑料材料在物理上的叠加或相加后的复合，其具体形态为塑料板。

玻璃应当被理解为易碎的非晶体物质，这些物质可以是透明的也可以是半透明的，通常由熔融硅和硅碳酸盐融合组成。玻璃还可以认为是一类不具有结晶过程，而是由熔化状态固化而来的材料，大体上由Na₂O、CaO和6SiO₂化学氧化物组成，具有光学属性和各种机械属性。

具体地说，所述的检测板由聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯或玻璃等制成，具有多孔构造，如：96孔或48孔酶标板。

抗原，应当具有两个以上相同或不同的抗体识别表位，并可以选择基因重组方式实现。对于具有相同或不同抗体识别表位的蛋白或多肽融合后的抗原，其构建原则和方法是本领域普通技术人员所周知。为了不影响待融合肽段的各自的功能，一般需要在不同肽段之间添加一个接头。文献Protein Eng.，2001，14，529-532中提供并详细描述了多种用于多肽或蛋白融合的接头，这些内容可以作为本领域普通技术人员选择适合接头提供一些参考。

一般而言，用于将两个以上相同或不同的抗原识别表位相连接而形成的重组抗原所选择的多肽或蛋白质，其序列长度一般为1-100个氨基酸，通常选择长度为4-30个氨基酸的多肽，优先选择长度为4-15个氨基酸的多肽。组成这些多肽和蛋白质的氨基酸指既具有共价连接氨基又共价连接羧基的不对称中心碳原子的有机分子。

化学方式(如：有机合成)合成或连接是另一种得到本发明所述抗原的方式。抗原的化学合成可以参照多肽合成的常规方法，如，但不仅限于，Fmoc多肽合成方法(J.Org.Chem.，1972，37，3404-3409；Eur.J.Immunol.，1994，24，3188-3193；黄惟德，陈常庆多肽合成，北京：科学出版社，1985)。抗原的化学连接是将不同或相同抗体识别表位连接在一起而得到。这些连接方式，如：但不仅限于，将两个相同或不同的抗原表位经化学过程直接连接；或通过化学方式将两个相同或不同的抗原表位均与一个长度为4-15个氨基酸的多肽接头相连；或通过化学方式将两个相同或不同的抗原表位均与一个有机小分子或有机大分子相连。

此外，由于抗体识别表位分子量通常较小，还可以将两个相同或不同的抗体识别表位通过化学方式连接于高分子聚合物的方式得到目标抗原。

高分子聚合物(polymer)是指分子量大于2,000Da的化合物，分子间由结构单位(structural unit)或单体经由共价键相互连接在一起。其结构可以为直线型(linear)、分枝型(branch/multi-arm)或分叉型(dendrimer)。所述聚合物选自于，但不仅限于，聚乙二醇、聚氨基酸、聚核苷酸、聚乳酸、聚赖氨酸、聚亚胺和10个以上单糖通过糖苷键形成的多聚糖(polysaccharide)，如：但不仅限于，淀粉及其水解产物、纤维素、甲壳素或葡聚糖。

分叉型聚合物(dendrimer)一般为聚氨基胺(poly(amidoamine)，PAMAM)，可以分别由氨或乙二胺为起始物制备(Clin.Chem.，1994，40，1845-1849)，也有使用氨基酸聚合而成(J.Immuno.Method.，1996，196，17-32)，如：赖氨酸和精氨酸。所得聚合物具有活性基团，如：氨基、羟基或羧基，聚合次数越多，其分子量越大，官能团也越多，所能结合的分子也相应增加。

聚乙二醇选自于两端均未封闭或一端封闭的聚乙二醇，封闭基团选自于C1-C30烷基，C1-C30脂肪酸或C3-C30糖基。聚乙二醇选自于分子量2,000-100,000Da，可以选择2,000-50,000Da，一般选择5,000-50,000Da。进一步的，所述封闭基团选自于C1-C20烷基，通常选择C1-C10烷基，优先选择甲基、乙基或丙基。

聚氨基酸包括由相同氨基酸聚合而成的寡聚分子，也包括由不同分子聚合而成的多聚分子，蛋白质或多肽是其天然存在形式。这些蛋白质包括从生物体中分离得到的天然产物及其水解产物，也包括基因工程重组的产物及其水解产物，还包括通过化学方式直接合成的或将不同多肽片段连接而成的产物。多肽的长度应当15个氨基酸以上，包括从生物体中分离得到的天然产物及其水解产物，也包括基因工程重组的产物及其水解产物，还包括通过化学方式直接合成的或将不同多肽片段连接而成的产物。

各种相同或不同的抗体识别表位与高分子聚合物共价结合(covalent coniugate)，形成的共价键如：但不仅限于，酰胺键(amide bond)、尿键(urine bond)、酯键或二硫键。抗体识别表位通过其氨基酸侧链、N末端氨基或C末端羧基与高分子聚合物相结合。这种结合可以通过如：但不仅限于，N-羟基琥珀酰亚胺、马来酸酐或丙/乙醛基等试剂将氨基酸侧链、N末端氨基或C末端羧基进行活化后与高分子聚合物相结合，也可以适用前述相同或不同的方式，先活化高分子聚合物的基团后，再与目标抗原(如：乙肝病毒C抗原)相结合。其它还有通过腙(hydrazone)、肟(oxime)、巯基或噻唑烷(thiazolidine)等方式结合(J.Immuno.Method，1996，196，17-32)。

各种相同或不同的抗体识别表位与糖类分子之间的结合方式参见J.Pharma.Sci.87，326-332；Adv.Drug deliv.Rev.，6，103-131；Adv.Drug deliv.Rev.，13，251-267。聚乙二醇与各种抗原表位的结合方式参见Adv.Drug deliv.Rev.，28，275-299；Adv.Drug deliv.Rev.，54，453-609；Adv.Drug deliv.Rev.，60，1-88。由于抗原表位与高分子聚合物结合所涉及的化学反应相同或相似，本领域普通技术人员在参考这些结合方式的情况下，可以将其同样应用于各种抗体识别表位与其它聚合物结合的反应当中以得到目标抗原。

各种相同或不同的抗体识别表位还可以通过连接子(space linker)以化学连接的方式与高分子聚合物间接连接。这种连接子选自于氨基酸长度1-500的多肽或蛋白质、分子量在100-2,000Da的聚合物或有机小分子。如：但不仅限于，分子量为200-2,000Da的两端活化的聚乙二醇(NOFCorporation)、NH₂(CH₂)_nCOOH、SH(CH₂)_nCOOH或两端活化的C1-C30的脂肪酸(J.Gene.Med.，2005，7，604-612)。化学连接可以是抗体识别表位N末端或C末端与上述连接子上的活化基团连接，也可以由抗体识别表位某一个氨基酸侧链与连接子上的活化基团连接。连接子与抗体识别表位之间形成共价键，如：但不仅限于，酰胺键、尿键、酯键、、硫醚键、腙键(-CH＝N-NH-)、肟键(-CH＝N-O-)和二硫键。所形成的共价键选自于这些化学键之一种或几种。

本发明使用标记物的目的在于，当结合有标记物的抗体与已结合血清中抗体的抗原相结合后，通过仪器可以将该标记直接检测，或通过显色反应检测溶液吸光度，从而对血清是否存在待测抗体进行判断。这些标记物选自于，但不仅限于，荧光标记物(如：异硫氰基荧光素)、同位素标记、酶标记物(如：碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)和化学发光标记物(美国专利5,468,646)等。以酶标记为为例，当使用辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP，EC.1.11.1.7)标记抗体时，所用的显色反应物可以为3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，TMB)。

在检测过程中，标记物含量的差异，就使得检测值产生高低差异，再配合一条标准曲线，就可以实现对未知浓度的血清样品中待测抗体进行定量检测。

依据ELISA“夹心法”原理，将本发明所述的抗体检测方法应用于HBcAb的检测中，当HBcAb检测溶液显色时，就直接表明HBcAb呈阳性(+)，反之则为阴性(-)，使检测结果与人的认识习惯相一致。

一种本发明乙肝病毒C抗体的体外检测方法，使用具有两个以上抗体识别表位的乙肝病毒C抗原，与待测乙肝病毒C抗体和标记的乙肝病毒C抗体同时结合，加入显色反应物后，溶液显色表明待测抗体为阳性。

另一种本发明乙肝病毒C抗体的体外检测方法，先将包被于检测板上的抗体结合蛋白与血清中抗体相结合，然后同时加上乙肝病毒C抗原和辣根过氧化物酶标记的乙肝病毒C抗原抗体，在加入显色底物TMB后，加入终止液。于450nm下测定溶液吸光度。

在本发明所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法中，需要先将抗体结合蛋白，如：葡萄球菌蛋白A，包被于酶标板表面，然后加入稀释的待测血清样品，使酶标板上的抗体结合蛋白与样品中抗体IgG相结合；清洗后，加入HBcAg和HRP标记的HbcAg单克隆抗体，使样品中的乙肝病毒C抗体和HRP标记的HBcAg抗体都与HBcAg相结合。再次清洗后，加入显色底物TMB和反应终止液，最后在450nm波长下检测。随着样品中所含HBcAb的量不同，其显色后溶液吸光度也有变化，这样通过若干个检测点就可以得到一条标准曲线，用以血清中未知含量HBcAb的定量。

另一种本发明所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，包括如下步骤：

1.将葡萄球菌蛋白A包被于多孔酶标板，4℃过夜；

2.除去包被液，加入200μl/孔封闭液(如：pH7.4，1％(w/v)BSA溶液)，4℃过夜或37℃1-2小时；

3.清洗酶标板，将已知不同浓度的HBcAb标准品和稀释的待测血清样品分别加入酶标板各个孔中，200μl/孔，37℃孵育1小时；

4.清洗酶标板，加入HBcAg和HRP标记的HBcAg抗体，混匀，37℃孵育30分钟，再次清洗酶标板，加入显色底物TMB，37℃孵育15-30分钟，加入终止液；

5.在450nm波长下检测各孔中溶液的吸光度值。

通过建立不同浓度HBcAb与吸光度的坐标关系，得到一条标准曲线及其公式，然后将未知浓度的血清样品吸光度值代入公式中就可得到相应的HBcAb含量。最后结合样品稀释度得出实际的定量结果。

本发明所述的乙肝病毒C抗原，包括SEQ ID No：1所示的序列，也包括从其抗原序列上获取的具有70％以上同源性的2种以上抗体结合表位的多肽进行重组后得到的重组C抗原。

本发明所述的乙肝病毒C抗原还可以使用蛋白质表位预测软件，如：BIOSUN(北京基础医学研究所计算生物学中心)，选取抗原中具有一个或多个表位、尤其是优势表位(能够激发较强的免疫反应的表位)的相应肽段，通过常规的分子生物学方法钓取其编码序列并表达出该抗原多肽；或依据功能区段对C抗原表位进行筛选(J.Immunol.，1988，141，4376-4380；Immuno.Lett.，1991，30，59-68；J.Gen.Virol.，1993，74，1335-1340)。从特定抗原表位中选择适宜的抗体，可以采用免疫抗体库的噬菌体展示技术进行筛选(J.Immunol Method，2008，329，176-183)。

本发明所述的乙肝病毒C抗原可以为如：SEQ ID No：1所示序列。也可以从SEQ ID No：1上选择两个以上的抗体识别表位，使用基因工程方法在体外进行重组，如：以大肠杆菌(Virus Res，1989，14，27-48)、酵母(J Biotechnol.，1993，29，243-255；美国专利6,277,631)、赤毕酵母(J Biotechnol.，2008，138，1-8)、哺乳动物细胞(Antiviral Res，2006，72，116-124)或昆虫细胞(Biotechnology，1995，13，261-264)为重组表达系统，使经重组后表达的重组乙肝病毒C抗原(rHBcAg)具有2个以上的抗体结合(识别)表位。

本发明所述的乙肝病毒C抗原如：SEQ ID No：1所示序列，或从SEQID No：1上选择两个以上的抗体结合表位，通过化学方式连接后得到的抗原，或从SEQ ID No：1上选择两个以上的抗体结合表位，通过化学方式与高分子聚合物连接后得到的抗原。。

本发明技术方案实现的有益效果

本发明将与血清中抗体特异结合的抗体结合蛋白包被于酶标板表面，使得抗体的Fc片段与抗体结合蛋白相结合，抗体的Fab片段则保持原有构象。所有与抗体结合蛋白相结合的抗体均以“Y”型结构处于活性状态，更有利于与抗原结合，并提高检测的灵敏度和重复性。

将与血清中抗体特异结合的抗体结合蛋白包被于酶标板表面后，能使乙肝病毒C抗体的检测从“竞争法”改为“夹心法”。在检测过程中，检测溶液显色以表明HBcAb阳性(+)，反之则为阴性(-)，使检测结果与人的认识习惯相一致，更便于操作和判断，还能实现血清样品的准确定量。

通过使用具有两种抗体结合表位的乙肝病毒C抗原，增强了检测特异性。

本发明所涉及的术语与其一般概念相同。

所述的“抗原”或“目标抗原”均指适用于本发明所述检测方法的，具有两个以上抗原识别表位，能同时识别或结合两个以上抗体的抗原。这些抗体可以相同也可以不相同，如：但不仅限于，在检测过程中，这些抗体通常分别为来自于血清中的抗体和结合有标记物的抗体。

所述的“抗体识别表位通过化学方式连接于高分子聚合物”指抗原直接或通过连接子间接与高分子聚合物共价结合。

所述的“乙肝病毒C抗原与高分子聚合物共价结合”指乙肝病毒C抗原直接或通过连接子间接与高分子聚合物共价结合。

所述的“C1-C10烷基”、“C1-C20烷基”和“C1-C30烷基”指直链或支链烷基，如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基等。其中，字母C表示碳原子，其后数字为正整数，如：1、2、3、4或5等，表示基团所含的碳原子个数。

所述的“C1-C30的脂肪酸”指饱和或不饱和的直链或支链碳链，其上至少有一个羧基，如：甲酸、乙酸、丙酸、油酸、亚油酸、软脂酸，十八碳四烯酸、琥珀酸和苹果酸等。其中，字母C表示碳原子，其后数字为正整数，如：1、2、3、4或5等，表示基团所含的碳原子个数。

所述的“C3-C30的糖基”，如：丙糖基、丁糖基、戊糖基和己糖基等。其中，字母C表示碳原子，其后数字为正整数，如：3、4或5等，表示基团所含的碳原子个数。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。

实施例1Protein A包被于酶标板

选择未经处理的聚苯乙烯酶标板，加入0.9μg/ml Protein A溶于碳酸盐缓冲液，pH9.2-9.8，100μl/孔，4℃过夜。去除包被液，每孔加入1％(w/v)BSA溶液(PBS，pH7.4)200μl进行封闭，37℃1-2小时。

实施例2血清样品检测方法

用PBST(含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液)清洗酶标板1-2次，每次拍干。

每孔加入90μl PBS后，每孔加入待测血清10μl，混匀后于37℃孵育60分钟。

去除反应液并拍干后，用PBST洗板4次，每次均拍干。

每孔加入40μl重组HBcAg(SEQ ID NO：1，由上海荣盛生物药业有限公司提供)(用PBS稀释1∶2000)和40μl经HRP标记的HBcAg抗体(用PBS稀释1∶2000)。

每孔分别加入底物A和B液各50μl，混匀，37℃孵育15分钟，然后加入终止液，450nm酶标仪测定。

底物A液配制：

称取柠檬酸17.9g和Na₂HPO₄·12₂O 4.67g溶解于400ml去离子水中，然后缓慢加入30％(w/w)H₂O₂ 330μL，搅拌均匀后，加水至500ml。分装成10ml/瓶，2～8℃下保存。

底物B液配制：

称取TMB 0.1g于100ml去离子水中，加入DMSO 2.5ml，在搅拌的同时，缓慢加入0.5ml 6M HCi，直至完全溶解，最后加水至500ml。分装成10ml棕色小瓶，2～8℃下保存。

底物反应终止液的配制：

分别量取98％H₂SO₄55ml和去离子水445ml，然后将浓硫酸缓慢加入到去离子水中，混匀，分装成10ml/瓶，2～8℃下保存。

在酶标板中加入5种不同浓度的已知HBcAb标准品和稀释的待测血清样品分别加入酶标板各个孔中，使用相同的检测方法就能实现HBcAb的定量检测。

实施例3HBcAb检测平行对照

以目前使用的HBcAb竞争ELISA检测试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)进行对照。

共有350例标本用于此实验，其中，

大三阳(HBsAg、HBeAg和HBcAb阳性)：110例；

小三阳(HBsAg、HBeAb和HBcAb阳性)：100例；

健康人血清(来自血库)：140例。

检测结果见表1。

表1HBcAb检测平行对照

从表1可得：

阳性一致率：203/203＝100％；

阴性一致率：140/147＝95.2％；

总的一致率：343/350＝98％。

实施例4HBcAb灵敏度检测

从用于实施例3检测的小阳性标本中随机选择6例，用磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)系列稀释，分别为：1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512和1/1024。同时做(阴性)对照，即不加入稀释血清，用PBS代替，其它步骤相同，检测OD值结果见表2。

表2HBcAb灵敏度检测结果

注：此方法检测阈值(Cut-Off值)：X+2SD，即，Cut-Off＝0.025

OD450≥0.025为阳性，OD450＜0.025为阴性。

从结果可见，竞争抑制法ELISA灵敏度不超过稀释度1/512，而应用本发明检测反应方法检测HBcAb，其稀释度至少可达到1/1024，灵敏度得到显著提高。

实施例5HBcAb专一性检测

收集临床标本共90例(包括Anti-HAV，Anti-HCV和Anti-HIV(1+2)阳性，均经上海荣盛生物药业有限公司相应试剂盒检测)和健康人标本100例，应用此方法(正向反应)检测HbeAb，结果总结如下表3。

表3HBcAb专一性检测

检测专一性＝真阴性/(真阴性+假阳性)＝188/190＝99％

实施例6HBcAb定量检测

①校正品的制备

本试剂盒采用5个不同相对浓度的校正品，浓度单位为相对单位(RU/ml)，其设定方法如下：

OD₄₅₀＝1.9～2.0时，设定浓度单位为100RU/ml，作为上限；

OD₄₅₀＝0.9～1.0时，设定浓度单位为50RU/ml

OD₄₅₀＝0.4～0.5时，设定浓度单位为25RU/ml

OD₄₅₀＝0.2～0.3时，设定浓度单位为12RU/ml

OD₄₅₀＝0.01～0.2时，设定浓度单位为0RU/ml，作为下限。

绘制标准曲线，设定5个测定点，分别制备校正品1～5号(0、12、25、50和100RU/ml)。

5号校正品的制备：取抗HBcAb阳性且OD₄₅₀＝1.9～2.0的乙肝患者血清/血浆1ml，用9ml样品稀释液稀释，充分混匀；取其中的5ml，分装标准小瓶中，每瓶1ml，注明为“校正品-5”，2～8℃下保存。

4号校正品的制备：取上述余下的5ml，加入样品稀释液5ml，充分混匀，取其中的5ml，分装标准小瓶中，每瓶1ml，注明为“校正品-4”，2～8℃下保存。

3号校正品的制备：取上述余下的5ml，加入样品稀释液5ml，充分混匀，取其中的5ml，分装标准小瓶中，每瓶1ml，注明为“校正品-3”，2～8℃下保存。

2号校正品的制备：取上述余下的5ml，加入样品稀释液5ml，充分混匀，取其中的5ml，分装标准小瓶中，每瓶1ml，注明为“校正品-2”，2～8℃下保存。

1号校正品的制备：取样品稀释液，分装标准小瓶中，每瓶1ml，注明为“校正品-1”，2～8℃下保存。

②弱阳性对照品的制备

取抗HBcAb阳性且OD₄₅₀＝0.2～0.3的乙肝患者血清/血浆1ml，离心取上清，用0.22tm生物膜过滤除菌，用9ml样品稀释液稀释，充分混匀，分装标准小瓶中，每瓶1ml，注明为“弱阳性对照品”，2～8℃下保存。

③阴性对照品的制备

取正常人血清多份，等比例混合，取1ml，离心取上清，用0.22μm生物膜过滤除菌，用9ml样品稀释液稀释，充分混匀，分装标准小瓶中，每瓶1ml，注明为“阴性对照品”，2～8℃下保存。

④结果计算与判定

定性分析

结果计算：比值＝样本OD₄₅₀/弱阳性对照OD₄₅₀

结果判定：

比值＜0.95        阴性

0.95＜比值≤1.0   临界值，建议重新测定

比值>1.0          阳性

定量分析

绘制标准曲线：以5个校正品的OD₄₅₀值为纵坐标，各自对应的浓度为横坐标，绘制出标准曲线。

结果计算：计算样本测定的OD₄₅₀平均值，然后在标准曲线上读出相应浓度(RU/ml)。

结果判定：

≥12RU/ml    阳性

＜12RU/ml    阴性

序列表

<110>上海荣盛生物药业有限公司

<120>乙肝病毒C抗体的体外检测方法

<130>BRS.HF.9006

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID No 1

<211>183

<212>PRT

<213>乙肝病毒C抗原

<223>183

<400>1

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp

1                5                   10                    15                  20

Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro

         25                  30                 35                  40                  45

Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn

                50                  55                  60                  65

Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn

         70                  75                  80                 85                  90

Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

                 95                  100               105                   110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro

        115                 120                  125              130                  135

Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg

                 140                  145               150                 155

Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu

        160                 165                 170                 175                 180

Ser Gln Cys

Claims (14)

1.一种乙肝病毒C抗体的体外检测方法，使用具有两个以上抗体识别表位的抗原，与待测抗体和结合有标记物的抗体同时结合，直接检测标记物或加入反应底物后检测能确定待测抗体。

2.根据权利要求1所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述的乙肝病毒C抗原为重组乙肝病毒C抗原。

3.根据权利要求1所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述的乙肝病毒C抗原为将两个相同或不同的抗体识别表位通过化学方式连接于高分子聚合物所得到的抗原。

4.一种乙肝病毒C抗体的体外检测方法，先将抗体结合蛋白包被于检测板表面；然后加入待测样品，使抗体结合蛋白与样品中抗体相结合；接着将抗原和结合有标记物的抗体同时加入，直接检测标记物或加入反应底物后检测能确定待测抗体。

5.根据权利要求4所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述的抗体结合蛋白选自于Protein A、Protein G、Protein A/G、抗人IgG抗体和Protein L之一或其组合。

6.根据权利要求4所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述的标记物选自于荧光标记物、同位素标记、酶标记物和化学发光标记物。

7.根据权利要求4所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述的抗原选自于具有2个以上的抗体结合表位的乙肝病毒C抗原。

8.根据权利要求7所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述的乙肝病毒C抗原为重组乙肝病毒C抗原。

9.根据权利要求7所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述的乙肝病毒C抗原为将两个相同或不同的抗体识别表位通过化学方式连接于高分子聚合物所得到的抗原。

10.一种乙肝病毒C抗体的体外检测方法，先将包被于检测板上的抗体结合蛋白与血清中抗体IgG相结合，然后同时加上乙肝病毒C抗原和辣根过氧化物酶标记的乙肝病毒C抗原单克隆抗体，在加入显色底物TMB后，加入终止液，于450nm下测定溶液吸光度。

11.根据权利要求10所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述的乙肝病毒C抗原氨基酸序列选自于SEQ ID No：1。

12.根据权利要求10所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述的乙肝病毒C抗原为从SEQ ID No：1上选择两个以上的抗体结合表位，通过化学方式连接后得到的抗原。

13.根据权利要求10所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述的乙肝病毒C抗原为从SEQ ID No：1上选择两个以上的抗体结合表位，通过化学方式与高分子聚合物连接后得到的抗原。

14.根据权利要求13所述的乙肝病毒C抗体的体外检测方法，其特征在于所述抗体识别表位与所述高分子聚合物之间的共价键选自于酰胺键、尿键、酯键、硫醚键、腙键、肟键和二硫键之一种或几种。