JPS61177999A - β−N−アセチル−D−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬 - Google Patents
β−N−アセチル−D−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明はβ−N−アセチル−D−ヘキソサミニダーゼ活
性測定用試薬に関するものである。体液中のβ−N−7
セテルーD−へキンサミニダーゼ活性の測定は、腎移植
後の拒絶反応の早期診断、急性腎不全、糸球体腎炎等の
各種腎疾患の診断及び経過観察、薬物の腎毒性等に有用
な情報を与えるものとして臨床的意義が高い。
性測定用試薬に関するものである。体液中のβ−N−7
セテルーD−へキンサミニダーゼ活性の測定は、腎移植
後の拒絶反応の早期診断、急性腎不全、糸球体腎炎等の
各種腎疾患の診断及び経過観察、薬物の腎毒性等に有用
な情報を与えるものとして臨床的意義が高い。
(従来の技術)
従来、β−N−アセチル−D−へキンサミニダーゼ(以
下WAGと略する)活性は、N−アセチル−D−グルコ
サミンの還元末端にp−ニトロフェノールを結合させた
基質を用いてNAGを作用させ、遊離してくるp−ニト
ロフェノールをアルカリ性下で比色する方法が一般的で
ある( MethodsEngymol、、 28.
702 (1972) )。
下WAGと略する)活性は、N−アセチル−D−グルコ
サミンの還元末端にp−ニトロフェノールを結合させた
基質を用いてNAGを作用させ、遊離してくるp−ニト
ロフェノールをアルカリ性下で比色する方法が一般的で
ある( MethodsEngymol、、 28.
702 (1972) )。
ところがこの方法では目的とする酵素NAGの至適pH
(pH4〜5.5)と発色用であるp−二トロフェノー
ルの発色p)ICpH9以上)とが異なる為にNAG活
性を測定する為には酵素反応と発色反応を別々に一番適
当であるといわれている速度分析(レートアッセイ1法
が出来ない欠点がある。
(pH4〜5.5)と発色用であるp−二トロフェノー
ルの発色p)ICpH9以上)とが異なる為にNAG活
性を測定する為には酵素反応と発色反応を別々に一番適
当であるといわれている速度分析(レートアッセイ1法
が出来ない欠点がある。
60997号)、N−アセチルグルコサミンにm−上記
p−ニドI:1フェノールを用いる場合と同様の欠点が
ある。
p−ニドI:1フェノールを用いる場合と同様の欠点が
ある。
(発明の解決しようとする問題点)
本発明の目的は定量性に優れたNAGのレートアッセイ
が可能となるNAG活性測定試薬を提供することである
。
が可能となるNAG活性測定試薬を提供することである
。
(問題点を解決する為の手段)
本発明者らは、上記目的を達成するために種々鋭意検討
したところ、一般式CI)で示される基質を用いること
により体液中のNAG活性を短時間に正確簡単にレート
アッセイ出来ることを見い出し本発明に到達した。
したところ、一般式CI)で示される基質を用いること
により体液中のNAG活性を短時間に正確簡単にレート
アッセイ出来ることを見い出し本発明に到達した。
すなわち本発明は基質として下記一般式CI)で示され
る化合物を含有することを特徴とするβ−N−7セテル
ーD−ヘキソサミニダーゼ活性測定試薬である。
る化合物を含有することを特徴とするβ−N−7セテル
ーD−ヘキソサミニダーゼ活性測定試薬である。
〔式中、AII′iN−アセチルグルコサミン又はN
−アセチルガラクトサミン残基であって、その還元性末
端が置換芳香族基(解裂したアグリコンとして基質とは
異なったスペクトル吸収を示す基)とβ−結合されてい
る。置換芳香族基中のXはニトロ基又は水素原子を示す
。Xが水素原子の場合はR1−R4のいずれかの置換基
の2個以上がニトロ基であシ、他の基は水素原子又はハ
ロゲン原子である。Xがニトロ基の場合はR1−R4は
水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基のいずれかを示し、
またR1及びR2u−緒になって環を形成してもよい基
を示す。ただし、R1−R4全てが水素原子の場合は除
く。ン 本発明に用いる基質としては一般式CI)で示さ端で置
換芳香族基とβ−結合したものである。置換芳香族基と
は解裂したアグリコンとしては基質とは異なったスペク
トル吸収を示す置換芳香族基であればいかなるものでも
良いが、具体的には(X、R,〜R4は前記のものと同
じ)で示される。
−アセチルガラクトサミン残基であって、その還元性末
端が置換芳香族基(解裂したアグリコンとして基質とは
異なったスペクトル吸収を示す基)とβ−結合されてい
る。置換芳香族基中のXはニトロ基又は水素原子を示す
。Xが水素原子の場合はR1−R4のいずれかの置換基
の2個以上がニトロ基であシ、他の基は水素原子又はハ
ロゲン原子である。Xがニトロ基の場合はR1−R4は
水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基のいずれかを示し、
またR1及びR2u−緒になって環を形成してもよい基
を示す。ただし、R1−R4全てが水素原子の場合は除
く。ン 本発明に用いる基質としては一般式CI)で示さ端で置
換芳香族基とβ−結合したものである。置換芳香族基と
は解裂したアグリコンとしては基質とは異なったスペク
トル吸収を示す置換芳香族基であればいかなるものでも
良いが、具体的には(X、R,〜R4は前記のものと同
じ)で示される。
その置換芳香族基はフェノールの形で示せば、例エバ2
.6−’)クロロ−4−二トロフェノール、2.6−ジ
プロモー4−二トロフェノール、2,3.6−ドリクロ
ロー4−ニトロフェノール、2.3.6−トロフェノー
ル、2.5−ジニトロフェノール、2−クロc1−4−
二トロフェノール、2−プロモー4−二トロフェノール
、8−ハイドロ* シー 5.7−シニトロー2−ナフ
タレンスルホン酸等があげられる。
.6−’)クロロ−4−二トロフェノール、2.6−ジ
プロモー4−二トロフェノール、2,3.6−ドリクロ
ロー4−ニトロフェノール、2.3.6−トロフェノー
ル、2.5−ジニトロフェノール、2−クロc1−4−
二トロフェノール、2−プロモー4−二トロフェノール
、8−ハイドロ* シー 5.7−シニトロー2−ナフ
タレンスルホン酸等があげられる。
これら基質の合成方法はN−アセチルヘキソテミンをア
セチル化し、このアセチル化され九N −アセチルヘキ
ソサミンと置換芳香族基、アグリコンを結合させた後、
脱アセチルすることKより合成するか(実験化学講座第
24巻第304頁、1958年)、又はアセチル化され
たN−アセチルヘキソサミンをハロゲン化し、次いでそ
のハロゲン化物と置換芳香族基、アグリコンをエーテル
結合させたあと、脱アセチルすることKより合成するこ
とが出来る( Methods in Carbohy
4+ateC!hemi%try [1,第334頁)
。
セチル化し、このアセチル化され九N −アセチルヘキ
ソサミンと置換芳香族基、アグリコンを結合させた後、
脱アセチルすることKより合成するか(実験化学講座第
24巻第304頁、1958年)、又はアセチル化され
たN−アセチルヘキソサミンをハロゲン化し、次いでそ
のハロゲン化物と置換芳香族基、アグリコンをエーテル
結合させたあと、脱アセチルすることKより合成するこ
とが出来る( Methods in Carbohy
4+ateC!hemi%try [1,第334頁)
。
基質の置換芳香族基においてR1又はR4がノ・ロゲン
原子である場合には、基質の溶解性の点から見て、シク
ロデキストリンが必要である。
原子である場合には、基質の溶解性の点から見て、シク
ロデキストリンが必要である。
本発明に用いるシクロデキストリンとしてはα。
β、γノの重合度のものが知られているが、上記基質〔
■〕の溶解性又は呈色のpH安定性に効果があ本発明の
β−N−アセチル−D−ヘキソサミニダーゼ活性測定試
薬は上記基質、及び必要により串 シフロブキストリおよび/又は塩化ナトリウムを含有す
る。
■〕の溶解性又は呈色のpH安定性に効果があ本発明の
β−N−アセチル−D−ヘキソサミニダーゼ活性測定試
薬は上記基質、及び必要により串 シフロブキストリおよび/又は塩化ナトリウムを含有す
る。
該試薬のpHは体液中のNAGの至適pHであるpH4
,0〜5.5を保つ緩衝液であれば、いかなるものでも
良い。例えばクエン酸緩衝液やその他有機酸緩衝液、例
えば酢酸、コハク酸、フタル酸等の緩衝液があけられる
。
,0〜5.5を保つ緩衝液であれば、いかなるものでも
良い。例えばクエン酸緩衝液やその他有機酸緩衝液、例
えば酢酸、コハク酸、フタル酸等の緩衝液があけられる
。
基質濃度としては特に制限がないが、好ましくは最大の
NAGの酵素活性を示す濃度が適当である。
NAGの酵素活性を示す濃度が適当である。
例えば1mM以上である。次にシクロデキストリン濃度
としては基質の溶解性又は呈色のpH安定性に有効でお
る濃度であれば特に制限はないが好ましくは0.1チ以
上が適当である。
としては基質の溶解性又は呈色のpH安定性に有効でお
る濃度であれば特に制限はないが好ましくは0.1チ以
上が適当である。
塩化ナトリウム濃度としてはNAGの活性化に有効な濃
度であれば%に制限はないが、好ましくは1−1000
mMが適当である。史に必要があれば界面活性剤、防腐
剤等を加えてもよい。
度であれば%に制限はないが、好ましくは1−1000
mMが適当である。史に必要があれば界面活性剤、防腐
剤等を加えてもよい。
本発明のβ−N−アセチル−D−ヘキソサミニダーゼ活
性測定試薬を用いて、RAG活性を測定する方法として
は、試薬を該試薬と反応させて生成するアグリコンの吸
光度の高化を直接分光光度計を用いて比色定量する方法
である。
性測定試薬を用いて、RAG活性を測定する方法として
は、試薬を該試薬と反応させて生成するアグリコンの吸
光度の高化を直接分光光度計を用いて比色定量する方法
である。
(発明の効果)
本発明のβ−N−アセチル−D−ヘキソサミニダーゼ活
性測定試薬において、一般式〔I〕で示される化合vl
Jti質として用いることKより、体液中のβ−N−ア
セチル−D−へキンサミニダーゼ活性を短時間に正確、
かつ簡単にレートアッセイすることができる。
性測定試薬において、一般式〔I〕で示される化合vl
Jti質として用いることKより、体液中のβ−N−ア
セチル−D−へキンサミニダーゼ活性を短時間に正確、
かつ簡単にレートアッセイすることができる。
(実施例)
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例1
被検液中のNA()活性t’を下記試薬を用いて下記方
法により測定した。
法により測定した。
1、試薬
2−クロロ−4−二トロフェニルーN −7セfルβ−
D−グルコサミニド 1mM0.05M
クエン酸緩衝液(pH4,5)で全量 10m/2、
測定方法 NAG含有被検液50μlに上記試薬2m/を加えて3
7℃で反応させ、その吸光度を波&400nmで測定し
て発色速度を求めた。
D−グルコサミニド 1mM0.05M
クエン酸緩衝液(pH4,5)で全量 10m/2、
測定方法 NAG含有被検液50μlに上記試薬2m/を加えて3
7℃で反応させ、その吸光度を波&400nmで測定し
て発色速度を求めた。
反応曲線を第1図に示す。検量波を第2図に示す。
第1図および第2図から明らかなように、本発明の試薬
を用いると、短時間に正確かつ簡単にレートアッセイす
ることができる。
を用いると、短時間に正確かつ簡単にレートアッセイす
ることができる。
第1図は本発明実施例1の反応曲線を示す。
第2図は本発明実施例1の検tiを示す。
Claims (3)
- (1)基質として下記一般式〔 I 〕で示される化合物
を含有することを特徴とするβ−N−アセチル−D−ヘ
キソサミニダーゼ活性測定試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 〔式中、AはN−アセチルグルコサミン又はN−アセチ
ルガラクトサミン残基であって、その還元性末端が置換
芳香族基(解裂したアグリコンとして基質とは異なった
スペクトル吸収を示す基)とβ−結合されている。置換
芳香族基中のXはニトロ基又は水素原子を示す。Xが水
素原子の場合はR_1〜R_4のいずれかの置換基の2
個以上がニトロ基であり、他の基は水素原子、又はハロ
ゲン原子である。Xがニトロ基の場合はR_1〜R_4
は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基のいずれかを示し
、またR_1及びR_2は一緒になって環を形成しても
よい基を示す。ただし、R_1〜R_4全てが水素原子
の場合は除く。〕 - (2)一般式〔 I 〕で示される化合物およびシクロデ
キストリンを含有することを特徴とする特許請求の範囲
第1項記載のβ−N−アセチル−D−ヘキソサミニダー
ゼ活性測定試薬。 - (3)一般式〔 I 〕で示される化合物および塩化ナト
リウムを含有することを特徴とする特許請求の範囲第1
項記載のβ−N−アセチル−D−ヘキソサミニダーゼ活
性測定試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1745285A JPS61177999A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | β−N−アセチル−D−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1745285A JPS61177999A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | β−N−アセチル−D−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61177999A true JPS61177999A (ja) | 1986-08-09 |
JPH0573398B2 JPH0573398B2 (ja) | 1993-10-14 |
Family
ID=11944412
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1745285A Granted JPS61177999A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | β−N−アセチル−D−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61177999A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990010084A1 (en) * | 1989-02-23 | 1990-09-07 | Iatron Laboratories, Inc. | Substrate for enzymatic activity determination and method and reagent for determining enzymatic activity using said substrate |
-
1985
- 1985-01-30 JP JP1745285A patent/JPS61177999A/ja active Granted
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BIOCHEMICAL PLEPARATIONS=1963 * |
METHODS ENZYMOL=1972 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990010084A1 (en) * | 1989-02-23 | 1990-09-07 | Iatron Laboratories, Inc. | Substrate for enzymatic activity determination and method and reagent for determining enzymatic activity using said substrate |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0573398B2 (ja) | 1993-10-14 |
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