JPS63101494A - 酵素含有洗浄剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

１権光裏 本発明は、優れた洗浄力を有する酵素を含有する洗浄剤
組成物に関する。 丈來技嵐 従来、衣類の汚れに対する洗浄力をより向上させた洗浄
剤組成物を得るために、アミラーゼ、プロテアーゼ、セ
ルラーゼなどの酵素を配合することがよく知られている
（特公昭４７−４５８０２号公報、同４８−　３０６４
６号、特開昭４７−３７３３号公報。 同５２−１２８９０４号公報、同５３−５６２０４号公
報、同５６−１２９２９８号公報）。その中でも特にバ
チルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から生産されるアルカリ
プロテアーゼが一般に使用されており、ノボ・インダス
トリー社の「アルカラーゼＪ　（Ａｌｃａｌａｓｅ）、
「エスペラーゼＪ　（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）、「サビナー
ゼＪ　（Ｓａｖｉｎａｓｅ）、ギスト・プロカーズ社の
「マキサターゼＪ　（Ｍａｘａｔａｓｅ）、ナガセ生化
学工業■の「ビオブラーゼ」等の商品名で市販されてい
る。 しかながら、これらの酵素を配合した洗浄剤組成物は、
酵素による洗浄力向上効果はある程度あるものの、いま
だ不十分であり、よりいっそうの洗浄力向上効果を発揮
する酵素含有洗浄剤組成物の開発がまたれていた。 ｌ匪ムｌ旌 本発明は、洗浄力向上効果に優れた酵素含有洗浄剤組成
物を提供するものである。 見匪立豊底 本発明の酵素含有洗浄剤組成物は、バチルス・エスピー
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）Ｙ株（微工研条寄第１０
２９号）から生産されるアルカリプロテアーゼと、該ア
ルカリプロテアーゼ以外の他種の酵素とを含有すること
を特徴とする。 以下、本発明についてさらに詳細に説明する。 本発明で用いられるアルカリプロテアーゼは新規な酵素
であり、広く自然界よりアルカリプロテアーゼ産生菌を
検索した結果具い出された、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）に属する１菌種、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｙ株から産生されたものである。 バチルス・エスピー７株は、微工研条寄第１０２９号（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０２９）として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。また、バチルス・エス
ピー７株については、特願昭６０−１２３０２１号とし
て既に出願された出願明細書に記載されている。 以下にその菌学的詳細を説明する。 なお、菌学的性質および分類方法は、 Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ　）３ａｃｔｅｒｉｏ−１ｏｇｙ第８版
（１９７４）、Ｒ，Ｅ、Ｇｏｒｄｅｎの検索表（１９７
２）に準じて行なった。ｐＨｌＯの培地は、炭酸ナトリ
ウム１％を加えて調製した。温度およびｐＨに関する成
育最適範囲の測定は、温度勾配バイオフォトレコーダー
で行なった。 Ａ、形態的性質 肉汁寒天培地上で３５℃にて２日間培養したとき、以下
の形態的特徴が観察される。 １）細胞の形および大きさ： 桿菌、０．４−０．５μｍＸ１．７−１．９７℃ｍｅ２
）多形性：なし。 ３）運動性：周鞭毛を有し運動性あり。 ４）胞子：胞子を形成し、形成途上で細胞は先端近くか
ら膨張する。成熟した 胞子はレモン型であり、大きさは。 ０．７−０．９　ｐ　ｍ　Ｘ　１．０−１．２　μｍ。 ５）ダラム染色性：陽性。 ６）抗酸性：ｌｉ３性。 Ｂ、培養的性質 １）肉汁寒天平板培養： ｐ）Ｉ　７．０にて生育して、円形、偏平状。 金縁のコロニーを形成する。該コロニーの表面は滑らか
で光沢有り、該周辺部は淡褐色、該中心部は半透明の淡
褐色。 ｐｌ＋　１０．０にて生育して、円形、偏平状。 金縁のコロニーを形成する。該コロニーの表面は滑らか
で光沢有り、クリーム色。 ２）肉汁寒天斜面培養： ＰＨ７，０およびｐＨ１０，０にて波帯状に生育し、光
沢のあるクリーム色ないし淡褐色のコロニーを形成する
。赤褐色の色素を僅かに生成する。 ３）肉汁液体培養： ｐ＋（７，０にて生育するが、菌膜は形成しなり１゜ ＰＨ１０，０にて生育が良好で、菌膜は形成しない。 ４）肉汁ゼラチン穿刺培養： ＰＨ７，０にて僅かに液化する。 ｐＨｌＯ，ｏにて液化する。 ５）リドマス・ミルク ＰＨ７，０にて生育が非常に悪い。 ＰＨ０，０にて生育する。 ミルクの凝固は見られない。培地がア ルカリ性のため、リドマスの変色は不 明。 Ｃ０生理的性質 ■）硝酸塩の還元：陽性。 ２）脱窒反応：陰性。 ３）ＭＲテスト：陰性。 ４）ｖＲテスト：ＩＩ３性。 ５）インドールの生成：陰性。 ６）硫化水素の生成：陰性。 ７）デンプンの加水分解：陽性。 ８）クエン酸の利用：　Ｋｏｓｅｒの培地では利用しな
い。Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培 地では僅かに利用する。 ９）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用しない。 アンモニウム塩は利 用しない。 １０）色素の生成：水溶性の赤褐色の色素を菌体組成物
とに生産する。 １１）ウレアーゼ：陽性。 １２）オキシダーゼ：陽性。 １３）カタラーゼ：陽性。 １４）生育の温度範囲＝３３ないし３５℃付近（２０な
いし４７℃）が良好。 １５）生育のｐＨ範囲：　１０．０付近（６０ないし１
２．０）が良好。 １６）酸素に対する態度：好気性下でも嫌倶性下でも生
育する。 １７）Ｏ−Ｆテスト：陰性。 １８）糖類から酸およびガスの生成： Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、 Ｄ−フラクトース、麦芽糖、ショ糖、 トレハロース、Ｄ−マンニット、デン プンから酸を生成するが、ガスは生成 しない、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシ ロース、Ｄ−ガラクトース、乳糖、イ ノジット、グリセリンからは酸もガス も生成しない。 Ｄ、その他の性質 ｌ）塩化ナトリウムに対する耐性： １０％Ｎ　ａ　ＣΩ下で生育する。 以上の性質を総括すると、まず、本菌株は、カラターゼ
陽性、通性好気性で耐熱胞子を有するダラム陽性の桿菌
であることにより、バチルス属の細菌である。 本菌株が、バチルス・アルカロフィルスに属すると思わ
れるため、理研、川越らのバチルス・アルカロフィルス
＆２２１（ＡＴＣＣ２１５２２）、Ｎαβ８（特公昭４
８−２７９２号、５０−１６４３５号参照）、およびＮ
ＱＤ−６（特公昭５６−４２３６参照）と菌学的性質を
比較した。本菌株とバチルス・アルカロフィルスＮα２
２１、　Ｎα５８、ＮＱＤ−６とは、アルカリ性の培地
（ｐＨ０）で良く生育する点で一致するが、無機窒素源
の利用に関して１本菌株が、硝酸塩およびアンモニウム
塩を利用できないのに対して、上記公知の菌株らは、利
用できる。また、生育ｐｏの範囲において、本菌株がＰ
Ｈ６からｐ）＋１２であるのに対して、Ｎａ２２１は、
ｐＨ７からＰＨＩＩであり、Ｎα５８、ＮａＤ−６は、
ｐＨ７，５からｐＨ１１であり、上記公知の菌株は、Ｐ
Ｈ７，０以下では生育できない点で異なる。 生育温度の範囲においても、本菌株が２０℃から４７℃
であり、最適温度範囲が３３℃から３５℃であるのに対
して、Ｎ１１２２１は５５℃、恥５８は４５℃まで生育
でき、最適温度が３７℃から４０℃であり、＆Ｏ−６も
最適温度が３５℃から４０℃と高く、本菌株と異なる。 また、本菌株と、糖類からの酸の生成を＆Ｄ−６と比較
すると、本菌株がＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−ガラクトース、グリセリンから酸を生成しないのに
対して、淘Ｄ−６は生成する。更に、本菌株は、１０％
食塩下でも成育し、上記公知の菌株とは区別される。 このように本菌株は公知のバチルス・アルカロフィルス
の菌株とは異なるが、上述の菌学的性質からバチルス・
アルカロフィルス類縁菌と判断することが妥当である。 バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｙ
株を培養して得られるアルカリプロテアーゼは、Ｙａ酵
素とｙｂ酵素との２種類であり、それぞれ特願昭６０−
１２３０２２号および特願昭６０−２８６９４４号に記
載されている。 バチルス・エスピー７株の培養は、例えば次のようにし
て行なうことができる。まず、可溶性デンプン２％、硫
酸マグネシウム０．０２％を含む液体培地と、乾燥酵母
１％、リン酸水素カリウム０．１％を含む液体培地とを
、それぞれ１２１　℃にて２０分間別々に滅菌した後、
各２０ｍ　Ｑを５００１１Ｑの坂ロフラスコに分注し、
更に滅菌済みの炭酸ナトリウムを終濃度１％となるよう
に該フラスコに加え、５０ｔａ　Ｑの培養液を調製する
。該培養液にバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｓｐ、）Ｙ株を接種し、該培養液を３０℃で１５時間培
養し、種培養液を調製する。該種培養液１００ｎ＋　Ａ
を同じ組成の培地３．５０の入った醗酵タンクに加え、
該タンクに３０℃で毎分３．５Ｑの空気を送りながら７
０時間通気撹拌培養して微生物液を得る。 Ｙａ酵素とＹｂ酵素との分離・製造法は第１図に示した
通りである。まず、微生物培養液を、１００００ｒｐｎ
＋で５分間遠心分離し上清を得た０次に上清液を７０％
飽和の硫安塩析にかけた。更に得られた沈殿物を２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ｐＨ７
，２）に溶解し、同緩衝液に対して透析し、Ｙ粗酵素（
以下、単にＹ酵素と称す）を得た。続いてＹ酵素溶液を
、ジエチルアミノエチル（ＤＦ３．ＡＥ）　−５３セル
ロースのアニオン交換クロマトグラフィーにかけ１０＋
ｉＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９，３）で溶出させ、非吸着画
分を得た。 さらに続いて該非吸着画分を、再び７０％飽和の硫安塩
析にかけた。得られた沈殿物を再び２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）に溶解
し、同緩衝液に対して透析した。 更にまた該溶液を、トヨパールＨＷ−５５のゲル濾過ク
ロマトグラフィーにかけ、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）で溶出させ、活
性のある両分を集めた。さらに該両分を７０％飽和の硫
安塩析にかけ、得られた沈殿物を２０履Ｍトリスー塩酸
緩衝液（Ｃａイオン２ＩＩＩＭ添加、　ｐＨ７，２）に
対して透析した。最後に変性蛋白質を除去するために、
透析後の活性画分をミリポアフィルタ−で濾過し、精製
Ｙｂ酵素（以下、単にＹａ酵素と称す）を得た。 一方、得られたＹ酵素溶液をジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）　−５３セルロースのアニオン交換クロマトグ
ラフィーにかけ２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオ
ン２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）で非吸着画分としてＹａ酵
素を溶出させた後、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む
同緩衝液を用い、直線濃度勾配で溶出し、Ｙｂ酵素の粗
両分を得た。該クロマトグラフィーの溶出曲線を第２図
に示す。 さらに続いて該ｙｂ粗両分を、再び７０％飽和の硫安塩
析にかけた。得られた沈殿物を５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐ）１７．０）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。 さらに該溶液をヘモグロビン−アガロース、アフィニテ
ィーカラムクロマトグラフィーにかけ、５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出させ、活性のある両分を集
めた。さらに該両分を７０％飽和の硫安塩析にかけ、得
られた沈殿物を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオ
ン２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）に溶解し、同緩衝液に対し
て透析した。さらに該溶液をトヨパールＨＷ−５５のゲ
ル濾過クロマトグラフィーにかけ、２０Ｉｌ１Ｍトリス
ー塩酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ＰＨ７，２）で
溶出させ、活性のある両分を集めた。さらに該両分を７
０％飽和の硫安塩析にかけ、得られた沈殿物を２０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオン２＋＋＋Ｍ添加、ＰＨ
７，２）に溶解し、同緩衝液に対して透析し、精製Ｙｂ
酵素（以下、単にＹｂ酵素と称す）を得た。 精製済みのＹａ酵素およびＹｂ酵素を試料としたゲル濾
過クロマトグラフィーの溶出曲線を、それぞれ第１２図
および第１３図に示す。樹脂としてトヨパールＨＷ−５
５を用い、溶出液として２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２，Ｃａイオン２ｍＭを含む）を用い、展開を上
昇法により実施した。 また、精製済みのＹａ酵素を試料とした高速液体クロマ
トグラフィーの溶出曲線を第１４ｇＡに示す１機種はウ
ォーターズＷ　Ｉ　Ｓ　Ｐ−７１０Ｂを用い、ｌ−１２
５カラムを２本直列させ、５０ｍＭリン酸緩衝液で溶出
させた６以上から明らかなように、Ｙａ酵素およびＹｂ
ｇ素は完全に精製された。 すなわち、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ、）Ｙ株を培養することによって得られるアルカリプ
ロテアーゼであるＹ酵素は、はＹａ酵素とｙｂ酵素との
混合物であり、その比率はＹａ酵素／Ｙｂ酵素＝　９０
／　１０〜５０１５０である。 次に前述した方法に従って得られたＹａ酵素、Ｙｂ酵素
およびＹ酵素について説明する。 〔１〕基質特異性 Ｙａ酵素およびＹｂ９素の作用は、蛋白質の加水分解で
ある。その酵素の基質特異性を第１表に示す。また、バ
チルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）Ｙ株よ
り同時に生産されるＹａ酵素およびＹｂ酵素との混合物
の基質特異性も同様に評価し、比較した。 Ａ酵素［バチルス・リケニフオルミス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）よ
り単離されたアルカリプロテアーゼ（商品名アルカラー
ゼ、ノボ社）の活性を１００としたときの相対分解率を
次の条件で測定した。 条件：温度　　　３５℃ ｐＨ１０，５（５０＋ｍＭホウ酸緩衝液）反応時間　６
０分 基質温度　１％ただしヘモグロビ ンは０．４％ 酵素使用量１００ＡＰＵ／ｍＡ　　ただし卵白は５００
ＡＰＵ／ｍｌ 蛋白質分解率すなわち活性の測定は、アンソン−萩原の
変法に従った１反応後濾過した反応溶液の吸光度を２７
５１にて測定した。１分間にチロシン１μｇを遊離させ
る酵素活性を１アル力リプロテアーゼ単位（Ａ　Ｐ　Ｕ
）とした。 この表から、Ｙａ酵素はケラチンに対して特異性が強＜
、Ｙｂ酵素は卵白に対する特異性が強く、不溶性蛋白質
であるケラチンに対しては弱いことが分かる。また、Ｙ
ａ酵素とＹｂ酵素の混合物であるＹ酵素は、公知のＡ酵
素より広範な基質に対して強く作用する特徴を有する。 〔２〕至適ｐＨおよび安定ｐＨ領領 域ａ酵素およびＹｂ酵素の至適ｐｔ＋および安定ｐＨ領
域のグラフ図を第３図および４図に示す。用いた緩衝液
は以下のとおりである。 （以下余白） 一一下血城一一　　　−−Ｊｌ差−一−３，５−５，５
酢酸 ４．５−７．０　　　　　　　クエン酸６．０−８．０
　　　　　　　リン酸 ７．５−９．０　　　　　　　トリス−ＨＣｊ２８．０
−９．０　　　　　　ホウ酸−Ｈ（１９，０−１０，５
グリシン−ＮａＯＨ ９，５−１１，０ホウ酸−ＮａＯＨ １１，０−１２，０リン酸−ＮａＯＨ １２，０−１３，０ＫＣＱ　−Ｎ　ａ　ＯＨ至適ｐＨを
調べるに当っては、カゼイン０．６％を含む２０ｍＭの
各緩衝液に各酵素を約４００ＡＰＵ／議Ｑとなるように
カロえ、３５℃で１０分間反応させ活性を測定した。至
適ｐＨでの活性を１００とするときの各ｐＨでの相対活
性を求めた。安定ｐＨ領域を調べるに当っては、２０ｍ
Ｍの各緩衝液に各酵素を約４００ＡＰＵ／ｍαとなるよ
うに加え、２５℃で２４時間インキニーベートした後、
活性を測定した。インキューベート前の活性を１００と
して各ｐＨでの相対活性を求めた。第３図から分かるよ
うに、Ｙａ酵素の至適ｐｉは１０．０ないし１２．５で
あり、安定ｐｉ領領域６．５ないし１３．０である。第
４図から分かるように、Ｙｂ酵素の至適ＰＨは９．０な
いし１Ｏ００であり、安定ｐＨ領域は６．５ないし１２
．０である。 〔３〕至適温度及び耐熱性 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の至適温度と耐熱性を第５図お
よび６図に示す、至適温度を調べるに当っては、基質と
して０．６％のカゼインを含むＰＨ１０，５の緩衝液に
各酵素を加え、１０分間各温度で反応させた。３５℃で
の活性を１００として各温度での相対活性を求めた。耐
熱性は次のようにして調べた。５０ｍ　Ｍホウ酸−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（３５℃でＰｌ（１０，５）に約４００ＡＰ
　Ｕ　／　ｒｓ　Ｑの酵素を加え、各温度で１０分間熱
処理し、氷冷した後、活性を測定した。第５図から分か
るように、Ｙａ酵素の至適温度は７０℃であり、５５℃
の温度まで活性が維持される。 第６図から分かるように、Ｙｂ酵素の至適温度は６５な
いし７０℃の範囲であり、５０℃の温度まで１００％活
性が維持される。 〔４〕紫外線吸収スペクトル Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の紫外吸収スペクトルを第７図
および第８図に示す。試料を５０ｍＭのトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）に溶がし、紫外線吸収スペクトルを
測定したところ、Ｙａ酵素は２７６ｎｍの波長で極大吸
収を示し、その波長での吸光係数Ｅ）ルは７．４と計算
された。一方、ｙｂ酵素は２７８ｎｍの波長で極大吸収
を示し、その波長での吸光係数ＥｅＡは９．５と計算さ
れた。 〔５〕金属イオンの影響 金属イオンのＹａ酵素およびＹｂ酵素の活性に与える影
響を調べた。その結果を第２表および第３表に示す。２
０ｍＭホウ酸−Ｎ　ａ　ＯＨ緩衝液（ｐ）１１０．５）
にＹａ酵素またはＹｂ酵素を約４００ＡＰＵ／ｍｌを加
え、更に各種金属塩を１ｍＭの濃度で添加し、各所定の
条件で処理後残存活性を測定した。数値は０分の活性を
１００としてその相対活性で表す。 第２表（Ｙａ酵素） この第２表から、Ｙａ酵素は１！！酸銅、硝酸銀、塩化
第２水銀、塩化カドミウムの添加により活性は阻害され
るが、塩化カルシウムの添加では活性の熱に対する安定
性が増すことが分かる。 また、第３表から、Ｙｂ酵素は硫酸銅、硝酸銀、塩化第
２水銀の添加により、活性が阻害されることが分かる。 バチルス属に属する菌の生産するアルカリプロテアーゼ
は、一般にＣａ”＋によって熱安定性を増すことから、
Ｃａ”＋の効果をみるため、５ｍＭのＣａ”を含む５０
ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（３５℃でｐｕｘｏ、５）
に約４００ＡＰＵ／耐の酵素を加え、各温度で１０分間
熱処理し。 水冷した後活性を測定して残存活性を求めた。 比較のため、Ｃａ”＋を加えない条件でも同時に評価し
た。その結果を第４表に示す。数値は０分の活性をｌＯ
Ｏとしてその相対活性で表す。 （以下余白） 第４表 Ｃａイオンの添加により、熱に対する安定性がＹａ酵素
では約５℃、ｙｂ酵素では約１０℃向上することが分か
った。 〔６〕阻害剤の影響 Ｙａ酵素およびｙｂ酵素に対する各種の阻害剤の影響を
調べた。条件および方法は以下の通りである。５０ＩＩ
ＩＭトリスー塩酸緩衝液（Ｐ１１７．２）でＹａ酵素ま
たはｙｂ酵素を８００ＡＰＵ／ｍｌになるよう調製した
。各阻害剤を添加して、３５℃で３０分間インキュベー
ト後、残存活性を測定した。値は、阻害剤無添加のもの
を１００とした相対活性で示した。その結果を第５表に
示す。 （以下余白） この表から分かるように、Ｙａ酵素およびＹｂ酵素は、
カゼインを基質とした場合、ＥＤＴＡ（エチレンジアミ
ン四酢酸）およびＰＣＭＢ（Ｐ−クロロマーキュリ−安
息香酸）、アンチパイン（Ａｎｔｉｐａｉｎ）　、キモ
スタチン（Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）では活性が阻害さ
れないが、ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロリン酸）お
よびＰＭｓＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリド
）では活性が阻害されることより、活性中−〇−にセリ
ンを有するプロテアーゼである。 〔７〕分子量 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の分子量をゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより調べた。充填剤には、トヨパールＨト５
５を用い、２０＋＋＋Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（Ｃａイ
オン２ｍＭ添加、　ｐＨ７，２）を溶出液とした。標準
蛋白に以下の蛋白（カッコ内は分子量）を用いて検量線
を作成した。蛋白アルブミン（４３，０００）、サーモ
ライシン（３７、５００）、ズブチリシン（２７，６０
０）、キモトリプシノーゲン（２５，７００）、ミオグ
ロビン（１７，２００）、チトクロームＣ（１１，７０
０）を用いた。 検量線を第９図に示す。この方法により、Ｙａ酵素の分
子量は２１，０００．Ｙ　ｂ酵素の分子量は４０，００
０と決定した。 〔８〕等電点 Ｙａ酵素およびｙｂ酵素の等電点を等電点電気泳動法に
より調べた。カラム用担体には。 ファルマライト３−１０を用いた。Ｙａ酵素およびＹｂ
酵素の等電点電気泳動模様を第１θ図および１１図に示
す、この方法によりＹａ酵素の等電点は１０．１、ｙｂ
酵素の等電点は５．１と決定した。

〔９〕アミノ酸組成 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素のアミノ酸組成〔アミノ酸分析
器几Ｃ−２００Ａ（日本電子）使用〕を調べた。なお、
トリプトファンはアルカリ分解法、システィンは過蟻酸
酸化法により測定した。その組成を公知のプロテアーゼ
のものと比較して第６表に示す。 （以下余白） その結果、他の酵素と比べてＹａ酵素はトリプトファン
、セリン、バリンなどｙｂ酵素はトリプトファン、ヒス
チジン、アルギニン。 アスパラギン酸、グリシン、アラニンなどのアミノ酸組
成において顕著な相違が見られる。 〔１０〕元素分析値 Ｙａ酵素およびｙｂ酵素の元素分析値を第７表に示す。 第７表 最後にまとめとして、Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の各種性
状をＡ酵素、バチルス属の好アルカリ性細菌の生産する
公知のアルカリプロテアーゼのもと比較して後記の第８
表に示す。 他の類似した公知のアルカリプロテアーゼ（Ｅ−１，Ｅ
−２，ＡＰＩ−２１，魔２２１については第８表の注を
参照）と比較すると、至適ＰＨはＡ酵素、Ｅ−１、Ｅ−
２およびＡＰＩ−２１が１０〜１１．４２２１が１１〜
１２であり、Ｙａ酵素は１０〜１２．５と領域が高ＰＨ
側に広く、Ｙｂ酵素の至適ｐＨは９〜１０であり、Ｙａ
酵素と他の公知のアルカリプロテアーゼに比べて低い。 次に、至適温度がＹａ酵素およびｙｂ酵素が７０℃付近
にあるのに対して、Ａ酵素。 Ｎａ　２２１は６０℃、ＡＰＩ−２１は４５〜５０℃と
低く、Ｅ−１、Ｅ−２においては、７５℃とＹａ酵素お
よびｙｂ酵素より高く、この点においても異なる。 また、Ｙａ酵素およびＹｂ酵素は５ｍＭＣａ”＋イオン
存在下で、Ａ酵素、Ｎａ２２１．ＡＰＩ−２１の酵素と
同様に耐熱性が約５〜１０℃向上するが、バチルス＆Ｄ
−６株（第８表の注を参照）の生産するＥ−１、Ｅ−２
はＣａ！＋イオンによる熱安定性の増大が認められない
点で異なる。 更に、Ｙｂ酵素の分子量が４万と公知のアルカリプロテ
アーゼに比べて大きく、等電点も５．１と低いことから
も、明らかに別種のものと言える。 以上のことから本酵素は従来知られているアルカリプロ
テアーゼのいずれとも異なる。 よって本酵素を新規酵素と判断することが妥当であり、
アルカリプロテアーゼＹａおよびｙｂと命名した。 （以下余白） 本発明のアルカリプロアーゼ（Ｙ酵素）の配合量は特に
限定されないが、好ましくは、洗浄剤組成物１ｋｇ当り
５０〜１００ＯＯＡ　Ｐ　Ｕ、さらに好ましくは１００
０〜５０００Ａ　Ｐ　Ｕである。 本発明に用いられる上記アルカリプロテアーゼ以外の他
種の酵素としては、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアー
ゼ、セルラーゼなどが挙げられるが、その中でもバチル
ス属 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から生産されるアルカリプロテア
ーゼが好適であり、ノボインダストリー社の「アルカラ
ーゼ」（Ａｌｃａｌａｓｅ）、「エスペラーゼ」（Ｅｇ
ｐｅｒａｓｅ）、［サビナーゼＪ　（Ｓａｖｉｎａｓｅ
）、ギストフロカースノ「マクサターゼＪ　（Ｍａｘａ
ｔａｓｅ）、［マクサカールＪ　（Ｍａｘａｃａｌ）、
ナガセ生化学工業の「ピオプラーゼ」等の商品名で市販
されている。 これらの酵素は１種または２種以上で洗浄剤組成物に配
合される。この配合量は特に限定されないが、好ましく
は０．０５〜１０ｗｔ％、さらに好ましくは０．１〜５
ｖｔ％の範囲で洗浄剤組成物に配合される。 本発明の洗浄剤組成物の中には、さらに必要に応じて任
意成分を配合することができる。任意成分としては、一
般に洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤、ビルダー、
再汚染防止剤、漂白剤、酵素、蛍光増白剤、ハイドロト
ロープ。 無機塩、香料などがあげられる。 界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤。 ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界
面活性剤または双性イオン界面活性剤などが用いられる
。アニオン性界面活性剤としては、通常のスルホネート
系、サルフェート系、ホスフェート系のアニオン性界面
活性剤および石鹸が使用される。スルホネート系アニオ
ン性界面活性剤としては、Ｃ１〜、の直鎖または分枝鎖
のアルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｃ，、□の長鎖アル
キルスルホン酸塩、Ｃ，−１の長鎖オレブインスルホン
酸塩などが挙げられる。また。 サルフェート系アニオン性界面活性剤としては、Ｃ，−
２□の直鎖または分枝鎖のフルキルないしアルケニル硫
酸エステル塩、Ｃ＠、２のポリオキシエチレン（ＥＯｐ
＝　１〜７モル）直鎖または分枝鎖のフルキルないしア
ルケニルエーテル硫酸エステル塩、Ｃ１−１，のポリオ
キシエチレン（ＥＯｉ５＝　１〜７モル）直鎖または分
枝鎖のアルキルフェニル。 エーテル硫酸エステル塩などが挙げられる。ここでＥＯ
βは、エチレンオキシドの平均付加モル数を示す、また
、ホスフェート系アニオン性界面活性剤としては、Ｃ１
〜。のモノアルキル（またはアルケニル）、ジアルキル
（またはアルケニル）あるいはセスキリン酸塩、Ｃ１〜
２２のポリオキシエチレン（ＥＯβ＝１〜７モル）モノ
アルキル（またはアルケニル）、ジアルキル（またはア
ルケニル）あるいはセスキリン酸塩などが挙げられる０
石鹸としては、Ｃ，〜２．の飽和または不飽和脂肪酸塩
が挙げられる。これらのアニオン性界面活性剤の対イオ
ンとしての陽イオンは、例えばナトリウム、カリウム、
マグネシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金
属イオン、モノエタノールアミン、ジェタノールアミン
。 トリエタノールアミンなどのフルカノールアミン、アン
モニウムなどである。 ノニオン性界面活性剤としては、Ｃ，、、のポリオキシ
エチレン（ＥＯβ：１〜２５モル）直鎖または分枝鎖の
アルキルまたはアルケニルエーテル、Ｃ，−□８のポリ
オキシエチレン（ＥＯｉ５＝　１〜２５モル）アルキル
またはアルケニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレ
ンポリオキシプロピレンブロックコポリマーなどのオキ
シアルキレン付加化合物、Ｃ，−０の飽和または不飽和
脂肪酸アルカノールアミドまたはそのアルキレンオキサ
イド付加物、Ｃ１□〜□、の第三級アミンオキシドなど
が挙げられる。 両性界面活性剤としては、ジメチルジアルキル（Ｃ−、
、Ｓ）アルキルカルボキシベタイン、ジアルキル（ＣＳ
−□８）アミノアルキレンカルボン酸塩。 ２−アルキル−１−カルボキシ−１−ヒドロキシエチル
イミダゾリウムベタインなどが挙げられる。 カチオン性界面活性剤としては、下記の一般式（１）、
　（ｎ）、　（ＩＩＩ）で表されるものが挙げられる。 （式中のＲ工、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の少なくとも１つは０
１２−２４のアルキルまたはアルケニル基であり、その
他はＣ１，のアルキル基またはビトロキシアルキル基あ
るいはベンジル基を表わし、又はハロゲンを表わす。） たはアルケニル基、Ｒ７はＣ工〜４のアルキル基または
ビトロキシアルキル基あるいはベンジル基、Ｒ６はＨま
たはＣＨ，、ｎは１〜５の整数、Ｘはハロゲンを表わす
。） （式中のＲ，とＲ１゜はＣ工２−２４のアルキル基また
はアルケニル基、Ｑおよびｍは１〜２０の整数、Ｘはハ
ロゲンを表わす。） これらの界面活性剤はそれぞれ単独で用いてもよいし、
２種以上組合せてもよく、その配合量は１０〜５０ｗｔ
％が適当であり、好ましくは２０〜４０ｗｔ％である。 ビルダーとしては、オルソリン酸塩、ピロリン酸塩、ト
リポリリン酸塩、メタリン酸塩、ヘキサメタリンル酸塩
等のリン酸塩；ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢
酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチ
レントリアミン五酢酸等のアミノカルボン酸またはこれ
らの塩；クエン酸、ジグリコール酸、リンゴ酸、シュウ
酸、酒石酸、コハク酸などの多価カルボン酸またはこれ
らの塩；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリル
酸共重合体、ポリマレイン酸、ポリフマル酸、無水マレ
イン酸共重合体などの高分子電解質またはこれらの塩；
ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、カル
ボキシメチルセルロースなどの非電解離高分子；一般式 （ＴＶ）で表わされる結晶性または無定形アルミノケイ
酸塩、炭酸塩などの無機塩；トリエタノールアミン、ジ
ェタノールアミン、モノエタノールアミンなどのアルカ
ノールアミンが挙げられる。 Ｘ（Ｍ、○又はＭ’　Ｏ）Ａ　Ｑ　ｚ　Ｏａ　・ｙ　（
Ｓ　ｚ　０２）　　・Ｗ　（Ｒ２０）・・・（ＩＶ） （式中のＭはアルカル金属、Ｍ′はカルシウムと交換可
能なアルカリ土類金属、ｘ、ｙ、Ｗは各成分のそれぞれ
のモル数を表わし、一般的には、Ｘは０．７〜１．５ｙ
は１〜３、Ｗは任意の数である。） これらビルダーは１種または２種以上組合せて用いられ
、洗浄剤組成物中に好ましくは１〜５０ｖｔ％、さらに
好ましくは５〜３０ｗｔ％配合させる。　再汚染防止剤
としては、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレン
グリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドンなどが、蛍光増白剤としては、４，４′−ビス（２
−スルホスチリル）−ビフェニル塩、４，４′−ビス（
４−クロロ−３−スルホスチリル）−ビフェニル塩、２
−（スチルフェニル）ナフトチアゾール誘導体、４，４
′−ビス（トリアゾール−２−イル）スチルベン誘導体
、ビス（トリアジニルアミノ）スチルベンジスルホン酸
などが、ハイドロトロープとしては低級アルコール、多
価アルコール、低級アリールスルホン酸またはその塩な
どが挙げられ、これらの各成分はいずれもそれぞれ単独
で用いてもよいし、２種以上組合せてもよい。 月」ヱ夏１釆 本発明によれば、バチルス・エスピー７株から生産され
る新規なアルカリプロテアーゼとこれ以外の他種の酵素
とを併用して用いることにより、優れた洗浄力向上効果
が発揮され、従来知られていた酵素含有洗浄剤組成物に
比べて顕著に洗浄力が改良された極めて実用性の高い洗
浄剤組成物が実現できる。 次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。 各実施例における評価は、以下の試験方法に従って行な
った。 ・叉企左 ＵＳ、　Ｔｅｓｔｉｎｇ社のＴｅｒｇ−０−Ｔｏａｓｔ
ｅｒを洗浄装置として使用し、これにタンパク質配合湿
式人工汚垢布１０枚とセバム布、清浄メリヤス布を入れ
浴比３０倍に合わせ、１２０ｒ、ｐ、鵬で２５℃１０分
間洗浄する。洗浄液は、所定の洗浄濃度のもの９００ｍ
　ｎを用い、すすぎは９００ｒｍ　Ｑの水で３分間行な
う。 使用水は３°ＤＨのものを用いた。洗浄力は次式で算出
する。 洗浄力（％）＝　　　−６１”ＷＪｆｉ”’−Ｘ１００
汚垢布のに／Ｓ−未汚垢布のに／Ｓ なお、本洗浄力試験法は、油化学３０，４３２（１９８
１）　ｒ新しい人工汚垢に関する研究（第１報）」に準
する。 実施例１ ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステルナト
リウム塩（炭素数１３、直鎖率５０％、［ＥＯｉ５＝　
３　）２０ｖｔ％、ポリオキシエチレンアルキルエーテ
ル（炭素数１２〜１３、直鎖率８０％、ＥＯｉ５＝１５
）　１５ｖｔ％を基準配合組成とし、これに第９表に示
すようにアルカノールアミン、パラトルエンスルホン酸
、酵素を含有させた各種液体洗浄剤組成物を調製し、そ
れぞれの組成物の洗浄力を評価し、その結果を第９表に
示した。 実施例２ 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム１０ｖｔ％
、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム１０ｗｔ％、ケ
イ酸ナトリウム（Ｓ　ｉ　Ｏ／　Ｎ　ａ　ｘ○のモル比
２　）１０ｖｔ％、炭酸ナトリウム１０ｖｔ％、ポリエ
チレングリコール（＃６０００）　１　ｗｔ％、牛脂石
鹸１ｗｔ％、ゼオライト（４Ａ型）１５ｗｔ％、水５ｖ
ｔ％を基準配合組成とし、第１０表に示すように酵素を
含有させた粒状洗浄剤組成物を調製し、それぞれの組成
物の洗浄力の評価し、その結果を第１０表に示した。 第１０表 ×１）Ｙ酵素の力価：５０万ＡＰＵ ×２）洗浄剤濃度０．１３３％

【図面の簡単な説明】

第１図はＹａ酵素およびＹｂ酵素のＷ製段階を示すフロ
ーシートである。 第２図はＹ酵素のＤＥＡＥ−５３セルロースのアニオン
交換クロマトグラフィーにかけた際の溶出曲線を示すグ
ラフである。 第３図はＹａ酵素の至適ＰＨおよび安定ｐＨ領域を、第
４図はｙｂ酵素の至適ＰＨおよび安定ｐＨ領域を示すグ
ラフである。 第５図はＹａ酵素の至適温度および耐熱性を。 第６図はＹｂ酵素の至適温度および耐熱性を示すグラフ
である。 第７図はＹａ酵素の紫外線吸収スペクトル曲線を、第８
図はＹｂ酵素の紫外線吸収スペクトル曲線を示すグラフ
である。 第９図はＹａ酵素およびＹｂ酵素の分子量決定の際の検
量線を示すグラフである。 第１０図はＹａ酵素の、第１１図はＹｂ酵素のそれぞれ
等電点電気泳動模様を示すグラフである。 第１２図はＹａ酵素の、第１３図はＹｂ酵素のそれぞれ
ゲル濾過クロマトグラフィー溶出曲線を示すグラフであ
る。 第１４図はＹａ酵素の高速液体クロマトグラフィー溶出
曲線を示すグラフである。　　　　　−第１図 〔微生物培養液〕 ↓ Ｉｎ工１ ↓ Ｃ上清〕 ↓ ↓ 〔Ｙ粗酵素〕 ↓ （１製ｙｂｇ素〕・ 第４Ａ図 ｐＨ 第４Ｂ図 Ｈ 第５Ａ図　　　　　第６Ａ図 ′ｕ　！を度（ｃ′ｃ）　　　　　　　　　ｌｕ　１１
度（’Ｃ）浴出ｔ（ｍｌｌ 第１０図 分画番号 第１１図 分画番号 第１２図 分画番号 ″７ｆロ蓄す

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）
   Ｙ株（微工研条寄第１０２９号）から生産されるアルカ
   リプロテアーゼと他種の酵素とを含有することを特徴と
   する酵素含有洗浄剤組成物。