JPH0255034B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、バチルス属の１新菌株を培養するこ
とにより得られる、新規アルカリプロテアーゼに
関する。特には、洗浄剤全般に配合して優れた安
定性を有し、洗浄力の改善に寄与する新規アルカ
リプロテアーゼに関する。 ［従来技術とその問題点］ 近年、洗浄剤、特に液体洗浄剤の洗浄力を更に
向上させるために、洗浄剤原液のPHをよりアルカ
リ性にするとともに、プロテアーゼ、アミラー
ゼ、リパーゼ、セルラーゼ等の各種加水分解酵素
の配合が試みられている。その中でも蛋白質分解
酵素なかんずくアルカリプロテアーゼは、洗浄剤
のみでは落ちにくい蛋白汚垢を分解し、洗浄力の
改善に寄与する。そのため、該酵素を洗浄剤に添
加することが不可欠である。 一般的には、バチルス・リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）が生産するアルカラー
ゼ（ノボ社、以下本文中Ａ酵素と称する）、マキ
サターゼ（ギスト社）、がよく使用されている。
しかし、これら酵素は高PHの洗浄剤溶液中で直ち
に失活するため、流体洗浄剤に安定配合すること
は困難である。その他、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）、バチルス・アルカロフイル
ス（Bacillus alcalophilus）をはじめ、ストレプ
トマイセス層（Strepto myces）、アスペルギル
ス属（Aspergillus）、アースロバクター属
（Arthrobactor）、フザリウム属（Fusarium）等
の微生物により生産されるアルカリプロテアーゼ
も知られているが、前述と同様、安定性に問題が
あるため利用できない。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明は、洗浄剤成分共存下の高アルカリ条件
において優れた安定性を有し、洗浄力の改善に寄
与する新規なアルカリプロテアーゼを提供するこ
とを目的とする。 本発明者らは、上記の問題を克服したアルカリ
プロテアーゼを得るために、広く自然界よりアル
カリプロテアーゼ産生菌を検索した結果、バチル
ス属に属する１菌種が、前記の性質において公知
のアルカリプロテアーゼより優れたアルカリプロ
テアーゼを培地中に生産することを見出だした。
該酵素を産生する菌株は、特願昭60−123022の
Ya酵素を生産する微工研条寄第1029号バチル
ス・エスピー（Bacillus sp.）Ｙと同一菌株であ
る。本発明者らは、該酵素を以下に述べる方法に
より単離精製し、種々の性質をYa酵素および公
知の酵素と比較しながら検討した。 本発明のアルカリプロテアーゼ（以下、Yb酵
素と称する）の単離精製法は第１図に示したとお
りである。まず微生物培養液を、10000rpmで５
分間遠心分離し上清を得た。次に該上清を、70％
飽和の硫安塩析にかけた。更に得られる沈澱物を
20mMトリス―塩酸緩衝液（Caイオン2mM添加、
PH7.2）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。
続いて該溶液を、ジエチルアミノエチル
（DEAE）−53セルロースのアニオン交換クロマト
グラフイーにかけ20mMトリス―塩酸緩衝液
（Caイオン2mM添加、PH7.2）で非吸着画分とし
てYa酵素を溶出させた後、０〜0.5M塩化ナトリ
ウムを含む同緩衝液を用い、直線濃度勾配で溶出
し、Yb酵素の粗画分を得た。該クロマトグラフ
イーの溶出曲線を第２図に示す。尚続いて該Yb
粗画分を、再び70％飽和の硫安塩析にかけた。得
られた沈澱物を50mMリン酸緩衝液（PH7.0）に
溶解し、同緩衝液に対して透析した。更にまた該
溶液をヘモグロビン―アガロース、アフイニテイ
ーカラムクロマトグラフイーにかけ、50mMリン
酸緩衝液（PH7.0）で溶出させ、活性のある画分
を集めた。尚また該画分を70％飽和の硫安塩析に
かけ、得られた沈澱物を20mMトリス―塩酸緩衝
液（Caイオン2mM添加、PH7.2）に溶解し、同緩
衝液に対して透析した。更にまた該溶液をトヨパ
ールHW−55（商標 東洋曹達工業(株)製）のゲル
濾過クロマトグラフイーにかけ、20mMトリス―
塩酸緩衝液（Caイオン2mM添加、PH7.2）で溶出
させ、活性のある画分を集めた。尚また該画分を
70％飽和の硫安塩析にかけ、得られた沈澱物を
20mMトリス―塩酸緩衝液（Caイオン2mM添加、
PH7.2）に溶解し、同緩衝液に対して透析し、精
製Yb酵素を得た。 ［作 用］ 上述の方法に従つて得られたYb酵素の様々な
性質を調べた。 該Yb酵素の作用は、蛋白質の加水分解である。
その酵素の基質特異性を第１表に示す。またバチ
ルス・エスピー（Bacillus sp.）Ｙより同時に生
産されるYa酵素およびYa酵素との混合物の基質
特異性も同様に評価し、比較した。

【表】 Ａ酵素の活性を100としたときの相対分解率＊ 条件：温度35℃ PH10.5（50mMホウ酸緩衝液） 反応時間60分、ただしケラチンは30分 基質濃度１％ ただしヘモグロビンは0.4
％ 酵素使用量100APU／mlただし卵白は
500APU／ml ＊蛋白質分解率すなわち活性の測定は、アンソ
ン―萩原の変法に従つた。反応後濾過した反応溶
液の吸光度を275nmにて測定した。１分間にチロ
シン1μgを遊離させる酵素活性を１アルカリプロ
テアーゼ単位（APU）とした。 この表から、本Yb酵素は卵白に対する特異性
が強く、不溶性蛋白質であるケラチンに対しては
弱いことが分る。また、同時に産生されるYa酵
素とは異なる特性を有し、Ya酵素と併用使用し
た場合相補し、公知のＡ酵素より広範な基質に対
して強く作用する特徴を有する。 次に、本Yb酵素の至適PHおよび安定PH領域の
グラフ図を第３図に示す。用いた緩衝液は以下の
とおりである。 PH領域 緩衝液 3.5−5.5 酢酸 4.5−7.0 クエン酸 6.0−8.0 リン酸 7.5−9.0 トリス−HCl 8.0−9.0 ホウ酸−HCl 9.0−10.5 グリシン−NaOH 9.5−11.0 ホウ酸−NaOH 11.0−12.0 リン酸−NaOH 12.0−13.0 KCl−NaOH 至適PHを調べるに当たつては、カゼイン0.6％
を含む20mMの各緩衝液に各酵素を約400APU／
mlとなるように加え、35℃で10分間反応させ活性
を測定した。至適PHでの活性を100とするときの
各PHでの相対活性を求めた。安定PH領域を調べる
に当たつては、20mMの各緩衝液に各酵素を約
400APU／mlとなるように加え、25℃で24時間イ
ンキユベートした後、活性を測定した。インキユ
ベート前の活性を100として各PHでの相対活性を
求めた。第３図から分かるように、本Yb酵素の
至適PHは9.0ないし10.0であり、安定PH領域は6.5
ないし12.0である。 更に、本Yb酵素の至適温度と耐熱性を第４図
に示す。至適温度を調べるに当たつては、基質と
して0.6％のカゼインを含むPH10.5の緩衝液に各
酵素を加え、10分間各温度で反応させた。35℃で
の活性を100として各温度での相対活性を求めた。
耐熱性は次のようにして調べた。50mMホウ酸−
NaOH緩衝液（35℃でPH10.5）に約400APU／ml
の酵素を加え、各温度で10分間熱処理し、氷冷し
た後、活性を測定した。第４図から分るように、
本Yb酵素の至適温度は65ないし70℃の範囲であ
り、50℃の温度まで100％活性が維持される。 続いて、本Yb酵素の紫外吸収スペクトルを第
５図に示す。試料を50mMのトリス−塩酸緩衝液
（PH8.0）に溶かし、紫外吸収スペクトルを測定し
たところ、278nmの波長で極大吸収を示した。そ
の波長での吸光係数E¹%_1cnは9.5と計算された。 尚次に、金属イオンの本Yb酵素の活性に与え
る影響を調べた。その結果を第２表に示す。
20mMホウ酸−NaOH緩衝液（PH10.5）に本Yb
酵素を約400APU／mlを加え、更に各種金属塩を
1mMの濃度で添加し、各所定の条件で処理後残
存活性を測定した。数値は０分の活性を100とし
てその相対活性で表わす。

【表】 この表から、硫酸銅、硝酸銀、塩化第２水銀の
添加により本Yb酵素の活性は阻害されることが
分る。 バチルス属に属する菌の生産するアルカリプロ
テアーゼは一般にCa²⁺によつて熱安定性を増す
ことから、Ca²⁺の効果をみるため5mMのCa²⁺を
含む50mMホウ酸−NaOH緩衝液（35℃でPH
10.5）に約400APU／mlの酵素を加え、各温度で
10分間熱処理し氷冷した後活性を測定した。比較
のためCa²⁺を加えない条件でも同時に評価した。
その結果を第３表に示す。数値は０分の活性を
100としてその相対活性で表わす。

【表】 この表から、Caイオンの添加により熱に対す
る安定性が約10℃向上することが判る。 尚つづいて、本Yb酵素に対する各種阻害剤の
影響を調べた。条件および方法は以下のとおりで
ある。50mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）で本
Yb酵素を800APU／mlになるよう調製した。各
阻害剤を添加して、35℃で30分間インキユベート
後、残存活性を測定した。値は、阻害剤無添加の
ものを100とした相対活性で示した。その結果を
第４表に示す。

【表】

【表】 この表から分るように、本Yb酵素は、カゼイ
ンを基質とした場合、EDTAおよびPCMB、ア
ンチパイン、キモスタチンでは活性が阻害されな
いが、DFPおよびPMSFでは活性が阻害される
ことより活性中心にセリンを有するプロテアーゼ
である。 尚、更に、液体界面活性剤中での本Yb酵素の
安定性を第６図に示す。各酵素をグリシン−
NaOHの緩衝液でPHを11に調整した液体ヘビー
洗浄剤原液中で40℃にて保存した後、経日的に各
酵素のケラチンに対する分解活性を測定した。 その結果、第６図に示したとおり、Ａ酵素が３
日目で80％失活し、７日目完全に失活するのに対
し、本Yb酵素は、３日目で70％、７日目でも50
％活性が残存する。このように、本Yb酵素は、
公知のアルカリプロテアーゼに比べると、高PH液
体界面活性剤中での安定性について優れているこ
とが分る。 尚続いて、本Yb酵素の分子量をゲル濾過クロ
マトグラフイーにより調べた。充填剤には、トヨ
パールHW−55（商標 東洋曹達工業(株)製）を用
い、20mMトリス−塩酸緩衝液（Caイオン2mM
添加、PH7.2）を溶出液とした。標準蛋白に以下
の蛋白（分子量）を用いて検量線を作成した。卵
白アルブミン（43000）、サーモライシン
（37500）、ズブチリシン（27300）、キモトリプシ
ノーゲン（25700）、ミオグロビン（17200）、チト
クロームＣ（11700）を用いた。この方法により、
本Yb酵素の分子量は40000と決定した。 また次に、本Yb酵素の等電点を等電点電気泳
動法により調べた。カラム用担体には、フアルマ
ライト ３−10（商標 フアルマシア(株)製）を用
いた。この方法により本Yb酵素の等電点は5.1と
決定した。 また更に、本Yb酵素のアミノ酸組成［アミノ
酸分析器JLC−200A（日本電子）使用］を調べ
た。尚、トリプトフアンは、アルカリ分解法、シ
ステインは過蟻酸酸化法により測定した。その組
成を公知のプロテアーゼのものと比較して第５表
に示す。 その結果、本発明のYb酵素は、他の酵素に比
べ、例えばトリプトフアン、ヒスチジン、アルギ
ニン、アスパラギン酸、グリシン、アラニンなど
のアミノ酸組成において顕著な相違が見られる。

【表】 また続いて、本Yb酵素の元素分析値を第６表
に示す。

【表】 最後にまとめとして、本Yb酵素の各種性状を
同一菌株から同時に生産されるYa酵素、Ａ酵素、
およびバチルス属の好アルカリ性細菌の生産する
公知のアルカリプロテアーゼのものと比較して第
７表に示す。 同一菌株から生産されたYa酵素、およびその
他の類似した公知のアルカリプロテアーゼ（Ｅ−
１，Ｅ−２，ADI−21，No.221については第７表
の注を参照）と比較すると、まず本Yb酵素の至
適PHが９〜10に対して、Ａ酵素、Ｅ−１，Ｅ−２
およびAPI−21は10〜11、No.221は11〜12と高く、
更にYa酵素においては、10〜12.5と領域が高PH
側に広い点で異なる。 次に至適温度が本Yb酵素およびYa酵素が70℃
付近にあるのに対してＡ酵素、No.221は60℃、
API−21は45〜50℃と低く、Ｅ−１，Ｅ−２にお
いては、75℃と本酵素より高く、この点において
も異なる。 また、本Yb酵素は5mMCa²⁺イオン存在下で
Ya酵素、Ａ酵素、No.221、API−21の酵素と同様
に耐熱性が約５〜10℃向上するが、バチルスNo.−
６株（表７の注を参照）の生産するＥ−１，Ｅ−
２はCa²⁺イオンによる熱安定性の増大が認めら
れない点で異なる。 更に、本Yb酵素の分子量が４万と公知のアル
カリプロテアーゼに比べ大きく、等電点もpI5.1
と低いことからも、明らかに別種のものと言え
る。 以上のことから本酵素は従来知られているアル
カリプロテアーゼのいずれとも異なる。よつて本
酵素を新規酵素と判断することが妥当であり、ア
ルカリプロテアーゼYbと命名した。

【表】 ［実施例］ 菌株の培養 可溶性デンプン２％、硫酸マグネシウム0.02％
を含む液体培地と、乾燥酵母１％、リン酸水素二
カリウム0.1％を含む液体培地とを、それぞれ121
℃にて20分間別々に滅菌した後、各20mlを500ml
の坂口フラスコに分注し、更に滅菌済みの炭酸ナ
トリウムを終濃度１％となるように該フラスコに
加え、50mlの培養液を調製した。該培養液にバチ
ルス・エスピー（Bacillus sp）Ｙ株を接種し、
該培養液を30℃で15時間培養し、種培養液を調製
した。該種培養液100mlを同じ組成の培地3.5の
入つた醗酵タンクに加え、該タンクに30℃で毎分
3.5の空気を送りながら70時間通気撹拌培養し
た。得られた培養液3.5（2500APU／ml）を遠
心分離により除菌し、上清約3.0を得た。 Yb酵素の精製 このようにして得た培養上清2650mlを冷却撹拌
しながら該上清に硫安1250ｇを添すると、アルカ
リプロテアーゼが析出した。該沈澱物を遠心分離
により回収し、該沈渣を20mMトリス―塩酸緩衝
液（PH7.2、Caイオン2mMを含む）500mlに溶解
し、該溶液を透析膜に入れ同緩衝液に対して一晩
透析した。ここに890mlの粗酵素液（6600APU／
ml、比活性435OAPU／mg蛋白）を得た。 同時に生産されるYa酵素の除去のため、
20mMトリス―塩酸緩衝液（Caイオン2mM添加、
PH7.2）で平衡化したDEAE―53（セルロース）を
充填したカラムに該溶液を展開させ、同緩衝液で
Ya酵素を溶出させた。その後、０〜0.5M塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液でYb酵素を溶出させ、
活性画分を集めたところ、全量は、350ml、活性
は4200APU／ml、比活性は1350APU／mg蛋白で
あつた。 次に該Yb粗画分をヘモグロビン―アガロース
アフイニテイ―カラムクロマトグラフイーにか
け、50mMリン酸緩衝液（PH7.0）で溶出させ、
活性画分を集めた。回収率は15％であり、比活性
は7400APU／mg蛋白に向上した。 更に該溶液をトヨパールHW−55のゲル濾過ク
ロマトグラフイーにかけ、20mMトリス−塩酸緩
衝液（Caイオン2mM添加、PH7.2）で展開させ
た。得られた活性画分を硫安塩析し、沈澱物を同
緩衝液３mlに溶解し、同緩衝液に対して透析し
た。 透析後、活性94000APU／ml、比活性
8500APU／mg蛋白の溶液７mlを得た。この精製
過程を第８表にまとめて示す。

【表】 次に、精製済みの本Yb酵素を試料としたゲル
濾過クロマトグラフイーの溶出曲線を第７図に示
す。 上記の精製により本Yb酵素は完全に精製され
た。 本Yb酵素の洗浄力 洗浄剤の基準組成として、アルキルポリエトキ
シ硫酸ナトリウム20、アルコールエトキシレート
10、エタノール６、トルエンスルホン酸ナトリウ
ム６、アルカリビルダー（グリシン6.6、
NaOH3.3）、水（バランス）の配合物を準備し
た。数値の単位はいずれも重量パーセントであ
る。 前記組成だけの試料をサンプル−１とし、前記
組成物に本Yb酵素を5000APU／ｇ添加させた試
料をサンプル−２とした。同一菌株から生産され
るYa酵素を同量添加したものをサンプル−３と
した。また前記の精製法に準じ調製した比活性
4350APU／mg蛋白の粗酵素（Ya／Yb＝２／１
の比率で含有）を添加したものをサンプル−４と
した。更に市販の液体洗浄剤の試料をサンプル−
０とした。 洗浄装置には、US−テスチング社のTerg−Ｏ
−Tometer（ターゴツトメーター）を使用し、蛋
白質配合湿式汚垢布10枚、セバム布および洗浄メ
リヤス布を入れ、浴比30倍に合せ、25℃で
120rpmにて10分間洗浄した。洗浄液には、洗浄
剤濃度0.1％のもの900mlを用い、濯ぎは900mlの
水で３分間行なつた。使用水には、3゜DHのもの
を用いた。尚、洗浄力指数は、油化学、30、432
（1981）に示された式に準じて計算した。該結果
を第９表に示す。

【表】 この結果から、本Yb酵素を含むサンプルは、
本Yb酵素を含まないサンプルよりも明らかに洗
浄作用が強く、本Yb酵素は液体ヘビー洗浄剤の
洗浄力の改善に寄与することが分る。 また、粗酵素を添加したサンプル−４の洗浄力
がわずかながら強い傾向にあることから、本Yb
酵素は単独でも使用することはできるが、性能お
よび経済的にみて基質特異性の異なるYa酵素と
の併用使用が望ましい。 尚、本Yb酵素およびYa酵素と公知の酵素との
併用使用も洗浄力のより一層の改善に有効なこと
は、公知酵素のもつ諸理化学的性質と異なること
から当然ながら予測できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本Yb酵素の精製段階を示すフローシ
ートである。第２図は本Yb酵素のDEAE−53セ
ルロースのアニオン交換クロマトグラフイーにか
けた際の溶出曲線を示すグラフ図である。第３図
は本Yb酵素の至適PHおよび安定PH領域を示すグ
ラフ図である。第４図は本Yb酵素の至適温度お
よび耐熱性を示すグラフ図である。第５図は本
Yb酵素の紫外領域吸収スペクトル曲線を示すグ
ラフ図である。第６図は本Yb酵素の界面活性剤
中での安定性を示すグラフ図である。第７図は本
Yb酵素のゲル濾過クロマトグラフイー溶出曲線
を示すグラフ図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有するアルカリプロテア
   ーゼ。 (イ) 作用：高アルカリ条件下で各種の蛋白質を分
   解する。 (ロ) 基質特異性：卵白に対して著しい特異性を示
   す。 (ハ) 至適PH：カゼインを基質として35℃で10分間
   反応させた場合、PH9.0ないし10.0において作
   用が至適である。 (ニ) 安定PH範囲：カゼインを基質として25℃で24
   時間処理した場合、PH6.5ないし12.0の範囲に
   おいて作用が安定である。 (ホ) 至適温度：カゼインを基質としてPH10.5で反
   応させた場合、温度65ないし70℃の範囲におい
   て作用が至適である。 (ヘ) 耐熱性：PH10.5で60℃にて10分間熱処理した
   場合、90％以上活性が残存する。 (ト) 吸収スペクトル：PH8.0の50mMトリス―塩
   酸緩衝液中において紫外領域278nmに極大吸収
   を示す。 (チ) 金属イオンの影響：カゼインを基質とした場
   合、Hgイオンでは活性が阻害され、Caイオン
   では活性の熱安定性が増す。 (リ) 阻害剤の影響：カゼインを基質とした場合、
   EDTA（エチレンジアミン四酢酸）および
   PCMB（ｐ―クロロマーキユリー安息香酸）で
   は活性が阻害されないが、DFP（ジイソプロピ
   ルフルオロリン酸）およびPMSF（フエニルメ
   タンスルフオニルフルオリド）では活性が阻害
   される。 (ヌ) 界面活性剤の影響：PH11に調整した界面活性
   剤中で40℃にて１週間保存した場合、50％活性
   が残存する。 (ル) 分子量：40000（ゲル濾過法）。 (ヲ) 等電点：5.1（等電点電気泳動法）。