JP2004506191A - 照明された試料の波長依存特性把握のための方法および装置 - Google Patents

Abstract

【解決手段】照射試料が持つ波長依存性の特徴的な特性量、主として蛍光および／またはルミネセンスおよび／またはりん光および／または酵素で活性化した光線放射および／または酵素で活性化した蛍光についての、特に放射および／または吸収に関する特性量の把握用画像形成光学システムを作動させるための方法および装置、
特に、試料の画像点情報を検出側での位置分解に基づきスペクトル成分へ波長別に分割する場合に、異なったスペクトル成分に対して少なくとも１回の総和計算を行なう、レーザ走査型顕微鏡作動のための方法および装置。
【選択図】図５

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光顕微鏡法、特にレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法および走査型近視野顕微鏡法における、主として生物学上の試料、プレパラートおよび付属する構成成分を検査するための方法および装置に関するものである。
それと共に、作用物質を検査するための蛍光検出に基づく方法（ハイ・スループット・スクリーニング）も含まれる。
【０００２】
少数の広域スペクトル色素帯の検出から完全なスペクトルの同時記録へと移行することにより、空間的部分構造または動力学的過程に関連して殆どが分析面または機能面からなされる試料特性の確認、分離、分類において新たな可能性が開けてくる。それにより、オーバーラップ部分を持つ蛍光スペクトルの場合では多重蛍光団を含む試料の同時検査が、厚い試料の空間構造においても可能となる。本装置によってデータ記録率が低下するということはない。
【０００３】
【従来の技術】
生物プレパラートを検査するための光学顕微鏡の古典的利用分野の１つに蛍光顕微鏡法（文献：Ｐａｗｌｅｙ「生物共焦点顕微鏡法ハンドブック」、プレーナム・プレス１９５５年）がある。この場合では特定の色素が細胞部分への特殊標識付けのために使用される。
【０００４】
色素分子は、入射した一定エネルギーを持つ光子１個の吸収により光子基底状態から励起状態へ励起される。この励起は一般に１光子吸収と称される（図１ａ）。色素分子は、このように励起された状態からさまざまな方法で基底状態に戻ることができる。蛍光顕微鏡法では蛍光光子の放射下での移行が最も重要である。放射される光子の波長はストークス変位のため励起放射に比較して原則的に赤側にずれる。すなわち長波長側である。ストークス変位が蛍光光線の励起光線からの分離を可能にする。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
蛍光は、ブロックフィルタと組合せた適当なダイクロイック・ビームスプリッタによって励起放射から分離して別途観察する。そうすることによって、さまざまな色素で着色された個々の細胞部分の描写が可能である。しかし原則的には、プレパラートのいくつかの部分を、独特な堆積の仕方をするさまざまな色素で同時に着色することもできる（多重蛍光）。個々の色素から送出される蛍光信号を区別するために、ここでも特殊なダイクロイック・ビームスプリッタを使用する。
【０００６】
高いエネルギーを持つ１光子による色素分子の励起（１光子吸収）のほかに、より小さいエネルギーを持つ複数の光子による励起も可能である（図１ｂ）。この場合、個々の光子のエネルギー総和は高エネルギー光子の何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と称される（文献：Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」；アカデミック・プレス１９９６年）。
しかし、色素放射はこの種の励起によっては影響されない。すなわち、多光子吸収の場合、放射スペクトルは負のストークス・シフトを起すため、励起放射に比較するとその波長は短い。励起光線を放射光線から分離するのは１光子吸収の場合と同じ方法で行う。
【０００７】
以下に現状技術を共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）の例で説明する（図２）。
ＬＳＭは大きく分けて次の４モジュールから成っている：光源、走査モジュール、検出ユニット、顕微鏡。これらのモジュールは以下により詳しく説明する。それに加え、ＤＥ１９７０２７５３Ａ１も参考になる。
【０００８】
プレパラート中にあるさまざまな色素の個別励起には、さまざまな波長のレーザをＬＳＭ内で使用する。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性に従って行う。励起光線は光源モジュール内で生成される。この場合さまざまなレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、ＴｉＳａレーザ）が使用の対象になる。そのほか、光源モジュールでは波長の選択および必要な励起波長の強度調整を、たとえば音響光学結晶の使用により行う。それに続き、レーザビームはファイバまたは適当なミラー装置を通じて走査モジュール内に導かれる。
【０００９】
光源で生成されたレーザビームは対物レンズを通り、回折の抑制下でスキャナ、走査レンズ系、円筒レンズを経由してプレパラート内へ集束される。試料に焦点を当ててｘ−ｙ方向にドット走査する。試料走査における画素上滞留時間は多くの場合マイクロ秒未満ないし数秒の範囲とする。
【００１０】
蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の場合、焦平面（試料）からおよびその上・下にある平面から放射された光は、スキャナを通じてダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、正確に焦平面と共役な平面内にある絞り（共焦点絞り／ピンホール）で焦点を結ぶ。これによって焦点外の蛍光成分が遮断される。
【００１１】
絞りの寸法をさまざまに変化させることによって、顕微鏡の光学解像度を調節することが可能である。絞りの後ろに別のダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ）があり、これが再度励起ビームを差し止める。蛍光は、ブロックフィルタを通過した後、点像検出器（ＰＭＴ）によって測定される。
【００１２】
多光子吸収を利用した場合、色素蛍光の励起は励起強度が特に強い小ボリューム部分に起こる。この領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より極僅かに大きいだけである。したがって共焦点絞りの使用は省くことができ、検出は対物レンズの直後で行うことができる（ノンデスキャン検出）。
多光子吸収によって励起される色素蛍光を検出するための別の装置では、さらに１つのデスキャン検出が行われるが、しかしこの場合では対物レンズのひとみは検出ユニット内へ結像する（非共焦点デスキャン検出）。
【００１３】
３次元照明による像のうち、対応の１光子吸収もしくは多光子吸収と接続している２検出器の装置によって、対物レンズの焦平面内に存在する平面（光学的断面）のみが再現される。それに続いて、試料のさまざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面内のいくつかの光学的断面の描画により、コンピュータでサポートされた試料３次元像が生み出される。
【００１４】
したがって、ＬＳＭは厚いプレパラートを検査するのに適している。励起波長は使用色素の固有吸収特性で決定される。色素の放射特性に合わせたダイクロイックフィルタにより、それぞれの色素から送出される蛍光のみが確実に点像検出器で測定されることになる。
【００１５】
生医学応用においては、目下のところいくつかのさまざまな細胞領域がさまざまな色素で同時に標識付けされている（多重蛍光）。現状技術では、個々の色素はさまざまな吸収特性に基づき、または放射特性（スペクトル）に基づき別々に検出されている（図３ａ）。図３ａは各種典型的な色素の放射スペクトルを示している。放射信号は波長別に表わされている。ナンバー１〜４の色素にはそれぞれ放射スペクトルの位置および形態に差のあるのが認められる。
【００１６】
それぞれ別個の検出には、複数色素の蛍光に対する追加分割を副ビームスプリッタ（ＤＢＳ）で行ない、個々の色素放射検出を別々の点像検出器（ＰＭＴｘ）内で行なう。当装置では、検出および励起の際、新たな色素特性に対してフレキシブルに適応することは利用者にとって可能ではない。従って、それぞれの（新しい）色素について、新しいダイクロイック・ビームスプリッタおよびブロックフィルタが用意されなければならない。
【００１７】
ＷＯ９５／０７４４７に基づく装置では、蛍光は１基のプリズムによってスペクトル分割される。本方法はダイクロイック・フィルタを有する前記装置とは、使用フィルタの特性曲線を調節できる点が異なるだけであるが、しかしそのほか、点像検出器当たり１色素の放射帯域が記録されるというのも好ましいことである。
両装置とも検出領域の迅速な切替は限定的にしか可能でない。それは、放射領域の設定がダイクロイックフィルタおよび絞りの機械的作動に依拠しているからである。
【００１８】
迅速な切替は、例えば、放射スペクトルが図３ｂに描かれているようにオーバーラップしてはいるが吸収特性が異なる場合に必要になる。図３ｂは、色素ＣＦＰ、黄玉、ＣＦＴおよびシアンＦＰの放射信号を波長の関数で表わしたものである。この方法（マルチトラッキング）はＤＥ１９８２９９８１Ａ１に記載されている。
【００１９】
これらの色素は、検査試料への毒性作用がなく、生体プレパラートの検査には特に適している。両色素ＣＦＰ、ＣＦＴをできる限り効果的に検出するため、１走査方向においてＣＦＰを波長４５８ｎｍで励起して４６０〜５５０ｎｍの蛍光を検出し、スキャナの復路ではＧＦＰに対して波長４８８ｎｍで選択的励起を行なって、波長領域４９０〜６５０ｎｍで検出する。
【００２０】
使用色素の放射スペクトル位置が未知である場合、あるいは周辺条件に依存して放射スペクトルに位置移動が起きる場合では（図３ｃ）、色素蛍光を効果的に検出するにも限界がある。図３ｃも同様に放射信号を波長の関数で描いたものである。波長シフトは数１０ｎｍに到ることもある。
【００２１】
試料内の放射スペクトルの測定には、今日ではＬＳＭとの組み合わせの場合も含めて分光計が使用される。この目的には点像検出器の代わりに、ほとんどの場合高分解能を持つ従来型分光計が使用される（Ｄｉｘｏｎ他の特許ＵＳ５，１９２，９８０）。しかしこれらは放射スペクトルを点単位でのみ、あるいはある領域について平均的に記録するだけである。つまり、一種のスペクトル分析である。
【００２２】
蛍光顕微鏡法のまた別な適用例では、特に生物プレパラート中のイオン濃度（たとえばＣａ^＋，Ｋ^＋，Ｍｇ^２＋，Ｚｎ^＋…）の測定に用いられている。それには、特別な色素や、またはイオン濃度に依存してスペクトルのずれる色素配合（たとえばフラ、インド、フルオ；モレキュラー・プローブズ社）が使用される。
【００２３】
図４ａ）はカルシウムイオンの濃度に依存するインド−１の放射スペクトルを示している。図４ｂ）はフルオ−３とフラ赤色素との組み合わせの場合で、カルシウムイオン濃度に依存する放射スペクトルの例を示している。これらの特殊色素は放射率識別色素と称される。図４ａ）に示した２つの蛍光領域を検出して、両強度の比率を出すと、対応のイオン濃度を導き出すことができる。多くの場合この測定によっ生命プレパラート中のイオン濃度の動的変化が分析されるが、それには１ミリ秒以内の時間分割が要求される。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
以上より、本発明の課題は、フレキシブルでプログラミング自由な新しい検出方法ということになる。これらの方法は、解析的顕微鏡法システムと同様に像作成システムでも使用できなければならない。それゆえ、これらの方法を使用する際にはデータ採用率が悪化してはならない。
【００２５】
顕微鏡システムとしては、生物プレパラートを２００ｎｍまでの光学解像度で３次元検査するためのレーザ走査型顕微鏡や、表面を解像度１０ｎｍまでの高解像度で検査するための走査型近視野顕微鏡のような像作成システムがある。分子濃度の定量測定用、および分子拡散測定用の蛍光相関顕微鏡もある。さらに、蛍光検出に基づく色素検査の方法も含まれる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
上記システムではいずれも、プレパラートに特殊な標識付けをするために蛍光色素が使用される。上記課題は独立特許請求項に基づく方法および装置により解決される。
その他の主要態様は従属請求項の対象とする。
【００２７】
本発明に基づく方法の背景には、スペクトル分割された蛍光検出がある。その場合では放射光が、走査モジュール内または顕微鏡内（多光子吸収の場合）でメインカラー・スプリッタ（ＭＤＢ）、あるいは７３４６ＤＥまたは７３２３ＤＥに基づくＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）など励起光線を被検出光線から分離するための素子によって、励起光から分割される。透過光装置の場合ではこの種の素子は完全に省くこともできる。
【００２８】
それに続いて配置されている検出器ユニットの構成図を図５に示してある。試料から出た光Ｌは、共焦点検出の場合では結像レンズ系ＰＯ、さらには絞り（ピンホール）ＰＨを通って焦点を結び、それによって焦点外に生じる蛍光が遮断される。ノンデスキャン検出の場合には絞りは不要である。この場合では光は角分散素子ＤＩによってそのスペクトル成分へ分解される。
【００２９】
角分散素子としてはプリズム、格子および音響光学素子が使用される。分散素子によってそのスペクトル成分へ分割された光は、続いてライン検出器ＤＥ上へ結像される。つまり、このライン検出器ＤＥは波長に依存する放射信号Ｓを測定し、これを電気信号へ変換する。加えて、検出ユニットには励起波長を抑制するための線型フィルタを直列接続することもできる。
【００３０】
図５にブロック接続図で示した検出器ユニットを光学的ビーム光路として用いた場合の考え得る実施態様を図６に示している。本構造は本質的にはサーニー・ターナー構造に基づくものである。共焦点検出の場合、試料からの光Ｌはピンホールレンズ系ＰＯにより共焦点絞りＰＨを通され集束する。
ノンデスキャン検出で多光子吸収の場合には、この絞りは不要である。第１の結像鏡Ｓ１は蛍光を視準する。続いて光は線形格子Ｇ、たとえばミリ当たり線数６５１本を有する格子上に当たる。格子は光をその波長に応じてさまざまな方向に偏向させる。
【００３１】
第２の結像鏡Ｓ２はスペクトル分割された個々の波長成分を、対応ライン検出器のチャネルＤＥ上へ集束させる。浜松製作所のＨ７２６０ライン２次電子増倍管を使用するのが特に好ましい。当検出器は３２チャネル型で高感度を有する。上記実施態様の自由なスペクトル領域は約３５０ｎｍである。自由なスペクトル領域はこの装置ではライン検出器の３２チャネルに均等に配分されるので、光学的解像度は約１０ｎｍとなる。
したがって、この装置は分光測定には限定的にしか適さない。しかし、これを結像システムに使用するのは有利である。これは、検出スペクトル帯域が相対的に広く、検出チャネルごとの信号がなお比較的大きいからである。自由なスペクトル領域の移動は、加えて、たとえば格子をねじることによっても行なえる。
【００３２】
また別な実施態様として、マトリクス検出器（たとえばソニー、コダックなどのＣＣＤ＝電荷結合素子）の使用を伴う例もある。この場合、ある座標において分散素子によりさまざまな波長成分へ分割が行われる。マトリクス検出器上に留まっている方向に、走査像の完全なライン（または隙間）が結像さる。
この実施態様は、ライン・スキャナ（文献：Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ「共焦点光学顕微鏡法と関連画像システム」；アカデミック・プレス１９９６年）の構成時には特に有利である。
【００３３】
構造原理は本質的には図２記載のＬＳＭに準じている。但し、点焦点でなくて１本の線を焦点に結像させ、検査試料を１方向にのみ走査する。ラインはスキャナの前に円筒レンズＺＬ（図２の波線表示）を設置することにより生成する。
このような構造の場合、共焦点絞りとしては、孔絞りの代わりにスリット絞りを用いる。特に、多光子吸収を利用するノンデスキャン検出は図２に描かれているようにこの装置によって行うこともできる。多光子吸収の場合では、さらに、スリット絞りを省くことができる。
【００３４】
上記の実施態様では、各個別チャネルが検出する放射スペクトル幅は約１０ｎｍの帯域である。しかし、蛍光顕微鏡検査法にとって重要な色素の放射帯域は、数１００ｎｍの波長領域に亘っている。それ故、本発明に基づく装置では使用色素の蛍光帯域に相応して個別チャネルの合算が行なわれる。それには第１ステップとして、例えば画像情報としての個別チャネル情報の読出しを行なう、いわゆるスペクトルスキャンが行なわれる。その場合、好ましくは使用色素に相応した複数励起波長で試料を照射する。それにより、測定対象の各画像点毎に、当該画像点に存在する個別色素のスペクトル成分総和が記録される。
【００３５】
続いて、個別チャネルを任意にまとめて、つまり合算して検出帯域（放射帯域）とすることができる。合算領域の選択は、例えば個別チャネルの画像点毎に信号をヒストグラムで表示して行なうことができる。ヒストグラムは試料内で使用した色素の全放射スペクトルの合計を表わしている。この合計は励起された色素の放射スペクトルに対して行なうのが好ましく、その場合それぞれの励起波長はフェードアウトさせて、それぞれの検出帯域内にあるそれぞれの色素の信号を合計する。
【００３６】
本発明に基づく装置によって、マルチトラッキング操作のために、即ち走査過程において照射波長および／または照射強度を切り替えるために、ＤＥ１９８２９９８１Ａ１に記述されているように、検出帯域を迅速に切り替えることが可能である。この切替は画素単位で、即ち数μ秒間隔で行なうことができる。それにより例えば、検査試料の特定領域を異なった検出帯域で観察（ＲＯＩトラッキング）することも可能である。
【００３７】
図７ａは例えば、様々に着色された細胞領域を表わす、ＬＳＭ画像内におけるそれぞれの観察対象特定領域（ＲＯＩ１〜４）の分布状態を図示したものである。図７ｂには放射スペクトル１〜４の典型例がそれぞれ対応の励起波長（Ｌ１〜Ｌ４）と共に描かれている。個別色素の放射スペクトルは強力に重なり合っている上に、それぞれの吸収特性間には大きな差があるので、個別色素の検出にはマルチトラッキング法ＣＺ７３０２が提供されている。現状技術レベルで当方法を従来通り適用した場合個別色素が選択的に励起されて、本例では４つの完全画像が順次走査されることになる。
【００３８】
検出器構成要素の作動面から、現状技術の検出ユニットには個別ＲＯＩ間に関して再構築が必要であり、従って例えば急速に退色したり、動いたりする試料または迅速経過過程の様々な領域における幾つかの動力学的プロセスの迅速比較の際に望まれるような数μ秒単位の速度は達成不可能である。
しかし、本発明に基づく装置によれば、オペレータまたはコンピュータにより個別ＲＯＩ間における合算帯域の迅速な組替が可能である。強力に重なり合っているＲＯＩを記録するには試料を再走査するだけでよい。この点は、特に退色性の強いプレパラートには好都合である。
【００３９】
そのほか、個別領域（ＲＯＩ）間の迅速経過変化／コントラストを明らかにすることができる。この点は、例えば生物環境の中で分散特性を検査する場合には有利になる。その場合では試料の特定箇所で色素を脱色し、続いて新たな色素の流入を検査する。
また別な方法ではいわゆるケージド・コンパウンドが使用される。この色素を照準励起することによって、例えばニューロンのカルシウムイオンを遊離させることができる。続いて、このイオン濃度変化を試料の他の領域における変化と相関させることができる。
【００４０】
ＲＯＩに対する調整について、オペレータは、例えば次のように行なうことができる：個別ＲＯＩ内の色素励起に要するすべての、または殆どの励起光線を使用してスペクトル走査を実行および記録し、それに基づき個別励起レーザ光線の間にそれぞれの総合チャネル枠を設けることが可能である（図７ｂに表示されている通り、Ｌ１〜Ｌ２、Ｌ２〜Ｌ３、Ｌ３〜Ｌ４およびＬ４〜最大放射波長）。これらの総合チャネルは個別色素の蛍光帯域部分に相当する。また、同一総合チャネル内で様々な色素が強力に重り合っているので、それらの信号の同時合算も行なわれる。
【００４１】
これらの総合チャネルは、続いて、カラーコード化により様々な画像チャネルに分解され、相互に重畳表示される。画像チャネルにおける様々な局部的色素混合により、オペレータまたは自動パターン識別器はそれぞれのＲＯＩの位置設定が可能になり、例えば個別ＲＯＩにおいて最も強く現われる色素に基づいて、それぞれの加算調整に対する定義付けができる。
様々なＲＯＩに対する第２調整法では蛍光重心の測定が行われる。その場合、検出器内では励起レーザ光線で照射されるすべての個別チャネルのスイッチが遮断される。
【００４２】
各ＲＯＩは、使用されるそれぞれの色素の放射特性に変化が現われるため特徴的な蛍光重心を有している。従って、それぞれのＲＯＩは特徴的な色素重心の位置によって区別し、明確に分離することができる。
続いて、個別ＲＯＩ毎に、特に色素特性面での適合化による総合チャネルの調整が行われる。
その他の優位点として、オペレータが任意の個別チャネルをスイッチオフにすることもできる。このことは、特に複数励起レーザ光線の１つを遮断するという場合には有意である。
【００４３】
図４に基づくイオン濃度の測定では、総合信号を個別成分に分離し、それによってイオン濃度のレベル基準を求めることができる。
蛍光相関分光法において当方法を適用した場合、単一総合チャネルの自動相関関係および／または複数総合チャネル間の相互相関関係を求めることができる。
放射帯域の計算はデジタルまたはアナログのいずれによっても行なえる。
【００４４】
両方の装置を以下に詳細に記述する。総合信号および位置信号をデジタルで計算するための装置が図８に示されている。この場合、多チャネルＰＭＴの陽極に流れる電流は、それぞれ第１増幅器Ａ（電流／電圧変換器として接続されている）によって電圧に変換され、増幅される。電圧は積分器Ｉに導かれ、そこで当該時間（たとえば画素上滞留時間）だけ信号が積分される。
【００４５】
迅速に値を求めるため、積分器Ｉの後に、単純な比較器として次のようなスイッチング閾値を有す比較器Ｋを、即ち閾値を超えたときにデジタル出力信号を発するか、またはウィンドウ比較器として形成されていて、入力信号がスイッチング閾値の上限と下限との間にあるか、または入力信号がスイッチング閾値の外（下または上）にあれば、デジタル出力信号を発するという比較器Ｋを配置させることができる。比較器もしくはウィンドウ比較器の装置は、積分器の前にすることも後にすることもできる。積分器なしの接続装置（いわゆる増幅モード）も同様に考え得る。
【００４６】
増幅器モードでの装置の場合、比較器Ｋは然るべき基準に適合させて装置する。比較器Ｋの出力は直接アクティブなチャネルに接続する（オンライン）スイッチ・レジスタＲｅｇの制御信号として用いられるか、またはアクティブなチャネルを個別選択するために（オフライン）、その時の状態が付属連結器Ｖを通じてコンピュータに伝えられる。積分器Ｉの出力信号は後続のＡ／Ｄ変換のため、レベル適合用の別な増幅器Ａ１へ直接導かれる。
【００４７】
ＡＤ変換された値は適当なデータ伝送装置を通じて、図７および図９に従って、位置信号および総合信号の計算を実行するコンピュータ（ＰＣまたはデジタル信号プロセッサＤＳＰ）へ伝送される。
図９には、図８の装置と等価のアナログデータ処理に基づく装置が描かれている。この場合、個々のチャネルの信号は増幅器によって電圧信号に変換される。続いて、個々の電圧信号は積分器Ｉ内で画素上滞留時間だけ積分される。
積分器の後に、積分された信号と基準信号との比較を行なう比較器Ｋが設置されている。
【００４８】
積分された信号が比較器閾値より小さい場合、当該個別チャネル内では蛍光信号は測定されていないか、または測定された信号があまりにも小さくなりすぎる。このような場合は、個別チャネルの信号加工は続行すべきでない。なぜななら、当チャネルが総信号に関与してのは雑音成分だけとなるからである。比較器はこのような場合、Ｒｅｇを通じてスイッチＳを操作し、個別チャネルは実測されている画素に対して遮断される。すなわち比較器とスイッチとの組み合わせによって、実測像ポイントにとって重要なスペクトル領域が自動的に選択される。
【００４９】
続いて、スイッチ・レジスタＳＲと連結するデマルチプレクサＭＰＸを擁す個別チャネルの積分電圧信号をレジスタＲｅｇ１により様々な加算ポイントに接続させることができる。図９には８種の加算ポイントＳＰが描かれている。レジスタ１の制御はコンピュータの制御線Ｖ１によって行なわれる。各加算ポイントはそれぞれ、選択した個別チャネルの加算を行う加算増幅器ＳＶの１部を形成している。図８では全部で８つの加算増幅器ＳＶが描かれている。
【００５０】
引き続き、総合信号はそれぞれ、アナログ／デジタル変換器によってデジタル信号に変換され、コンピュータまたはＤＳＰ（デジタルシグナルプロセッサ）によりさらに加工される。加算増幅器ＳＶは変動する非直線性特性線に従って作動させることもできる。
別な装置（デジタル検出（図８に示す）およびアナログ検出（図９に示す））では、個別検出チャネルの入力信号は、以下によって操作し、もしくは歪ませる：
それは、（Ａ）における増幅の変更、（Ｉ）における積分時間の変更、積分器の前の付加オフセット入力および・または光子計数装置によって計数される光子によるデジタルな影響の付与である。３方法はすべて任意相互に組み合わせることもできる。
【００５１】
人為的原因を避けるため、蛍光測定の際には、試料から後方散乱する励起光を抑制するか、または少なくとも、放射の最大より小さいかまたは同じ系列量になるように弱める必要がある。それには、上記の付加線形フィルタまたは然るべく最適化したメインカラー・スプリッタ（ＭＤＢ）を、光学的減衰用として使用することができる。
【００５２】
励起レーザビームのスペクトル帯域は個別チャネルによって検出される帯域幅よりはるかに狭いから、後方散乱した、もしくは反射した励起ビームも、対応の個別チャネルを図９のＭＰＸによって所期設定どおり遮断することができる。励起波長が２つの検出チャネルに到達した場合、格子を回転させるかライン検出器を移動させるかによって、あるいは図６のＳ１またはＳ２を傾倒させることによって、励起光線が１検出チャネルにのみ達するように当光線をシフトさせることができる。
【００５３】
図９の装置は図８の装置に対していくつかの長所を持つ。最も目立つ長所は、単に総合チャネル（つまり、使用色素の検出帯域）をデジタルデータに変換してコンピュータに送り込むだけでよいことである。これにより、コンピュータによって処理すべきデータ率は最小化される。このことは、極めて迅速に経過する動力学的過程が記録できるように、たとえば５０画像以上を５１２×５１２画素および１２ビット画素階調で検出する実時間顕微鏡法に本方法を適用した場合に特に重要である。
【００５４】
また、この方法を利用すれば、使用されるライン検出器（マトリクス検出器）の個別チャネル数、従ってまた、検出可能なスペクトル領域の広さおよび／またはスペクトルセンサの分光分解能に関しては制限がない。
さらに、図８に示された装置では、変換可能な信号レベルは遥かに低い。それにより、信号対雑音比の想定値は小さくなる。
【００５５】
上記の両装置では、個別チャネル信号の検出には主として積分器スイッチングが使用された。また、光子計数も個別チャネル内で制限を受けることなく行うことができる。しかし、図８に示された装置は、画像追加加工のために、総合信号のほかに完全なスペクトル情報さえ提供できるという長所を持っている。本発明はそれゆえ両装置の組合せをも含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ａ）１光子吸収、ｂ）多光子吸収
【図２】共焦点レーザ走査型顕微鏡
【図３】各種色素の放射スペクトル
【図４】カルシウムイオンの濃度に依存する放射スペクトル、ａ）インド−１の場合、ｂ）フルオ−３とフラ赤色素との組合せの場合
【図５】検出器ユニットの構成図
【図６】検出器ユニットの実施例
【図７】ａ）ＬＳＭ画像内における観察対象特定領域の分布状態、ｂ）放射スペクトルの典型例の励起波長
【図８】総合信号および位置信号をデジタルで計算するための装置
【図９】総合信号および位置信号の計算を実行するコンピュータ
【符号の説明】
Ｌ　　　光
ＰＯ　　　結像レンズ系
ＰＨ　　　絞り（ピンホール）
ＤＩ　　　角分散素子
ＤＥ　　　ライン検出器
Ｓ　　　放射信号
Ｓ１，Ｓ２　　　結像鏡
Ｇ　　　線形格子
Ｉ　　　積分器
Ａ　　　増幅器
Ｋ　　　比較器
ＳＶ　　　加算増幅器
Ｖ　　　コンピュータの制御線
ＳＲ　　　スイッチ・レジスタ
ＭＰＸ　　　デマルチプレクサ

Claims (88)

1. 照射試料が持つ波長依存性の特徴的な特性量、主として蛍光および／またはルミネセンスおよび／またはりん光および／または酵素で活性化した光線放射および／または酵素で活性化した蛍光についての、特に放射および／または吸収に関する特性量の把握用画像形成光学システムを作動させるための方法であって、
   特に、試料の画像点情報を検出側での位置分解に基づき波長別にスペクトル成分へ分割する場合に、それぞれのスペクトル成分毎に少なくとも１回の合算を行なう、レーザ走査型顕微鏡作動のための方法。
2. 異なった試料領域間での走査過程内で少なくとも１つの照射波長および／または照射強度の切替が行なわれ、また、異なった各試料領域および／または異なった各照射波長、照射強度毎にスペクトル成分の少なくとも１部について合算が行なわれる、請求項１に記載の走査システム作動のための方法。
3. 合算された領域の画像表示を伴う、上記請求項の１項に記載の方法。
4. 複数の部分合計を出して加算する、上記請求項の１項に記載の方法。
5. 様々な蛍光成分についてのオーバーラップ信号を含むスペクトル成分においてオーバーラップの部分合計がなされる、上記請求項の１項に記載の方法。
6. 複数のスペクトル成分を検査対象として、スペクトルの重心構成法と組み合わされることを特徴とする、上記請求項の１項に記載の方法。
7. 部分合計または個別成分の商または差などの数学的関係およびその関係の画像表示を伴う、上記請求項の１項に記載の方法。
8. 照射試料が持つ波長依存性の特徴的な特性量、主として蛍光および／またはルミネセンスおよび／またはりん光および／または酵素で活性化した光線放射および／または酵素で活性化した蛍光についての、特に放射および／または吸収に関する特性量の光学的把握のための上記請求項の１項に記載の方法において、
   放射光線を分散素子でスペクトル分割し、放射光線および／または吸収光線の少なくとも１つの総合信号を位置分解によって検出し、電子的に測定する、放射および／または吸収に関する特性量の光学的把握のための方法。
9. 様々な色素の検査のために、および／または複数色素の同時使用における画像局部の色素組成の測定のために、および／または色素の結合している局部周辺の条件に依存する放射スペクトル局部シフトの測定のために、および／またはイオン濃度測定用放射色素の測定のために、
   スペクトル分割された放射光線の総合信号の測定を行なう、
   上記請求項の１項に記載の方法。
10. 様々な色素の検査のために、および／または複数色素の同時使用における画像局部の色素組成の測定のために、および／または色素の結合している局部周辺の条件に依存する吸収スペクトル局部シフトの測定のために、および／またはイオン濃度測定用放射色素の測定のために、
    スペクトル拡大反射、後方散乱したおよび／または透過したフルオロクローム励起光線の総合信号の測定を行なう、上記請求項の１項に記載の方法。
11. 励起パラメータに依存して、走査過程で総合信号の組成変更（マルチトラッキング）ができる、上記請求項の少なくとも１項に記載の方法。
12. それぞれの走査位置に依存して、走査過程で総合信号の組成変更（ＲＯＩトラッキング）ができる、上記請求項の少なくとも１項に記載の方法。
13. 試料の放射光線を分散素子で分割し、少なくとも１方向において位置分割により検出を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載の方法。
14. 蛍光光線の分割を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載の方法。
15. 吸収測定のため、試料で反射、後方散乱した光線および／または試料を透過した光線を分散素子で分割し、少なくとも１方向において位置分割により検出を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載の方法。
16. 検出チャネルの信号を変換してデジタルで読み出しさせ、総和計算をコンピュータによりデジタルで行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
17. アナログデータの加工による総和計算を、加算増幅器と組み合わせたデマルチプレクサにより行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
18. 検出チャネルの信号が入力信号の非直線性歪みによって影響される、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
19. 積分パラメータに影響を与える、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
20. 増幅器の特性線に影響を与える、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
21. 総合信号を画像形成のために使用する、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
22. カラーコード化された蛍光画像を形成する、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
23. 別な画像によりオーバーラップを行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
24. 総合信号をルックアップ・データと組み合わせる、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
25. ルックアップ・データによって様々な色素の表示および／または形成画像の展開表示を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
26. 検出チャネル内の比較器を通じて測定信号と基準信号との比較を行ない、基準信号以下および／または基準信号超過の場合には検出チャネルの作動内容を変更する、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
27. それぞれの検出チャネルの遮断および／または無応答化を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
28. それによってスペクトル領域の分析対象幅を狭隘化させる、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
29. 検出チャネルの信号をそれぞれ少なくとも１つの積分器の接続によって発生させる、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
30. 検出チャネルの信号を光子計数および続いてのデジタル／アナログ変換によって発生させる、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
31. 光子計数を時間の関数で行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
32. 単一および／または複数の光子蛍光を、および／または錯綜光子によって励起された蛍光を把握するための、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
33. 試料が、好ましくは微量滴定プレートであって、特に作用物質の検査において照射と検出が平行になされる、顕微鏡内における、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
34. 走査型近接場顕微鏡での検出のための、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
35. 蛍光と相関させた分光器における単一光子および／または多光子の色素蛍光検出のための、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
36. 共焦点型検出による、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
37. 走査装置による、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
38. 照射においてＸ／Ｙスキャナを用いる、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
39. Ｘ／Ｙ走査テーブルによる、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
40. 非共焦点型検出による、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
41. 走査装置による、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
42. デスキャン検出による、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
43. ブライトフィールド結像による、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
44. 点結像による、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
45. ノンデスキャン検出による、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
46. ブライトフィールド結像による、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
47. 非走査、共焦点または非共焦点での検出および点結像またはブライトフィールド結像による、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
48. Ｘ／Ｙ走査テーブルによる、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法。
49. 照射試料が持つ波長依存性の特徴的な特性量、主として蛍光および／またはルミネセンスおよび／またはりん光および／または酵素で活性化した光線放射および／または酵素で活性化した蛍光についての、特に放射および／または吸収に関する特性量の光学的把握のための装置において、放射光線が分散素子によりスペクトル分割、位置分解検出され、放射光線および／または吸収光線の少なくとも１つの総合信号が電子的に測定される、照射試料が持つ波長依存性の特徴的な特性量の光学的把握のための装置。
50. 様々な色素の検査のために、および／または複数色素の同時使用における画像局部の色素組成の測定のために、および／または色素の結合している局部周辺の条件に依存する放射スペクトル局部シフトの測定のために、および／またはイオン濃度測定用放射色素の測定のために、
    スペクトル分割された放射光線の総合信号の測定が行われる、請求項４９に記載の装置。
51. 様々な色素の検査のために、および／または複数色素の同時使用における画像局部の色素組成の測定のために、および／または色素の結合している局部周辺の条件に依存する吸収スペクトル局部シフトの測定のために、および／またはイオン濃度測定用放射色素の測定のために、
    スペクトル拡大反射したまたは透過したフルオロクローム励起光線の総合信号の測定を行なう、請求項４９または５０に記載の装置。
52. 走査過程で総合信号の組成変更（マルチトラッキング）ができる、上記請求項の少なくとも１項に記載の装置。
53. 走査過程で総合信号の組成変更（ＲＯＩトラッキング）ができる、上記請求項の少なくとも１項に記載の装置。
54. 試料の放射光線を分散素子で分割し、少なくとも１方向において位置分割により検出を行なう、蛍光光線の分割を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載の装置。
55. 吸収測定のため、試料で反射した光線または試料を透過した光線を分散素子で分割し、少なくとも１方向において位置分割により検出を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載の装置。
56. 検出チャネルの信号を変換してデジタルで読み出しさせ、総和計算をコンピュータによりデジタルで行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
57. アナログデータの加工による総和計算を、加算増幅器と組合せたデマルチプレクサにより行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
58. 検出チャネルの信号が入力信号の非直線性歪みによって影響される、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
59. 積分パラメータに影響を与える、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
60. 増幅器の特性線に影響を与える、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
61. 総合信号を画像形成のために使用する、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
62. カラーコード化された蛍光画像を形成する、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
63. 別な画像によりオーバーラップを行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
64. 総合信号をルックアップ・データと組み合わせる、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
65. ルックアップ・データによって様々な色素の表示および／または形成画像の展開表示を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
66. 検出チャネル内の比較器を通じて測定信号と基準信号との比較を行ない、基準信号以下および／または基準信号超過の場合には検出チャネルの作動内容を変更する、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
67. それぞれの検出チャネルの遮断および／または無応答化を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
68. それによってスペクトル領域の分析対象幅を狭隘化させる、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
69. 検出チャネルの信号をそれぞれ少なくとも１つの積分器の接続によって発生させる、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
70. 検出チャネルの信号を光子計数および続いてのデジタル／アナログ変換によって発生させる、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
71. 光子計数を時間の関数で行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
72. 単一および／または複数の光子蛍光を、および／または錯綜光子によって励起された蛍光を把握するための、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
73. 試料が、好ましくは微量滴定プレートであって、特に作用物質の検査において照射と検出が平行になされる、顕微鏡内における、上記請求項の少なくとも１項に記載された方法
74. 走査型近接場顕微鏡での検出のための、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
75. 蛍光と相関させた分光器における単一光子および／または多光子の色素蛍光検出のための、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
76. 共焦点型検出による、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
77. １基の走査装置を持つ、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
78. 照射においてＸ／Ｙスキャナを用いる、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
79. １基のＸ／Ｙ走査テーブルを持つ、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
80. 非共焦点型検出器を持つ、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
81. １基の走査装置を持つ、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
82. デスキャン検出を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
83. ブライトフィールド結像を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
84. 点結像を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
85. ノンデスキャン検出を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
86. ブライトフィールド結像を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
87. 非走査、共焦点または非共焦点での検出および点結像またはブライトフィールド結像を行なう、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。
88. １基のＸ／Ｙ走査テーブルを持つ、上記請求項の少なくとも１項に記載された装置。

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