JPS61181387A - マラリアワクチン用ポリペプチドのイー・コリにおけるクローニングおよび発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、哺乳動物をマラリアから防御するワクチンに
関する。

発明の背景 マラリアは、長年鋭意研究が重ねられてきたにもかかわ
らず、ワクチンが開発されていない、重く、かつ広範囲
にわたる病気である。例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）、第２２６巻、６７９頁（１９８４年１１月９日
）参照。実験的に、ヒトを含めた哺乳類は、照射したス
ポロゾイトを接種することにより、マラリアの病原体、
プラスモジウム（Ｐ　Ｉａｓｍｏｄｉｕｍ）による感染
に対して防御される。

クライトら、アメリカン・ジャーナル・オプ・トロピカ
ル・メジシン・アンド・ハイジーン（Ｃ１ｙｄｅｅＬ　
ａｌ、　、Ａｍ、　Ｊ　、　Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄｓ　Ｈ
ｙｇ、　）、第２４巻、３９７頁（１９７５）およびリ
ークマンら、ブリティン、ダブリュー・エイチ・オー（
Ｒｉｅｃｋｍａｎｅｔ　ａｌ、　、Ｂｕｌｌ、　ＷＨＯ
）、第５７巻（補遺ｌ）、２６１頁（１９７９）参照。

ヨシダら、サイエンス（Ｙｏｓｈｉｄａ　　ｅｔ　　ａ
ｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ）、第２０７巻、７１頁（１９
８０）は、かかる防御は、少なくとも、スポロゾイトの
表面上のタンパク質、サーカムスボロゾイト（ＣＳ）タ
ンパク質に対する抗体により部分的に媒介され、ＣＳタ
ンパク質に対して生じたモノクローナル抗体は、ｉｎ　
　ｖｉｔｒ。

で感染を中和し、ｉｎ　　ｖｉｖｏで動物を防御する。

ＣＳタンパク質は、棟内で高度に進化的に保存されるが
、種間ではかなり異なる。

プラスモジウムの４つの種は、ヒトを感染させることが
公知である。これらは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ　、　
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ。

ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐ　、　ｏｖａｌｅ
）および四日熱原虫（Ｐ　、　ｍａｌａｒｉａｅ）であ
って、後の２つは頻度が少ない。科学的に興味深い他の
種は、１歯類住血胞子虫（Ｐ　、ｂｅｒｇｈｅｉ）およ
び猿マラリア原虫（Ｐ。

ｋｎｏｗｌｅｓｉ）であり、これらの種の宿主は、各々
、唱歯傾動物およびサルである。

猿マラリア原虫のＣＳタンパク質は、１２のアミノ酸配
列の１２のタンデム重複からなる。ザバラら、ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｚａｖａｌ
ａ　　ｅｔ　　ａｌ、　、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　
）、第１５７巻、１９４７頁（１９８３）は、該重複単
位に対するモノクローナル抗体が、抗スポロゾイト抗血
清の可溶化スポロゾイトタンパク質に対する接触をブロ
ックするという実験に基づいて、該重複単位が、猿マラ
リア原虫ＣＳタンパク質の主な免疫原であることを報告
している。ジシンら、ジャーナル・オブ・エクスベリメ
ンタル・メジシン（Ｇｙｓｉｎ　　ｅｔ　　ａｌ、　　
、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　）、　第１６０巻、９３
５頁（１９８４）は、猿マラリア原虫ＣＳタンパク質の
タンデム重複単位を表す合成の２４のペプチド残基は、
サルにおける病原性スポロゾイトの感染性を中和するこ
とを報告している。

コルマンら（Ｃｏｌｍａｎ　　ｅｔ　　ａｔ）　、国際
特許公開ＷＯ３４−２９２２−Ａ号（１９８４年８月２
日公開）は、猿マラリア原虫ＣＳタンパク質重複単位の
コーディング領域のタンパク質のクローニング、および
イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）におけるそのβ−ラクタ
マーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ融合株の発現を報告
している。ヌッセンッバイクラ（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉ
ｇ　　ｅｔ　　ａｌ、　）、米国特許第４４６６９１７
号は、Ｐ４４タンパク質と称するスポロゾイトタンパク
質、およびイー・コリにおけるそのクローニングおよび
発現を開示している。

エネアら、ブロンーディングズ・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・才ブ・サイエンシズ・ニー・ニス伊エイ（Ｅ
ｎｅａ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、第８１巻、７５２０頁（１９８４）
は、シノモルギマラリア原虫（Ｐ　、　ｃｙｎｏｍｏｌ
ｏｇｉ）のＣＳタンパク質質重類貝した重複単位構造を
報告している。

ケンブら（Ｋｅｍｐ　　ｅｔ　　ａｌ）　、国際特許公
開ＷＯ３４−０２９１７−Ａ号は、イー・コリにおける
熱帯熱マラリア原虫ｃＤＮＡのクローニングおよび発現
を開示している。

ゲノムら、サイエンス（Ｄ　ａｍｅ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、第２２５巻、５９３頁（＋９８４
’）は、イー・コリにおける熱帯熱マラリア原虫のＣＳ
タンパク質のクローニングおよび発現を報告している。

該タンパク質は、分子量約４４０００の約４１２のアミ
ノ酸からなると記載されている。これは、テトラペプチ
ドの４１タンデム重複からなる。モノクローナル抗体に
結合した重複領域由来の合成の７−１１１−および１５
−ペプチド残基は、ＣＳタンパク質に対して発生する。

発明の概要 一態様において、本発明は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ　
ｌａｓｉｏｄｉｕｍ　　ｆａｌｃｉｐａｒｕＩＩｌ）　
ＯＳタンパク質の重複単位の全部または一部に対するコ
ーディング配列を有するイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）
発現ベクターである。

他の態様において、本発明は、本発明のイー・コリ発現
ベクターで形質転換されたイー・コリ、および増殖イー
・コリ培養株から本発明の熱帯熱マラリア原虫ＣＳタン
パク質の４以上のタンデム重複単位を有するポリペプチ
ドを精製する方法からなる。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は、ＣＳタンパク質のコーディング配列を担う
熱帯熱マラリア原虫（Ｐ　、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）
ゲノムＤＮＡの領域の部分的制限エンドヌクレアーゼ開
裂地図である。 第ｔｂ図は、ｐＡｓｌの部分的制限エンドヌクレアーゼ
の開裂地図である。 聚吸堅県反 本発明のポリペプチドは、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ
）において産生される４つ以上のタンデムＣＳタンパク
質重複単位からなる。該ポリペプチドは、ＣＳタンパク
質ではないが、重複単位以外のＣＳタンパク質の部分を
含んでもよい。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕｍ）重複単位は、次に示す配列を有するテトラ
ペプチドである： アスパラギン（ａｓｎ）−アラニン（ａｌａ）−ａｓｎ
−プロリン（ｐｒｏ）−本発明のポリペプチド内で、種
々のテトラペプチドが存在し、かかるペプチドは、熱帯
熱マラリア原虫ＣＳタンパク質に関して、その抗体の反
応性に著しく悪い影響を及ぼさない。 例えば、ゲノムら、サイエンス（Ｄ　ａｍｅ　　ｅｔ　
　ａｌ、　。 Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、第２２５巻、５９３頁（１９８４
）に開示されている如く、天然に存在する熱帯熱マラリ
ア原虫における４１テトラペプチド重複の３７はａｓｎ
　−ａｌａ　−ａｓｎ　−ｐｒｏであり、４はａｓｎ−
バリン（ｖａｌ）−アスパラギン酸（ａｓｐ）　　ｐｒ
ｏである。好ましくは、本発明のポリペプチドにおける
テトラペプチド重複単位の半分以上は、いわゆる共通塩
基配列、ａｓｎ　−ａ　Ｉａ　−ａｓｎ　−ｐｒｏであ
る。 好ましくは、本発明のポリペプチドは、約８重複（即ち
３２アミノ酸）〜約１４８重複からなる。 さらに好ましくは、ポリペプチドは、約１６〜約１１２
の重複からなる。 本発明のポリペプチドは、ハイブリッド、即ち、非ＣＳ
タンパク質重複単位配列を有する融合ポリペプチドであ
ってもよい。かかる非ＣＳタンパク質重萬配列は、免疫
原性を高めるか、または組換微生物におけるクローニン
グおよび発現を促進する担体分子として機能し得る。あ
るいは、かかる追加的配列は、他のスポロゾイト免疫原
、他のプラスモジウム免疫原および／または他の非プラ
スモジウム免疫原に対する１以上のエピトープを担うこ
とができる。特に、イー・コリにおいて実施可能な量で
安定に発現されず、熱帯熱マラリア原虫に対する免疫化
に関して必要でないことが判明しているＣＳタンパク質
は、本発明から除外され本明細書において例示する本発
明のポリペプチドの種類の具体例は、次のとおりである
：重複のＣ末端と融合したｐＢＲ３２２におけるテトラ
サイクリン耐性（Ｌｅｔ　Ｒ）遺伝子由来の約３２のＮ
−末端アミノ酸を有する少なくとも４つの重複からなる
Ｒｔｅｔ＋ｔポリペプチド；重複のＣ末端と融合したｔ
ｅｔＲ遺伝子を有する少なくとも４つの重複からなるＲ
ｔｅｔｓｅポリペプチド； 重複のＣ末端と融合したＮＳＩの２２７のアミノ酸を有
する少なくとも４つの重複からなるＲＮＳ１ポリペプチ
ド； 重複のＮ末端と融合したＮＳ１の８１のＮ末端アミノ酸
を有する少なくとも４つの重複からなるＮ５ＩＲポリペ
プチド； 重複のＣ末端で一グリシン残基が続いている少なくとも
４つの重複からなるＲＧポリペプチド；重複のＣ末端で
一ロイシンーアルギニン残基につながっている少なくと
も・４つの重複からなるＲＬＡポリペブヂド：および 重複のＣ末端で−ａｓｎ−ｔｈｒ−ｖａｌ−ｓｅｒ−ｓ
ｅｒにつながっている少なくとも４つの重複からなるＲ
Ｎポリペプチド。 ＣＳタンパク質重複単位に関する遺伝子コーディング配
列は、公知の技術により得ることができる。 該技術には、合成、好ましくは、例えば、エリスら、ネ
イチャー（Ｅｌｌｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ、　、Ｎａｔｕ
ｒｅ）、第３０２巻、５３６頁（１９８３）に開示され
ている様なメツセンジャーＲＮＡの逆転写により、熱帯
熱マラリア原虫から得られるものによるか、または、前
記ゲノムら（Ｄ　ａｍｅ　　ｅｔ　　ａｌ）により開示
されている様な、熱帯熱マラリア原虫ゲノムＤＮＡから
得られる完全な遺伝子の直接的クローニングによるもの
が挙げられる。図面に、ｃｓタンパク質ココ−ディング
領域示す。熱帯熱マラリア原虫およびそのスポロゾイト
は、感染したヒトおよび蚊より得ることができる。 ＣＳタンパク質の全部または一部に対するコーディング
配列をクローンし、重複単位の全部または一部をコード
するそのサブフラグメントを、公知の技術により調製す
ることができる。第１ａ図に、ＣＳタンパク質遺伝子内
の選択された有用な制限サイトを示す。好ましいサイト
はＸｈｏｌＩサイトである。Ｘｈｏ■で切断すると、次
に示す１６重複のコーディング配列が得られる： Ｎ　−ａｓｐ−ｐｒｏ　　（（ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ
−ｐｒｏ）＋５（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｐｒｏ）＋
〕ｎＣ 〔式中、ｎはｌである〕 適当な配列の多重タンデムＸｈｏＩＩフラグメントを用
いることにより、さらに長い重複、即ち、ｎが１以上で
ある重複が得られる。 合成技術は公知であり、かつ、商業的に入手可能なりＮ
Ａ合成装置を用いて達成することができる。実質的に同
じアミノ酸に関するコドンを有し、同じＸｈｏ■末端ま
たは末端に異なる開裂サイトを有する合成オリゴヌクレ
オチドを合成することができる。かかる合成オリゴヌク
レオチドは、天然の６４コドンと異なってもよく、同じ
アミノ酸、または少数の、好ましくは約８未満の異なる
アミノ酸をコードし得る。ただし、これらはポリペプチ
ドの免疫防御性に著しく悪影響を及ぼさないものとする
。典型的な合成コーディング配列は、完全に、共通塩基
配列、（ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐｒｏ）ｎ（式中、
ｎは少なくとも４である）をコードする。 ポリペプチドのコーディング配列は、いかなるイー・コ
リ発現ベクターにも挿入することができ、その多くは公
知であり、かつ入手可能である。イー・コリにおける本
発明のポリペプチドの高レベルの発現は、生成物の異常
なアミノ酸組成（アスパラギン（ａｓｎ）約５０％、ア
ラニン（ａｌａ）２５％、プロリン（ｐｒｏ）　２５％
）の観点から、驚異的である。さらに以下に記載する様
に、プラスミドｐＡＳｌに含まれる様な、λ−ＰＬ−ロ
モーターおよびλ−ｃｌＩ　　リポソーム結合サイトか
らなる調節エレメントを用いて、コーディング配列がよ
く発現されることが判明している〔ローゼンベルクら、
メソッズ・オプ・エンザイモロジー（Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇｅｔ　　ａｌ、　、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　）、
第１０１巻、１２３頁（１９８３）およびシャツラマン
ら、エクスペリメンタル・マニピュレイション・才ブ・
ジーン・エクスプレッション、エム・イノウニ編、アカ
デミツクプレス、ニューヨーク（Ｓｈａｔｚｍａｎ　　
ｅｔ　ａｌ、。 ｉｎ　　Ｅ　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｍａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｇｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ、　ｅｄｉｔ、　ｂｙ　　Ｍ、　Ｔ　ｎｏｕｙｅ、　
ＡｃａｒｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）（
１９８２）参照）。ＭＳＩは、ｐＢＲ３２２複製開始点
、アンピシリン耐性マーカーおよびＰＬ、Ｎ抗停止機能
認識サイト（ＮｕｔＬおよびＮ　ｕ　ｔ　Ｒ）、ρ−依
依存性転写停止ダグナルｔＲｌ）およびＧ残基が直接Ｂ
ａｍＨＩ開裂サイトにつながっているａｌｌ翻訳開始サ
イトを含むｃｌＩリポソーム結合サイトを含むλ由来の
一連のフラグメントを担う。ｐＡｓｌは、ｐＫＣ３０ｃ
ＩＩから、ｐＫｃ３０ｃＩ［のｃＩｒ−ｐＢＲ３２２結
合のＢａｍＨＩサイトおよびｃｌＩＡＴＧ間のヌクレオ
チドを切除し、該分子を再結紮して、ＡＴＧのすぐ下流
にＢａｍＨＩサイトを再生することにより得ることがで
きる。ｐＫｃ３０ｃＵは、ｐＫＣ３０のＨｐａｌ　　サ
イトに、ｃ■遺伝子を担うλ由来の１゜３ｋｂ　　Ｈａ
ｅｍフラグメントを挿入することにより組立てることが
できる（前記シャツラマンら（Ｓｈａｔｚｍａｎ　ｅｔ
　ａｌ、）および前記ローゼンベルクら（Ｒｏｓｅｎｂ
ｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、）参照）。ｐＫｃ３０は、シミタ
ケら、ネイチ−？−（Ｓｈｉｍｉｔａｋｅ　　ｅｔ　　
ａＬ、　、Ｎａｔｕｒｅ）、第２９２巻、１２８頁（１
９８１）により記載されている。これは、ｐＢＲ３２２
のｔｅｔ　Ｒ遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ
サイト間に挿入されたλの２゜４　ｋｂ　　）Ｔｉｎｄ
Ｉ［Ｉ−ＢａｍＨｒフラグメントを有するｐＢＲ３２２
誘導体である。ｐＡｓｔ　　に類似した構造は、コート
ニーら、ネイチャー（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　ｅｔａｌ　、
　、　Ｎａｔｕｒｅ）、第３１３巻、１４９頁（１９８
５）に記載されている。１）ＡＳＩは、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａ　ｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ１ｔｅｃｔｉｏｎ、Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に、ブダペスト
条約に従って寄託されている。コーディング配列は、有
効に、即ち、適当な配列で、適当な解読フレーム中で、
イー・コリ発現ベクターの調節エレメントに、標準的技
術により結合され、本発明の発現ベクターを形成する。 この様に発現されたポリペプチドを、公知の標準的タン
パク質単離技術により、増殖培養株から単離精製する。 典型的な、有用な一連の精製反応は、ｌ）細胞の破壊、
２）細胞片の清澄化、３）本発明のポリペプチドの、清
澄化細胞抽出物中に存在する他のポリペプチドからの分
離、４）残存ポリペプチド、炭水化物、核酸および／ま
たはりポポリサッカライドを含む残存する汚染物質を除
去するための最終精製からなる。 第１工程は、例えば、リソシームまたは他の溶解または
浸透化剤を添加するか、あるいは機械的または超音波破
壊により達成することができる。 抽出物を清澄化するための遠心操作または濾過の前に、
界面活性剤を添加して、本発明のポリペプチドを溶液状
態に保つ。 本発明の一態様としては、本発明のある種のポリペプチ
ドは、清澄化した抽出物を、タンパク質の溶解性を維持
するために界面活性剤を添加した後、約８０℃に加熱す
ることにより、他のポリペプチドから非常に効率よく分
離できることが判明した。少なくとも約４分間８０℃に
加熱することにより、実質的に重複または他の非熱変性
配列と融合した重複からなるポリペプチドを変性させる
ことなく殆んど全ての細菌性ポリペプチドを沈殿させら
れることが判明した。変性した細菌性ポリペプチドは、
遠心操作によりペレット化し、除去することができる。 この操作は、Ｒｔｅｔ３ｔ、ＲＧｌＲＬＡおよびＲｔｅ
ｔｅａポリペプチドを精製するのに用いられる。特に、
この操作は、以下の実施例に記載の如く、ＲＩ　６　ｔ
ｅｔ３．、Ｒ３２Ｌｅｔ３ｔ、Ｒ４８ｔｅｔ３２、Ｒ６
４ｔｅｔＨ１Ｒ４８Ｇ、Ｒ３２ＬＡおよびＲＩ　６　ｔ
ｅｔａｅをうまく精製するのに用いられるが、Ｒ１６Ｎ
ＳＩおよびＲ３２ＮＳ１を加熱すると、これらのポリペ
プチドは沈殿する。 例えば、選択的沈殿剤を添加し、次いでイオン交換クロ
マトグラフィーまたは逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ等の仕上クロマ
トグラフィ一工程により、本発明のポリペプチドをさら
に精製することができる。 本発明のワクチンにおいて、好ましくは生理的ｐＨに緩
衝された本発明のポリペプチドの水性溶液を直接用いる
ことができる。あるいは、通常の凍結乾燥を施したかま
たはしていないポリペプチドを、いかなる各種公知のア
ジュバントと混合あるいは吸着させることができる。か
かるアジュバントとしては、とりわけ水酸化アルミニウ
ム、ムラミルジペプチドおよびＱｕｉｌ　Ａ等のサポニ
ンが挙げられる。別の変法例として、ポリペプチドをリ
ポソーム等の微粒子中に封入することができる。 さらに別法例として、死菌百日咳（Ｂ　ｏｒｄｅｔｅｌ
　Ｉａ）または破傷風トキソイド等の免疫刺激性高分子
に接合することができる。 ワクチンの調製は、一般的に、「ワクチンにおける新傾
向および発展」ポーラ−ら編、ユニバシティー・パーク
・プレス（Ｎｅｗ　　Ｔｒｅｎｄｓ　　ａｎｄＤｅｖｅ
ｌｏｐｅｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、　
　ｅｄｉｔｅｄ　　ｂｙＶｏｌｌｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ
、　、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　Ｐａｒｋ　　Ｐｒｅｓ
ｓ。 Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、　Ｓ　、
　Ａ）、（１９７８）に記載されている。リポソーム中
への封入は、例えば、フユジートン（Ｆ　ｕｌｌｅｒｔ
ｏｎ）、米国特許第４２３５８７７号に記載されている
。タンパク質の高分子への接合は、例えぼりクハイト（
Ｌ　１ｋｈｉｔｅ）、米国特許第４３７２９４５号およ
びアーモーら（ａｒｍｏｒ　　ｅｔ　　ａｔ、　）、米
国特許第４４７４７５７号により開示されている。Ｑｕ
ｉｌ　Ａの使用は、例えばプレスガードら、アクタ・ベ
テリナリア・スカンジナビ力（Ｄａｌｓｇａａｒｄ　　
ｅｔ　　ａｌ、　、Ａｃｔａ、　Ｖｅｔ。 ５ｃａｎｄ、　）、第１８巻、３４９頁、（１９７７）
に開示されている。 各ワクヂン投与量中に存在するポリペプチドの量は、典
型的なワクチンにおける著しく有害な副作用なしに免疫
防御応答を惹起する量として選択される。かかる量は、
どのポリペプチドを用いるか、およびワクチンにアジュ
バントが添加されているか否かによって異なる。一般に
、各投与量はポリペプチドを１−１０００μ９、好まし
くは、１０〜２００μ２含有する。特定のワクチンに対
する最適量は、抗体力価および患者における他の応答の
観察を含めた標準的考察により確かめることができる。 第１同棲種の後、患者は好ましくは約４週間後に追加抗
原投与を受け、その後、感染の危険性が存在するかぎり
、６力月毎に追加抗原投与を繰返し受ける。 以下の実施例で本発明を説明するが、これに限定される
ものではない。ＣＳタンパク質コーディング配列は、ジ
ェームズ・ウェーバ−、ウォルター・リード・アーミー
・インスティチュート・フォア・リサーチ（Ｊ　ａｍｅ
ｓ　　Ｗｅｂｅｒ、Ｗａｌｔｅｒ　　ＲｅｅｄＡｒｍｙ
　　ｒ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　ｆｏｒ　　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）により、ｐＵＣ８（標準的なイー・コリクローニ
ングベクター（例えば、ベゼスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ・インコーホレイテッド（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　
ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ　ｎ
ｃ、　、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）より入手
可能）のＥｃｏＲＩサイトにおけるλｍＰＦ１（前記ゲ
ノムら（Ｄａｍｅ　　ｅｔ　　ａｌ、　）参照）の２３
３７ｂｐ　　ＥｃｏＲＩフラグメント（第１ａ図参照）
として得た。得られたｐＵＣ８誘導体は、ｐＵＣ８クロ
ーンｌと称する。 寒監匹 実施例１ ＣＳタンパク質誘導体 精製したｐＵＣ８クローンｌプラスミドＤＮＡ４０μ９
を培地緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７，５５０ｍＭ　
　ＮａＣＱ、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１
０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２２）　４００　ｕＱ中制限エンド
ヌクレアーゼ５ｔｕＩおよびＲｓａｌ　　（各酵素、そ
れぞれ１００単位）で３７℃にて１．５時間消化する。 ＣＳタンパク質のはじめの１８アミノ酸以外をコードす
る得られた１２１６塩基対フラグメントを、５％ポリア
クリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）上での電気泳動により単
離する。発現ベクター１）ＡＳＩ　　１０μ９を、培地
緩衝液２００μρ中制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ
　２５単位で、３７℃にて１．５時間消化する。切断さ
れたプラスミドを、次いでＤＮＡポリメラージーフラグ
メントで処理しくフレノウ５単位；２０ｍＭ）リス−Ｈ
ＣＱＳｌ）Ｈ７，５，７ｍＭ　　ＭｇＣｈ、６０ｍＭ　
　Ｎａｃ（１，６ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび
各０．２５ｍＭの４種のデオキシヌクレオチドトリホス
フェート：２５℃、１５分）、ＢａｍＨＩサイトの末端
をうめる。Ｏ９遺伝子フラグメントＩμ９を次いで３０
μＱリガーゼバッフｙ−（５０ｍＭトリス、ｐＨ７，５
，１ｍＭ　　ＤＴＴｌ　１０ｍＭ　　ＭｇＣＱｔ、１０
０μＭ　　ｒＡＴＰ）中、１単位のＴ４−ＤＮＡリガー
ゼで４℃にて１６時間、このベクター１００ｒ＋９に結
紮する。該結紮混合物をイー・コリＭＭ２９４ＣＩ＋株
に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを得、Ｃ８遺
伝子フラグメントのｐＡｓｌ　　中への挿入に関してス
クリーンする。適正な構造を有するプラスミド（ｐＣＳ
Ｐ）を同定し、イー・コリＮ５１５１株（ｃｒｔｓ８５
７）に形質転換し、完全なＣＳタンパク質の発現に関し
てテストする。 （タンパク質のアミノ末端での１８アミノ酸の欠失は、
真正ＣＳタンパク質の開裂シグナルペプチドに対応する
。）細胞を、ルリア・ベルタニ・ブロス（ＬＢ）中で３
２℃にて６５０ｎｍでの吸収（Ａ。 、。）が０．６となる様に増殖させ、２時間４２８Ｃで
発現プラスミドのＰＬプロモーターの転写およびその結
果ＣＳタンパク質誘導体の翻訳が起こる。 細胞の１１１２をサンプルにとり、ペレット化し、溶解
緩衝液（１０ｍＭ）リス−ＨＣｅ、ｐＨ７，８，２５％
（Ｖ／Ｖ）グリセロール、２％２−メルカプトエタノー
ル、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．１％
ブロモフェニルブルー）中に再懸濁し、１０５℃加熱ブ
ロック中で５分間インキュベートする。タンパク質を５
ＤＳ−ＰＡＧＥ（１３％アクリルアミド３０：０．８　
　アクリルアミド：ビスアクリルアミド比）により分離
する。タンパク質をニトロセルロースに移し、イー・コ
リにおいて産生されたＣＳタンパク質を、熱帯熱マラリ
ア原虫ＣＳタンパク質のテトラペプチド重複領域と反応
性の５つのモノクローナル抗体のプールを用いて、ウェ
スタンプロット分析により検出する（前記ゲノムら（Ｄ
ａｍｅ　　ｅｔ　　ａｌ、　）参照）。 実施例２ Ｒｌ　６　Ｌｅｔｅａ 精製したｐｕｃｓクローンｌプラスミド１００μ９を培
地緩衝液４００μσ中制限工ンドヌクレアーゼＸｈｏ■
４０単位で３７℃にて、１６時間消化する。ＣＳタンパ
ク質の１６テトラベプチド重複をコードづける１９２塩
基対フラグメントを次いでＰＡＧＥにより単離する。発
現ベクターｐＡｓ１を実施例１に記載したのと同様にし
て制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂させる。実
施例１に記載したのと同様にして、１９２塩基対のＸ　
ｈｏ　ＩＩフラグメントｌμ２をｐＡｓｌ　　１００ｎ
９のＢａｍＨ■サイトに結紮する。結紮ミックスをイー
・コリＭＭ２９４ＣＩ十株に形質転換する。クローンは
、該プラスミドのＢａｍＨＩ　−ＨｌｎｄＩＩ　　フラ
グメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により
１）ＡＳＩのＢａｍＨＩサイトで適正な配列である１９
２塩基対のＸｈｏｌＩフラグメントを含有し、Ｈｉｎｄ
■サイトがｔｅｔＲ遺伝子の下流であり、ＢａｍＨＩサ
イトがｃｌｌＡＴＧ　および適正な配列のプラスミドの
挿入部の結合点にあるものと同定される。このプラスミ
ドｌ）ＲＩ　６　Ｌｅｔｅａは、次の様に表されるｐＢ
Ｒ３２２ＰＬ　　　重複　　ｔｅｔＲＳ　　ｐＢＲ３２
２ＢＨＢＢ （図中、ＢＨはＢａｍＨＩサイトを意味し、ＢはＢａｎ
■サイト、Ｓは終止コドンを意味する）。ｐＲ１６Ｌｅ
ｔｓｓは、イー・コリＮ５１５１株（ｃ　Ｉ　ｔｓ８５
７）を形質転換するのに用いられ、ウェスタン・プロッ
ト分析によりＣＳタンパク質のテトラペプチド重複の産
生に関して調べる。この様にして産生されたタンパク質
は、次の様な配列を有する：Ｎ−ｎｅｔ−ａｓｐ−ｐｒ
ｏ（ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐｒｏ）＋５（ａｓｎ−
ｖａｌａｓｐ−ｐｒｏ）、Ｔ　８６−Ｃ （式中、ＴＢＧはｐＡＳｌ上に存在するテトラサイクリ
ン耐性遺伝子由来の８６アミノ酸である）。 Ｎ−末端メチオニン（ｍｅｔ）残基も、ベクター、より
詳しくは、ｃ［Ｉタンパク質開始コドン由来である。 実施例２Ａ Ｒ３２ｔｅｔａａおよびＲ４８ｔｅｔａａ精製したｐＲ
Ｉ　６　ｔｅＬａｅプラスミドＤＮＡ１０ｔ１９を培地
緩衝液２００μｃ中ＢａｍＨＩ　２５単位で３７℃にて
２時間、消化する。このＤＮＡ１００ｎ！？を次いで前
記と同様にして、＋９２塩基対のＸｈｏｆｆフラグメン
トＩμ９と結紮する。次のポリペプチドをコードするプ
ラスミド発現ベクター、ｐＲ３２ｔｅｔａｇおよびｐＲ
４８ｔｅｔｓｅを調製し、イー・コリにおいて発現させ
る： Ｎ　−ｍｅｔ　−ａｓｐ−ｐｒｏ　Ｃ（ａｓｎ−ａｌａ
−ａｓｎ−ｐｒｏ）　＋　５−（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓ
ｐ−ｐｒｏ）＋　）　ｎ−Ｔ　８６−Ｃ（式中、ｎは２
　（Ｒ３２ｔｅｔｓａ）またはｎは３（Ｒ４８ｔｅｔｅ
ｓ）である。）ｎが２または３であるｐＡｓ１クローン
は、前記と同様にして、各々ｎが２または３以外である
クローンから選択される。調べた全てのクローンは、適
正な配列の挿入部を有していた。Ｒ３２ｔｅｔｓｅおよ
びＲ４８ｔｅｔｅｅは両方とも、イムノプロッティング
により評価される如く、Ｒ１６ｔｅＬｅとほぼ同じレベ
ルで発現される。 数種のＲｔｅｔｓｅタンパク質のイムノプロット分析に
より、クーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０染
色により見られない不均一な生成物があることが示され
る。これらのタンパク質は、以下に記載の如（ＲｔｅＬ
ａｔポリペプチドのおよそ半量まで蓄積されると考えら
れる。最小の分解生成物の大きさは、クローン中のテト
ラペプチド重複の数に比例する。これらのタンパク質の
不安定性は、不均質Ｃ０ＯＨ末端の低下による。 実施例３ Ｒｌ　６　ｔｅＬｅを 精製したｐＲＩ６Ｌｅｔｓｅ　ＤＮＡｌ０．ＣＺ９を培
地緩衝液２００μρ中制限エンドヌクレアーゼＢａｎＩ
［２５単位で、３７℃にて２時間で切断する。切断した
ＤＤＮＡｌｏｏｎを次いで結紮する。この操作により！
４塩基対のＢａｎＵフラグメントが欠失し、残存するＢ
ａｎＩ［サイトのすぐ下流に終止コドンが生じる。得ら
れたプラスミドｐＲｌ　６　ｔｅｔ３ｔを用いてイー・
コリＮ５１５１株においてＲＩ　６　ｔｅｔｓｔを発現
させ、ＲＩ　６　ｔｅｔｓｔをこれから精製する。 ＲＩ　６　Ｌｅｔ、ｔを含有するイー・コリ３０ｇ（湿
潤重量）を緩衝液Ａ（５０ｍＭ）リスＨＣｌ２、ｐ）（
８，０，２ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸ＤＴＡ）、
０．１ｍＭジチオトレイトール、５％（Ｖ／Ｖ）グリセ
ロール）２００ｉ（中に再懸濁させる。リソザイムを添
加して最終濃度を０．２ｔｘｇ／＊Ｑにし、該混合物を
氷上で３０分間インキュベートし、細胞を溶解させる。 該混合物を次いでワーリングブレングー中、最高値にセ
ットして３分間処理し、次いでプランラン３５０超音波
装置で１分間超音波処理することにより、微生物性ＤＮ
Ａを除去する。デオキシコール酸ナトリウムを添加して
最終濃度を０．１％（Ｗ／Ｖ）にし、この混合物を４℃
にて３０分間撹拌する。該懸濁液を次いで１２０００Ｘ
９で３０分間遠心操作に付し、細胞片を除去する。上清
をフラスコ中に集め、沸騰水浴中で１０分間インキュベ
ートし、１２０００ｘｙで３０分間遠心分離する。殆ど
全てのイー・コリタンパク質が、加熱工程中に沈殿し、
遠心操作中にペレット化され、一方、Ｒ１６ｔｅｔｔｈ
ｔタンパク質は溶解性で、上清中に含まれる。上清を集
め、次いで硫酸アルミニウムをゆっくり添加して、最終
濃度を飽和状態の２０％とする。これにより、Ｒ１６ｔ
ｅｔＢタンパク質が選択的に沈殿し、これを遠心操作（
１２０００×２で３０分間）により集める。この時点で
、Ｒ１６ｔｅｔｓ＊は、他の汚染バクテリアタンパク質
に関して約９５％純粋である。 最終クロマトグラフィ一工程（例えば、イオン交換、逆
相高速液体クロマトグラフィー、フエニルセファロース
クロマトグラフイー、サイズ・セパレーション等）を行
い、タンパク質、炭水化物、核酸またはりボボリサッカ
ライド等の他の物質による残存する汚染物質を除去する
。ＲＩ　６　Ｌｅａｓｔを発現させ、イー・コリタンパ
ク質全体の５％にほぼ等しいレベル、即ち、フーマシー
ブルー染色により示される様な、約３０〜６０ｍｇ／Ｌ
で精製する。 Ｒ１６ｔｅｔａｔは次に示す配列を有する・Ｎ　−ｍｅ
ｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　Ｃ（ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐ
ｒｏ）＋５（ａｓｎ−ｖａトａｓｐ−ｐｒｏ）＋　）　
ｎＴ　３２−Ｃ（式中、ｎは１、Ｔａ２はテトラサイク
リン耐性遺伝子由来の３２アミノ酸である。）さらに詳
しくは、Ｔａ２は、次の様に配列ニ ー　１ｅｕ−ａｒｇ−ａｒｇ−ｔｈｒ−ｈｉｓ−ａｒｇ
−ｇｌｙ−ａｒｇ−ｈ　ｉｓ−ｈｉｓ−ａｒｇ−ａｒｇ
−ｈ　ｉｓ−ａｒｇ−ａｙｓ−ｇｌｙ−ｃｙｓ−ｔｒｐ
−ａｒｇ−１ｅｕ−ｔｙｒ−ａｒｇ−ａｒｇ−ｈｉｓ−
ｈｉｓ−ａｒｇ−ｔｒｐ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ｇ
ｌｙ−ｓｅｔ−Ｃを有し、残存するＢａｎＩ［サイトは
、３０および３！残基の間にある。 実施例３Ａ Ｒ３２ｔｅｔ＋ｔ、Ｒ４８ｔｅｔ３を 前記実施例３と実質的に同様にして、Ｒ３２ｔｅｔ３ｔ
およびＲ４８ｔｅｔｔｔ（各々、ＲＬ　６　ｔｅｊＨに
おいてｎが２および３である）をイー・コリにおいて発
現させ、Ｒ１６ｔｅｔｆｆ２と同じレベルおよび程度の
純度に単離する。出発ベクターは、各々、ｐＲ３２ｔｅ
ｔｓａおよびｐＲ４８ｔｅｔｓａである。 実施例３Ｂ Ｒ６４ｔｅｔｊ２、Ｒ８０ｔｅｎｔ 精製したｐＲ４８ｔｅｔ３ｚプラスミドＤＮＡｌ０μ９
を培地緩衝液２００μρ中ＢａｍＨＩ　２５単位で、３
７℃にて２時間消化する。このＤＮＡ１００ｎ！？を次
いで前記と同様にして、１９２塩基対のＸｈ。 ■フラグメントｌｕ９と結紮する。次に示すポリペプチ
ドをコードするプラスミド発現ベクターを調製し、イー
・コリにおいて発現させる。 Ｎ　−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒ□　Ｃ（ａｓｎ−ａｌａ−
ａｓｎ−ｐｒｏ）＋５（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｐｒ
ｏ）＋）　ｎ−Ｔ　３２−Ｃ（式中、ｎは４　（Ｒ６４
ｔｅｔ３ｔ）またはｎは５（［Ｏｔｅｔ３ｇ）である）
。ｎが４または５であるｐＡｓ１クローンを、前記と同
様にして、各々、ｎ＃（４または５以外であるクローン
から選択する。　Ｒ６４ｔｅＬ、、およびＲ８０Ｌｅａ
ｓｔは両方ともＲ４８ｔｅｔ、ｔとほぼ同じレベルで発
現する。Ｒ６４Ｌｅａｓｔを、前記Ｒ１６Ｌｅａｓｔ、
Ｒ３２ｔｅｔａｔおよびＲ４８ｔｅｔｓｔと実質的に同
じ方法で精製する。 実施例３Ｃ Ｒ９６ｔｅｔ＋ｔおよびＲｌ　１２　ｔｅｔＨ前記実施
例３Ｂに記載したのと実質的に同様にして、Ｒ９６ｔｅ
ｔａｔおよびＲ１１２Ｌｅｔ＋２（各々、ｎは６および
７である）をＲ４８ＬｅｔＨとほぼ同じレベルでイー・
コリにおいて発現させる。出発ベクターはｐＲ８０ｔｅ
ｔｓｔである。 イムノプロット分、折により、精製したＲｔｅｔ３ｇポ
リペプチドにおいて、いくぶん不均一性がみられるが、
バンドに対応する主要な反応性種がタンパク質染色によ
り見られる。５ＤＳ−ＰＡＧＥによって得られる分子量
は、予想値の約２倍であるが、各タンパク質の移動は、
各構造中のテトラペプチドの数に比例する。数種のＲｔ
ｅＬａｔポリペプチドに関するアミノ酸組成決定は、予
想通りの値を示す。 実施例４ １６Ｇ ｐ’Ｉ’ｅｒｍは、配列； ５°−ＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡ　　
　−３’３°−ＧＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＣＴ
ＡＧ−５゜を有する合成リンカ−を、ｐＡｓｌのＢａｍ
ＨＩ　　サイトに挿入することにより調製される。ｐＡ
ｓ１１０ｕ９を２５単位のＢａｍＨＩで消化する。１０
０ｎ９のＢａｍＨＩ切断ｐＡ切断音Ａｓ１９の合成リン
カ−と結紮し、プラスミドｐＴ　ｅｒｍをｐΔＳｌのＢ
ａｍＨｌサイトに挿入されたリンカ−で同定する。この
ベクターはＢａｍＨＩサイトを有し、全ての３種の解読
フレーム中にｃＩＩ　タンパク質のＡＴＧ開始コドンの
下流にＴＧＡ終止コドンが挿入される。 ｐＲ１６Ｇは、ｐｔｒｃｓクローンｌ由来の１９２塩基
対のＸｈｏＩＩフラグメントをｐＴ　ｅｒｍのＢａｍＨ
Ｉサイトに挿入することにより調製し、適正な配列の１
つのＸｈｏ■挿入部を有するクローンを、実質ｐＲ１６
Ｇは、ｐｕｃｓクローンｌ由来の１９２塩基対のＸｈｏ
ｌＩフラグメントをｐＴｅｒｍのＢａｍＨＩサイトに挿
入することにより調製し、適正な配列の１つのＸｈｏＵ
挿入部を有するクローンを、実質的に前記と同様にして
選択する。 実質的に前記と同様にして、ｐＲ１６Ｇをクローン化し
、イー・コリＮ５１５１株において発現させる。 ＲＩ６Ｇは、次に示す配列を有する： Ｎ　−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｌａ−
ａｓｎ−ｐｒｏ）　＋　ａ−（ａｓｎ−ｖａｌａｓｐ−
ｐｒｏ）Ｉ）ｎ−ｇｌｙ−Ｃ （式中、ｎはｌである）。 このタンパク質は芳香族残基を含有していないので、発
現レベルを定量化するクーマシーブリリアントブルーＲ
−２５０染色法によって視覚化することができない。ｃ
ｓタンパク質に関して特異的な５種のモノクローナル抗
体を用いたイムノプロット分析（前記ゲノムら（Ｄａｍ
ｅ　　ｅｔ　　ａｌ、）参照）により、クーマシーブリ
リアントブルーＲ−２５０染色が可能なＲＩ　６　ｔｅ
ｔ、と比較して評価したレベルは、全細胞タンパク質の
約１％である。 実施例４Ａ Ｒ３２Ｇ、Ｒ４８Ｇ１Ｒ６４ＧＳＲ８０ＧおよびＲ１１
２Ｇ 前記実施例４と同様にして、Ｒ３２ＧＳＲ４８Ｇ、Ｒ６
４Ｇ、Ｒ８０ＧおよびＲ１１２Ｇ（Ｒ１６Ｇにおいて各
々、ｎが２．３．４．５または７である）をイー・コリ
Ｎ５１５１株において発現させる。これらのポリペプチ
ドは、Ｒ１６Ｇとほぼ同じレベルで発現される。実質的
に実施例３に記載したのと同様にして、Ｒ４８Ｇを精製
する。 実施例５ Ｒ１６ＬＡおよびＲ３２ＬＡ 実質的に実施例４に記載したのと同様にして、配列： ５°−ＧＡＴＣＣＧＣＴＧＣＧＴＴ　　　−３’３″−
ＧＣＧＡＣＧＣＡＡＣＴＡＧ−５゜を有する合成リンカ
−をｐＡｓｌのＢａｍＨＩ　　サイトに挿入することに
よりｐＴ　ｅｒｍ　２を調製する。 ｐＴ　ｅｒｍ　２はＢａｍＨＩサイトを有する。ｐＵＣ
８りローンｌ由来の１９２塩基対のＸｈｏＩＩフラグメ
ントを前記と同様にして挿入する。各々、適正な配列の
１種または２種のＸｈｏＩＩ挿入部を有するクローンで
あるｐＲ１６，ＬＡおよびｐＲ３２ＬＡを、実質的に前
記と同様にして選択する。実質的に実施例３に記載した
のと同様にして、Ｒ３２ＬＡを精製する。 実質的に前記と同様にして、ｐＲ１６ＬＡおよびｐｒ（
３２ＬＡをクローン化し、イー・コリＮ５１５１株にお
いて発現させる。 ＲＩ６ＬＡおよびｒ（３２Ｌ’Ａはつぎの配列を有する
： Ｎ　−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｌａ−
ａｓｎ−ｐｒｏ）　＋　５（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ−
ｐｒｏ）＋）　ｎ−１ｅｎ−１ｅｕ−ａｒ式中、ｎは、
各々、■および２である）。Ｃ末端のロイシンおよびア
ルギニンは、ｐＴ　ｅｒｍ　２の合成リンカ−由来のも
のである。Ｒ１６ＬＡは全イー・コリタンパク質の約１
％で発現され、一方、Ｒ３２ＬＡは、全細胞タンパク質
の約５％で発現される。 実施例６ Ｒ１’６ＮＳ！ ｐＡｓ１デルタＥＨは、ＰＡＳＩ　　起源のＴ）ＢＲ３
２２の必須でないＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩ［領域
の切除により調製される。実質的に前記と同様にして、
１０　μ９（７）ＰＡ　Ｓ　ｌを、培地緩衝液２００ｕ
Ｑ中ＥｃｏＲ■およびＨｉｎｄＩ［Ｉ（各々、２Ｇ単位
）で切断し、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ）で処理し
、結紮し、イー・コリ中に形質転換する。２９塩基対の
ＥｃｏＲｒ　−Ｈ１ｎｄｌｌｒ　フラグメントが欠失し
たクローンを同定する。８６１塩基対のビールス原およ
び３７５塩基対のｐＢＲ３２２原生にインフルエンザビ
ールス（Ａ／ＰＲ／８／３４）ＮＳ　１コーデイング領
域を含有するｐＡＰＲ８０１の１２３６塩基対のＢａｍ
ＨＩフラグメント（ヤングら、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニ
ー・ニス・エイ（Ｙｏｕｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ、　、Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ。 Ｓ　、Ａ）、第８０巻、６１０５頁（１９８３）参照）
を、ｐＡＳｌデルタＥＨのＢａｍＨＩサイトに挿入する
。得られたプラスミド、ｐＡｓ１デルタＥＨ／８０１は
真正のＮ５Ｉ（２３０アミノ酸）を発現する。このプラ
スミドは、ｃＩＩ翻訳開始サイトおよびＮＳＩコーディ
ング配列間にＢａｍＨ［サイトを有する。 実質的に前記と同様にして、１）ＡＳ＋デルタＥＨ／８
０１　　１０μ９を、ハイ・バッファー（５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ２、ｐＨ７，５、ＩｍＭ　　ＤＴＴ。 １０ｍＭ　　ＭｇＣσ７、Ｉ　ＯＯｍＭ　　ＮａＣｌ２
）　２００μＱ中ＥｃｏＲＩ　２０単位および５ａ１１
２０単位で、３７℃にて２時間で切断し、ＤＮＡポリメ
ラージーフラグメント（フレノウ）で処理し、結紮する
。 ６５０塩基対のＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　Ｉ領域が欠失し
たクローンを単離する。このプラスミド、ｐＮｓ１デル
タＥＳは真正のＮＳＩを発現する。 ｐｕｃｓクローン１由来の１９２塩基対のＸｈ。 ■フラグメントをｐＮＳｌデルタＥＳ中のＢａｍＨＩサ
イト中に挿入することによりｐＲ１６ＮｓＩを調製し、
実質的に前記と同様にして、適正な配列の１つのＸｈｏ
ｌｌ挿入部を有するクローンを選択す４っ 煮沸工程を除いて、実質的に前記と同様にして、ｐＲ１
６Ｎｓ１をクローンし、イー・コリにおいて発現し、Ｒ
１６ＮＳ＋を精製する。 ＲＩ６ＮＳＩは、次の配列を有する。 Ｎ　−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｈａ−
ａｓｎ−ｐｒｏ）　＋５（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｐ
ｒｏ）＋　）　ｎ−Ｎ　２２７（式中、ｎはｌ、Ｎ２２
７は、ＮＳＩ起源の２２７アミノ酸である）。 Ｒ１６Ｎ９１調製におけるＲＩ６ＮＳＩは、煮沸または
イオン交換工程なしで、タンパク質の８０％以上と評価
された。特に著しく高い比率を示すＲ１６ＮＳ１は、総
細胞タンパク質の約２５％である。 実施例６Ａ Ｒ３２ＮＳ　ｌ５Ｒ４８ＮＳ１およびＲ６４ＮＳＬ煮沸
工程を除いて、実質的に実施例３に記載したのと同様に
して、Ｒ３２ＮＳ１　　（Ｒ１６ＮＳ＋においてｎが２
である）をイー・コリにおいて発現し、イー・コリから
精製する。Ｒ３２ＮＳ　１はＲ１６ＮＳＩとほぼ同じレ
ベルで発現され、同じ程度まで精製する。 実質的に前記と同様にして、Ｒ４８ＮＳｌ（Ｒ１、６Ｎ
、Ｓ　ｌにおいてｎが３である）およびＲ６４ＮＳ’１
（Ｒ１６ＮＳ　１においてｎが４である）をイー・コリ
において発現させる。Ｒ４８ＮＳ　ＩおよびＲ６４ＮＳ
１は、各々、総イー・コリタンパク質の約ｌＯ％および
約５％で発現する。 実施例７ ５ＩＲ４８ 実質的に前記と同様にして、ｐＲ４８ｔｅｔｅａをＢａ
ｍＨＩで開裂させ、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ）で
末端をうめる。プラスミドを次いで前記の如＜ＢａｎＩ
Ｉで開裂させ、３つのＸｈｏｆｆフラグメントを担う６
７２塩基対のフラグメントおよびテトラサイクリン耐性
遺伝子由来の９６塩基対を得る。 実質的に前記と同様にして、１０μ９のＩ）ＡＳＩデル
タＥＨ／８０１をハイバッファ−２００μａ中Ｎｃｏ１
２０単位で３７℃にて２時間で切断し、ＤＮＡポリメラ
ージーフラグメント（フレノウ）で末端をうめる。Ｎｃ
ｏｌサイトは、ＮＳＩ中の８１残基に関するコドン中に
ある。プラスミドを次いで前記の如＜ＢａｎＩｒ切断し
て残存するＮＳＩコドンおよびテトラサイクリン耐性遺
伝子の一部を切除し、ｐＡｓｌデルタＥＨ／８０１−１
を得る。 ６７２塩基対のＢａｍＨＩ（末端をうめたもの）−Ｂａ
ｎＩＩフラグメントをｐＡｓＩデルタＥＨ／８０１−１
に挿入して１）Ｎ５ＩＲ４８を調製する。このプラスミ
ドを実質的に前記と同様にして、イー・コリにおいて発
現させる。Ｎ５ＩＲ４８は、次の配列を有する： Ｎ　−８１Ｎ　−ａｓｐ−ｐｒｏ　Ｃ（ａｓｎ−ａｌａ
−ａｓｎ−ｐｒｏ）＋５（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｐ
ｒｏ）＋　）　ｎ−Ｔ　３２−Ｃ（式中、８１ＮはＮＳ
Ｉの８１Ｎ末端アミノ酸、ｎは３、Ｔａ２は前記のとお
りである）。　Ｎ５ＩＲ４８は総細胞タンパク質の約５
％で発現される。 実施例８ ３２Ｎ 実質的に前記と同様にして、１０μ９のｌ）Ｒ３２ＮＳ
Ｉを培地Ｖ新液２００μｆ２中ＨｉｎｄＩ［２５単位で
３７°Ｃにて２時間で切断し、ｐＲ３２ＮＳ　１−１を
得る。ＨｉｎｄＩＩＩ　サイトはＮＳＩコーディング領
域中の残基５に関するコドン中にある。ｐＲ３２ＮＳＩ
−１１０Ｏｒ＋９を次いで実質的に前記と同様にして結
紮する。得られたプラスミド、ｐＲ３２Ｎは、ＮＳＩコ
ーディング配列において、５番目のコドンの後にＴＡＡ
終止コドンを含有する。 ｐＲ３２Ｎ　は、実質的に前記と同様にしてイー・コリ
においてＲ３２Ｎを発現するのに用いる。 Ｒ３２Ｎは、次の配列を有する： Ｎ　−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　　Ｃ（ａｓｎ−ａｌａ
−ａｓｎ−ｐｒｏ）　＋　５−（ａｓｎ−ｖａｉａｓｐ
−ｐｒｏ）＋　）　ｎ−Ｎ　５−Ｃ（式中、ｎは２、Ｎ
５はＮＳＩ　　遺伝子由来の５つのアミノ酸である）。 さらに詳しくは、Ｎ５は、次の配列を何するニ ーａｓｎ−ｔｈｒ−ｖａｌ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ＣＲ３２
Ｎは総イー・コリタンパク質の約５％で発現される。 実施例９ 抗体応答−ＥＬ　Ｉ　ＳＡ 組換タンパク質Ｒ１６ｔｅｔｓｔ、Ｒ３２ｔｅｔｓｔお
よびＲ４８ｔｅＬｔを実質的に前記と同様にして精製し
、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７、０（ＰＢＳ
）に対して透析し、アリコートをとり、−８０℃にて貯
蔵する。構築物を、ＰＢＳ、水酸化アルミニウム（明パ
ン）または完全フロインドアジュバント（ＣＦ　Ａ）の
いずれかと混合して、５０μ９のタンパク質を含有する
０　、　５　ＲＱの投与量を得る。 ＰＢＳ中ＣＦＡ（ＧＩＢＣＯｌＧｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎ
ｄ、　Ｎｅｗ　Ｙ　ｏｒｋ）十抗原をｌ：ｌの比で、機
械的撹拌機で３０分間撹拌することにより乳濁化させる
。明パンをＰＢＳ中に希釈した水酸化アルミニウムゲル
（ＵＳＰ）から調製する。 ４℃にて１２時間回転式混合機で、抗原は明パンに吸着
される。該懸濁液をさらに１２時間静置し、上清を廃棄
して、ｌ投与量につきＡ１２０．８０所お上び組換タン
パク質５０μ９を得る。６〜８週令のＣ５７Ｂ１／６マ
ウスを総量５０μ９のタンパク質を皮下投与および腹腔
内投与により免疫化する（１群につき５匹）。被験動物
に、第一回注射と同じ方法に従って、初期免疫化の４週
間後に追加抗原投与をする。ただし、ＣＦＡ中免疫原を
受けた群には、不完全フロインドアジュバント（■ＦＡ
）中孔濁化したタンパク質で追加抗原投与を行う。１週
間後、尾から採取した血を全部ため、−夜４℃にて凝固
させ、遠心操作に付して血清を分離する。この血清を必
要になるまで一８０℃にて保存する。 固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、熱帯熱マ
ラリア原虫ＣＳタンパク質（ａｓｎ−ａＱａ−ａｓｎ−
ｐｒｏ）ａの４つの重複からなるＩ６アミノ酸合成ペプ
チドとの反応性に関して、全ての血清をテストする（ゲ
ノムら、サイエンス（Ｄａｍｅ　　ｅｔ　　ａｌ、。 Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、第２２５巻、５９３頁（１９８４
）参照）。合成ペプチド抗原を牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）と結合させ、これをマイクロタイタープレートの孔
に塗布する。０．０１Ｍ　リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７
，４（ＰＢＳ）で希釈したスクリーニング抗原５０μ１
２（０，１μｇ）をポリスチレンマイクロタイタープレ
ート（イムンロン２　ダイナチク・ラボラトリーズ（Ｉ
　ｍｍｕｎｌｏｎ　２　　Ｄ　ｙｎａｔｅｃｈ　　Ｌ　
ａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　
　ＶＡ）のくぼみにピペットで添加し、−夜室温（約２
２℃ＸＲＴ）に保つ。 孔内容物を次いで、吸引し、ブロッキングバッファー（
ＢＢ＝ＰＢＳ中１．０％ＢＳＡ、０．５％カゼイン、０
．００５％チメルソールおよびｏ、ｏｏ。 ５％フェノールレッド）を充填し、１時間室温に保つ。 マウスの血清を連続してＢＢ中に希釈し、５０μｅを番
孔に添加する。室温にて２時間インキュベートした後、
孔を吸引し、ＰＢＳ−０，０５％ツイーン２０（ＰＢＳ
−ＴＷ２０）で３回洗浄し、■Ｏ％ＰＢＳ中熱不活化ヒ
ト血清で１１５００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ
＋Ｌ）（バイオラドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）と接合したホースラディツ
シュパーオキシダーゼ５０μａを番孔に添加する。１時
間後、孔内容物を吸引し、ＰＢＳ−ＴＷ２０で３回洗浄
し、次いで基質（１３！９２．２°−アジノージ−（３
−エチルベンズチアゾリンスルホン酸−６　）　／　Ｏ
、Ｉ　Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ４、ＯｗＱ。 使用直前に０．００５％過酸化水素を添加）を路孔に添
加する。４１４ｎｍにおける吸収を１時間後にＥＬｒＳ
Ａプレートリーダー（ティターチク・マルチスキャン、
フロー・ラボラトリーズ・インコーホレイテッド（Ｔ　
１ｔｅｒｔｅｋ　　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ、　　Ｆ　ｌｏ
ｗｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｉ　ｎｃ、　、　Ｍ
ｅ　Ｌ　ｅａｎ、　Ｖ　Ａ　））で測定する。 Ｒ１６ｔｅｔ３２、Ｒ３２ｔｅｔ、およびＲ４８ｔｅｔ
３を構築物は、全てＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて反応する抗
体を産生する。Ｒ１６ｔｅｔ＊ｔは、単独で投与した場
合、Ｒ３２ｔｅｔ＊ｚおよびＲ４８ｔｅｔａｔに比べて
免疫原性が劣る。明パンおよびＣＦＡは両方とも３種の
タンパク質全部の免疫原性を高め、抗体は、少なくとも
ｌ領域で滴定により＋０２０００検出される。 実施例ＩＯ 抗体応答−ｒＦＡ 実施例９で得た抗血清は、間接免疫蛍光抗体分ＶＦｒ（
ＩＦＡ）でテストし、真正熱帯熱マラリア原虫ＣＳタン
パク質と強く反応することが示された。 猿マラリア原虫、シノモルギマラリア原虫（Ｐ。 ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ、　ｖ
ｉｖａ）、およびガリナケウムマラリア原虫（Ｐ　、ｇ
ａｌｌｉｎａｃｅｕｍ）に対する反応性は検出されなか
った。Ｒ３２ｔｅｔ３２に対する抗血清の反応性は、若
干、嘔歯類住血胞子虫（Ｐ　、ｂｅｒｇｈｅｉ）に関し
てみられた。この結果は、ホックマイヤーら、プロシー
デングズ・サード・インターナショナル・シンポジウム
・オブ・イムノバイオロジー、プロテインズペプタイズ
、アタソン、エム・ゼット編、プレナム（Ｈｏｃｋｍｅ
ｙｅｒ　　ｅｔａｌ、、　　ｉｎ　　Ｐｒｏｃ、　　３
ｄ　　Ｉｎｔ’１．　Ｓｙｍｐ、　　Ｉｍｍｕｎｏ−ｂ
ｉｏｌ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　
　ｅｄ、　ｂｙ　Ａｔａｓｓｉ。 Ｍ、　Ｚ、、　　Ｐ　ｌｅｎｕｍ　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒ
ｋ（ｉｎｐｒｅｓｓ）による、熱帯熱マラリア原虫に対
するある種のＭａｂは、ＩＦＡにより、１歯類住血胞子
虫スポロゾイトと反応することを示すデータと一致する
。 実質的にボスワース、ジャーナル・オブ・バラントロシ
イ（Ｂｏｓｗｏｒｔｈ、　Ｊ　、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、
）、第６１巻、７６９頁（１９７５）に記載されている
のと同様にして、スポロゾイトを感染した蚊の唾液腺か
ら摘出し、食塩水または０．５％ＢＳＡを含有するＭｅ
ｄｉｕｍ　Ｉ　９９　（Ｇ　Ｉ　Ｂ　ＣＯ）中に希釈し
、血球計算盤で計測し、２０００〜５０００スポロゾイ
ト／ＩＯμｅに希釈する。１０μｅのアリコートを、マ
ルチウェルプリンテッドＩＦＡスライドの路孔に入れ、
室温で乾燥し、−８０’Ｃにて保存する。 ｒＦＡｉ；ｔ、まず、ＢＢでｌ／＋００７．：希釈した
血清２０μρ容を、乾燥したスポロゾイトを入れたＩＦ
Ａスライドの孔に入れることにより開始する。湿潤室内
で室温にて２０分間インキュベートした後、該血清溶液
を吸引し、スポットを２滴のＰＢＳで洗浄する。ＢＢで
１：４０に希釈したフルオレセインイソチオシアネート
（キルヶガード・アンド・ベリー（Ｋｉｒｋｅｇｏｒｄ
　　ａｎｄ　　Ｐｅｒｙ。 Ｇ　ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　　Ｍ　Ｄ　）と接合し
たヤギ抗マウス抗体２０μＱを次いで各スポットに添加
する。再び室温にて２０分間インキュベートした後、該
スポットを再び２滴のＰＢＳで洗浄し、グリセロールに
添加し、５００倍のＵＶ光の下で蛍光に関して調べる。 実施例１１ ｃｓｐ反応 Ｒｌ　６　ｔｅｔｓｔ、Ｒ３２ｔｅｔ、およびＲ４８ｔ
ｅｔｓｔで免疫化したマウス由来の血清は、強いｃｓｐ
ｌｉ性反応を示す（第１表参照）。アジュバントなしで
投与した場合、ＲＩ　６　ｔｅｔ＋ｔだけが、陽性のＣ
Ｓ２反応を示す抗体を産生せず、一方、ＣＦＡまたは明
パンとともに投与した場合、３つの構築物は全て強いＣ
１２反応を示す抗体を産生じた。 第　　１　　表 ＲＩ　６　ｔｅｔＨｌＲ３２ｔｅｔ３ｔおよびＲ４８ｔ
ｅｔｓｔに対する血清のＣ２Ｆ反応性 抗血清 アジュバント　Ｒ１６Ｌｅｔ３ｆＲ３２Ｌｅｔ３２Ｒ４
８ｔｅｔ３ｔなし　　　　　Ｏ／２５（−）　１７／２
５（２＋）　２１／２５（４＋）ＣＦＡ　　２３／２５
（４＋）　２１／２５（４＋）　２１／２５（４＋）明
パン　　　２５／２５（４＋）　２５／２５／（４＋）
　　１６／２７（２＋−４＋） Ｃ１２反応は、基本的にファンデルベルクら、（Ｖａｎ
ｄｅｒｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｉｌ、　Ｍｅｄ、）
、第１３４巻（補遺Ｉ）、１１８３頁（１９６９）によ
り記載されているのと同様にして行う。Ｍｅｄｉｕｍ　
Ｉ　９９　中に再懸尚させた熱帯熱マラリア原虫５００
〜１０００を含有する蚊唾液腺スポロゾイトを、顕微鏡
スライド上で血清５μＱと混合し、カバーガラスをかけ
、ペトロリウムゼリーをふちにつけて密封し、３７℃に
て１時間インキュベートする。位相差顕微鏡で４００倍
で反応を評価する。２５のランダムスポロゾイトを、各
血清サンプルに関して調べ、Ｃ９Ｐ陽性生体の数を表に
示す。面記ファンデルベルクら（Ｖ　ａｎｄｅｒｂｅｒ
ｇ　　ｅｔ　　ａｌ、）により記載されているＣ２Ｆ反
応度を書き加えである。 （−）は、ＣＳＰ反応性が検出されないことを示す＋（
２＋）は、スポロゾイトの表面上に粒状の沈殿が見られ
ることを示す；（４＋）は、スポロゾイトの一端に、長
い糸状フィラメントが見られることを示す。正常マウス
血清、およびＣＦＡのみで免疫化したマウスから得た血
清は、同様の分析で検出可能なＣ８Ｐ活性を示さなかっ
た。 実施例１２ 肝臓細胞ブロッキング 前記実施例９で得た血清を、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏでの侵
入阻害分析で調べた（第２表）。これらのデータにより
、Ｒ３２ｔｅｔＨおよびＲ４８Ｌｅｔ３．タンパク質は
アジュバントの非存在下でも抗体に強いブロッキング活
性を惹起することがわかる。Ｒｌ　６　ｔｅｔｓｔは、
適用され明パンに吸収される場合は、強いブロッキング
抗体の惹起にあまり有効でない。これは、Ｒｌ　６　ｔ
ｅｔｓｚタンパク質に生じる抗血清について見られる弱
いＣＳＰ反応性および低いＥＬｉＳＡ滴定値と一致する
。 第２表 ｉｎ　　ｖｉｔｒｏの熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト
侵入ＨｅｐＧ　２−Ａ　Ｉ　６ヘパトーム細胞の阻害な
　　し　　　　　　　　　　　　４６　　　　　　９５
　　　　　　９２ＣＰＡ　　　　　　　７６　　　９２
　　　９４明パン　　　　　１００　　１００　　　９
６培養細胞のスポロゾイト侵入の阻害は、ホリングデイ
ルら、ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｈｏｌｌｉｎ
ｇｄａｌｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、）第３２巻、９０９頁（１９８４）により記載され
ているのと実質的に同様にして行なわれる。Ｒ１６ｔｅ
ｔ、、、Ｒ３２Ｌｅｔ：＋ｔおよびＲ４８ｔｅｔａｔ構
築物で免疫化されたマウスから得た血清を、熱帯熱マラ
リア原虫スポロゾイトによる培養細胞の侵入の阻害性に
関してテストした。血清を培養液中に希釈し、ＨｅｐＧ
２−ＡＩ６細胞培養物に添加しで、最終希釈度をｌ　：
２０（ｖ／ｖ）にする。次いで１２０００〜４００００
の蚊唾液腺熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトを適用した
培養物を、３７℃にて５％ＣＯを雰囲気下で３時間イン
キュベートし、Ｄ　ｕｌｂｅｃｃ。 のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、メタノー
ル中で凝固させて、ＰＢＳで２回洗浄する。 細胞中にはいったスポロゾイトは、免疫パーオキシダー
ゼ分析（ＩＰＡ）により視覚化できる（前記ホリングデ
イルら（Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ　　ｅｔ　　ａｌ、参
照）。ＩＰＡは、まず、固定化培養物を熱帯熱マラリア
原虫に対するＭａｂ（２Ｆ　１　、　ｌ　、前記ゲノム
ら（Ｄａｍｅ　　ｅｔ　　ａｌ、参照）で処理し、次い
で、ホースラディツシュパーオキシダーゼと接合したウ
サギ抗マウスイムノグロブリンとともにインキュベート
し、３．３−ジアミノベンジジンで染色することにより
行う。培養細胞中に侵入したスポロゾイトの数を、ライ
フ（Ｌｅｉｔｚ）の顕微鏡で、２５０倍で、暗青色フィ
ルターを用いて、全調製物中に存在する細胞内寄生体の
計測により測定する。 実験は、２回または３回ずつ行い、同一の実験において
は、各細胞培養物に同数のスポロゾイトを添加する。阻
害は、正常マウス血清対照例と比較した杭構築免疫血清
によるスポロゾイト侵入の減少率（％）であり、ＣＳ反
応性Ｍａｂ２Ｆ　　１．１により、希釈度ｌ／２０で１
００％のスポロゾイト侵入阻害が得られた。 実質的に前記と同様にして調製した組換タンパク質、Ｒ
ＬＡ、Ｒ１６ＮＳ　！およびＲ３２ＮＳ　１を、同様に
ＥＬ　Ｉ　ＳＡおよびＩＦＡ分析でテストし、同様に、
１６合成ペプチド残基と反応する抗体を惹起し、陽性の
ＣＳＰ反応を示すことが判明した。Ｒ３２ｔｅｔ＝ｔお
よびＲ３２ＬＡは、その反応の均一性、発現レベルおよ
び調製の容易性のために好ましい。 合成的に製造したワクチンの第一の問題は、合成免疫原
性に対して産生された抗体が真正分子を認識するかどう
か、および該抗体が防御を付与するのに十分な生物学的
性質を有するかどうかである。免疫蛍光分析およびＣ８
Ｐ反応の両方を示す実施例により、イー・コリ構築物に
対して産生された抗体は、スポロゾイトの表面と反応し
、従って、真正ＣＳタンパク質を認識することがわかる
。 Ｃ９Ｐ抗体は動物およびヒトにおいて存在し、防御免疫
と重要な関連があることが判明している。 抗構築抗体がｉｎ　　ｖｉｔｒｏでヒトへブトーマのス
ポロゾイト侵入を阻害することは明らかである。前記ホ
リングデイルら（Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ　　ｅｔ　　
ａｌ、）は、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア
原虫に対するＭａｂは両方とも、これらのマラリア種に
対するヒト免疫由来のポリクローナル血清と同様に、ス
ポロゾイト侵入をブロックすることを示している。ｉｎ
　　ｖｉｔｒｏでのスポロゾイト侵入のブロッキングは
、従って防御抗体に関する評価として考慮される。従っ
て、該データは全体として、侵入のワクチンは、熱帯熱
マラリア原虫スポロゾイトによる感染からヒトを防御す
るのに用いることができることがわかる。 ＥＬＩＳＡ滴定により評価されるこれらの組換タンパク
質、表面反応性（ＩＦＡおよびＣ８Ｐにより示される）
およびスポロゾイト侵入のブロッキングに対する免疫応
答は、完全フロインドアジュバントまたは明パンのいず
れかを用いることにより高められる。完全フロインドア
ジュバントは、発熱させ、肉芽腫を生じさせ、その結果
、ツベルクリン過感作となるので、ヒトにおいて用いる
ことができない。明パンは、現在、ジフテリアおよび破
傷風トキソイド等の確立されたワクチン、ならびに最新
ワクチンの一種、Ｂ型肝炎において、アジュバントとし
て用いられている。これは、有効で、ヒトにおいて長期
間安全に使用できることが実証されている。 実施例１３ ワクチン調製物 一例として、ワクチンを以下の様にして調製する。３％
水酸化アルミニウムの緩衝水性溶液（１０ｍＭリン酸ナ
トリウム、１５０　ｍＭＮａｃ１２．　ｐＨ６。 ８；濾過により滅菌化）に、同様のＩＩ街液液中本発明
ポリペプチド溶液を撹拌しながら添加し、ポリペプチド
の最終濃度を１００μ９／村、アルミニウム（ＡＱ”＋
）の最終濃度を１．０肩９／酎にする。Ｉ）Ｈを６．６
　に保つ。該混合物を約０℃にて一夜静置する。チメル
ソールを添加し、最終農度を０．００５％にする。ｐ）
（をチェックし、要すれば、６゜８に調節する。 以上の様に本発明およびその好ましい具体例を記載した
が、本発明は、記載した具体例に限定されるわけではな
く、むしろ特許請求の範囲に含まれるあらゆる修飾が含
まれる。 ４、図面の簡単な説明 第１ａ図は、ＣＳタンパク質のコーディング配列を担う
熱帯熱マラリア原虫（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｕｉｍｆａｌｃ
ｉｐａｒｕｍ）ゲノムＤＮＡの領域の部分的制限エンド
ヌクレアーゼ開裂地図である。 第１ｂ図は、ｐＡｓｌの部分的制限エンドヌクレアーゼ
の開裂地図である。 特許出願人　スミスクライン・ベックマン・コーポレイ
ション 代　理　人　弁理士前　山　　葆ほか２名

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）調節エレメントと有効に結合した熱帯熱マラリア
   原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）
   のＣＳタンパク質の重複単位の全部または一部に対する
   コーディング配列を有するイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
   発現ベクター。
2. （２）ＣＳタンパク質コーディング配列またはそのタン
   デム重複のＸｈｏII−ＸｈｏII領域を含む前記第（１）
   項のベクター。
3. （３）コーディング配列が少なくとも４タンデム重複を
   コードする前記第（１）項のベクター。
4. （４）コーディング配列が少なくとも約１６〜１４８重
   複単位をコードする前記第（３）項のベクター。
5. （５）コーディング配列が、Ｒｔｅｔ＿３＿２ポリペプ
   チド、Ｒｔｅｔ＿８＿８ポリペプチド、ＲＮＳ１ポリペ
   プチド、ＮＳ１Ｒポリペプチド、ＲＧポリペプチド、Ｒ
   ＬＡポリペプチドおよびＲＮポリペプチドからなる群よ
   り選ばれるポリペプチドをコードする前記第（４）項の
   ベクター。
6. （６）コーディング配列が、 Ｒ１６ｔｅｔ＿８＿８　Ｒ３２Ｇ Ｒ３２ｔｅｔ＿８＿６　Ｒ４８Ｇ Ｒ４８ｔｅｔ＿８＿８　Ｒ６４Ｇ Ｒ１６ｔｅｔ＿３＿２　Ｒ８０Ｇ Ｒ３２ｔｅｔ＿３＿２　Ｒ１１２Ｇ Ｒ４８ｔｅｔ＿３＿２　Ｒ１６ＬＡ Ｒ６４ｔｅｔ＿３＿２　Ｒ３２ＬＡ Ｒ８０ｔｅｔ＿３＿２　Ｒ１６ＮＳ１ Ｒ９６ｔｅｔ＿３＿２　Ｒ３２ＮＳ１ Ｒ１１２ｔｅｔ＿３＿２　Ｒ４８ＮＳ１ Ｒ１６Ｇ　Ｒ６４ＮＳ１ ＮＳ１Ｒ４８　Ｒ３２Ｎ からなる群より選ばれるポリペプチドをコードする前記
   第（４）項のベクター。
7. （７）ポリペプチドがＲ３２ｔｅｔ＿３＿２またはＲ３
   ２ＬＡである前記第（４）項のベクター。
8. （８）調節エレメントが、ＰＬプロモーター、およびｃ
   II翻訳開始サイトを含めたｃIIリボソーム結合サイトを
   含む前記第（１）項のベクター。
9. （９）ｐＡＳ１調節エレメントを有する前記第（８）項
   のベクター。
10. （１０）前記第（１）項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
11. （１１）前記第（２）項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
12. （１２）前記第（３）項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
13. （１３）前記第（４）項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
14. （１４）前記第（５）項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
15. （１５）前記第（６）項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
16. （１６）前記第（７）項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
17. （１７）前記第（８）項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
18. （１８）前記第（９）項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
19. （１９）細胞抽出物に界面活性剤を添加し、次いで該抽
    出物を加熱して細菌性タンパク質を沈殿させ、さらにポ
    リペプチドを上清から精製することを特徴とする、増殖
    イー・コリの清澄化細胞抽出物から熱帯熱マラリア原虫
    ＣＳタンパク質の４以上のタンデム重複を有するポリペ
    プチドを精製する方法。
20. （２０）前記第（１０）項のイー・コリを培養してポリ
    ペプチドを産生し、これより該ポリペプチドを精製する
    ことを特徴とする熱帯熱マラリア原虫ＣＳタンパク質の
    ４以上のタンデム重複を有するポリペプチドの調製方法
    。