JPS61502129A - 生物分解可能なマトリツクスおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物分解可能なマトリックスおよびそ（７）　ｆＪ　進法発明の分野 本発明は生物分解可能なマトリック疋関する。更に詳述すると、多機能性コラ− ピンなベースとでるマトリックスおよび／又はそのキャリアー系に関する。

発明の背景 外部の傷に薬、生長因子、ホルモン、ペプチドおよびグリコペプチドを適用する のは、一般的に直接局所に行ない、内部の傷に対しては血液に注入したり又は消 化系を通して血液に吸収させて適用する。これらの薬剤の放出を調節するには、 台底ポリマー（例えばシリコーン）や天然ポリマー（例えばゼラチンやセルロー ス）を便ってバルクで又は順微境的レベルでカプセル化して行なってかだ。放出 率は、拡散率を調節するのに匣うポリマー系を適切に選ぶことにより１平畝の量 調節することができる（ランが−・アール・ニスお；びペパス・エヌ・エイ、「 バイオマテリアルス」２゜２０１．１９８１）、ゼラチンやセルロースの如キ天 然ポリマーは数分から数時間でゆっくり溶け、シリコーンは数ケ月から数年の間 そのま＼の形で残る。生物分解性ポリマーは唯一回の外科ヨコ処置を必要とする だけであるから、内部の傷に対し放出を調節する利点がある。

コラーダンは動物やヒトにみられる生物分解性プリマーである。血漿増補液、薬 剤供給用担体、ガラス体代用品、止血剤、縫合材料、代用角膜、血液透析膜、包 帯、人工皮膚、ヘルニアパッチ、人工血管、膣用紙娠調節具、および組織増強用 注入剤として使われてきた（シュバビル等、「コネクティデ・ティッシュ・リサ ーチのインタナショナル・しぎニーＪ６．１．１９７３；エイ・−一デイックお よびジエイ・ブースト編「パイオロジイ・オプ・コラーダン」、アカデミツクプ レス、第２２章、１９８０）。これらの殆んどの応用では、コラ−ｒ７は再構成 され、不溶性の形に架橋してＡる。

合成皮膚としてコ？−Ｐｆンやムフポリサツカライドを使用することがヤナス等 （米国特許第４，０６０，０８１号明細書）に記述さ１ている。このような物質 はゲルタールアルデヒド、二官能性架橋剤を便って、遊離アミンと反３させ、架 橋される。架橋したコラーダンを匣う主な欠点は、コラーダンを架橋し子爵化す るのに使う通常の薬剤、ゲルタールアルデヒドが遊離することによる生物的悪影 響であった。架橋したコラーダンからゲルタールアルデヒドが浸出することは、 線維芽細胞の如き細胞に毒性があることが翔られている（スピア−等、「ジャー ナル・オプ・バイオメディカル・マテリアルス・リサーチ」、１４％７５３．１ ９８０；クック等、「プリティッシュ・ジャーナル・オプ・エクスペリメンタル ・バンロンイ」、６１，１７２．１９８３）、グルタールアルデヒ？ポリマー（ 七ツマー注ゲルタールアルデヒドではない）はコラーピン分子間にクロスリンク を形成することが最近の文献に示唆されている。これらのクロスリンクは遊離ゲ ルタール７　／ｌ／デヒドトクルタールアルデヒドポリマーを放出して転位しう る（チェノ・ディー・ティーおよびニムニ・エム・ディー、コネクテイデ・ティ ッシュ・リサーチ、１０，１８７−２１７．１９Ｂ２　）。

本発明の目的 本発明の目的は新規生物分解性マ）　ＩＪラックス供することである。

本発明の別の目的はコラーダンをベースとする新規マトリックスを供することに ある。

本発明の更に別の目的はスポンジ状又はシート状のコラーダンをべ一艮とする新 規マトリックスを供することにある。

また別の目的はキャリアー化合物を含ませＬ＠規生物分解注１トリックスを供す ることにある。

本発明のその他の目的はキャリアー化合物を含ませた新規生物分解性コラービン をベースとするマトリックスな、供するにある。

更に、キャリアー化合物をゴませたスポンジ状又はシ・−ト状Ｓ＃規生物分解注 コラ一ケ“ンをベースとするマトリックスを供す′るにある。

キ・ヤリアー化合吻を言ませ、非毒性かつ七胞の生長を促進しうるコラ−ピンを ベースとする＃ｒ規生物分解注マトリックスを供することも本発明の目的である 。

更に、薬剤の放出を調節するために、キャリアー化合物を言ませたコラーゲンを ベースとする新規生物分解性マトリックスな供することも目的である。

外部の傷に局所適用するために、キャリアー化合物：！ｉｌｌ：′含ませたコラ ーゲンをベースとする新規生物分堺注マトリックスを供することを目的とする。

内部の傷に適用するために、キャリアー化合物を言まぜたコラ−ピンをベースと する新規生物分解性マトリックスを供することも不発明の目的である。

発明の要約 本発明の一つの態様として、■型、■型および用型コラ・−・ピンから放る詳か ら選んだ；ラーダンを言むコラ−ｒ７をベースとする物質のスポンジ又はシート を形成し、このスポンジ又９エシートをカルボジイミド又はサクシニミジル活性 エステルの架橋剤と遥触させ、ついで苛酷な脱水条件に情して、スポンジ状又し エシート状シ）コラーケ０ンをベースとし１こマトリックスな玉取することによ り達成さＣろ。他の態様では、コラーピンヲペー・スとする物質のスポンジ又汀 シ・−トを先ず苛酷な脱水条件に供し、続いて虫取した中間のコラーゲンをベー スとするマトリックスをカル、ｌｆジイミド架橋化合物と接触させて、スポンジ 状又はシート状のコラ−９’　：ｙ　ｆペースとするマトリックスを虫取する。

他の態様では、架橋剤な、コラーゲンベースの中間シート又はスポンジを生ａ： する前に、コラーゲンをベースとする物質と混合し、ついで苛酷な脱水処理工程 に付する。符に望ましい本発明の態様では、キャリアー化合物を処理中に加えて 、キャリアー化合物を含ませたスポンジ状又はシート状のコラーゲンをベースト −ｆ’ルマトリックスを虫取する。このキャリアー化合物は■型とＶ型コラーピ ン、フイブロネクチン、ラミニン、ヒアルロネート、プロテオグリカン、表皮生 長因子、血小板由来生長因子、脈管形成因子、抗生物質、防カビ剤、殺精子剤、 酵素お工び酵素阻害剤から収る群から選ぶ。

発明の詳細な記述 本発明のコラーケ９ンをベースとする°キャリアー系はＩ、■お工び■型コラー ダンお工びその混合物から収る詳から選ばれた可＠注又は不浴注コラーダンを出 発物質として使用するものであるう Ｉ、ＩＩおよび■型コラーピンの可＠注コラーピンはその＝５１（、型のコラー ゲンに富んだ８１織を制限的醇素消化により製造１７、コラ−ｒ７をベースとす る溶液（即ち、稀埴酸、稀酢俄の如き適当な＠媒に溶解した可＠注コラーダノ） に生収される。

不浴注コラーダンは次のものから誘導される＝１型コラーデン：ウシ、鶏および 魚の皮、ウシや鶏の健および胎児の組織を言むウシや鶏の骨：■型コラーダン： ウシ関節の軟骨、鼻隔膜、胸骨の軟骨：■型コラーピン：ウシやヒトの大動脈と 皮。

本発明の一態様において、適当な液状媒質（例えば、稀塩ぢや稀酢酸）に分散し かつ膨潤させたコラ−ピンをベースとする溶液又は不＠注コラーピンを約Ｏから 一１００’Ｃの温度に供し、コラーゲンをベースとする物質を固形化させる。そ の後、固形化したコラーゲンペースの物質な約２２から一１００℃の温度で約５ ０ミリトール未黄の真空に供し、後記する様に、更に加工するコラーゲンをベー スとするスポンジを形成する。

一般に、可溶化又は不浴化コラーダン対溶媒又は分散剤の重量比は夫々１対ｉ　 ｏ、ｏ　ｏ　ｏから１：１５を使用し、コラーゲンをベースとする溶液又は分散 液を得る。

本発明の別の態様において、このようなコラーゲンをベースとした溶液又は分散 液は後記する様に、更に加工する前はシート状に乾燥する。乾燥は４から４０℃ の温度で２〜４８時間行なう。

コラーゲンをベースとするマトリックスを得る態様においては、コラーゲンをベ ースとするスポンジ又はシートを先ずカルボジイミド又はＮ−ヒドロキシサクシ ンイミド誘導活性エステル（サクシンミジル活注エステル）から成る群から選ん だ架橋剤と接触させ、ついで苛酷な脱水に供し、コラーゲンをベースと−ｊるマ トリックスを得る。カルボジイミドの例にはシアナミドおよび１−エチル−３− （，３−ジメチルアミンプロざル）−カルボジイミド塩酸塩がある。二官能性サ クシニミジル活性エステルの例は二官能性Ｎ−ヒドロキシーサクシンイミド％　 ３　＋　’ｉミニ−ジチオスルホサクシニミジル）プロピオネートおよびビス（ スルホサクシニミジル）スペレートがある。カルざジイミド架橋剤を便う場合、 コラーゲンをベースとするスポンジ又はシートを約２から４０℃の温度とＰ）（ ２から１１に約２から９６時間維持した約０．１から１０％（’Ｉ／Ｖ　）の濃 度でカルボジイミド浴液に浸漬させる。サクシニミジル活性エステル架橋剤を使 う場合、コラーゲンをベースとＴるスポンジ又はシートを約２から４０℃ノ＠度 ニ約２から９６時間維持させた約０．１から約１５．０％（Ｗ／Ｖ　）の濃度の 該溶液に浸漬させる。このコラ−ピンをベースとしたスポンジ又はシートを、０ ．１から約１５％（Ｗ／りのＮ−ヒドロキシサクシンイミドおよびから４０°Ｃ の温度で２から９６時間おく。こうして処理Ｌ　７ｊ　中間のコラーゲンベース のマトリックスを十分。に洗い、過剰の架橋剤を除く。

中間のコラーピンペースのマトリックスの苛酷な脱水、工５０から２００　’Ｃ の温度、５０ミリトール以下の真空で２から９６時間の条件を含み、それにより コラーダンをベースとするマトリックスを生成する。苛酷な脱水の前に、スポン ジ状の中間コラーピンペースのマ）　ＩＪラックス約Ｏから一１００℃の温度で 固形化するのがよく、その後少なくとも５０　ミＩＪ　）−ルの真空、約２２か ら一１００℃の濃度に供する。

カルざジイミド架橋剤を使う場合、コラーダンｆｔヘ−スとするマトリックスを 形成する本発明の別の態様において、この中間コラ−ピンペースのマトリックス と架橋剤とを接触する前に中間コラーピンベースのマトリックスを得るために苛 酷な脱水を行なうことができる。

コラ−ピンをベースとするマトリックスを得る本発明の別の態様におＬＡ″Ｃ１ 乾燥する前又は凍結乾燥処理工程の開始前に、架橋剤とコラ−ピンベース物質と を予め混合する。

本発明によ°り製造したコラ−ピンをベースとするマトリックスは共有結合の形 成を介してクロスリンク間の分子ｔ　ｉ、ｏ　ａ　ｏから１００．０００と共に 、孔形間隔３から１００　ｔｔｒｎ　、分子量１０Ｘ１０６〜５０Ｘ１０’以上 を有する「サンプ様」又は「足場」構造として記述することができる。

本発明の他の態様はキャリアー化合物を；ラーダンペースマトリックスに加える ことである。このようなキャリアー化合物は■型コラーダン、ＶＷコラーピン。

フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロネー）、７’ｃｚチオグリカン、表皮生 長因子、血小板由来生長因子、脈管形成因子、抗生物質、助力♂剤、殺精子剤、 ホルモン、酵素および酵素阻害剤から成る詳から選択される。

一般に、キャリアー化合物はコラーピンベースの物質の加工中すつでもスポンジ 状又はシート状のコラ−デフペースマトリックスに加えることができる。キャリ アー化合物は中間のコラーデノベースマトリックスを生成する場合、可溶性又は 不溶性コラーゲンを固形化する前、又は苛酷な脱水前の中間コラーピンベースマ トリックスを固形化する前に加えるのが望まし一〇キャリアー物質は可溶性又は 不溶性コラーゲンの重量に基づ込て１から３０１　（Ｗ／Ｗ）の量で添加する。

一般に、フィブロネクチン、■型とｖ盟コラ−ピン、ラミニン、グリコスアミノ グリカンおよびヒアルロネートの如き結締組織因子は、コラ−ピンペースのスポ ンジを生成する場合の初期加工中、又は中間コラーピンペースのマトリックスの 架橋後に添加する。中間のコラーピンペースマトリックスの生改中フイデロネク チンとヒアルロネートを加えるのが望ましい。

本発明の一態様を構成するコラ−ピンペースのマトリックスに添加するのに各種 Φヤリアー化合物の供給源は多くある。■型とＶ型コラ−ピンは夫々基底漠と組 織中の平滑筋細胞と関連してみられる。■型コラーダンの代表的供給源には、Ｅ Ｈ１３マウス肉重瘍、ウシとヒトの胎盤、水晶体被膜および腎臓がある。Ｖ型コ ラ−７Ｆ’ンの供給源には胎盤膜、目組織および胎児の皮膚がある（例えば、ト レルスタッド・イン・イムノケミストリイ・オデ・デ・エクストラセルラー・マ トリックス、第１巻、エイチ・ファースマイアー著、シーアールシイ−プレス、 Ｈ２章、１９８２年参照）。

プロテオグリカンの代表的供給源はウシとヒトの軟骨〉よび滑液、鼻中隔と胸骨 の軟骨、および皮膚である。グリコプロティンの代表的供給源はＩＣＨ８腫瘍、 ウシとヒトの腎臓、軟骨、骨、胎盤ならびにウシとヒトの血液である。ヒアルロ ネートの代表的供給源は雄鶏のトサカおよびウシのガラス体である。

コラーダンをベースとするマトリックスの望ましめキャリアー化合物はフィブロ ネクチン、ラミニン、■型コラーピンおよびヒアルロネートとプロテオグリカン の複合体である。開いた傷と接触するコラ−ピンなベースとするマトリックスに とって２：５から５の膨潤比が必要であるが、皮下移植用のキャリアー化合物を 含めてコラーダンをベースとするマトリックスに対しては２．５から１０の膨潤 比が有用である。膨潤比はコラーダンをベースとするマトリックスの容量単位当 り吸収される水の容量として定義されろ。

内部の傷と短期間薬剤放出の場合には、シート状又はチューブ状のキャリアー化 合物を含めてコラ−ピンをベースとするマトリックスは組織と直接接触しておか れる。

生物分解率および放出率はクロスリンクの密度を変えることにより調節すること ができる。長期間の放出を望む場合には、ポリ−３−（ヒドロキシブチレート） の如き生物分解可能なポリマーの非多孔拡散層をコラーｒノベースのマトリック スの谷側に適用する。十分の厚さの傷に使用する材料については、上記米国特許 に記述した様な拡散調節層は水又はコラ−ピンをベースとするマトリックス由来 の他の揮発性小分子の拡散を防ぐために適用される。拡散調節層はコラ−ピンを ベースとするマトリックスに固着していなくてはならない。コラ−ピンをベース とするマトリックス層と拡散調節層の組み合わせは縫合するのに十分強＜　ｒｃ 　＜ではならず、引張り強度に少ｔくとも１００　ｐｓｉであり。

破壊前少なくともｉｏｓで変形しうるものである。シリコーンポリマー（シラス ティック　メディカル　グレード　アドヒツシデ）の如き合成非−生物分屏性ポ リマー又はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ−３−（ヒドロキシブチレート） およびその共重合体の如きシリコーンポリマーは小分子の拡散率を調節するのに 望ましい物質である。拡散調節層におけるキャリアー化合物の硬化は、室温で乾 燥することにより、コラーダンをベースとするマトリックスにキャリアー化合物 を湿潤せずＫおこり得る。厚さ０．５から１．５」のフィルムなマトリックス層 に適用し、ｉ　４　ｉｎ、　Ｈｇ　（ｆ）真空を使って室温で少なくとも２時間 硬化させる。

コラーダンをベースとするマトリックスの厚さは１から数百」まで変り得る。十 分厚い傷では、２から３４の厚さが望ましく、コラーダンをベースとするマトリ ックス中のキャリアー化合物と傷床間の密接な接触が可能である。

皮丁的に又は十分な厚さの傷に直接移植する場合、本発明のコラーダンをベース とするマトリックスハ炎症′ｊ″ロセスを刺激しない。更に、長期の移植により 線維子細胞や内皮細胞はコラーダンをベースとするマトリックスに移行すること になる。コラーダンをベースとするマトリックスの変質と吸収は、その物質１■ が細菌性ニラデナーゼ１００単立による可洛（ヒに耐える時間を測定して試験管 内で偵査する。コラデナーゼ１単位は３７℃で５時間Ｌ−ロイシン１．０マイク ロモルに相当するコラ−ｒ）中のアミノ酸を遊離する。サクシニミソル活性エス テルの生成と苛酷な脱水又はカルとジイミド処理の組み合わせおよび苛酷な脱水 は前に浸った操作により観察されるもの以上にコラゲナーゼ耐往時間を有意に増 大する。これらの研究の指摘によれば、本発明の架橋方法はコラｒナーゼによる 変質耐性となりかつ炎症の刺激を示さない。

発明の実施例 次の例は本発明方法の条件を示すものであり、本発明の範囲を限定するものでは ない。

例１ 可溶性および不溶性コラー２ンの調製 痩用するコラーダンは、顆粒層を真皮から分離した後の子牛の皮から作る。真皮 を切断し、洗い、膨潤し、凍結乾燥して、−２０℃で貯Ｗ、ｆる。

可＠性コラーピンは、結晶性ペプシン（シグマ化学）１．５ｇを含有する五ＣＬ １゜５！！、−２−５中に凍結乾燥した不溶性コラ−ｒ７２５０ｇを入れて得ら れる。この混合物を４°Ｃで一晩攪拌し、つ論でチーズクロス、ワットマン濾紙 ＋４、ついです４２、ダルマ７５μｍおよび１．２μｍ、最後にミリポア０．６ ５　μｍと０．４５　ｔｍフィルターで濾過する。連続濾過後に得た可溶性フラ クションはＩ、ＤＩお・よびＶ型コラ−ピンを含有する。

可溶性コラ−ｒンフラクションはｐＨ７，５に調整した５　０　ｍＭ　）リス含 有１．ＯＭ　ＮａＣＪ溶液により透析し、十分の固形食塩を加えて、溶液のモル を１．７に上げる。

１．７　Ｍ　ＮａＣｊの沈京物は■型コラーピンであり、１０．０００　Ｘｉ／ ６０分間遠心集取する。ついで０．００５　Ｍ酢酸により透析し、凍結乾燥し、 −２０℃で貯蔵する。上澄液に更にＮａＣ２を加え、２．５Ｍに上げ、沈澱物（ Ｉ型：ラーピン）を遠心によりベレット化し、０．００５　Ｍ酢酸で透析し、凍 結乾燥し、−２０℃で貯蔵する。残存上澄液はＶ型コラーピンを含み、０．００ ５Ｍ酢酸で透析し、凍結乾燥し、−２０００で貯蔵する。

不溶性コラ−ｒン溶液はｐＨ２，５のＥＪ中ウつリイーミルを便って粉砕した凍 結乾燥真皮な分散させて得る。

この膨潤したコラーダンを０．００５　Ｍ酢酸に対し透析し、凍結乾燥した。ｆ ｆ熟牛の皮を真皮源とする場合、生成した不浴注コラーピンは一役にＩ型である 。

可溶性の■型コラーピンは１０．０００　ｘｇ１５０分間スピン濾過により冷蒸 留水中で３回腫瘍を洗った後、マウスＸｉ肉腫瘍より抽出する。ペレット（０， ５ｇ）なＥＩＣノでｐｉ（２，５に調整した０、５Ｍ酢酸０．５１でホモジナイ ズし、ついでペプシン０．５２を加える。ホモジネートを４℃で２４から４８時 間攪拌し、チーズクロスで濾過し、１０，０００　Ｘ９／３０分間スピンした。

ペレットを５０　ｍ　）リス含有０．５　Ｍ　Ｎａｃｔに再懸濁し、最終遣度４ ．５ＭになるまでＮ　ａＣＪを加え、１ｏ、ｏ　ｏ　ｏｘｙ１５０分間遠心し、 ペレットを０．１１Ｊ酢酸で３度透析し、凍結乾燥した。

ＩＩ２ ウシ血清フィブロネクチンの調製 所しく採ったウシの血Ｈ（８０ｒｔ　）な５％クエン酸ナトリウム２０−および （）、ｉｍＭフェニルメチルスルホニルフロライド含有２リゾαぎレン管に集め る。この血液を３００）ｌ／１０分遠心し、血漿を絽胞層から分離し、さらに１ ５℃の温度で３αＯＯＯＸｇ／３０分遠心する。この血漿にさらにｉ　ｍＭのフ ェニルメチルスルホニルフロライドを加え、つ込でゼラチン−セファロースカラ ムに注ぐ。このカラムはリン酸バッファー溶液（０，１８２Ｍリン酸塩と０．１ ４５　Ｍ　ＮａｃＪ、）、リン酸バッファー中２カラム容量の１Ｍ　ＮａＣｊ、 リン竣バッファー溶液２カラム容量、リン酸バッファー中２カラム容ｔ０４Ｍ尿 素で洗う。カラムフラクションの光学密度は４Ｍ尿素含有フラクションに通常存 在するフィブロネクチンにより波長２８皿でモニターする。

０．１より大きＡ光学密度な胃するフィブロネクチン含有フラクションを、　０ ．１４５　Ｍ　Ｈａｃｋ（ｐＨ７，２）含有０．１８０　Ｍリン酸バッファーに より透析する。ついで試料を４．５Ｍ尿素（ｐＨ７，２）含有０．０５　Ｍ　） リス−Ｈ（Ｊにより透析し、室温でＤＩＣＡＫ　（ジエチルアミンエチルセルロ ース）イオン交換カラムに加える。このカラムを４．５Ｍ尿素官有０．０５　Ｍ 　）リスーＨロ１バッファー洛液（ｐＨ７，２）中０−０．３　Ｍ　Ｎａ（Ｊ直 線勾配で＠離スる。

溶離したフィブロネクチンを０．１４５　Ｍ　ＩＪａＣＬおよび１．０Ｍ尿素含 有０．１８０　Ｍリン酸バッファーにより透析し、−２０℃で凍結する。

例３ ラミニンの調製 ラミニンはＣ５７／６　、Ｔマウスにて作ったラチリズムｌｌＨ８腫瘍により製 造する。腫瘍を切断し、ｐＨ７，４に調整した５　０　ｍｕ　）　リス−ＨＣＬ およびグロテアーゼイ／ヒビターを含む３゜Ａ　Ｍ　ＮａＣＪ＋にてホモジナイ ズする。

ホ七ジネートを１６．０００　Ｘ９／６０分遠心し、ペレットを集め、３．４　 Ｍ　Ｎａｑ２に再懸濁する。　１６．０００Ｘ、Ｖ／６０分で２回遠心してから 、５０　ｍＭ　トリス−ＥＣｚｐＨ７，４とプロテアーゼインヒビター含有０− ５　Ｍ　Ｎａユにて再懸濁し、４℃で１８−２４時間攪拌し、統一で１６．００ ０　×ｉ７６０分遠心する。上澄液を固形食塩を添加して３．５Ｍにし、４℃で 一晩攪拌し、沈澱物を遠心集取する。ラミニンを更に５　Ｃ１ｍＭ　）リス−Ｅ ＩＣＬｐＨ７，４言有０．５　Ｍ　Ｎａ＝１に再溶解し、続いて１０．０００Ｘ Ｆ／６０分遠心して精製し、上澄液を２．５　Ｍ　ｍａりＬおよび５０　ｍＭ　 ）リスーＨＣＬｐ８８．６含有２Ｍ尿素により、透析し、４℃で同じバッファー で等張したＤＫＡＩセルロースｔｉ２．５ｘ２．５αカラムでクロマトグラフィ にかける。未結合フラクションは５０　ｍＭ　）リス−ＨＣ’ＪＬｐＨ８゜６言 有２Ｍ尿素により透析し、同じバッファーで等張しｊ、−ＤＥＡＩＣカラムで再 クロマトにかける。この未結合フラクションを真空透析により濃縮し、１゜ＱＭ ＣａＳＪ、２．５０　ｍＭ　）リス−［Ｃ２ｐＨ７，５，２２℃で等張したセフ ァクリルＳ−３００でクロマトグラフィにかけル。微容量を集め、Ｑ、４　Ｍ　 ＮａｆＪ、　５　Ｑ　ｍＭ　）リス−塩酸Ｐｌ−１７，４により透析し、４℃で 貯蔵する。ラミニンは００１Ｍ水酸化アンモニウムＰｉ（１１，０で再溶解し、 −を７．２に調整する。

例４ コラーダンをベースとしたス２ンジおよびシートの調製 可Ｍ性又ｔｓＴＪｒ注＝ｙ　９−ｒ　ｙ　（１，２１）をｐＨ３，０の稀ＨＣｊ 溶液１２０Ｔｌｔに加え、混合物をワーリングゾレンダーで低速７１分粉砕し、 その後高速度で１分間粉砕する。溶液又は分散液を真空フラスコに注ぎ、１００ ミリトールの真空下で１０分説気する。スポンジに転換するコラ−２７分散液と 溶液を０°Ｃに冷却し、りｂで一６５°Ｃ／１０ミＩＪ　）−ル未満の真空で凍 結乾燥する前に一１００℃で凍結する。シートに加工するコ２−ｙン分散液又１ ２溶液を滅菌フードに入れ、２２℃で２４〜４８時間風乾した＠ 例５ サクシニル化、サクシニミジルエステル架橋中間コ５−ｃンをベースとするマト リックスの調製無水コハク酸９Ｉを８０−の蒸留水に溶解し、６７℃で３０分混 合した。無水；ハク酸を浴解し、−を７．２に調整した後、容量を１００−にも っていつｆｓ。

この浴液をワーリングプレンダーに入れ、コラ−ｒ７１ｇを加え、２分間粉砕し 、２２°Ｃで１時間放置し、ワットマンナ４濾紙におき、未反りの無水コＩ〜り 酸な除き、蒸留水１００−で洗う。

残渣をリン酸バッファー（０，１８２Ｍリン酸塩、０．１４５　Ｍ　ＮａＣｆ） 　２Ｑ−とｗ−ヒＹｏｄｒシーｆクシンイミｒ２１の溶液に入れ、シアナミド２ ｇを加える。

溶庫のＰＨを入２に調整する。残渣を室温で３時間反石させ、１４　ｉｎ、　Ｈ ｇの真空下プラナ−ロート中蒸留水で洗５．サクシニル化、サクシニミジルエス テル架橋中間；ラーダンをベースとしたマトリックスのシートおよびスポンジを 例４に記載の方法により製造する。

例６ フィブロネクチン含有のコラ−ピンをベースとするマトリックスの調製 ＨＣｉ１２０　ａｔ　ＰＨ３，０中可溶性又は不溶性コラ−ピン１．２９に、０ ．１８２ＭＵｙ酸塩と０．１４５　Ｍ　ＮａＣｊを含む０．１　Ｍ尿素中フイデ ロネクチン０．１２　ｇ（２，５■フイデロネクチン／ｄ）を加え、混合物をワ ーリングプレンダーにて２分分散させる。シートとスポンジは例４に記載の方法 により製造する。

例７ ＩＷコラーデピンラミニン、フィブロネクチンおよび■型フラーピンで被覆する ことにより生成したスポンジおよびシート 例４と６により生成したコラーピンシートおよびスポンジ１　１〜５チラミニン 、フィブロネクチン又は■型コラーダンを含有する０、１酢酸アンモニウム−７ ，２にて膨潤させる。膨潤したスポンジ又はシートを凍結し、−６５℃および５ ０　ミＩＪ　）−ル未溝の真空下凍結乾燥する。

例８ ヒアルロネートおよびプロテオグリカンを含有するコラーダンをベースとするマ トリックスの調製Ｆ１ｃｔ　ｐＨ５，ＣＪ中可溶性および不溶性コラーピン１． ２１に、ヒアルロネートとプロテオグリカン（シグマ化学、ｆＬ／−ド■−Ｐ） ＋７）複合体０．１２　ｊｉ／ＨＣＪ、　ｐＨ２，０を加え、最終容量１２０− とする。混合物をワーリングデレンダーにて分散し、例４の方法により凍結乾燥 又は風乾した。

例９ ■型コラーピンを含有するコラーダンをベースとするマトリックスの調製 ＨＣｊ　ｐＨ２，０中可ｆｉｇ　注文ｋｌ　不’ｆｆｉ　ａ　コラ−１”　ン１ −２１　Ｋ、０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７，２中ＩＶＷコラ−ｒノ０．０１ ２　ｇを加え、最終容量１２０−にする。混液をワーりングゾレンダーにて２分 間分散し、例４の方法によ゛リゾート又はスポンジに底形した。

例１０ コラーダンをベースとするマトリックスのシアナミド架橋 例４および６〜９の生成物をシアナミド１重量係−５，５を含有する水溶液に２ ２℃／２４時間浸漬することにより架橋する。除去後、スポンジとシートを数回 水を変え′″Ｃ２４時間十分に洗い、凍結し、−６５℃１５０　ｊ　ＩＪ　）− ル未溝の真空下凍結乾燥する。

例１１ 苛酷な脱水によるコラ−ピンをベースとする１トリツクスの架橋 例４および６〜１０の生成物を室温で真空オープンに入れ、５０　ミＩＪ　）− ル未溝の真空下にさらす、１時間後、試料を１１０℃に加熱し、この温度で７２ 時間保ち、それから温度を４０℃に下げる。ついで試料を真空オープンから殴り 出し、＝２０℃で貯蔵する。

例１２ サクシニミジル活性エステルを便５コラーｒンをベースとしたマトリックスの架 橋 例５により製造したサクシニミジル活性エステル架橋コラーピン２１’ｔＨＣヱ Ｐ）（２゜０４０〇−含有するワーリングデレンダーに入れ、２分間分散させる 。この混合物を３００ミリトールの真空下におくことにより脱気し、相対湿度１ ００％の環境にて室温に２４時間おく。ついでこの物質を０℃に冷却し、凍結し 、５０ミリトール未溝の真空を便って一６５°℃で凍結乾燥するか又は風乾して 夫々スポンジ又ｉエシートを作る。

ｖＡｌ　１３ デａテア−・ゼインヒビターを富有するコラーダンをベースとするマトリックス の調製 列４〜９により作ったスポンジ又はシートを２５％システィン又は０．１４　（ ｗ／ｖ）α・２マクログロブリンを含有するＨｚ　２　ｏ　ｒｒｔｐＨ２，０に 加える。混合物を凍結しつめで５０ミＩＪ　）−ル未溝の真空下−６５℃で凍結 乾燥するか又は室温で風乾する。

上記例の各生成物に２を２５　ｍＭ塩化カルシウム富有のｉ　Ｑ　ｍＭ　トリス −Ｈ（Ｊｐ）（入４２ｏＯ−に入れ、クロストリンラム、ヒストリカム由来の■ 型コラデナーゼ（シグマ化学）１００単位を試料１η当り加える。この試料ｔｔ ３７℃の環境におき、各試料の無損傷を１０分毎に肉眼でチェックする。各試料 が約０．５μｍより小さい片に肉眼的に分解する時間を記録する。結果は表１に 示す。

２り 列１５ 膨潤率の試験管内測定 変性コラーピンの膨潤率は架橋度とは逆比例する。

上記例の生成物を蒸留水に２分間ボイルし、ついで２枚めナフキンで吸＾取る。

１ｋｇＩ重ｋをこの物質を含むナフキン上部に２０秒おく。湿つ１こ試料の重量 を記録し、ついで試料を１１０℃で３時間乾燥した。乾＃に後重量を再度記録し 、膨潤率Ｃｒ）を次の式により計算した。

ｒ＝ｌ／■ｆ ｆｆと■は乾燥重量と湿潤重量であり、ＰｏとＰＨｚｏはそれぞれ物質と水の密 度である。結果は表１に示す。

例１６ コラーダンをベースとするマトリックスの物理的性質 上記の例により製造したスポンジとシートは方形（４，０ｃｍ　ｘ　１．Ｏｃｍ 　）のストリップに切り、物理的試験の前にリン酸バッファー浴液ＰＨ７，５に ２０分間浸漬した。このストリップはインストロンモデル１１２２Ｅ験獲置を便 って１０％／分の引張速度で２２℃−軸張力で試よした０ストリツプの一端）ヱ ｒ−ジ長さ２０ＵＬの４３　ｐｓｉｇ、の圧力下に閉じた空気グリップに入れた 。応力−張力曲線を得、それから高引張（Ｈ８Ｍ）および低引張時のヤングモジ ュールを計算しｆｓ　、低モジエール領域が終った引張りは８Ｌで表わし、破壊 時の引張りをｅｆで表わした。引張りの結果は表■に示す。

例１７ ：７ラー’Ｉンをペースとするマトリックスの床内生物適合性 上記例にしたがって製造したスポンジとシートは２．５Ｍのｒ線に照射殺菌後皮 内の生物適合性を試験した。移植は試験動物として雌のモルモット３５０．９を 便って殺菌条件下行なった。

１ｃ！ｎ、の皮膚切開は背中の片方に行ない、皮膚は筋膜層から離し、１ｃｍＸ １ｃＩＩＬ片の移植物をこのスペースに入れた。皮膚の一端は傷口クリップを使 って移植物と一緒に固定した。

動物は移植後ろ、９．１２日目に殺し、キャリアー、を含む組織はカーンン固定 液に入れ、組織学的研究のために処理した。結果は表■に示す。

ＴＡＢＺＪ　ＩＩ 皮下移植したコラーピノをベースとし たキャリアースポンジの生体内適合性 生長なし、移植物無傷 ＸＦＪ１コラーデン　ナシ　１２　炎症感応観られず、内部生長なし、移植物無 傷 Ｉ型コラーピン　５Ｄ（３１６炎症感応観られず、内部生長なし、移植物無傷 ■型コラーピン　ａ（１１＋５Ｄ（３１６炎症感３観られず、スポンジの縁に若 干内部生長、 移植物無傷 １型コラーピン　ａ（１１＋　５Ｄ（３１９炎症感応観られず、周囲に内部生長 、移植物無傷 ＩＷコラ−ｒ７　Ｐ　６　炎症感応観られず、内部生長なし、移植物無傷 １型コラーデン　Ｐ　＋５Ｄ（３）　６　炎症感応貌られず、周囲に良好な内部 生長、移植 物無傷 略記 Ｐ＝ササクシニルエステル法使って架橋ＳＤ＝苛酷な脱水 例１８ マトリックス層に対する拡散コントロール層の調裏例４〜１０により作ったス２ ンジおよびシー）を２って、シラスティック　メディカル　グレード接着剤１ｒ ｕｔｒ層はヘラを使ってマトリックス層の表直に適用した。拡散コントロール層 は２２℃で２時間１００ミリトールの真空を適用して硬化する。拡散コントロー ル層とマ）　ＩＪワックス層生ｇ複合体は十分厚Ａ皮膚の傷と接触させた。

１ｌ１９ 十分厚い皮膚傷について拡散層とマトリックス層の生物適合性 例１８により製造したスポンジとシートは雌のハートレイアルピノの３５０ｇ白 色モルモットについて開口皮膚傷の包帯として放射線殺菌後に試験した。各動物 は別々に給餌し、試験前に４日間重量を測った。試験１日前、動物は電気バリカ ンを便って刈り、続めてネアー（１（ａｉｒ）で脱色処理し、洗った。ついで動 物をエーテルで麻酔し、その背中をプロｆｈンー沃素とアルコール浴液で洗った 。リン酸バッファー溶液（０−１８２Ｍリン酸塩、０．１５４　Ｍ　ＮａＣ２） 　Ｋ浸漬シｆ、−マトリックス層拡散コントロール層から放る物質片２　ａｒｔ 　Ｘ　２　ａｎは肉脂肪（ｐａｎｎｉｃｕｌｕｓ　ｃａｒｎｏｓｕｓ）に対しマ トリックス層と同じ面積で十分厚す皮膚膓においた＠マトリックス層と拡散コン トロール層はクロムなめしのがット縫合糸を使って包帯の端で傷未に縫合した。

動物は包帯の上に滅菌綿包帯ス〆ンソをおりてしばり、ついで首のまわりに固定 したエラステイコン弾性テープ（ジョンノン・アンド・ジョンノン・プロダクツ 社）で包んだ。動物は実験中ケージに３度つないだ。

動物は毎日モニターし、その包帯は破れ目につ込て試験した。動物は移植後６． ９．１２日に殺し、移植物と傷床な削り取り、固定し、組織学的試験のために処 理した。結果は表■に示す。

ＴＡＢＬ三１ 十分の厚さに切った反膚傷に移植したシリコーン被覆したコラーダンをペースと したキャリアーの生体内適合性略記： Ｎ、工、Ｒ０＝炎症感応ｒＬＬ　工、’Ｌ＝移植物無傷Ｗ、工、Ｒ０＝弱い炎症 感応　Ｐ＝サクシニルエステル形戊による架橋ＳＤ＝　苛酷な脱水　（）＝　架 橋期間、日Ｃ＝シアナミド処理　ＨＡ／ＰＧ　＝ヒアルロネート／プロテオグリ カン複合体 本発明の各種変法は上記の教示からみて可能であるから、請求の範囲に記述した 範囲で、本発明に特に記述しｆＳ以外でも実施することができる。

手続補正書（自発） 昭和６０年＾月／７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コラーゲンをペースとする新規マトリツクスの製造法において、 ａ）１型、ＩＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンから成る群から選択したコラーゲン を液体媒質と混合して、コラーゲンをペースとする基体を得、 ｂ）工程ａ）の生成物に、カルボジイミド又は二官能注サクシンイミジル活性エ ステルの架橋剤を加え、そして ｃ）工程ｂ）の生成物を真空下に供して、コラーゲンをペースとするマトリツク スを得ることを特徴とする、上記方法。 ２．工程ｃ）を工程ｂ）の前に行なう、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．液体媒質はコラーゲンの溶媒である、請来の範囲第１項又は第２項記載の方 法。 ４．液体媒質はコラーゲンの分散剤である、請求の範囲第１項又は第２項記載の 方法。 ５．架橋剤はカルボジイミドであり、約０．１から１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度の溶 液である、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ６．カルボジイミド溶液とコラーゲンをペースとする基体は更に処理する前に２ 〜４０℃の温度で２〜９６時間維持する、請求の範囲第５項記載の方法。 ７．カルボジイミド溶液はｐＨ２〜１１である、請求の範囲第６項記載の方法。 ８．架橋剤は二官能注サクシンイミジル活性エステルであり、約０．１から約１ ５．０％（Ｗ／Ｖ）の濃度の溶液である、請求の範囲第１項又は第２項記載の方 法。 ９．二官能注サクシンイミジル活性エステル溶液とコラーゲンをペースとする基 体に更に処理する前に２〜４０℃の温度で２〜９６時間維持する、請求の範囲第 ８項記載の方法。 １０．工程ｃ）の前に、過剰の架橋剤を除く、請求の範囲第１項又は第２項記載 の方法。 １１．工程ｃ）は５０ミリトール未満の真空下５０℃から約２００℃の温度で行 なう、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 １２．工程ｃ）を２から９６時間行なう、請求の範囲第１１項記載の方法。 １３．スポンジ形のコラーゲンをペースとするマトリツクスを形成する方法にお いて、工程ｂ）の前に、コラーゲンをペースとする基体を凍結乾燥する、請求の 範囲第１項又は第２項記載の方法。 １４．コラーゲンをペースとする基体を凍結乾燥工程前に固形化する、請求の範 囲第１３項記載の方法。 １５．５０ミリトール未満の真空下および約２２℃から−１００℃の温度で、凍 結乾燥工程を行なう、請求の範囲第１４項記載の方法。 １６．コラーゲンをペースとする基体を０゜から−１００℃の温度で固形化する 、請求の範囲第１５項記載の方法。 １７．中間のコラーゲンをペースとするマトリツクスを工程ｃ）の前に凍結乾燥 する、請求の範囲第１３項記載の方法。 １８．中間のコラーゲンをペースとするマトリツクスを工程ｃ）の前の凍結乾燥 前に固形化する、請求の範囲第１７項記載の方法。 ｏ １９．約５０ミリトール未満の真空下および約２２゜から−１００℃の温度で凍 結乾燥を行なう、請求の範囲第１７項記載の方法。 ｏ ２０．コラーゲンをペースとする基体を０°から−１００℃の温度で固形化する 、請求の範囲第１７項記載の方法。 ２１．コラーゲンをペースとするマトリツクスをシート形に成形する方法におい て、コラーゲンなをペースとする基体を工程ｂ）前に乾燥する、請求の範囲第１ 項又は第２項記載の方法。 ２２．４から４０℃の温度で２から９６時間乾燥を行なう、請求の範囲第２１項 記載の方法。 ２３．コラーゲンをペースとするマトリツクスの形成中、キヤリアー化合物をこ のマトリツクスに加え、キヤリアー化合物はＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン 、ブイプロネクチン、ラミニン、ヒアルロネート、プロテオグリカン、表皮生長 因子、血小板誘導生長因子、脈管形成因子、抗生物質、防カビ剤、殺精子剤、酵 素かよび酵素阻害剤から成る群から選択される、請求の範囲第１項又は第２項記 載の方法。 ２４．コラーゲンをペースとするマトリツクスをスポンジ状に成形する方法にお いて、コラーゲンをペースとする基体を工程ｂ）前に凍結乾燥に供する、請求の 範囲第２３項記載の方法。 ２５．コラーゲンをペースとする基体を凍結乾燥工程前に固形化する、請求の範 囲第２４項記載の方法。 ２６．凍結乾燥工程を約５０ミリトール未満の真空下で約２２°から−１００℃ の温度で行なう、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．コラーゲンをペースとする基体を０から−１００℃の温度で固形化する、 請求の範囲第２６項記載の方法。 ２８．中間のコラーゲンをペースとするマトリツクスな工程ｃ）の前に凍結乾燥 に付する、請求の範囲第２４項記載の方法。 ２９．中間のコラーゲンをペースと下るマトリツクスを工程ｃ前の凍結乾燥前に 固形化する、請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０．凍結乾燥工程を約５０ミリトール未満の真空下で約２２°から−１００℃ の温度で行う、請求の範囲第２８項記載の方法。 ｏ ３１．コラーゲンをペースとする基体を０°から−１００℃の温度で固形化させ る、請求の範囲第２８項記載の方法。 ３２．コラーケンをペースとするマトリツクスをシート状に成形する方法におい て、コラーゲンをベースとする基体を工程ｂ）の前に乾燥させる、請求の範囲第 ２３項記載の方法。 ３３．乾燥は４°から４０℃の温度で２から９６時間行なう、請求の範囲第３２ 項記載の方法。 ３４．シート状のコラーゲンをペースとするマトリツクスを拡散層で被覆する工 程を含む、請求の範囲第３３項記載の方法。 ３５．拡散層は非多孔性である、請求の範囲第３４項記載の方法。 ３６．非多孔性拡散層は生物分解性である、請求の範囲第３４項記載の方法。 ３７．拡散層は非−生物分解可能なポリマーから出来ている、請求の範囲第３４ 項記載の方法。 ３８．分子量が少なくとも１．０×１０６であるＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型コ ラーゲンから成る群から選ばれにコラーゲンから成るコラーゲンをベースとする マトリツクス。 ３９．分子量が５０×１０６以上である、請求の範囲第３８項記載の方法。 ４０．共有結合を介してクロスリンク間の分子量が１，０００から１００，００ ０をペースとする、請求の範囲第３９項記載のコラーゲンをペースとするマトリ ツクス。 ４１．孔形３から１００μｍの間隔を有する、請求の範囲第３８項記載のコラー ゲンをペースとするマトリツクス。 ４２．ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、フイブロネクチン、ラミニン、ヒア ルロネート、プロテオグリカン、表皮生長因子、血小板由来生長因子、脈管形成 因子、抗生物質、防カピ剤、殺精子剤、酵素か与よび酵素阻害剤から成る群から 選択しにキヤリアー化合物を含む、請求の範囲第３８項記載のコラーゲンをペー スとするマトリツクス。 ４３．シート状である、請求の範囲第３８項又は第４２項記載のコラーゲンをベ ースとするマトリツクス。 ４４．拡散層を含む、請求の範囲第４３項記載のコラーゲンをペースとするマト リツクス。 ４５．コラーゲンをベースとするマトリツクスのいずれかの側に非多孔性拡散層 を適用する、請求の範囲第４４項記載のコラーゲンをペースとしにマトリツクス 。 ４６．非多孔性拡散層は生物分解性である、請求の範囲第４５項記載のコラーゲ ンをペースとするマトリツクス。 ４７．拡散層をコラーゲンをペースとするマトリツクスにしつかりと付着させる 、請求の範囲第４４項記載のコラーゲンをペースとしたマトリツクス。 ４８．コラーゲンをペースとするマトリツクスと拡散層は一緒にして少なくとも １００ｐＳｉの引張強度を有する。請求の範囲第４７項記載のコラーゲンをペー スとするマトリツクス。 ４９．コラーゲンをペースとするマトリツクスと拡散層は少なくとも１０％の変 形率を有する、請求の範囲第４７項記載のコラーゲンをペースとするマトリツク ス。 ５０．少なくとも約２．５の膨潤率を有する、請求の範囲第４３項記載のコラー ゲンをペースとするマトリツクス。