JPS62244382A - 新規プロモーター及び該プロモーターを用いた遺伝子発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えＤＮＮ性法よるＬ−１−リプトファン
の生産菌の分子育種や生理活性ペプチドの生産に応用可
能なコリネ型細菌の、さらに限定すればブレビバクテリ
ウムの、トリプトファンオペロン配列に関する。

本発明にいうコリネ型細菌（　Ｃ’ｏｒｙｎｅｆｏｒｍ
ｂａｃｔｅｒｉａ）は、パーシース・マニュアル・オブ
・デターミネイティブ・バタテリオロジ−（Ｂａｒｇｅ
ｙｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版５９９頁（１　９
　７　４）に定義されている一群の微生物であり、好気
性、ダラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を存しない桿菌
である。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述べ
るようなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本発明にお
いては、最も好ましいものである。

コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性株の例としては
次のようなものがあげられる。

ブレビバクテリウム・ディバリカタム へＴＣＣ　　１４０２０ フレビハクテリウム・ナソカロリティクムＡＴＣＣ１４
０６６ プレビハクテリウム・インマリオフィルムへＴＣＣ１４
０６８ フレビパクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ フ゛レビハクテリウム・ロゼラム　ＡＴＣＣ１３８２５
フレヒ゛バクテリウム・フラバム　ＡＴＣＣ１３８２６
ブレビハクテリウム・チオゲニタリス へＴＣＣ１９２４０ コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム八ＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミｎムＡＴＣＣ１５
８０６ コリネバクテリウム・カルナエ　八ＴＣＣ１５９９１コ
リ翠バクテリウム・グルタミン酸 ＡＴＣＣ１３０３２，１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム　ＡＴＣＣ１５９９０コ
リネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムへＴＣＣ１５
３５４ 本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には上記のよ
うなグルタミン酸生産性を有する野性株のほかにグルタ
ミン酸生産性を有するまたはグルタミン酸生産性を失っ
た変異株も含まれる。

ここでいうトリプトファンオペロンとは、プロモーター
、およびアテニュエーター、さらにリーダーペプチドを
コードする令頁域（ｔｒｐＬ）　、アンスラニル酸シン
ターゼ遺伝子（ｔｒｐＥ、　ｔｒｐＧ）、ホスホリボシ
ルアンスラニル酸トランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｐＤ
）　、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）アンスラニル酸イ
ンメラーゼーインドール−３−グリセロールリン酸シン
ターゼ遺伝子（ｔｒｐＣ）　、）リプトファンシンター
ゼ遺伝子（ｔｒｐＢ、　ｔｒｐＡ）の各構造遺伝子が隣
接して配置され、一つの転写単位として機能しているも
のをいう。

各構造遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌のトリプ
トファンオペロン、或いは、各構造遺伝子を有している
株より、まず染色体遺伝子を抽出しく例えば１１．５ａ
ｉｔｏ　ａｎｄに、Ｍｉｕｒａ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ。

胱ｔａ　　７２，６１９（１９６３）の方法が使用でき
る。）、これを適当な制限酵素で切断する。ついで微生
物細胞内で複製し得て、かつプロモーター活性をもつベ
クターに接続し、得られた組換えＤＮＡを用いて、コリ
ネ型細菌もしくはその他の微生物で、トリプトファン生
合成系の構造遺伝子が変異を受け、酵素が活性を失ない
、そのためにトリプトファン要求性を示すようになって
いる変異株を形質転換し、該酵素活性が回復、上界し、
トリプトファン要求性が消失する菌株を採取し、これよ
り該構造遺伝子をもつ複合プラスミドを分離できる。

このような方法でも、幸運にしてオペロン全域を’ｉ’
−ｇｌｌできる場合もあるが、もしもオペロン全域を単
離（クローン化）できなかった場合は、上述の方法によ
り分離した各構造遺伝子の一部もしくは全部をアイソト
−プ等でラベルしそれらをプローブにして、プラスミド
もしくはファージ−＼フタ−を用いて作成したコリネ型
細菌の染色体遺伝子のシーンバンクからコロニーハイブ
リダ・イゼイションにより、単離可能である。

染色体遺伝子を切断するには、切断反応時間等を調節し
て切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が使
用できる。

本発明のうちトリプトファンオペロンもしくはその１部
をトリプトファンの生産に使用する場合に用いるベクタ
ーは、コリネ型細菌細胞内もしくはＥ、Ｇｏｌｉ、　Ｂ
、５ｕｂＬｉｌｉｓにおいて増殖し得るものであればど
のようなものでも良い。具体的に例示すれば、以下のも
のがあげられる。

（１１ｐＡＭ　３３０　　特開昭５８−６７６９９参照
（２１ｐＡＭ　１５１９　　特開昭５８−７７８９５参
照（３）ｐＡＪ　６５５　　特開昭５８−１９２９００
参照（４）　ｐＡＪ　６１１　　同上 （５１１）ＡＪ　１８４４　　同上 （６）ｐＣＧ　１　　　特開昭５７−１３４５００参照
（７ｊ　　ｐＣＧ　２　　　特開昭５８−３５１９７参
照（８１ｐＣＧ４　　　特開昭５７−１８３７９９参照
（９１ｐｃｃ　１１　　　同上 （１０）　ｐＣＣ１特開　　　　（Ｍｒｉｕｔｉｎ／Ａ
ｊｉｃｏ）（１１）　ｐＢＬ　１００　　特開　　　　
（〜）（１２）ｐＢＲ３２２ （１３）　　ｐＣ１９４ ヘクターＤＮＡの開裂は、当該ＤＮＡを一箇所で切断す
る制限酵素を用いて切断するか、複数部位をりＪ　ＬＩ
Ｊｉする制限酵素を用いて部分的に切断するごとにより
行う。

ヘクターＤＮＡは、染色体遺伝子を切断した際に用いら
れた制限酵素により切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたヘクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続せしめて、ついでゲラスミ１゛ヘクターと染色体
ＤＮＡフラグメントとのライケーション反応に付される
。

このようにして得られた、染色体ＤＮＡとヘクターとの
組換えＤＮＡをコリネ型細菌に屈する受容菌へ’）、７
ｆ−人するには、エシェリヒア・コリに−１２について
報告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｉ
ｌｉｇａ。

八、、Ｊ、Ｍｏ１．、　Ｂｉｏｌ、、　５３．１５９（
１９７０）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮ
Ａの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスに
ついて報告されている様に（Ｄｕｎｃａｎ、Ｃ，Ｈ，、
Ｗｉｌｓｏｎ、Ｇ、八、　ａｎｄＹｏｕｎｇ、　Ｆ、Ｅ
、、　Ｇｅｎｅ、工、１５３（１９７７））　ｔ（Ｉｌ
胞が１）ＮＡを取り込み得る様になる増殖段階（いわゆ
るコンビテンＩ・セル）に尋人する方法により可能であ
る。

あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母
について知られている様に（Ｃｈａｎ［Ｘ、　Ｓ、　ａ
ｎｄＣｈｏｅｎ、　Ｓ、Ｎ、、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、
、Ｇｅｎｅｔ、、　３６８．１１１（１９７９）；Ｂｉ
ｂｂ、Ｍ、Ｊ、Ｊａｒｄ、Ｊ、Ｍ、　　ａｎｄ　　ｌｌ
ｏｐｗｏｏｄ、　　Ｏ，八、１Ｎａｔｕｒｅ、γ７４．
３９８＜１９７８）；Ｈｉｎｎｅｎ、Ａ、、ｌ１ｉｃｋ
ｓ、　　Ｊ、Ｂ。

ａｎｄ　　Ｆｒ１ｎｋ、Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ
、Δｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、ヱ互１９２９（１９７８
））　、ＤＮＡ受容菌を、プラスミＦ’ＤＮへを容易に
取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストにして
組換えＤＮＡ受容菌に導入することも可能である。

プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得るとかで
きるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリネ
バクテリウム屈またはブレビバクテリウム属のプロトプ
ラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルアル
コールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをとり込ま
せる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコールま
たはポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、フィコール、プルロニック
Ｆ６８　（セルバ社）などの添加によってＯＮへのとり
込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。

クローニングしたトリプトファンオペロン、或いは各構
造遺伝子を用いてトリプトファン生産菌の分子育種を行
うには、遺伝子のクローニングの際に用いたトリプトフ
ァン要求性の変異株を宿主として形質転換した株を用い
ることができるが、以下に示すような宿主を用いればよ
りトリプトファンの生産性が高い菌株が得られることが
ある。

ブレビバクテリウム屈のフェニルアラニン、チロシンを
要求し、５−メチルトリプトファンに耐性を打する変異
株（１，５ｈｉｉｏ、１１．５ａｔｏ、Ｍ、Ｎａｋａｇ
ａｗａ、。

Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　３６．２３１５
（１９７２））、ブレビバクテリウム屈のフェニルアラ
ニンを要求し、ｍ−フルオロフェニルアラニン、５−フ
ルオロトリプトファンに耐性を有する変異株（ｒ、５ｈ
ｉｉｏ、　Ｓ。

Ｓｕｇｉｍｏｔｏ、Ｍ、Ｎａｋａｇａｗａ、、Ａｇｒｉ
ｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍｉ、、　３９＋６２７　（１９
７５）　）、ブレビバクテリウム属のチロシンを要求し
、５−フルオロトリプトファン、アザ′セリンに耐性を
有する変異株、コリネバクテリウム属のフェニルアラニ
ン、チロシンを要求し、５−メチルトリプトファン、４
−メチルトリプトファン、６−フルオルトリプトファン
、トリブトファンヒドロキサメー１−１ｐ−フルオロフ
ェニルアラニン、チロシンヒドロキサメート、フェニル
アラニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株（Ｉｌ
、Ｈａｇｉｎｏ。

に、Ｎａｋａｇａｗａ、＋へ５ｒｉｃ、Ｂｉｏ１．Ｃｈ
ｅｍ、、　　３９．３４５（１９７５））等がある。

このようにして得られたトリプトファン生産能を有する
コリネ型細菌を培養してトリプトファンを生成蓄積せし
める方法は、従来コリネ型細菌によるトリプトファンの
製造のために使用されていた方法と特に大きく違う点は
ない。即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオ
ン、更に必要に応しアミノ酸、ビタミン等の有機Ｅａｆ
ｆｌ栄養素を含有する通常のものである。炭素源として
は、グルコース、シュクロース、ラクトース等及びこれ
らを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、θｇ蜜等が用い
られる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩その他が使用できる。

培養ば好気的条件下で培地のρ１１及び温度を適宜３Ｊ
！ＩＩ節しつつ、実質的にトリプト７７フの生産蓄積が
停止するまで行なわれる。

トリプトファン生産菌の分子育種に加え、さらに、本発
明によって得られるもう一つの大きな利点は、ブレビバ
クテリウムのトリプトファンオペロンのプロモーターが
Ｅ、ｃｏｌｉのトリプトファンオペロン い活１にを有し、かつその末尾の構造から予測されろ様
に強いターミネータ−を有しており、またコリ名ホルム
型細菌内においてトリプトファンにより発現調節を受け
るオペレーターを存していることである。Ｅ．ｃｏｌｉ
での異種遺伝子例えば、インク−フェリン、成長ホルモ
ン、インターロイキン、神経成長因子、或いはその他生
理活性ポリペプチド又は酵素等の発現又は異種蛋白の過
剰生産においては、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌ−リブトファンプ
ロモーター、オペレーター、及びターミネーターが繁用
されている。即ち、本発明によって得られたトリプトフ
ァンオペロンは、コリネホルム型細菌におけるし一トリ
プトファン生産菌の分子育種を勿論促進するが、さらに
Ｅ．ｃｏｌｉ系、或いは他のコリネボルム型細菌におけ
る遺伝子の強力な発現、及びその調節を行い得るプロモ
ーター、オペレーター、及ヒ、ターミネータ−を有する
ものであり、このＤＮＡ配列を用いて上記の異種遺伝子
を強力に発現し、過剰生産することが可能である。

また、本発明のＤＮＡ配列のうち、遺伝子の発現に関与
する部分であるプロモーター領域、オペレーター領域、
アテニュエーター領域ならびにリポソーム結合領域の塩
基配列、及びターミネータ−領域の塩基配列を各々単独
で、或いはいずれかを組合わせた形で（取り出して）使
用する場合、あるいは、各酵素の構造遺伝子の塩基配列
について、コードされたアミノ酸配列が異ならないよう
に置換して得たＤＮＡ配列も、更にいえば、本発明のＤ
ＮＡ配列の任意の部分の塩基を他のものと置換したり、
新たに塩基を挿入したり、又は削除した場合、或いは、
塩基配列の一部を転位させた場合に得られる誘４体およ
びそれにコードされるアミノ酸配列の蛋白も、いずれも
遺伝子の発現及びＬ−トリプトファン 与えるものと想定され、主要部分を本発明に依存する技
術として本発明の範囲に入るものである。

以下、具体例によって本発明のＤＮＡ配列を含むプレヒ
バクテリウムラクトフェルメンタＪ、のトップ１−ファ
ンオペロンの取得方法、及び本発明のＤＮＡの塩基配列
の決定とアミノ酸配列の決定、並びに本発明のＯＮ八を
用いて形質転換して得られるコリネ型綱菌によるＬ−１
−リプトファンの生産およびプロモーター、オペレータ
ーについて説明す実施例１。

アンスラニル酸シンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアン
スラニル酸トランスフェラーゼ遺伝子、トリプトファン
シンターゼβサブユニツト遺伝子のクローニング １−１ブレビバクテリウムラクトフエルメンタムのトリ
プトファンオペロンを含む染色体ＤＮＡの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム＾Ｊ１１２
２５（ＦＩＥＲＭ−Ｐ４３７０）を１βのＣＩ′ｌＧ培
地（ペプトン１ｇ／ｄ１、酵母エキスＩｇ／ｄ１、グル
コース０、５ｇ／ｄ１、及びＮａＣ６　０．　５　ｇ　
／　ｄｉを含み、ｐＨ７、２に調整したもの）に植菌し
、３０°Ｃで約３時間振盪培養を行ない、対数増殖期の
菌体を集めた。

この菌体をリゾチーム・ＳＯＳで溶菌させたのち、通常
のフェノール処理法により、染色体ＤＮＡを抽出精製し
、最終的に３．　５　ｍｇのＤＮＡを得た。

１−２ベクターＯＮへの調製 ベクターとしてρ＾Ｊ１８４／ｌ　　（分子１５．４メ
ガダルトン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製し
た。

まず面封８４４をプラスミ１′として保有するブレヒ゛
ハクテリウｌ、・ラクトノェルシメンタム八月２０３７
を１００ｍ１のＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増殖
！ＩＪｌ後ル１まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処
理により溶菌させ、３０．０００Ｘ　ｇ、　　３０分の
超遠心により上清を得た。フェノール処理ののち、２容
のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱回収した。これを少
量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸塩、２０ｍＭ　
ｈｌ！、　　１ｍＭ　［ＥＤＴＡ　　（ｐＨ８，０）　
）に溶解後、塩化セシウムーエヂジウムブロミド密度勾
配平衡遠心によりプラスミド画分を分離し、最終的にｐ
ＡＪ　１８４４プラスミドＤＮＡ約２００μｇを得た。

Ｌａ　Ｓ包体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入１−１で得
た染色体ＤＮＡｌ０μｇと１−２で得たブラスミｌ”Ｄ
ＮＡ　５μｇとを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ　　Ｉ
でそれぞれを３７℃に１時間保持し、切断した。６５°
Ｃに１０分間加熱した後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及
びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮ
＾リガーゼによって１０℃に２４時間保持しＤＮＡ鎖を
連結せしめた。ついで反応液を、６５°Ｃにて５分間加
熱し、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結された
ＤＮＡの沈澱を採取した。

１−４アンスラニル酸シンクーゼ遺伝子、ホスホリボシ
ルアンスラニル酸トランスフェラーゼ遺伝子、及びトリ
プトファンシンターゼβサブユニツト遺伝子のクローニ
ング ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのアンスラニ
ル酸シンターゼ欠損株ＡＳ６０、ホスホリボシルアンス
ラニル酸トランスフェラーゼ欠損株Ｎｃ３８、トリプト
ファンシンターゼβサブユニット欠損株１１ｋＬ３０　
（いずれも＾Ｊ１２１２５を親株とし、Ｎ−メチル−Ｎ
−ニトロ−Ｎ−二１−口ソグアニジンにより変異処理す
ることにより分離した）をＤＮＡ受容菌として用いた。

形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５ｍｌのＣＭＧ
液体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧ
を０゜６ユニソト７ｍｌ添加後、さらに１．５時間振盪
培養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５　Ｍ
シュークロース、２０叶マレイン酸、２０ｍＭ塩化マグ
ネシウム、３．５％ベナ・７セイブロス（Ｄｉｒｃｏ）
からなるＳＭＭＰ培地（ｐｌ＋　６．５　）０．５ｍｆ
ｆで洗浄した。次いでＬｏｍｇ／ｍＡのりゾチームを含
むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロ１〜プラ
スト化を図った。６０００ｘｇ、１０分間遠心分ｘｔｔ
　１＆、プロトプラストをＳＭＭＰで洗浄し０．５ｍ／
、のＳ）ＩＭＰに再度懸濁した。この様にして得られた
プロトプラスト を５ｍＭＥＤＴＡ存在下で混合し、ポリエチレングリコ
ールを最終濃度が３０％になる様に添加した後、ＤＮＡ
をプロトプラストに取り込ませるために室温に２分間放
置した。このプロトプラストをＳＭＭｆ’培地１　　ｍ
ｅで洗浄後、ＳＭＭＰ培地１　ｍ（ｌに再懸濁し、形質
発現のため、３０″Ｃで２時間培養した。この培養液を
ｐｌ＋７．０のプロトプラスト再生培地上に塗布した。

プロトプラスト再生培地は蒸留水１１あたり１−リス（
ヒドロキシメチル）アミノメタン１　２　ｇ，　Ｘ（１
　０．５　ｇ，グルコース１０ｇ１ＭｇＣＡｚ・６ｔｌ
ｚＯ　８．１　ｇ，　　ＣａＣｊｌ！ｚ・２Ｈｚ０　２
．２　ｇ、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミ
ノ酸（Ｄ　ｉ　ｆ　ｃｏ社）　　１　ｇ　、　Ｋ２ＨＰ
Ｏ４．０．　２　ｇ、コハク酸ナトリウム１３５ｇ、寒
天８ｇ及びクロラムフェニコール３μｇ７ｍ　Ｉ！を含
む。

３０℃で２週間培養後、各受容菌について各々＆’］２
５０００　個のクロラムフェニコール耐性コロニーが出
現してきたのでこれを最少培地（２％グルコース、１％
硫酸アンモニウム、０．３％尿素、０．１％りん酸二水
素カリウム、０．０４％硫酸マグネシウム７水塩、２　
ｐｐｍ鉄イオン、２　ｐｐｍマンガンイオン、２００μ
ｇ／ｌサイアミン塩酸塩、５０℃ｇ／ｌビオチン、カザ
ミノ酸（Ｄｉｒｃｏ）　　３　ｇ　／　７！、クロラム
フェニコール１０μｇ　／ｌｎ　（１　、ｐＨ７、　Ｏ
　、寒天１、８％）にレプリカし、クロラムフェニコー
ル耐性でかつトリプトファン要求性の消失した株をＡＳ
６０を用いた区分から２株、ｌｌｈ　３’　８を用いた
区分から１株、寛３０を用いた区分から１株得た。

上記５株からプラスミドを抽出したところ、いずれのプ
ラスミドもヘクタープラスミドｐＡＪ１８４４よりも明
らかに大きく、ＡＳ６０を用いた区分から得た、キ且Ｉ
Ｍえブレスミ１′をｐｔｒｐｌＥ３６　、ｐＬｒｐ［ｉ
４、阻３８を用いた区分から得た組換えプラスミドをｐ
ｔｒｐ０３８５１゜Ｎｏ、３０を用いた区分から得た３
■換えプラスミドをｐＬｒｐＢ３０１と名付けた。

１−５７ｆ￥形質転換 １４で得た組換えプラスミドｐｔｒｐ［ｉ３６　、ｐむ
ｒｐＥ４、ｐｔ、ｒｐＤ３８５１　、ｐｔｒｐＢ３０１
上に各々アンスラニル酸シンターゼ遺伝子、ホスホリボ
シルアンスラニル酸トランスフェラーゼ遺伝子、トリプ
トファンシンターゼβザブユニット遺伝子が存在するこ
とを確認するため、ｐｔｒｐＥ３６　、ｐｔｒｐＥ４を
ＡＳ６０に、ｐｔｒｐｌ）３８５１を階３８に、ｐｔｒ
ｐＢ３０１をＮＯ，３０に再度形質１１云喚した。

化したクロラムフェニルコール耐性コロニーのうぢそれ
ぞれ１０個を釣り上げ、トリプトファン要求性を調べた
。その結果、いずれもが要求性を消失しており、ｐＬｒ
ｐＨ３６、ｐｔｒｐＥ４、にはアンスラニル酸シンター
ゼ遺伝子が、ｐｔｒｐＤ３８５１には、ホスホリボシル
アンスラニル酸トランスフェラーゼ遺伝子が、ｐ　ｔｒ
ｐＢ３０１にはトリプトファンシンターセβナブユニソ
ト遺伝子が存在することが明らかになった。ただしｐｔ
ｒｐＥ４の形質転換株では栄養要求性の消失の程度、及
び最少培地上でのアンスラニル酸の蓄積がｐ　ｔｒｐＥ
３６の形質転換株に比較して悪（、ｐｔｒｐＥ４にはア
ンスラニル酸シンターゼの遺伝子の一部が欠けているの
ではないかと示唆された。

１−６　Ｍｌ換えプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の制限酵
素地図の作製 実施例１−２で用いた方法により組換えプラスミドｐＬ
ｒｐＥ３６　　、ｐｔｒｐ［Ｅ４、ｐｔｒｐＤ３８５１
　　、ｐｔｒｐＢ３０１を３周製し、常法に従い各種制
限酵素で切断し挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を作製し
た（第１図）。

実施例２゜ ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのトリプトフ
ァンオペロン ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＡＪ１１２２
５から自然突然変異により分離した５−フルオロトリプ
トファン抵抗性のＩｌｈ１０４１（＋・リフトファンに
よるアンスラニル酸シンターゼのフィードバック阻害が
解除した株）から実施例１で示した方法により染色体Ｄ
ＮＡを調製し、制限酵素Ｂａｍｌｌｌ或いはＳａｉｌ、
又はＸｈｏｌで完全に切断し、Ｅ．ｃｏｌｉのベクター
ｐＬＪ（、１８（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．、ｅｔ　ａｌ．
、Ｇｅｎｅ。

■，１０３ー］．Ｌ９（１９８５））の各制限酵素切断
部位に連結し、［ｉ．ｃｏｌｉ　Ｊ旧０９（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ，Ｊ．、ｅｔ　ａｌ．＋Ｇｅｎｅ＋３３＋１０３−
１１９（１９８５））を形質転換し、Ｘ−Ｇａｌ　（５
−ｂｒｏｍｏ−４ｃｈｌｏｒｏ−３−　ｉｎｄｏｌｙ＋
−　β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）　、　ＩＰＴＧ（ｉ
　Ｓｏｐｒｏｐｙ　’ーβーＤーｔｈｉｏーｇａｌａｃ
ｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、アンピシリンを含むし寒
天培地にブレーティングした。３７℃で２４時間培養後
出現した白色コロニー合計約１５００コロニーを二ｌ・
ロセルロースフィルター上に釣り上げた。実施例１で得
たアンスラニル酸シンターゼ遺伝子（ｔｒｐ［ｉ）を有
するｐ　ｔｒｐＥ３６の１．２ｋｂ．のＰｓｔＩ挿入断
片をプローブにして、コロニーハイブリダイゼイション
（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ。

Ｍ．、Ｗａｌｌｓ，Ｊ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉｉ
ｎｚｙｍｏｌｏＢｙ，飢．３７９、Δｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９）
）を行ない制御Ｋ１１酵素ＢａｍＨ　Ｉを用した区分か
ら１つ、制限酵素Ｓａｌｌを使用した区分から１つのポ
ジティブクローンを得た。［ｌａｍＨ　１区分から得た
組換えプラスミドをｐｔｒｐＥ９７　、Ｓａ１１区分か
ら得たプラスミドをｐｔｒｐＥ４２と名付け、実施例１
で示した方法に挿入ｐｔｒｐＢ３０１の挿入Ｐｓｔｌ断
片と同じ制限酵素地図を有限酵素地図を有していること
が明らかとなった。

又、ｐ　ｔｒｐＥ９７とｐｔｒｐＥ４２は共通のＢａｍ
）ＩＩ−Ｓａｌｌ断片を有していた。

実施例３ Ｎ−（５−ホスホリポシル）アンスラニル酸インメラー
ゼーインドール−３−グリセロールリン酸シンターゼ遺
伝子（ｔｒｐｃ）のサブクローニング及びトリプトファ
ンシンターゼのサブユニット遺伝子（　ｔｒｐＡ）のサ
ブクローニング第１図の組換えプラスミドの挿入ＤＮＡ
断片の制限酵素地図の比較からｔｒｐＤ遺伝子とｔｒｐ
Ｂ遺伝子の間にｔｒｐＣ遺伝子が、ｔｒｐＢ遺伝子の下
流にｔｒｐＡ遺伝子が存在するのでばないかと考えられ
ていた。そこで各遺伝子の存在を確認するため以下の実
験を行った。

３−１　ｔｒｐｃｌ伝子のザブクローニング組換えプラ
スミドｐ　ｔｒｐＥ９７から第１図に示した約２　ｋｂ
、のＳｓｔ［−１ＥｃｏＲＩ断片を分画し、５ｓｔｌ、
ＥｃｏＲＩで切断したｐＬＩＣ１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ、
Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、　３３゜１０３−１！
９．１９８５）に連結し、圏虹プロモーターからの転写
が可能になるように配置した。或いは第１図の約２．６
ｋｂ、の５ｓｔｌ−１１ｉｎｄ　ｍ断片を分画しＳｓ口
。

ｔｌｉｎｄｌＩＩで切断したｐＵｃｌＢ（Ｍｅｓｓｉｎ
Ｂ、Ｊ、、ａｔ　ａｌ、＋Ｇｅｎｅ。

η、　１０３−１１９．１９８５））に連結し、ｈ虹プ
ロモーターからの転写が可能になるように配置し、Ｅ、
ｃｏｌｉ結果、５ｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ断片、或いは５ｓ
ｊｌ暑ｆｉｎｄ　Ｕｉ断片を有する組換えプラスミドは
、ＩＥ、ｃｏｌｉの要求性を消失させた。

３−２　ｔｒｐＡ遺伝子の存在の確認 組換えプラスミドｐ　ｔｒｐＥ９７から第１図に示した
約２．４ｋｂ、のＮｒｕｒ−ｎａｍｌｌＴ断片を分画し
、Ｓｍａ　ｌ　。

［１ａｍｌｌ＋で切断したｐＵ（，１８に連結し、Ｉａ
ｃプロモーターからの転写が可能になるように配置し、
ε、ｃｏｌｉ　　　ＣＧＳＣＮｏ、５６４４　　　（ｔ
ｒｐ八３へ＋　　　ｒｈａ−Ｌ　　　λ　−）　　を形
質転換した。その結果、Ｎｒｕｌ−ｔｌａｍｌｌｌ断片
を存する組換えプラスミドを保持する形質転換株では、
トリジ１〜フアン要求性の消失が認められた。

実施例４゜ トリプトファンオペロンの塩基配列の決定実施例１で得
られたｐｔｒｐＥ３６　、ｐｔｒｐＤ３８５１、ｐｔｒ
ｐＢ３０１及び実施例２で得られたｐｔｒｐＥ９７を有
する形質転換株から各々プラスミドの調製を行った。

各々のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片について、ＵＣｌ３
或いはｐＵ（，１９又は旧３ｍｐｌＯ（Ｍｅｓｓｉｎｇ
、Ｊ、ａｎｄ　Ｖｉｃｉｒａ。

Ｊ、、　Ｇｅｎす、９．２６９（１９８２））を用いる
ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法
（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、ｅＬ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７４．５４６３（１９７７）
）により第２図に示した塩基配列決定のための戦略図に
よって、１−リブトファンオペロン全塩基配列を決定し
た。その結果、次に示すＤＮＡ塩基配列が得られ、この
塩基配列はブレビバクテリウムラクトフェルメンタムの
トリプトファンオペロンの発現に必要なＲＮＡポリメラ
ーゼの結合部位（ｔｒｐプロモーター）、リボゾームの
結合部位、アンスラニル酸シンクーゼ遺伝子（ｊｒｐｌ
Ｅ、　ｔｒｐＧ）　、ホスホリボシルアンスラニル酸ト
ランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｐＤ）、Ｎ−（５−ホス
ホリボシル）アンスラニル酸イソメラーゼーインドール
−３−グリセロールリン酸シンターゼ遺伝子（ｔｒｐＣ
）、トリプトファンシンターゼ遺伝子（ｔｒｐＨ，ｔｒ
ｐＡ）に対応するＤＮＡ配列、及び停止配列（ターミネ
ータ−）を含むことが判明した。

又、プロモーターとｔｒｐＥ構造遺伝子との間は、転写
レベルでの発現調節機構であるリプレッジ：ｊンに関与
するオペレーター領域及び翻訳レベルでの発現調節機構
アテニュエーションに関与するリーダーペブヂド（ｔｒ
ｐＬ）をコードする領域とアテニュエータ一様構造が存
在する領域が存在すると推定された（第３図）。ターミ
ネーターの構造は第６図に示した。

実施例５゜ プロモーターの単離と活性確認 塩基配列の決定の結果、推定されたトリプトファンオペ
ロンのプロモーターを単離し、その機能を確認するため
、第４図に示したように、ｐｔｒｐＥ９７、或いはｐｔ
ｒｐＥ３６のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片（約５
５０ｂｐ、）をＥ、ｃｏｌｉのプロモータープローブベ
クターｐｋｋ＋’７５−６　（７ンビシリン耐性（Ａｐ
）、テトラサイクリン（Ｔｃ）感受性）（Ｂｒｏｓｉｕ
ｓ、Ｊ、、Ｇｅｎｅ　２７，１５Ｈ１９８４））にサブ
クローンした。得られた組換えプラスミドｐｔｒｐＰＯ
１はＥ、ｃｏｌｉ中でＴｃ耐性を発現した。

さらに、９４Ｍ３３０　　由来のトリフ１〜プリム耐性
のベクター、ｐＡＪ２２６のＰｓｔＴ切断部位にＰｓｔ
ｌで切断した上記組換えプラスミドｐｔｒｐＰＯ１を連
結し、ブレビバクテリウムＡＪ１１２２５を形質転換し
たところＴｃ耐性の発現が認められた。この組換えプラ
スミドｐｔｒρＰＯ２を有する形質転換株のＴｃ耐性度
は第１表に示したように、Ｔｒｐ、存在下ではＴｃに対
する感受性が増した。従ってこの領域には、プロモータ
ーとオペレーターが存在すると考えられる。

次にプロモーター領域をさらに限定するため、その結果
Ａｌｕｌ−１１ｉｎｄ　’Ｍ断片（５１ｂＰ、）及び１
ｌａｅｌ−１１ｉｎｄ　ＩＩＩ　（１３５ｂｐ）上にプ
ロモーターが存在することが明らかとなった。同様の結
果をＥ、ｃｏｌｉのプロモーターブローブヘクターｐＫ
Ｋ２３２−８（Ａｐ耐性、クロラムフェニコール感受性
）を用いて得ており、Ａｌｕｌ−１１ｉｎｄｌＩＩ断片
（５１ｂｐ、）上にプロモーターが存在することを確認
した。

実施例６゜ ホスホリボシルアンスラニル酸１−ランスフェラーゼ遺
伝子（ｔｒｐＤ）、Ｎ−（５−ホスホリボシル）アンス
ラニル酸イソメラーゼーインドール−３−グリセロール
リン酸シンターゼ遺伝子（ＬｒｐＣ）　、ｌ・リプトフ
ァンシンターゼ遺伝子（ｔｒｐＨ，ｔｒｐＡ）の増幅に
よるトリプトファン生産菌の育種。

クローニングしたプレビバクテリウムラクトフェルメン
タムトリプトファンオベロンのうちｔｒｐＤ。

ｔｒｐＣ＋　ｔｒｐＢ、　ｔｒｐＡの４遺伝子を有する
ｍ喚えプラスミＩ・ｐＡＪ２３４を用いて、Ｌ−トリプ
トファン生産について検討した。

ｐＡＪ２３４ヲ用い、ｍ−フルオロフェニルアラニンベ
だ方法により形質転換し、クロラムフェニコール耐性を
指標として形質転換株を選択した。かくして得られた八
Ｊ１２１９５　（ＦＥＲＭ−Ｐ４Ｏ１０）を培養し、ト
リプトファン生産能を調べたところ第２表に示す結果を
得た。

培養はトリプトファン生産培地（グルコース１３０　ｇ
　、　（Ｎｌ１４．）ｚｓＯａ　　２５　ｇ、フマル酸
１２ｇ。

酢酸３ｍｌ、ＫＨｚＰ０４１　ｇ　、　Ｍｎ５Ｏａ　’
　７１１ｚＯ１０ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７１１□Ｏ１ｇ、
ｄ−ビオチン５０μｇ１サイア）ン塩酸塩２０００μｇ
、メチオニン４００■、チＩｌｌシン６５０ｍｇ、大豆
蛋白酸加水分解液「味液」５０　ｍ１２、ＣａＣ０：＋
　５０　ｇを水１βに含む、ｐｌ＋６．５゜）２０ｍｆ
ｆを５００ｍｊ＋の坂ロフラスコに入れたものに被検菌
株を植えつけ、３０°Ｃにて７２時間、振盪下に行なっ
た。培養後、遠心上清中のＬ−１リプトフアンをロイコ
ノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏ
ｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）八ＴＣＣ８０４２を
定量菌株として用いるバイオアッセイ法によって求めた
。

第２表　形質転換株のＬ　−トＩＪブトファン蓄積量尚
、Ｍ２４７を得るためには寄託されたＡＪ　１２１９５
より宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合プラスミ
ドを除去することが可能である。即ち、プラスミドは宿
主より自然に失なわれることもあるし、「除去」操作に
よって除くこともできる（Ｂａｃｔ、Ｒｅｖ、、　３６
．ｐ３（ｉ！−４０５（１９７２））。他の除去操作の
例は以下の通りである。ＡＪ　１２１９５をＣＭＧ液体
液体１定地種し、３７℃で一晩培養（高温処理）後、培
養液を適当に希釈し、クロラムフェニコールを含有し又
は含有しないＣＭＧ寒天培地に塗布し、フェニコール感
受性様として分離される１株がＭ２４７である。

【図面の簡単な説明】

第１図 ＡＭ　＋Ａえプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地
図 第２図 ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのトリプトフ
ァンオペロン の戦略図 種々の制限酵素で切断したＤＮＡ断片をｐＵ（、１８　
。 ｐＬＩｃｌ　９或いは旧３ｍｐｌＯにクローン化し、矢
印で示した方向へ、ｄｉｄｅｏｘｙ法により塩基配列を
決定した 第３図 ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのトリプトフ
ァンオペロン −ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのＬｒｐＥ
構造遺伝子の５′上流域の塩基配列並びに推定されるア
ミノ酸配列、及び、予想されるＲＮへの２次構造− 第４図 ブレビバクテリウムラクトフェルメンタｌ、のトリプト
ファンオペロンの構造とプロモーター、オペレーター領
域の単離、同定のための戦略第５図 ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのトリプトフ
ァンオペロンの構造とプロモーター、オペレーター領域
の限定のための戦略 −３５及び−１０は［Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーターコン
センサス配列の−３５、及び−１０Ｔｆ４域に相当する
領域を示す 第６図 ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのトリプトフ
ァンオペロンのターミネータ−の構造

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ｍ−ＲＮＡの合成をコントロールするオペレーター
   領域、ｍ−ＲＮＡの合成をコントロールするプロモータ
   ー領域、ｍ−ＲＮＡの合成をコントロールするアテニュ
   エーター領域、蛋白合成に必要なリボゾームとｍ−ＲＮ
   Ａとの結合領域、リーダーペプチドをコードする領域、
   トリプトファン合成系の酵素群をコードする領域及び最
   後にｍ−ＲＮＡの合成を停止させるシグナルを形成する
   ターミネーター領域が含まれる下記第一式に示される配
   列よりなるＤＮＡ第１式 【遺伝子配列があります】 ２）特許請求の範囲第１項記載の各種領域よりなる群か
   ら選ばれる１以上よりなるＤＮＡ。 ３）ＤＮＡが人工的に合成されたＤＮＡ又は微生物に由
   来するＤＮＡである特許請求の範囲第１項又は第２項記
   載のＤＮＡ。 ４）微生物がコリネ型細菌である特許請求の範囲第３項
   記載のＤＮＡ。 ５）微生物がブレビバクテリウム属に属する微生物であ
   る特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ。 ６）微生物がブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
   ムに属する微生物である特許請求の範囲第３項記載のＤ
   ＮＡ。 ７）ＤＮＡが１部置換、変異又は削除されたＤＮＡであ
   る特許請求の範囲第１項ないし第６項記載のＤＮＡ。 ８）ＤＮＡがプラスミド又はファージ由来のベクターに
   組込まれたＤＮＡである特許請求の範囲第１項ないし第
   ７項記載のＤＮＡ。 ９）特許請求の範囲第２およびまたは８項記載のＤＮＡ
   を用いるＬ−トリプトファンの製造法。 １０）下記第２式ないし第７式のアミノ酸配列をもつペ
   プチド又は蛋白（第２式ないし第７式中Ａアラニン、Ｃ
   システイン、Ｄアスパラギン酸、Ｅグルタミン酸、Ｆフ
   ェニルアラニン、Ｇグリシン、Ｈヒスチジン、Ｉイソロ
   イシン、Ｋリジン、Ｌロイシン、Ｍメチオニン、Ｎアス
   パラギン、Ｐプロリン、Ｑグルタミン、Ｒアルギニン、
   Ｓセリン、Ｔスレオニン、Ｖバリン、Ｗトリプトファン
   、Ｙチロシンを示す。 なお、第２式はトリプＥ酵素、第３式はトリプＧ酵素、
   第４式はトリプＤ酵素、第５式はトリプＣ酵素、第６式
   はトリプＢ酵素、第７式はトリプＡ酵素のアミノ酸配列
   を示す。）。 第２式 【アミノ酸配列があります】 第３式 【アミノ酸配列があります】 第４式 【アミノ酸配列があります】 第５式 【アミノ酸配列があります】 第６式 【アミノ酸配列があります】 第７式 【アミノ酸配列があります】 １１）アミノ酸配列が１部置換、変異、又は削除された
   アミノ酸配列である特許請求の範囲第１０項記載のペプ
   チド又は蛋白。 １２）特許請求の範囲第１０項ないし第１１項記載のペ
   プチド又は蛋白をコードするＤＮＡ。 １３）特許請求の範囲第１項及び又は第７項記載のプロ
   モーター領域の配列を有するＤＮＡを用いる遺伝子発現
   法。 １４）特許請求の範囲第１項及び又は第７項記載のオペ
   レーター領域の配列を有するＤＮＡを用いる遺伝子発現
   法。 １５）特許請求の範囲第１項及び又は第７項記載のアテ
   ニュエーターおよび、またはリーダーペプチド領域の配
   列を有するＤＮＡを用いる遺伝子発現法。 １６）特許請求の範囲第１項及び又は第７項記載のター
   ミネーター領域の配列を有するＤＮＡを用いる遺伝子発
   現法。