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CN111579781A - 丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒、制备方法及检测方法 - Google Patents

丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒、制备方法及检测方法 Download PDF

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CN111579781A
CN111579781A CN202010436988.1A CN202010436988A CN111579781A CN 111579781 A CN111579781 A CN 111579781A CN 202010436988 A CN202010436988 A CN 202010436988A CN 111579781 A CN111579781 A CN 111579781A
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hepatitis
virus
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antigen
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江伟敏
曹志刚
徐怀海
张峰
彭燕婷
李兵
古小丹
彭迎春
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Original Assignee
Shenzhen Uno Biotechnology Corp
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Abstract

本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种丙型肝炎病毒抗体的试剂盒、制备方法及检测方法。一种丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂，其中，所述R1试剂包括链霉亲和素磁微粒溶液；所述R2试剂包括生物素化丙型肝炎病毒抗原与丙型肝炎病毒重组抗原的混合试剂；所述R3试剂包括碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体溶液。本发明将丙型肝炎病毒抗体与生物素化丙型肝炎病毒抗原及丙型肝炎病毒重组抗原形成“三明治”夹心复合物，避免因磁性微粒和酶标记物的加入阻碍抗原与抗体结合位点，显著提高了丙型肝炎病毒抗体检测的灵敏度和特异性。

Description

丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒、制备方法及检测方法
技术领域
本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种丙型肝炎病毒抗体的试剂盒、制备方法及检测方法。
背景技术
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的肝脏疾病，不同性别、年龄、种族人群均对HCV易感，该病毒可造成急性或慢性肝炎感染。据世卫组织统计，全球约1.85亿人感染HCV，其感染率约2.8％，HCV具有隐匿性，确切的慢性丙型肝炎发病率尚不清楚。HCV的传播途径主要包括：血液传播、性传播、母婴传播、部分HCV感染者的传播途径不明确。
至今尚未成功研制出有效的疫苗预防丙型肝炎，因此，防治丙肝的有效途径是早期诊断、早期治疗。目前丙型肝炎的实验室诊断方法有：HCV血清学检测，HCV RNA、基因型和变异检测。HCV RNA检测特异性好、灵敏度高，对设备和操作人员的要求较高，在感染者的体内水平具有不稳定性，因此该法具有局限性。HCV基因型和变异检测结果有助于判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的方案，但价格较高，耗时较长，不适用于普筛。常用的HCV血清学检查采用的是酶联免疫法(ELISA)，化学发光免疫分析法(CLIA)和重组免疫印迹法(RIBA)，抗HCV抗体是血清学检测的标志。ELISA常利用多孔聚苯乙烯反应板作为固相载体，将待测抗原或抗体固定于固相载体表面，再用酶标记的抗原或抗体与其特异性反应，加入底物后，用酶标仪通过显色反应判断结果，该法适用于大批量样本的检测，但其灵敏度和特异性不太高，自动化程度低，容易出现操作失误引起结果误判。重组免疫印迹法(RIBA)是HCV感染的确证试验，主要解决ELISA试验中出现的假阳性，提高了特异性，但对于阳性结果的判断，RIBA不能提供更多相关HCV感染的信息，也不经济。化学发光免疫分析法(CLIA)是在酶免疫分析的基础上结合了高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，该法利用顺磁性微粒作为固相载体，体积小、比表面积大，扩大了反应面积，提高了检测的灵敏度，检测时需配套使用全自动化学发光仪器和配套试剂，自动化程度高。
然而，目前采用的化学发光免疫法检测丙型肝炎抗体，仍有灵敏度低、特异性差等问题。仍需开发一种检验灵敏度高、特异性强的丙型肝炎病毒抗体检测试剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检验灵敏度高、特异性强的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒、制备方法及检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒，采取以下技术方案：
一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂，其中，
所述R1试剂包括链霉亲和素磁微粒溶液，所述链霉亲和素磁微粒的浓度为0.05～1mg/ml，所述磁微粒的粒径为1～4μm；
所述R2试剂包括生物素化丙型肝炎病毒抗原与丙型肝炎病毒重组抗原的混合试剂，生物素化丙型肝炎病毒抗原浓度为0.05～0.2％，丙型肝炎病毒重组抗原的浓度为0.05～0.2％；
所述R3试剂包括碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体溶液，所述碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的浓度为0.05～0.2％，丙型肝炎病毒单克隆抗体与碱性磷酸酶的标记比例为1：1～10：1。
本发明人通过大量研究实验考察后发现，传统技术中难以实现用HCV抗原标记碱性磷酸酶的技术。其中一个原因在于，HCV的主要抗原表位区CORE抗原的主要活性区富含赖氨酸，赖氨酸侧链上的游离氨基是标记反应的主要靶基因，易出现标记后CORE抗原活性下降的现象；另一个原因在于，HCV的主要抗原表位区NS3抗原对构想依赖较强，标记时抗原分子的活性表位难以暴露，且被大分子物质(如碱性磷酸酶和过氧化物酶)标记后构象易改变，活性下降，降低试剂盒的灵敏度，易漏检。
在上述研究发现的基础上，本发明对传统技术进行了改进，将丙型肝炎病毒抗体与生物素化丙型肝炎病毒抗原及丙型肝炎病毒重组抗原形成“三明治”夹心复合物，再加入链霉亲和素磁微粒及酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体。该体系可避免因磁性微粒和酶标记物的加入阻碍抗原与抗体结合位点，而造成反应不充分，试剂灵敏度低，易漏检的问题。
在其中的一个实施例中，所述生物素化丙型肝炎病毒抗原由HCV Core、NS3、NS4、NS5基因片段串联融合表达得到；
所述丙型肝炎病毒重组抗原由HCV Core、NS3、NS4、NS5基因片段串联融合表达得到；
所述生物素化丙型肝炎病毒抗原和丙型肝炎病毒重组抗原与丙型肝炎病毒抗体在不同的位点结合。
上述方案中，使用的HCV抗原为包括HCV CORE、NS3、NS4及NS5基因片段融合表达得到，使HCV抗体检测的窗口期缩短、特异性提高，假阳性减少，灵敏度提高。
在其中的一个实施例中，所述R2试剂还包括还原剂，所述还原剂为二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐，还原性谷胱甘肽、半胱氨酸或β-巯基乙醇中的一种或多种；
所述还原剂优选为β-巯基乙醇；
所述β-巯基乙醇的浓度为0.1％～2.5％；
优选为β-巯基乙醇的浓度为0.25％～1％，更优选为β-巯基乙醇的浓度为0.5％。
上述方案中，还原剂的添加打开了HCV抗原结构中的二硫键，有利于抗原结合位点的暴露，提高了HCV抗原的活性，有利于HCV抗原与抗体的结合，从而使试剂盒的灵敏度提高。
在其中的一个实施例中，所述R2试剂还包括缓冲液、表面活性剂、蛋白；
所述缓冲液为0.2～0.8mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，0.02～0.1M Tris缓冲液或0.02～0.1M Hepes缓冲液中的一种，pH为7.2～7.6；
所述表面活性剂包括0.01～0.1％浓度的十二烷基硫酸钠及0.5～2％浓度的吐温-20、0.5～2％浓度的吐温-60或0.5～2％浓度的吐温-80中的一种；
所述蛋白为0.05～0.2％浓度的酪蛋白或0.5～2％浓度的牛血清白蛋白中的一种。
在其中的一个实施例中，所述试剂盒还包括校准品及质控品，
所述校准品包括丙型肝炎病毒抗体阴性的人血清和丙型肝炎病毒抗体阳性的人血清；
所述质控品包括丙型肝炎病毒抗体阴性的人血清和丙型肝炎病毒抗体阳性的人血清。
本发明还提供了一种如上所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括所述R2试剂中生物素化丙型肝炎病毒抗原的制备方法，包括如下步骤：
将所述丙型肝炎病毒抗原用脱盐柱进行脱盐，得纯化液；
按照DMF：生物素＝1：3～5的比例配制1～30mM生物素溶液；
将纯化液加入到生物素溶液中，常温反应20～40分钟。
反应后脱盐，回收离心液即可得到生物素化的丙型肝炎病毒抗原。
在其中的一个实施例中，所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述R2试剂的制备方法包括，将生物素化丙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒重组抗原、还原剂、缓冲液、表面活性剂、蛋白混合制成。
在其中的一个实施例中，所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述R3试剂中碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的制备方法包括：
(1)ALP-mal的制备：
1)添加DMF到EMCS中，配制成60～100mM EMCS溶液；
2)将EMCS溶液添加到ALP调制用缓冲液中；
3)搅拌ALP溶液的同时添加上述混合液，温度35～38℃，加热50～70分钟；
4)进行离心脱盐，回收离心脱盐后溶液；
(2)ALP-mal标记还原：
1)缓冲液置换，用离心脱盐柱进行丙型肝炎病毒单克隆抗体缓冲液的置换，回收缓冲液置换后的溶液；
2)凝胶过滤用缓冲液溶解MEA，配制0.2～0.5M的MEA溶液；
3)丙型肝炎病毒单克隆抗体溶液的巯基化，按照MEA溶液的量：丙型肝炎病毒单克隆抗体溶液＝1：8～10的比例进行混合，温度35～38℃，加热80～100分钟；
4)脱盐，反应结束后进行离心脱盐，回收脱盐后溶液；
5)ALP-mal的导入，将ALP-mal加入到上述溶液中，密封，2-8℃静置反应约16-24小时；
6)终止，添加0.1M的MEA溶液到步骤5)中的溶液中，充分搅拌，温度35～38℃，反应5～15分钟；
7)保存，终止后的溶液2-8℃环境下保存。
在其中的一个实施例中，所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述R1试剂的制备方法包括：取链霉亲和素磁微粒溶液，用0.05mol/L TRIS缓冲溶液稀释得到的浓度为0.05～1mg/ml链霉亲和素磁微粒的R1试剂。
本发明还提供了一种用于检测丙型肝炎病毒抗体的化学发光免疫方法，其特征在于，采用权利要求1-9中任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：
步骤A：将待测样本与R2试剂混合，36～38℃温育，生物素化丙型肝炎病毒抗原与丙型肝炎病毒重组抗原分别与待测物中丙型肝炎病毒抗体结合，形成“抗原-抗体-抗原”夹心复合物；
步骤B：加入R1试剂链霉亲和素标记的磁性微粒，36～38℃温育，上述夹心复合物通过生物素与链霉亲和素的亲和作用桥连，使该复合物连接在固相载体上，洗涤；
步骤C：加入R3试剂碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，36～38℃温育，洗涤；
步骤D：加入化学发光底物，使其在酶的催化下，产生发光信号，由光量子阅读系统接收，光电倍增管对反应所产生的光子数进行测量，软件根据光信号与Cutoff值自动计算待测样本中的丙型肝炎病毒抗体含量。
本发明的检测丙型肝炎病毒抗体的化学发光免疫方法，采用上述试剂盒，先加入待测样本与R2试剂，使待测样本中的丙型肝炎病毒抗体与生物素化丙型肝炎病毒抗原及丙型肝炎病毒重组抗原充分反应，形成“抗原-抗体-抗原”夹心复合物，再加入链霉亲和素标记的磁性微粒及碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，该方法由于后加入磁性微粒及碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，避免因磁性微粒和酶标记物的加入阻碍抗原与抗体结合位点，使两个HCV抗原与抗体充分结合，从而提高了检测灵敏度。
上述方案中，步骤B与步骤C可同时进行，加入R1试剂链霉亲和素标记的磁性微粒与R3试剂碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，36～38℃温育，一步洗涤，再加入化学发光底物进行检测；或步骤B与步骤C依次进行，两步洗涤，即先进行步骤AB，洗涤，再进行步骤C，洗涤，再加入化学发光底物进行检测。
所述化学发光底物为(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷，AMPPD)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒，将丙型肝炎病毒抗体与生物素化丙型肝炎病毒抗原及丙型肝炎病毒重组抗原形成“三明治”夹心复合物，再加入链霉亲和素磁微粒及酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，避免因磁性微粒和酶标记物的加入阻碍抗原与抗体结合位点，使“抗原-抗体-抗原”结合更充分，从而提高了检测灵敏度。
(2)本发明的一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒中，生物素化丙型肝炎病毒抗原及丙型肝炎病毒重组抗原均由HCV Core、NS3、NS4、NS5基因片段串联融合表达得到，且生物素化丙型肝炎病毒抗原和丙型肝炎病毒重组抗原与丙型肝炎病毒抗体在不同的位点结合，使HCV抗体检测的窗口期缩短、特异性提高，假阳性减少，灵敏度提高。
(3)本发明的一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒中，R2试剂中还包括还原剂，还原剂能够使蛋白分子内的二硫键打开而不被氧化，还原成-SH，稳定的存在于均一的溶液中，解决了蛋白分子可能因错配二硫键引起抗原构象改变的现象，从而提高了HCV抗原的活性，有利于HCV抗原与抗体的结合，使试剂盒的灵敏度提高。
(4)本发明的检测丙型肝炎病毒抗体的化学发光免疫方法，采用上述试剂盒，先加入待测样本与R2试剂，使待测样本中的丙型肝炎病毒抗体与生物素化丙型肝炎病毒抗原及丙型肝炎病毒重组抗原充分反应，形成“抗原-抗体-抗原”夹心复合物，再加入链霉亲和素标记的磁性微粒及碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，该方法由于后加入链霉亲和素磁微粒及酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，避免因磁性微粒和酶标记物的加入阻碍抗原与抗体结合位点，使两个HCV抗原与抗体充分结合，从而提高了检测灵敏度。
(5)本发明提供的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒采用链霉亲和素磁微粒，磁微粒作为固相载体，扩大了反应面积，且方便清洗，去除非特异性结合，利于提高检测准确度。
(6)本发明提供的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，实现了自动化监测，避免了人为操作导致的误差，提高了检测速度和检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例中检测丙型肝炎病毒抗体的检测方法原理示意图；
图2为本申请另一实施例中检测丙型肝炎病毒抗体的检测方法原理示意图。
其中：1.生物素化丙型肝炎病毒抗原；2.待测样本中的丙型肝炎病毒抗体；3.丙型肝炎病毒重组抗原；4.“抗原-抗体-抗原”夹心复合物；5.链霉亲和素标记的磁性微粒；6.碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
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实施例1
一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、校准品及质控品，其中，
所述R1试剂包括链霉亲和素磁微粒溶液，所述链霉亲和素磁微粒的浓度为0.05～1mg/ml，所述磁微粒的粒径为1～4μm。
R2试剂包括生物素化丙型肝炎病毒抗原与丙型肝炎病毒重组抗原的混合试剂，生物素化丙型肝炎病毒抗原浓度为0.05～0.2％，丙型肝炎病毒重组抗原的浓度为0.05～0.2％。生物素化丙型肝炎病毒抗原由HCV Core、NS3、NS4、NS5基因片段串联融合表达得到，丙型肝炎病毒重组抗原由HCV Core、NS3、NS4、NS5基因片段串联融合表达得到，生物素化丙型肝炎病毒抗原和丙型肝炎病毒重组抗原与丙型肝炎病毒抗体在不同的位点结合。R2试剂还包括还原剂，还原剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐，还原性谷胱甘肽、半胱氨酸或β-巯基乙醇中的一种，优选为β-巯基乙醇，β-巯基乙醇的浓度为0.1％～2.5％，更优选为β-巯基乙醇的浓度为0.5％。R2试剂还包括缓冲液，pH为7.2～7.6，表面活性剂及蛋白，缓冲液为0.2～0.8mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、0.02～0.1M Tris缓冲液或0.02～0.1M Hepes缓冲液中的一种，pH为7.2～7.6，表面活性剂包括0.01～0.1％浓度的十二烷基硫酸钠及0.5～2％浓度的吐温-20、0.5～2％浓度的吐温-60或0.5～2％浓度的吐温-80中的一种，蛋白为0.05～0.2％浓度的酪蛋白或0.5～2％浓度的牛血清白蛋白中的一种。
R3试剂包括碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体溶液，所述碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的浓度为0.05～0.2％，丙型肝炎病毒单克隆抗体与碱性磷酸酶的标记比例为1：1～10：1。
校准品包括丙型肝炎病毒抗体阴性的人血清和丙型肝炎病毒抗体阳性的人血清。
质控品包括丙型肝炎病毒抗体阴性的人血清和丙型肝炎病毒抗体阳性的人血清。
R2试剂中生物素化丙型肝炎病毒抗原的制备方法，包括如下步骤：
将所述丙型肝炎病毒抗原用脱盐柱进行脱盐，得纯化液；
按照DMF：生物素＝1：3～5的比例配制1～30mM生物素溶液；
将纯化液加入到生物素溶液中，常温反应20～40分钟。
反应后脱盐，回收离心液即可得到生物素化的丙型肝炎病毒抗原。
R2试剂的制备方法包括，将生物素化丙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒重组抗原、还原剂、缓冲液、表面活性剂及蛋白混合制成。
R3试剂中碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的制备方法包括：
(1)ALP-mal的制备：
1)添加DMF到EMCS中，配制成60～100mM EMCS溶液；
2)将EMCS溶液添加到ALP调制用缓冲液中；
3)搅拌ALP溶液的同时添加上述混合液，温度35～38℃，加热50～70分钟；
4)进行离心脱盐，回收离心脱盐后溶液；
(2)ALP-mal标记还原：
1)缓冲液置换，用离心脱盐柱进行丙型肝炎病毒单克隆抗体缓冲液的置换，回收缓冲液置换后的溶液；
2)凝胶过滤用缓冲液溶解MEA，配制0.2～0.5M的MEA溶液；
3)丙型肝炎病毒单克隆抗体溶液的巯基化，按照MEA溶液的量：丙型肝炎病毒单克隆抗体溶液＝1：8～10的比例进行混合，温度35～38℃，加热80～100分钟；
4)脱盐，反应结束后进行离心脱盐，回收脱盐后溶液；
5)ALP-mal的导入，将ALP-mal加入到上述溶液中，密封，2-8℃静置反应约16-24小时；
6)终止，添加0.1M的MEA溶液到步骤5)中的溶液中，充分搅拌，温度35～38℃，反应5～15分钟；
7)保存，终止后的溶液2-8℃环境下保存。
R1试剂的制备方法包括：取链霉亲和素磁微粒溶液，用0.05mol/L TRIS缓冲溶液稀释得到的浓度为0.05～1mg/ml链霉亲和素磁微粒的R1试剂。
校准品及质控品的制备方法：校准品制备包括筛选丙型肝炎病毒抗体阴性的人血清和丙型肝炎病毒抗体阳性的人血清；质控品制备包括筛选丙型肝炎病毒抗体阴性的人血清和丙型肝炎病毒抗体阳性的人血清。
实施例2
丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的检测方法
步骤A：将待测样本与R2试剂混合，36～38℃温育，生物素化丙型肝炎病毒抗原与丙型肝炎病毒重组抗原分别与待测物中丙型肝炎病毒抗体，形成“抗原-抗体-抗原”夹心复合物；
步骤B：加入R1试剂链霉亲和素标记的磁性微粒，36～38℃温育，上述夹心复合物通过生物素与链霉亲和素的亲和作用桥连，使该复合物连接在固相载体上，洗涤；
步骤C：加入R3试剂碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，洗涤；
步骤B与步骤C依次进行，两步洗涤；
步骤D：加入化学发光底物AMPPD，使其在酶的催化下，产生发光信号，由光量子阅读系统接收，光电倍增管对反应所产生的光子数进行测量，软件根据光信号与Cutoff值自动计算待测样本中的丙型肝炎病毒抗体含量。
实施例3
丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的检测方法
步骤B与步骤C同时进行，加入R1试剂链霉亲和素标记的磁性微粒与R3试剂碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，36～38℃温育，一步洗涤。其余步骤与实施例2相同。
对比例1
丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的检测方法
向待测样本中加入链霉亲和素磁性微球溶液及生物素的HCV抗原，混匀，37℃温育，待测样本中的HCV抗体和链霉亲和素磁性微球及生物素的HCV抗原反应，形成复合物，清洗；将标签蛋白的HCV融合抗原溶液和ABEI标记的融合蛋白抗体溶液加入到上述复合物中，混匀，温育，清洗，检测HCV抗体的含量。
试验例1
采用实施例1的试剂组成及制备方法制得的试剂，分别以实施例2的检测方法及实施例3的检测方法对待测样本中的HCV抗体进行检测。
待测样本：丙型肝炎病毒抗体国家灵敏度参考品(L1-L4)
各组分工作浓度：链霉亲和素标记的磁性微粒浓度0.2mg/mL；碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的浓度为0.1％；生物素化丙型肝炎病毒抗原浓度0.1％；丙型肝炎病毒重组抗原浓度0.1％；温育时间36～38℃。
检测数据：如下表1。
Figure BDA0002502643940000061
表1
备注：(本试剂盒)HCV cutoff值＝1.0；
由上表1可知，丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的检测方法无论采用两步洗涤还是一步洗涤，其灵敏度均能达到标准要求，其中两步洗涤的灵敏度较一步洗涤更优。
试验例2
采用实施例1的试剂组成及制备方法制得的试剂，分别以实施例2的检测方法、实施例3的检测方法及对比例1的检测方法对待测样本中的HCV抗体进行检测。
待测样本：丙型肝炎病毒抗体国家灵敏度参考品(L1-L4)
各组分工作浓度：链霉亲和素标记的磁性微粒浓度0.2mg/mL；碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的浓度为0.1％；生物素化丙型肝炎病毒抗原浓度0.1％；丙型肝炎病毒重组抗原浓度0.1％；温育时间36～38℃。
检测数据：如下表2。
样本 实施例2(两步洗涤) 实施例3(一步洗涤) 对比例1
灵敏度参考品L1 175.64 118.21 94.73
灵敏度参考品L2 107.01 75.80 66.13
灵敏度参考品L3 79.43 53.56 45.48
灵敏度参考品L4 0.28 0.32 0.36
表2
备注：(本试剂盒)HCV cutoff值＝1.0；
由上表2可知，采用实施例1的试剂组成及制备方法制得的试剂，分别以实施例2的检测方法、实施例3的检测方法进行丙型肝炎病毒抗体的检测，其灵敏度均优于采用对比例1的方法。
试验例3
还原剂的选择：
将HCV检测试剂各组分母液配制成相应工作浓度后，在R2试剂生物素化丙型肝炎病毒抗原与丙型肝炎病毒重组抗原的混合试剂中分别添加1％的还原剂(包括二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TECP-HCL)、β-巯基乙醇、还原性谷胱甘肽、半胱氨酸)，采用实施例2的检测方法，在其他条件不变的情况下，检测待测样本中的丙型肝炎病毒抗体。
待测样本：HCV阳性血清；
各组分工作浓度：链霉亲和素标记的磁性微粒浓度0.2mg/mL；碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的浓度为0.1％；生物素化丙型肝炎病毒抗原浓度0.1％；丙型肝炎病毒重组抗原浓度0.1％；温育时间36～38℃。
检测数据：见下表3。
Figure BDA0002502643940000071
表3
备注：HCV cutoff值＝1.0
检测结果分析：由上表3可知，以不添加还原剂作为对照，加入还原剂(包括二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TECP-HCL)、β-巯基乙醇、还原性谷胱甘肽、半胱氨酸)后，打开了HCV抗原的二硫键，提高了HCV抗原的活性，使试剂盒的灵敏度提高；其中β-巯基乙醇的还原能力最优。
试验例4
还原剂(β-巯基乙醇)浓度的选择：
将HCV检测试剂各组分母液配制成相应工作浓度后，在抗原稀释液中分别添加不同浓度的的还原剂(β-巯基乙醇)，采用实施例2的检测方法，在其他条件不变的情况下，检测待测样本中的丙型肝炎病毒抗体。
待测样本：HCV阳性血清；
各组分工作浓度：链霉亲和素标记的磁性微粒浓度0.2mg/mL；碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的浓度为0.1％；生物素化丙型肝炎病毒抗原浓度0.1％；丙型肝炎病毒重组抗原浓度0.1％；温育时间36～38℃。
检测数据：见下表4。
β-巯基乙醇浓度的选择 0 0.05％ 0.10％ 0.25％ 0.50％ 1％ 2.50％ 5％
阳性血清COI值 5.66 7.61 8.14 9.84 11.37 9.03 8.27 8.01
表4
备注：HCV cutoff值＝1.0
检测结果分析：由上表4可知，以0％浓度的β-巯基乙醇作为对照，分别加入浓度为0.05％、0.10％、0.25％、0.50％、1％、2.50％、5％的β-巯基乙醇后，确定β-巯基乙醇浓度为0.05％-5％，优选0.1％-2.5％，更优选0.25％-1％，最优选0.5％。
试验例5
本试验采用实施例1的试剂组成及制备方法制得的试剂，利用实施例2的检测方法对本试剂盒的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、精密性、灵敏度、批间差进行评价。
阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、灵敏度方案：分别按照丙型肝炎病毒抗体国家参考品的要求检测相应的待测样本。
精密性方案：分别采用3批本公司连续生产的丙型肝炎病毒检测试剂盒(化学发光免疫分析法)
检测待测样本，重复检测10次，按照公式CV＝标准差(SD)/10次检测值的平均值
Figure BDA0002502643940000082
计算变异系数。
批间差方案：用三个批号的试剂盒，分别检测国家参考品(J)，每批次重复10次，计算30次检
测结果的平均值
Figure BDA0002502643940000083
和标准差(SD)，按照公式CV＝标准差(SD)/10次检测值的平均值
Figure BDA0002502643940000084
计算变异系数。
待测样本：丙型肝炎病毒抗体国家参考品
各组分工作浓度：链霉亲和素标记的磁性微粒浓度0.2mg/mL；碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的浓度为0.1％；生物素化丙型肝炎病毒抗原浓度0.1％；丙型肝炎病毒重组抗原浓度0.1％；温育时间36～38℃。
检测数据：见下表5。
Figure BDA0002502643940000081
表5
检测结果分析：由上表5可知，3批试剂的阴性参考品符合率均为100％；阳性参考品符合率均为100％。精密性CV检测结果分别为5.62％、5.90％、5.47％，均小于15％。灵敏度参考品L1均检出阳性；L2均检出阳性；L3均检出阳性；L4均检出阴性；符合丙型肝炎病毒抗体国家参考品的要求。3批试剂的批间差检测结果为8.43％，小于15％，表明本试剂盒的批间差较好，能满足设计的CV小于15％的要求。
试验例6
本试验采用实施例1的试剂组成及制备方法制得的试剂，利用实施例2的检测方法对本试剂盒的稳定性进行评价。
将本公司生产的同一批次的丙型肝炎病毒检测试剂盒(化学发光免疫分析法)分别置于2～8℃和37±1℃条件下放置7天后取出，置于室温平衡，在同一条件下，按照丙型肝炎病毒国家参考品的要求检测待测样本，记录数据。
待测样本：丙型肝炎病毒抗体国家参考品
各组分工作浓度：链霉亲和素标记的磁性微粒浓度0.2mg/mL；碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的浓度为0.1％；生物素化丙型肝炎病毒抗原浓度0.1％；丙型肝炎病毒重组抗原浓度0.1％；温育时间36～38℃；还原剂选择β-巯基乙醇且浓度为0.5％。
检测数据：见下表6。
Figure BDA0002502643940000091
表6
检测结果分析：由上表6可知，丙型肝炎病毒检测试剂盒(化学发光免疫分析法)置于2～8℃和37±1℃7天后，其阴性参考品符合率均为100％；阳性参考品符合率均为100％；精密性CV检测结果分别为5.32％和7.88％；灵敏度参考品L1均检出阳性，L2均检出阳性，L3均检出阳性，L4均检出阴性。检测结果均符合丙型肝炎病毒抗体国家参考品的要求，表明本试剂盒的稳定性好。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂，其中，
所述R1试剂包括链霉亲和素磁微粒溶液，所述链霉亲和素磁微粒的浓度为0.05～1mg/ml，所述磁微粒的粒径为1～4μm；
所述R2试剂包括生物素化丙型肝炎病毒抗原与丙型肝炎病毒重组抗原的混合试剂，生物素化丙型肝炎病毒抗原浓度为0.05～0.2％，丙型肝炎病毒重组抗原的浓度为0.05～0.2％；
所述R3试剂包括碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体溶液，所述碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的浓度为0.05～0.2％，丙型肝炎病毒单克隆抗体与碱性磷酸酶的标记比例为1：1～10：1。
2.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述生物素化丙型肝炎病毒抗原由HCV Core、NS3、NS4、NS5基因片段串联融合表达得到；
所述丙型肝炎病毒重组抗原由HCV Core、NS3、NS4、NS5基因片段串联融合表达得到；
所述生物素化丙型肝炎病毒抗原和丙型肝炎病毒重组抗原与丙型肝炎病毒抗体在不同的位点结合。
3.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂还包括还原剂，所述还原剂为二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐，还原性谷胱甘肽、半胱氨酸或β-巯基乙醇中的一种；
所述还原剂优选为β-巯基乙醇；
所述β-巯基乙醇的浓度为0.1％～2.5％；
优选为β-巯基乙醇的浓度为0.25％～1％，更优选为β-巯基乙醇的浓度为0.5％。
4.根据权利要求3所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂还包括缓冲液、表面活性剂及蛋白，
所述缓冲液为0.2～0.8mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、0.02～0.1M Tris缓冲液或0.02～0.1M Hepes缓冲液中的一种，pH为7.2～7.6；
所述表面活性剂包括0.01～0.1％浓度的十二烷基硫酸钠及0.5～2％浓度的吐温-20、0.5～2％浓度的吐温-60或0.5～2％浓度的吐温-80中的一种；
所述蛋白为0.05～0.2％浓度的酪蛋白或0.5～2％浓度的牛血清白蛋白中的一种。
5.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品及质控品，
所述校准品包括丙型肝炎病毒抗体阴性的人血清和丙型肝炎病毒抗体阳性的人血清；
所述质控品包括丙型肝炎病毒抗体阴性的人血清和丙型肝炎病毒抗体阳性的人血清。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括所述R2试剂中生物素化丙型肝炎病毒抗原的制备方法，包括如下步骤：
将所述丙型肝炎病毒抗原用脱盐柱进行脱盐，得纯化液；
按照DMF：生物素＝1：3～5的比例配制1～30mM生物素溶液；
将纯化液加入到生物素溶液中，常温反应20～40分钟；
反应后脱盐，回收离心液即可得到生物素化的丙型肝炎病毒抗原。
7.根据权利要求6所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述R2试剂的制备方法包括，将生物素化丙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒重组抗原、还原剂、缓冲液、表面活性剂及蛋白混合制成。
8.根据权利要求6所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述R3试剂中碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体的制备方法包括：
(1)ALP-mal的制备：
1)添加DMF到EMCS中，配制成60～100mM EMCS溶液；
2)将EMCS溶液添加到ALP调制用缓冲液中；
3)搅拌ALP溶液的同时添加上述混合液，温度35～38℃，加热50～70分钟；
4)进行离心脱盐，回收离心脱盐后溶液；
(2)ALP-mal标记还原：
1)缓冲液置换，用离心脱盐柱进行丙型肝炎病毒单克隆抗体缓冲液的置换，回收缓冲液置换后的溶液；
2)凝胶过滤用缓冲液溶解MEA，配制0.2～0.5M的MEA溶液；
3)丙型肝炎病毒单克隆抗体溶液的巯基化，按照MEA溶液的量：丙型肝炎病毒单克隆抗体溶液＝1：8～10的比例进行混合，温度35～38℃，加热80～100分钟；
4)脱盐，反应结束后进行离心脱盐，回收脱盐后溶液；
5)ALP-mal的导入，将ALP-mal加入到上述溶液中，密封，2-8℃静置反应约16-24小时；
6)终止，添加0.1M的MEA溶液到步骤5)中的溶液中，充分搅拌，温度35～38℃，反应5～15分钟；
7)保存，终止后的溶液2-8℃环境下保存。
9.根据权利要求6所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述R1试剂的制备方法包括：取链霉亲和素磁微粒溶液，用0.05mol/L TRIS缓冲溶液稀释得到的浓度为0.05～1mg/ml链霉亲和素磁微粒的R1试剂。
10.一种用于检测丙型肝炎病毒抗体的化学发光免疫方法，其特征在于，采用权利要求1-9中任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：
步骤A：将待测样本与R2试剂混合，36～38℃温育，生物素化丙型肝炎病毒抗原与丙型肝炎病毒重组抗原分别与待测物中丙型肝炎病毒抗体结合，形成“抗原-抗体-抗原”夹心复合物；
步骤B：加入R1试剂链霉亲和素标记的磁性微粒，36～38℃温育，上述夹心复合物通过生物素与链霉亲和素的亲和作用桥连，使该复合物连接在固相载体上，洗涤；
步骤C：加入R3试剂碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，36～38℃温育，洗涤；
步骤D：加入化学发光底物，使其在酶的催化下，产生发光信号，由光量子阅读系统接收，光电倍增管对反应所产生的光子数进行测量，软件根据光信号与Cutoff值自动计算待测样本中的丙型肝炎病毒抗体含量；
所述步骤B与步骤C同时进行，加入R1试剂链霉亲和素标记的磁性微粒与R3试剂碱性磷酸酶标记的丙型肝炎病毒单克隆抗体，36～38℃温育，一步洗涤；或所述步骤B与步骤C依次进行，两步洗涤；
所述化学发光底物为(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷，AMPPD。
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