JPS62175198A - アリルスルフアタ−ゼ活性測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はアリルスルファターゼ活性測定用の試薬に関す
るものである。体液中のアリルスルファターゼ活性の測
定は、異染性白質変性症の診断及び経過観察に有用な情
報を与えるものとして臨床意義か高い。

（従来の技術） 従来、アリルスルファターゼ活性はｐ−ニトロフェノー
ルの硫酸エステル（ｆ）−二トロフェニル硫酸）を基質
としてアリルスルフ７ターゼを作用させ、遊離してくる
ｐ−ニトロフェノールをアルカリ性下で比色する方法が
用いられていた。

ところが、ｐ−ニトロフェノールを用いた方法では目的
とする酵素、アリルスルフ７ターゼＡ。

Ｂの至適ｐＨが酸性域に存在し、発色基であるｐ−ニト
ロフェノールの発色（ｐＨ９以上）ｐｌｌと異なる為に
アリルスルフ７ターゼＡ、Ｂを測定する為には酵素反応
と発色反応を別々に行なう必要がある。その為に試薬数
及び操作ステップが多く必要となり、酵素活性を求める
場合に一番適当であるといわれている速度分析（レート
アッセイ）法か出来ない欠点がある。

（発明の解決しようとする問題点） 本発明の目的は定量性に優れたアリルスルフ７ターゼの
レートアッセイが可能となる活性測定試薬を提供すると
とである。

（問題点を解決する為の手段） 本発明者らは、」二足目的を達成するために種々鋭意検
討したところ、一般式（Ｉ）で示される基質を用いるこ
とにより体液中のアリルスルフ７ターゼ活性を短時間に
正確簡単にレートアッセイ出来ることを見い出し本発明
に到達した。

すなわち、本発明は基質として下記一般式（Ｉ）で示さ
れる化合物又はその塩を使用するととを特徴とするアリ
ルスルファターゼ活性測定試薬である。

（Ｎｏ、　’）　’１ （Ｒ）　ｎ （式中、Ｘはハロゲン、Ｒは水酸基、カルボキシル基、
炭素原子数１〜３のアルキル基を示す。ｇは１〜４の数
、ｍは１〜４の数、ｎは０〜３の数を示し、ρ→−ｒｎ
十ｎ＝５である。）本発明に用いる基質としては一般式
（Ｉ）で示される化合物、すなわち硫酸の１つの水酸基
かハ１１ゲンおよびニトロ基で置換されたフェニル基と
結合したものである。ハロゲンおよびニトロ基置換フェ
ニル基としては解裂したアグリコンか基質となったスペ
クトル吸収を示すものである。

解裂したアグリコンとは具体的には−・般式：％式％） ＣＸｚＱ、ｍは前記のものと同じ） で示されるフェノール誘導体である。

例えば、　２−クロロ−４−ニトロフェノール、２−ブ
ロモ−４−二トロフェノール、２−ヨード−４−二トロ
フェノール、２，６−シクロロー、１−ニトロフェノー
ル、２．６−シプロモー４−二トロフェノール、２．６
−ジヨードー４−二トロフェノール、２，３．［−）リ
クロロー４−二トロフェノール、２，３．６−）リブロ
モー４−ニトロフェノール、２．３．６−）リョードー
４−二トロフェノール、２．４−ジニトロ−６−クロロ
フェノール、２−ヒドロキシ−３−クロロ−５−二トロ
フェノール、２−ヒドロキシ−３−ブロモ−５−二トロ
フェノール、２−ヒドロキシ−３−ヨード−５−二トロ
フェノール、２−ヒドロキシ−４−クロロ−５−二トロ
フェ７−ル、２−ヒドロキシ−４−ブロモ−５−二トロ
フェノール、２−ヒドロキシ−４−ヨード−５−二トロ
フェノール、２−クロｌ−１−３−＝）ｌ−ｊ−６−Ｌ
　ｌ’ロキシフェノール、２−ブロモ−３−二トロ＝６
−ヒトロキシーフエノール、２−ヨード−ニトロ−６−
ヒドロキシ−フェノール、２−クロロ−４−ニトロ−６
−ヒトロキシーフエノール、２−ブロモ−４−二トロー
６−ヒトロキシーフエノール、２−ヨード−４−二トロ
ー６−ヒトロキシーフエノール、２−ヒドロキシ−４−
二トロー５−り四ロフェノール、２−ヒドロキシ−４−
二トローブロモフェノール、２−ヒドロキシ−４−二ト
ロー５−ヨードフェノール、２−ヒドロキシ−３−クロ
ロ−４−二トロフェノール、２−ヒドロキシ−３−ブロ
モー４−二トロフェノール、２−ヒドロキシ−３−ヨー
ド−４−二トロフェノール、２−クロロ−４−二トロー
６−メチルフェノール、２−−１ｉ’ロモー４−二トロ
ー６−メチルフェノール、２−ヨード−４−二トロー６
−メチルフェノール等があげられる。

これらの基質の合成方法は、例えばハロゲン置換のｐ−
ニトロフェノールにクロルスルホン酸を反応させて水酸
化カリウム水溶液を加えて中和して目的基質を得る方法
がある（実験化学講座、２４、生物化学■）。

一般式（Ｌ）で示される化合物の塩としては、ロートリ
ウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マ
グネシウムなどのアルカリ土類金属塩あるいはアンモニ
ウム塩などがある。

本発明の試薬のｐＨは体液中のアリルスルフ７ターゼＡ
Ｉ　Ｂの至適ｐｌ−１であるｐＨ５，０〜６．０を保っ
緩衝液であれば、いかなるものでも良い。例えばクエン
酸緩衝液やその他有機酸緩衝液、例えば酢酸、コハク酸
、フタル酸等の緩衝液があげられる。

７２質濃度としては特に制限がないが、好ましくは最大
のアリルスルフ７ターゼの酵素活性を示す濃度が適当で
ある。例えば１ｍＭ以」−である。

本発明の試薬には必要により、界面活性剤、防腐剤、塩
化ナトリウム、シクロデキストリン、安定化剤等を加え
てもよい。

本発明のアリルスルファターゼ活性測定試薬を用いて、
アリルスルファターゼ活性を測定する方メツ；としては
、試薬を該試薬と反応させて生成するアグリコンの吸光
度の変化を直接分光光度計を用いて比色定量する方法が
ある。

（発明の効果） 本発明のアリルスルファターセ活性７１１１Ｉ定試薬に
おいて、−・般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を
入（質と１７て用いることにより、体液中のアリルスル
ファクーゼ活性を短時間に正確、かつｆｍ単に１／　−
）アッセイすることかできる。特にニトロツユノールを
結合した基質に比べて酵素反応と発色反応を１つの系で
行なえるという優れた効果を有する。

（実施例） 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例　１゜ 被検液中のアリルスルファクーゼＡ活性量を下記試薬を
用いて下記方法により測定した。

１、　　試　　　　薬 ２＋　　６−）りｌＪ＊−４−＝）０フェニ＃硫ｅ、　
　　５．０ｍＭクエン酸緩衝液　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．１．Ｍｔ）■−１５，２ ２、測定方法 アリルスルフ７ターゼ含有被検液５０μぐに−に記試薬
２ｍＱを加えて３７°Ｃて反応させ、その吸光度を波長
４００　ｆｆ１．で測定して発色速度を求めた。

反応曲線を第１図に示し、検量線を第２図に示す。

第１図および第２図から明らかなように、水溶性基質を
用いた本発明の試薬では、短時間に正確かつｆｆｆｉ　
単にレートアッセイすることかできる。

実施例　２ 被検液中のアリルスルファターゼ活性量を下記試薬を用
いて下記方法により測定した。

■、　試　　薬 Ａ、２．６−シプロモー４−二トロフェニル硫酸カリウ
ム５．０ｍＭ り工／酸ゾ衝液　　　　　　　　　　　　　　　　０．
ＩＭｐｌ−１５，２ Ｂ、　　　４−ニトロフェニル硫酸カリウム　　　　　
　　５．０ｍＭクエン酸緩衝液　　　　　　　　　　　
　　　　　０．１ＭｐＨ５，２ ２測定方法 ａ、　アリルスルファターゼ含を被検液５０μｇに」１
記試薬Ａ、Ｂ２ｍｆｆ１を加えて３７°Ｃて３分間加温
後、吸光度変化を波長４００ｎｍで測定して１分間の吸
光度変化を求めた（ブランクはアリルスルフ７ターゼ含
有被検液にかわり水を用いる）。

ｂ、アリルスルファターゼ含仔被検液５０μ党に」二足
試薬Ａ、Ｂ２ｍ党を加えて３７℃で５分間反応後、帆Ｉ
Ｍ炭酸ソーダ水２ｍｇを添加し、アルカリ条件下にして
反応を停止さぜ、波長４００　ｎｍの吸光度を測定した
（ブランクはアリルスルフ７ターゼ含有被検液にかわり
水を用いる）。

第１表にその結果を示ず。

第　　　　１　　　　表 本発明の試薬ＡはｐＨ５，２において十分測定可能な感
度を有する試薬であるが、試薬Ｂはｐｌ＋５．２におい
て全く測定可能レベルになく、アルカリ条件においての
み測定可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明実施例１の反応曲線を示す。 第２図は本発明実施例１の検量線を示す。 特許出願人　　　東洋紡績株式会社 手続補正書（自発） 昭和６１年８月１９日 １、　事件の表示 昭和６１年特許願第１７２１４号 ２　発明の名称 アリルスルファターゼ活性測定試薬 ３、　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 明細書の１特許請求の範囲」の桐および「発明の詳細な
説明」の欄 ５　補正の内容 （１）　　特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。 （２）　　明細書第３頁 化学式の右へｒ　（Ｉ）Ｊを挿入する。 Ｃ３）　　同第４頁第２行目 ｒＱ　＋ｍ＋ｎ＝５ＪをｒＱ　＋ｍ＋ｎ≦５１に訂正す
る。 （４）　　同第４頁第７〜８行目 「基質となった」を「基質と異なった」に訂正する。 （５）同第４頁 化学式中、ｒ　（Ｒ）ｍＪをｒ　（Ｒ）ｎＪに訂正する
。 （６）　　同第４頁下から第７行目 ｒｘ、Ｑ、ｍｌをｒｘ、Ｑ、ｍおよびｎ」に訂正する。 ″）　同第５頁第８行目 「２−ヨード−ニトロ−６−」を［２−ヨード−３−ニ
トロ−６−」に訂正する。 （８）　　同第５頁第１２行目 ［２−ヒドロキシ−４−二トローブロモ］を「２−ヒド
ロキシ−４−二トロー５−ブロモ」に訂正する。 （９）　　同第６頁第３行目 「生物化学■」を「生物化学Ｕ、２６８Ｊに訂正する。 別　　　　　　　紙 特許請求の範囲 基質として下記一般式（１）で示される化合物又はその
塩を使用することを特徴きするアリルスルファターゼ活
性測定試薬。 （Ｎｏ、　）　Ｑ （Ｒ）　ｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 基質として下記一般式（ I ）で示される化合物又はそ
   の塩を使用することを特徴とするアリルスルファターゼ
   活性測定試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘはハロゲン、Ｒは水酸基、カルボキシ基、炭
   素原子数１〜３のアルキル基を示す。 ｌは１〜４の数、ｍは１〜４の数、ｎは０〜３の数を示
   し、ｌ＋ｍ＋ｎ＝５である。）