JPS6332356A - 蛍光信号の解析と画像表示のための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は蛍光信号の解析、中でもそのような信号の減衰
挙動の解析のため及び映像的な描写のために用いること
ができ、これは例えば生物細胞の中の種々の物質への染
料の結合の研究において利用される。

〔従来の技術〕

対象物全体が励起用輻射線によって継続的に照射される
ような微小対象物の蛍光解析用の種々の装置が公知であ
る。この場合にその対象物から発出する蛍光光線によっ
て対象物の構造の像か作り出され、このものは通常の如
くに接眼レンズを用いて観測するか、またはフォトメー
ターを用いて調べることも可能である。これらの従来技
術はその蛍光強度が観測の間に減衰するので前後して測
定された各測定値を直接に比較することができないとい
う欠点を有している。その蛍光発生過程の短時間的な解
析の可能性は全く存在しない（１４゜Ｂｅｙｅｒ；”Ｈ
ａｎｄｂｕｃｈ　ｄｅｒ　Ｍｉｋｒｏｓｋｏｐｉｅ”　
−１９７７年、ベルリン）。短時間解析はその観測しよ
うとする対象物が波長分散性媒体によって背景の蛍光輻
射線と充分に分離することができないような蛍光輻射線
を放射するときに必要であり、これは例えばドイツ特許
第２８１８８４１　Ｃ２号に記述されているとおりであ
る。

更にまた、きわめて短い光パルスをマイクロ対物レンズ
によって試料の上に焦点合わせして照射し、そしてその
露光された対象物の部分から出てくる蛍光パルスを迅速
光電受光装置を用いてその時間的経過を記録し、そして
次にグラフ的に描写し、及び／又は数学的に解析するよ
うな極めて小さな対象物部分を短時間に蛍光解析するた
めの別な種々の装置が知られている　［Ｆ、　Ｄｏｃｃ
ｈｉｏ等、Ｊｏｕｒｎ、　）４ｉｃｒｏｓｃ、、１３４
　（１９８４）　１５１１゜　これらの装置はいわゆる
フェージングがなく、そして時間的に分解されたフルオ
ロメトリーの可能性を提供する。これらの装置を用いれ
ば繰返して使用することにより時間的に異なった蛍光応
答を有する種々の物質の空間的分布についての眺望を得
ることが原理的には可能であるけれども、しかしながら
これは多大の時間を費やしてしか行なえない。

このような難点を除くために、ドイツ特許　第３０３７
９８３　Ｃ２号において、走査顕微鏡の像面内の走査方
向に設けた受光用ダイオードのアレイを用いることが提
案されている。これもまた低い時間的分解能しか保証せ
ず、そして比較的ゆっくりと減衰する蛍光の場合にしか
使用することができないために、生物細胞の殆どの重要
な固有蛍光或はその他の通常的な蛍光色において用いる
ことができない。

米国特許第４２８４８９７　　号公報に記述されている
技術手段はフェージングを著しく少なくしているけれど
も、これは蛍光発生過程の時間的解析のための手段を全
く含んでいない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は、上述のような従来技術の諸欠点を時間
の節約のもとにできるだけ除くような、定量的フルオロ
メトリー用の装置を提供することである。

即ち本発明の課題は、微細対象物における蛍光減衰挙動
のナノ秒領域における空間的分布の映像を作り出し、そ
してそれら映像を迅速に作り出すことを許容するととも
に特性的な各パルスに基づいて特定の対象物像を浮き上
がらせ、または位置に依存する各パルスの継続的な変化
が明確に解釈できるように表示されるような、上記の減
衰挙動の空間的分布についての描写方式を作り出すこと
を課題とするものである。

（問題点を解決するための手段〕 上述の課題は、有利にはレーザーから発せられるパルス
の励起する輻射線を対物レンズによって試料の上に焦点
合わせさせ、そしてこの試料が例えばラスターなどに基
つく適当な手段によってスライドさせることかてきるよ
うにすることによって、蛍光信号の解析と映像描写のた
めの装置により解決される。試料の照射された部分から
出てくる蛍光光は迅速に反応する光電的手段を通して記
録され、その際この手段は電子的ゲート回路、同時計数
手段又はストリークカメラを含んでいることかてさ、こ
れらによってその全体的な蛍光パルスまたはこのものの
一定的な時間的に限定された部分を更に処理してそれら
の部分をその開始点と終点との各時点の選択により確定
させることができる。

更にまた、この蛍光パルスまたは上述の一つ以上の部分
のエネルギーあるいはそれらから導き出された各指標値
を試料の照射された部分に従圧する数値または適当な物
理量として記憶素子中に記憶させ、そしてその観測され
るへき対象物域の、例えばラスターに従う一部の点につ
いての測定の上述の過程を繰返すことかでき、それによ
って結局その試料の領域の特定の蛍光の時間的差異を映
像として描写することが可能となる。

上述の蛍光パルスの時間的に限定された部分は、蛍光の
特定的な減衰挙動を有する各対象物の点が映像的な描写
のために浮き出されるように選ばれ、及び／又は数学的
及び／又は論理的演算子と結合され、その際上記した結
合の特別な態様の一つは、蛍光パルスのエネルギー値ま
たはその幾つかの部分のエネルギー値が色モニターの基
本色の制御のために利用できるということより或ること
ができる。

全過程を何度も繰返すこと及び記憶素子の中でそれらの
値の平均値を継続的に作り出すことによって信号／ノイ
ズ比に好ましい影習がもだらされる。

〔実施例〕

以下本発明を添付の図面の参照のもとに更に詳細に説明
する。

第１図において、レーザー１が短い光パルスの列を送り
出し、これらのパルスの波長は試料１７の対象点におけ
る蛍光発生用励起に適したものである。これらのパルス
は適合化光学手段２を通過し、そして光線分割器６、フ
ィルター４、適合化光学手段５、光線分割器７及び顕微
鏡対物レンズ８を通して試料１７へ到達し、この試料は
顕微鏡対物レンズの焦点面内に存在している。試料１７
の照射された対象位置から対応する蛍光パルスが送り出
され、これらのパルスは顕微鏡対物レンズ８の後で光線
分割器７、光学手段結合系１６及びフィルター１５を通
過し、そして迅速に反応する光線検出器ｌＯの上に入射
する。この光線検出器１０　　から発信された電気的パ
ルスはパルスアナライザー１１に送り込まれる。このパ
ルスアナライザーＩＩは更に迅速フォトダイオード３　
から別な電気的パルスを受取り、このフォトダイオード
は光線分割器６から各励起用パルスの一部を受は取る。

パルスアナライザー１１のところのそれぞわの操作部材
、操作ボード　１２を備えたコンピューター　１９及び
計数並びに制御用ユニット　１８によってパルスアナラ
イザー１１は、全体的蛍光パルスのエネルギーまたはこ
のパルスの時間的な一つ以上の区間内のエネルギーを更
に処理することを許容するような異なった操作形式に合
致させることができる。それぞれのパルス部分の始点と
終点とは、フォトダイオード３からの電気的パルスの到
着から所望の時点までの調節可能な時間間隔によって選
ぶことかできる。

パルスアナライザー１１はまた、ある選択可能な、前後
して続く常に等しい数の励起用パルスに相当するそれら
更に処理されるべきエネルギ一部分を、その処理に先立
ってそれらの平均値か作り出されるように調節すること
も可能である。

試料の或るビクセルに屈するそれら蛍光エネルキーの平
均値化された、または平均値化されていない部分は記憶
装置１３の一つ以−Ｆの、そのビクセルに従属されてい
る要素の中に数値として記憶される。その選んだ作業形
態に従って、或る一つのピクセルによって常に等しい数
の一連の蛍光パルスまたは一個のパルスが評価されたと
きに、コンピューター１９によって制御された試料スラ
イド装置９によって試料１７は常に１ステツプだけスラ
イドされる。

この試料１７のステップの方向と大きさとはコンピュー
ター１９によって任意に制御することができ、そして有
利にはラスターの方式で行われる。即ち試料１７の所望
の全対象域が評価され、そして対応する蛍光エネルギー
の値が記憶装置１３　　に記憶される。

この過程と並列に、またはこれに引き続いて、記憶装置
１３の内容がデイスプレー１４の上に映像として描き出
される。この場合にこれはパルスアナライザーＩＩ　、
コンピューター１９　、記憶装置１３及びデイスプレー
１４の次のような作動態様、即ちその観察した試料の像
か選択的にその蛍光パルスの全エネルギーに従って、ま
たは時間的なエネルギ一部分に従って、あるいはその数
学的な結合に従って表わされることができるような作動
態様を許容する。中でもそれらエネルギ一部分またはそ
れらの数学的結合はティスプレー１４において映像の疑
似着色のために用いることができる。第２図には、フォ
トダイオード３の電気的パルスによって代表される励起
用パルス２０　、及びこの励起用パルス２０よりも時間
間隔２またけ遅延して開始されかつ励起用パルス２０よ
りも時間間隔２３だけ遅延して終了するような蛍光パル
ス２１　　並びにパルス部分２４の経過の可能な例が示
されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に従う装置の一具体例の構造を図式的に
示し、第２図はその励起用パルスと蛍光パルスとの時間
的経過を示す。 １・　・　・レーザー ２．５・・・適合化用光学手段 ３・・・フォトダイオード ４．１５・・　・フィルター ６．７・・・光線分割器 ８・・・顕微鏡対物レンズ ９・・・試料スライド装置 ＩＯ・・・光線検出器 ＩＩ・・・パルスアナライザー １２・・・操作ボード　　１３・・・記憶装置１４・・
・デイスプレー　１６・・・光学手段結合系１７・・・
試料　　　　　１８・・・制御ユニット１９・・・コン
ピュータ　２ｏ・・・励起用パルス２１・・・蛍光パル
ス　　２４・・・パルスの部分Ｆｉｇ、２

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）例えばパルス化されたレーザー光を用いて試料を
   蛍光発生のために励起させ、そして生じた蛍光パルスを
   光電的手段によって解析し、記録させ、そして試料は上
   記の励起用光線に対して相対的にスライドさせることが
   できるような、画像の形成のため及び蛍光信号の定量的
   解析のための装置において、 適当な公知の手段によって、或る全体的な蛍光パルスか
   、またはこのものの時間的に限定された選択可能な幾つ
   かの部分かが存在していること、上記時間的に限定され
   た部分はそれぞれの部分の始点又は終点の時点を選ぶこ
   とによって確定されており、それら蛍光パルスの総エネ
   ルギーまたは時間的に限定されたそのものの一つ以上の
   部分のエネルギー、或は適当な操作によってそれぞれの
   エネルギーの大きさから導き出した各指標値の記録が画
   像記録装置の幾つかの要素の中で行われていること、そ
   れら画像記録装置の各要素はその露光された試料のそれ
   ぞれの部分に対として従属されていること、試料のスラ
   イドによってその試料の全ての所望の位置を選ぶことが
   でき且つその測定を繰り返すことができること、および
   その画像記録装置の内容を次いで画像として表示するこ
   とができることを特徴とする、上記装置。
2. （２）試料のすべての所望の位置についての等しい、選
   択可能な数の励起用パルスが同じ態様で評価され、そし
   て、試料の各位置に対応する蛍光エネルギーまたはそれ
   らのエネルギーの部分の合計値または平均値が次の処理
   のために準備されている、特許請求の範囲第１項に従う
   装置。
3. （３）各蛍光エネルギーを画像として描写するために着
   色表示手段が設けられており、そしてそれら記録されて
   いる値が画像の疑似着色に用いられる、特許請求の範囲
   第１または第２項に従う装置。
4. （４）信号／ノイズ比及び色飽和を改善するために、各
   測定サイクルの画像寄与量を蓄積し、そしてこれが継続
   的に表示装置に描き出されている、特許請求の範囲第１
   ないし第３項の何れかに従う装置。
5. （５）追加的に各励起用パルスが次の処理のために準備
   されている、特許請求の範囲第１ないし第３項の何れか
   に従う装置。
6. （６）試料を通過した、及び／又はこの試料から散乱し
   た光がこれを更に処理するために準備されている、特許
   請求の範囲第１ないし第５項の何れかに従う装置。
7. （７）画像記憶装置に換えて残像時間の長い表示装置を
   用いる、特許請求の範囲第１項に従う装置。