HU201803B - Process for producing polypeptides forming the agent of anti-malaria vaccine - Google Patents
Process for producing polypeptides forming the agent of anti-malaria vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- HU201803B HU201803B HU86505A HU50586A HU201803B HU 201803 B HU201803 B HU 201803B HU 86505 A HU86505 A HU 86505A HU 50586 A HU50586 A HU 50586A HU 201803 B HU201803 B HU 201803B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- polypeptide
- asn
- protein
- pro
- coli
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 92
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 8
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 title 1
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 38
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims abstract description 24
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract 2
- 101100245267 Caenorhabditis elegans pas-1 gene Proteins 0.000 claims description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 102200030043 rs10012 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 102220006123 rs1042713 Human genes 0.000 claims description 4
- 102220226324 rs1064794702 Human genes 0.000 claims description 3
- 102220278932 rs121913388 Human genes 0.000 claims description 3
- 102220045637 rs587782266 Human genes 0.000 claims description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 101000726057 Plasmodium falciparum Circumsporozoite protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101150023114 RNA1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 2
- 102220095215 rs876660436 Human genes 0.000 claims description 2
- SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 abstract description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 69
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 27
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 102100031675 DnaJ homolog subfamily C member 5 Human genes 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 241000223801 Plasmodium knowlesi Species 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150052200 CS gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 2
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2-[(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- NUHQMYUWLUSRJX-BIIVOSGPSA-N Asn-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N NUHQMYUWLUSRJX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100060179 Drosophila melanogaster Clk gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 108091006065 Gs proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012375 Ion exchange chromatography - high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101150038023 PEX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000223821 Plasmodium malariae Species 0.000 description 1
- 206010035501 Plasmodium malariae infection Diseases 0.000 description 1
- 241001505293 Plasmodium ovale Species 0.000 description 1
- 206010035502 Plasmodium ovale infection Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 244000000056 intracellular parasite Species 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 101150014555 pas-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 102220082674 rs538303703 Human genes 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 102220482253 tRNA pseudouridine synthase A_R16A_mutation Human genes 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A malária súlyos, széles körben elterjedt betegség, amely ellen - éveken át tartó erőfeszítések ellenére - még nem sikerült vakcinát előállítani (Science, 226 679/1984/). Kísérletesen már sikerült emlősöket - beleértve az embert is - védetté tenni a malária kórokozója, a Plasmodium okozta fertőzések ellen, besugárzott sporozoitokkal végzett vakcinálással (Clyde és munkatársai: Am. J. Tropp. Med. Hyg. 24, 397 /1975/ és Rieckman és munkatársai: Bull. WHO 57(Supp. 1) 261 /1979/). Yoshida és munkatársai (Science 207,71 /1980/) ismertették, hogy a fenti védettséget - legalábbis részben - a sporozoit felületén levő egyik proteinnel, a circumsporozoií (CS) proteinnel szembeni antitestek nediálják. A CS-proteinek ellen termelődött monoklonális antitestek in vitro semlegesítik a fertőzőképességet és in vivő védik az állatot. Úgy tűnik, hogy a CS-proteinek az egyes fajokon belül erősen megőrződnek az evolúció során, de különböző fajokban erősen eltérőek
Négy Plasmodium fajt ismerünk, amelyek az embert fertőzhetik. Ezek a P. falciparum, a P. vivax, a P. ovale és a P. malariae, az utóbbi kettő sokkal ritkábban fordul elő. A tudományos érdeklődés szempontjából fontosak még a P. berghei és a P. knowlesi, mivel ezen fajok gazdaszervezetei a rágcsálók, illetve a majmok
A P. knowlesi CS-protein je egy 12 aminosavból álló szekvencia 12 egymás utáni ismétlődését tartalmazza. Zavala és munkatársai (J. Exp. Med. 157, 1947 /1983/) szerint az ismétlődő egység a fő immunogén a P. knowlesi CS-protinen, a fenti megállapítást azokra a kísérletekre alapozták, amelyek azt mutatták, hogy az ismétlődő egységek elleni antitestek blokkolják az anti-sporozoit antiszérum hozzáférhetőségét a szolubilizált sporozoit proteinhez. Gysin és munkatársa (J.Exp.Med. 160,935/1984/) megállapították hogy a P. knowlesi CS-proteinjének egymás utáni ismétlődő egységeit képviselő szintetikus, 24 aminosavból álló peptid semlegesíti a virulens sporozoitok fertőzőképességét majmok esetén.
Colman és munkatársai (WΟ 84-2922-A, nyilvánosságra kerülés: 1984.08.02.) ismertették a P. knowlesi CS-protein ismétlődő egységét kódoló régió egy részének klónozását és béta-laktamázzal és béta-galaktozidázzal fuzionálva annak annak kifejeződését. Nussenzweig és munkatársai (US 4 466 917) ismertették a P44 proteinnek nevezett sporozoit proteint, és annak klónozását és kifejeződését E. coliban.
Enea és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7520 /1984/) is találtak egy hasonló ismétlődő egység szerkezetet a P. cynomologi CS-proteinjében,
Kemp és munkatársai (WO 84 02917-A) leírták a P. falciparum cDNS-ének klónozását és kifejeződését E. coliban.
Dame és munkatársai (Science 225,593 /1984/) leírták a P. falciparum CS-proteinjének klónozását és kifejezését E. coliban. A protein eszerint közel 412 aminosavból áll, átlagos molekulatömege 44000, és egy tetrapeptid 41 egymás utáni ismétlődését foglalja magában. Az ismétlődő szakaszból származó szintetikus 7-, 11-és 15-tagúpeptid-töredékek kötődnek a CS-proteinnel szembeni monok2 lonális antitestekhez.
A találmány tárgya egyrészt eljárás a Plasmodium falciparum CS-protein ismétlődő egységét vagy annak egy részét kódoló szekvenciát tartalmazó E. coli expressziós vektor előállítására.
A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti eljárással előállított expressziós vektorral transzfomált E. coli tenyészettel a P. falciparum CS-protein 16 vagy annál több egymás után ismétlődő egységét tartalmazó polipeptid előállítására és annak tisztítására az E. coli tenyészetből.
Az 1 a. ábra a CS-proteint kódoló szekvenciát tartalmazó P. falciparum genom DNS egy régiójának részleges endonukleázos hasításával nyert géntérképe.
A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid az E. coliban termelődő 16 vagy több egymás után ismétlődő CS-protein egységet tartalmaz. Ez ugyan nem azonos a CS-proteinnel, de tartalmazhatja a CS-protein bizonyos, az ismétlődő egységtől eltérő részeit is. A. P. falciparum ismétlődő egysége egy tetrapeptid, amelynek szekvenciája az alábbi:
-Asn-Ala-Asn-Pro-, a képletben Asn aszparagint, Alá alanint és Pro prolint jelent.
A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidben a fenti tetrapeptid variációi is előfordulhatnak, feltéve, hogy nem csökkentik jelentősen a velük szembeni antitestek reaktivitását a P. falciparum CS-proteinnel. Például Dame és munkatársai (Science 225,593 /1984/) világosan kifejtik, hogy a P. falciparum természetes CS-proteinjének 41 ismétlődő tetrapeptid egysége közül 37 szekvenciája Asn-Ala-Asn-Pro, míg 4 tetrapeptid szekvenciája Asn-Val-Asp-Pro - az utóbbi rövidítések közül Val jelentése valin és Asp jelentése aszparaginsav -. A polipeptid ismétlődő egységeinek előnyösen több, mint fele úgynevezett működő szekvenciának, azaz -Asn-Ala-Asa-Pro- szekvenciának felel meg.
A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid előnyösenkb. 16-112ismétlődő egységet tartalmaz.
A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid hibrid is lehet, vagyis nem-CS-protein ismétlődő egységet tartalmazó fúziós polipeptid. A fenti nem-CS-protein ismétlődő szekvencia hordozó molekulaként szolgálhat, az immunogén tulajdonságok fokozására, vagy a rekombináns mikroorganizmusban a klónozás és expresszió megkönnyítésére. Másik lehetőség, hogy a fenti kiegészítő szekvenciák más sporozoit-immunogénként, más Plasmodiumimmunogénként és/vagy más nem-Plasmodium-immunogénként szolgáló egy vagy több helyet hordoznak, A találmány csak azokra a CS-proteinekrenem vonatkozik, amelyek gyakorlatilag hasznosítható mennyiségben nem fejeződnek ki megbízhatóan E. coliban, és nem szükségesek a P. falciparum elleni immunizáláshoz.
A találmány szerinti eljárással közelebbről az alábbi polipeptidek állíthatók elő:
Rtet32 polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez a pBR322 tetraciklin-rezisztencia (tetR) génjéből származó kb. 32 N-terminális aminosav kapcsolódik;
-2HU 201803 Β
Rtet86 polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és C-terminális végükhöz egy tetR gén termék van fuzionálva;
RNS1 polipeptidek, amelyeklegalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez az NS1 227 aminosavja kapcsolódik;
NSIRpolipeptidek, amelyeklegalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok N-terminális végéhez az NS1 N-terminális 81 aminosavja van fuzionálva;
RG polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy glicin-aminosavmaradék kapcsolódik;
RLA polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy leucin-arginin aminosav-maradék kapcsolódik;
RN polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy Asn-Thr-Val-Ser-Ser- szekvencia kapcsolódik
A CS-protein ismétlődő egységeket genetikailag kódoló szekvenciát ismert módon állítjuk elő, például szintézissel; vagy, előnyösebben, P. falciparumból a m-RNS reverz transzkripciójával, például Ellis és munkatársai (Natúré 302,536/1983/) módszerével; vagy a P. falciparum genom DNS-éből származó érintetlen gén közvetlen klónozásával, például Dame és munkatársai fent idézettmódszere szerint. Az 1 .a ábra a CS-proteint kódoló régiót szemlélteti. AP. falciparumot és annak sporozoitjait fertőzött emberből vagy moszkitóból nyerhetjük.
A CS-proteint vagy annak egy részét kódoló szekvencia klónozása után ismert módon előállíthatjuk annak egy al-fragmentumát, amely az ismétlődő egységet vagy annak egy részét kódolja. A CS-protein génben levő megfelelő hozzáférhető restrikciós helyeket az la. ábrán szemléltetjük Előnyösek az Xho Π helyek Az Xho Π-vel végzett hasítással egy
N-Asp-Pro -[(Asm-Ala-Asn-Pro) i s(Asn-ValAsp-Pro) i ]n-C képletű, 16 ismétlődő egységet kódoló szekvencia válik szabadddá, a fenti képletben n értéke 1. Több tandem XHo Π fragmentumot a megfelelő orientációban használva hosszabb ismétlődő egységeket kapunk, azaz a fenti képletben n értéke
1-nél nagyobb lesz.
A szintetikus eljárások jól ismertek, és kereskedelmi forgalomban levő DNS-szintetizátorok alkalmazásával végrehajthatók Szintézissel előállítható olyan oligonukleotid, amely lényegében a fenti aminosavaknak megfelelő kodonokat tartalmazza, és ugyanazon Xho Π végeket vagy más hasítási helyeket tartalmaz a végeken. A fenti szintetikus oligonukleotidok eltérhetnek a természetes 64 kodontól, és vagy ugyanezen aminosavakat kódolhatják, vagy egy olyan polipeptidet, amelyben kis számú, előnyösen kb. nyolcnál kevesebb eltérő aminosavvan, feltéve, hogy ezzel a polipeptid immunológiai védőképessége nem csökken jelentősen. A szintetikus kódoló szekvencia például a teljes működő szekvenciát kódolja, amelynek képlete (-Asn-Ala-Asn-Pro-)n, és n értéke legalább 16.
A polipeptidet kódoló szekvenciát egy E. coli expressziós vektorba illeszthetjük, amelyek többsége ismert és hozzáférhető. A találmány szerinti polipeptidek magas szintű expressziója E. coliban meglepő, a termék szokatlan aminosav-összetétele - kb. 50% aszparagin, 25% alanin és 25% prolin - miatt. Mint azt alább ismertetjük, tapasztalataink szerint a kódoló szekvencia jól cxpresszálható a lambdaPL promoteréböl és a lambda dl riboszoma-kötőhelyéből álló regulátor elem használatával, amint azt a pASl plazmid tartalmazza (Rosenberg és munkatársai: Meth. Enzym. 101,123 /1983/ és Shatzman és munkatársai: Experimental Manipulation of Gene Expression, szerk. M. Inouye, Academic Press, New York, 1982). ApASl hordozza a replikáció pBR322 kezdetét, egy ampicillin-rezisztencia markert, és a lambdából származó fragmentumoksorát, beleértve a PL-t, N-antiterminációs funkciójú felismerő helyeket (NutL és NutR), az rho-fűggő transzkripciós terminációs szignált (tRl) és a cfi riboszoma-kötőhelyet, amely magában foglalja a cH transzlációt iniciáló helyet, amelynek G-maradékát közvetlenül egy Bam Hl hasítási hely követi. A pASl a pKC30cII-ből származtatható oly módon, hogy a pKC30cH cH-pBR322 csatlakozásánál levő Bam Hl hely és a cH ATG közötti nukleotidokat töröljük, és a molekulát újra összekapcsoljuk, hogy a Bam Hl helyetközvetlenülazATG-tőllefeléregeneráljuk.A pKC30dI-t úgy szerkeszthet jük meg, hogy a lambda
1,3 kb-ből álló Hae fragmentumát - amely a cH gént hordozza - a pKC30 Hpa I helyébe illesztjük, Rosenberg és munkatársai, illetve Shatzman és munkatársai fent idézett módszerei szerint. A pKC30-at Shimitake és munkatársai (Natúré 292,128 /1981/) ismertették, ez egy pBR322 származék, amely a pBR322 tetR génjében a Hind ül és Bam Hl helyek közé illesztve egy 2,4 kb-ból álló lambda Hind ΙΠBam Hl fragmentumot tartalmaz. A pAS 1-hez hasonló szerkezetet ismertettek Courtney és munkatársai (Natúré 373, 149/1985/) is. ApASl az American Type CultureCollection-nél (Rockville,Maryland, Amerikai Egyesült Államok) van letétbe helyezve, ATCC 39262 számon. A találmány szerinti expressziós vektort úgy állítjuk elő, hogy a kódoló szekvenciát működőképes helyzetben - azaz helyes orientációban és megfelelő leolvasási rendben - ismert módszerrel egy E. coli expressziós vektor regulátor deméhez kötjük.
A fenti módon kifejeződött polipeptidet a szokásos fehérje-elválasztási módszerekkel választjuk el és tisztítjuk az azt termelő tenyészetből. A tisztítást például az alábbi lépésekből álló djárással végezhetjük: 1) a sejteket clroncsoljuk, 2) a sejt-törmeléktől megtisztítjuk a rendszert, 3) a találmány szerinti eljárással előállított polipeptideket elválasztjuk a tisztított sejt-extraktumban levő egyéb polipeptidektől, 4) a maradék szennyeződést, így a maradék polipeptidet, szénhidrátot, nukleinsavat és/vagy lipopoliszacharidot egy befejező tisztítási művelettel eltávolítjuk.
Az első lépést úgy hajthatjuk végre, hogy például lizozimet vagy más lizáló vagy pcrmeabillzáló szert adunk a rendszerhez, vagy a sejteket mechanikusan vagy ultrahangos kezeléssel roncsoljuk el. Az extraktum tisztítására szolgáló centrifugálás vagy ult3
-3HU 201803Β raszűrés előtt felületaktív szert adunk a rendszerhez, a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek oldatban tartására.
A találmány szerinti eljárás egyik lényeges elemét az a felismerés képezi, hogy a találmány szerinti eljárással előállított bizonyos polipeptideket úgy választhat juk el igen nagy hatékonysággal az egyéb polipeptidektől, ha a tisztított extraktumot a protein oldatban tartására adott detergens beadagolása után közel 80 ’C-ra melegítjük. Azt tapasztaltuk, hogy ha az extraktumot 80 ’C-on legalább 4 percen át melegítjük, csaknem az összes bakteriális polipeptid kicsapódik, anélkül, hogy a lényegében az ismétlődő egységekből álló, vagy az ismétlődő egységek más, nem hőre denaturálódó szekvenciákhoz való kapcsolódásából álló polipeptidek denaturálódnának. A denaturált bakteriális polipeptideket centrifugálással tömöríthet jük és eltávolíthatjuk A fenti eljárás azRtet32, RG, RLA és Rteteó polipeptidek tisztítására használható. Közelebbről, a fenti eljárást sikeresen alkalmaztuk az R16tet32, R32tet32, R48tet32, R64tet32, R48G, R32LA és Rlóteteó tisztítására, amint azt a példákban ismertetjük, míg azRlóNSl és R32NS1 melegítése ezen polipeptidek kicsapódását okozta.
A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet tovább tisztíthatjuk, például szelektív kicsapószer hozzáadásával, majd egy kromatográfiás lépéssel, például ioncserélő kromatográfiával vagy fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcinában a találmány szerinti eljárással előállított polipeptid vizes, előnyösen fiziológiáspH-npufferőit oldatát közvetlenül használhatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet - liofilizálás után vagy anélkül - különféle ismert adjuvánsokon is abszorbeálhatjuk vagy azokkal keverhetjük. A fenti adjuvánsok többek között alumínium-hidroxid, muramil-dipeptid vagy szaponinok, így Quil A lehetnek. További alkalmazási módként például a polipeptid mikrorészecskékbe - például liposzomákba - való kapszilázását említhetjük. Úgy is eljárhatunk, hogy a polipeptidet egy immunstimuláló makromolekulával - például elölt Bordatellával vagy egy tetanusz toxoiddal - kapcsoljuk össze.
A vakcinák előállítását például a New Trends and Development in Vaccines, szerk. Voller és munkatársai, Üniversity Park Press, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, 1978 irodalmi helyen ismertetik általánosan. A liposzomákba való kapszulázást például Fullerton (US-PS 4 235 877) ismertette. A proteinek makromolekulákhoz kapcsolását például Likhide (US-PS4 372 945) és Armor és munkatársa (US-PS 4 474 757) írtak le. A Quil A használatát például Dalsgaard ésmunkatársai (Acta Vet. Scand. 18,349/1977/) munkájából ismerjük.
A vakcina-dózisokban a polipeptid mennyiségét úgy választjuk meg, hogy azzal az immunprotektív válasz elérhető legyen, a szokásos vakcinák hátrányos mellékhatásai nélkül. A fenti dózis az alkalmazott specifikus polipeptidtől, valamint attól függ, hogy a vakcina adjuvánst is tartalmaz-e. Általában minden egyes dózis 1-1000 μg, előnyösen 10-200 μg polipeptidet tartalmazhat. Az egyes vakcinák op4 timális dózisát szokásos módon, például az antitesttiter meghatározásával vagy a kezelendő alany más válaszának mérésével határozhatjuk meg. Az első vakcinálást követően a kezelt alany előnyösen kb. 4 hét múlva újabb adagot kap, és ezt követően minden hónapban megismételjük az adagolást, egészen a fertőzésveszély fennállásáig.
A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni. A
CS-proteint kódoló szekvenciát James Webrtől (Waltér Reed Army Institute fór Research) kaptuk, egy standard E. coli klónozó vektorba, a pUC8-ba (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, Amerikai Egyesült Államok) az Eco Rí helynél illesztett XmPF 1 (Dame és munkatársai, fent idézve) 2337 bázispárból álló Eco Rí fragmens formájában (lásd la. ábra). A kapott pUC8 származékot a továbbiakban pUC8 1. klóronnak nevezzük.
1. példa
CS-protein származék μg tisztított pUC8 1. klón plazmid DNS-t 100 egység Stul 100 egység Rsal restrikciós endonukleázokkal emésztünk, 400 μΐ puffer-közegben (amelynek összetétele 50 mmól/1 Tris, pH 7,5, 50 mmól/1 NaCl, 1 mmól/1 ditiotreitol (DTT) és 10 mmól/1 MgCb), 37 ’C-on, 1,5 órán át. A kapott, a CS-protein első 18 aminosavját kódoló, 1216 bázisból álló fragmentumot 5% poli(akril-amid)-gélen elektroforézissel (PAGE) választjuk el.
pgpASl expressziós vektor 200 μΐ puffer-közegben 1,5 órán át, 37 ’C-on 25 egység Bam Hl restrikciós endonukleázzal emésztünk. A szétvágott plazmidot ezután DNS-polimeráz nagy fragmen35 tummal (Klenow, 5 egység; 20 mmól/1 Tris-HCl, pH 7,5,7 mmól/1 MgCb, 60 mmól/1 NaCl, 6 mmól/12merkapto-etanol és 0,25 mmól/1 a négy dezoxinukleotid-trifoszfát mindegyikéből; 25 ’C, 15 perc kezeljük, a Bam Hl helynél a vég betöltésére.
A CS-gén fragmentum 1 μg-ját ezután 100 ng fenti vektorral kötjük össze, 30 μΐ ligáz-pufferben (50 mmól/1 Tris, pH 7,5, 1 mmól/1 DTT, 10 mmól/1 MgCl2, 100 μπιό1/1 rATP), 1 egység T4-DNS ligáz segítségével, 16 órás reakcióidőt alkalmazva, 4 °C45 on. A ligációs elegyet E. coli MM294C1+ törzsbe (Ann. N.Y., Acad. Sci. 478,233-248) transzformáljuk, ampicillin-rezisztens telepeket kapunk, és ezeket vizsgáljuk a CS-gén fragmentum pASl-bc való beépülése szempontjából. Egy megfelelő szerkeze50 tűnek talált plazmidot (pCSP) azonosítás után E. coli
N5151 törzsbe transzformálunk (clts857) (Mol.Cell.Biol. 5(5), 1015-1024, 1985) és a teljes hosszúságú CS-protein expressziója szempontjából vizsgáljuk. (A protein N-terminálisánál a 18 amino55 sav törlése az autentikus CS-protein hasított szignál-peptidjének felelne meg.) A sejteket Luria-Bertani tápközegben (LB) tenyésztjük 32 ’C-on, amíg a tenyészet abszorpciója 650 nm-en (Aöso) eléri a 0,6 értéket, majd a hőmérsékletet 2 órán át 42 ’C-on tartjuk, az expressziós plazmid PL-promotere transzkripciójának beindítására és a CS-protein származék ezt követő transzlációjára. A sejttenyészetből 1 ml-es mintákat veszünk, tömörítjük, lizáló pufferben (10 mmól/1 Tris-HCl, pH 7,8,25 térfogat% glicerin, 2% 2-merkapto-etanol, 2% nátrium-dode-4HU 201803 Β
Ί cil-szulfát (SDS), 0,1% brómfenolkék) újraszuszpendáljuk és 105 ’C-os melegítő egységben 5 percen át melegítjük. A proteineket SDS-PAGE segítségével elválasztjuk (13% akril-amid, 30:0,8 akrilamid:bisz(akril-amid) arány). A proteineket nitrocellulózra visszük és az E. coliban termelődött CSprotein ún. western biot analízissel mutatjuk ki, a P. falciparum tetrapeptid ismétlődő szakaszával reagáló öt monoklonális antitestet használva (Dame és munkatársai fent idézett munkája).
2. példa
R16tet86 polipeptid
100 pg tisztított pUC8 1. klón DNS-t 40 egység Xho II restrikciós endonukleázzal emésztünk, 400 pl puffer-közegben, 37 'C-on, 16 órán át. ACSprotein 16 tetrapeptid ismétlődő egységét kódoló, 192 bázispárból álló fragmentumot ezután PAGE segítségével izoláljuk. ApASl expressziós vektortaz
1. példában ismertetett módon Bam Hl restrikciós endonukleázzal hasítjuk. 1 p.g 192 bázispárból álló Xho Π fragmentumot 100 ng pAS 1-hez kötünk, annak Bam Hl helyén, az 1. példában leírt módon. A ligációs elegyet E. coli MM294Q+ törzsbe transzformáljuk. Egy, a pASl Bam ΙΠ helyén megfelelő orientációban egy 192 bázispárból álló Xho Π fragmentumot tartalmazó klórt azonosítottunk, a plazmid Bam HI-Hind Π fragmentumának poli(akrilamid) gél-elektroforézisével, amelynek Hin Π helye a tetR géntől lefelé helyezkedik el, és a Bam Hl hely a cll ATG és a beillesztett fragmentum csatlakozásánál van a helyesen orientált plazmidban. A fenti pR16tet86 plazmid szerkezete az alábbi: pBR322 PL ismétlődő egység tetR S pBR322
BH BB ahol BH jelentése Bam Hl hely, B jelentése Bán Π hely és 8 jelentése terminációs kodon.
A pR16tet86-tal transzformáljuk az E. coli N5151 törzset (clts857) és a CS-protein tetrapeptid ismétlődő egységének termelődése szempontjából vizsgáljuk, western biot analízissel. A képződött protein szerkezete az alábbi:
N-Met-Asp-Pro- (Asn-Ala-Pro)is-(Asn-ValAsp-Pro)i-T86-C ahol T86 a pASl-ben levő tetraciklin rezisztencia génből származó 86 aminosavat jelenti. Az N-terminális metionin (Met) aminosavmaradék szintén a vektorból származott, közelebbről a cll protein iniciációs kodonból.
24. példa
R32tet86 és R48tet&6polipeptidek pg tisztított pR16tet86plazmid DNS-t 25 egység Bam Hl restrikciós endonukleázzal emésztünk 200 pj puffer-közegben, 37 ’C-on, 2 órán át. A fenti DNS 100 ng-ját ezután 1 pg fent ismertetett 192 bázispárból álló Xho Π fragmentummal kapcsoljuk össze. Előállítjuk az alábbi szekvenciájú polipeptideket kódoló expressziós vektorokat:
N-Met-Asp-Pro- [Asn-Ala-Asn-Pro) 15-(AsnVal-Asp-Pro) i ]n-T86-C, ahol n értéke 2 (R32tet86), vagy n értéke 3 (R48tet8ó), és azokat E. coliban fejezzük ki. Azokat a pASl kiónokat, amelyekben n értéke 2 vagy 3, elválasztjuk azoktól a kiónoktól, amelyekben n értéke 2-től vagy 3-tól eltérő, mint azt fent ismertettük. Mindenegyes vizsgált klón ahelyes orientációban tartalmazza a beépült fragmentumot. Mind az R32tet86, mind az R48tet86 közel azonos mértékben expresszálódott az R16tet86-tal, amint azt immun-lenyomatos analízissel (immunoblotting) kimutattuk.
Az Rtet86proteinek immun-lenyomatos analízisével kimutatható volt a termékek heterogén összetétele, amelyet Coomassie Brilliant Blue R-250-es festéssel nem lehetett látni. Ezek a proteinek úgy tűnik, hogy közel fele mennyiségben az alább ismertetett Rtet32 polipeptidekből állnak. Úgy tűnt, hogy a kisebb degradációs termékek mérete arányos a kiónban levő tetrapeptid ismétlődő egységek számával. A fenti proteinek instabilitása a heterológ COOH-terminális vég degradációjának tulajdonítható valószínűleg.
3. példa
R16tet32 polipetid pg tisztított pR16tet8öDNS-t 25 egység Banll restrikciós endonukleázzal hasítunk, 200 pl pufferközegben, 37 C-on, 2 órán át. A fenti hasított DNS 100 ng-ját ezután ligázzal zárjuk. A fenti művelet eredményeként töröltünk egy 14 bázispártról álló Bán Π fragmentumot, és egy terminációs kodon alakult ki éppen a megmaradt Bán II helytől lefelé. Az így kapott pRl 6tet 32 plazmidot használjuk fel E. coli N5151 törzsben az R16tet32 kifejezésére, majd a tenyészetből tisztítjukazR16tet32-t.AzR16tet32-t tartalmazó E.coli 30 g-ját (nedves tömeg) 200 ml A-puffrben (50 mmól/1 Tris-HCl, pH 8,0, 2 mmól/1 etiléndiamín-tetraecetsav (EDTA), 0,1 mmól/1 ditiotreitol, 5 térfogat% glicerin) újraszuszpendáljuk. 0,2 mg/ml végkoncentrációban lizozimet adunkhozzá, és azelegyet jégen 30 percen át inkubálva lizáljuk a sejteket. Az elegyet ezután Waring homogenizátorban 3 percen át magas fordulatszámot alkalmazva kezeljük, majd 1 percen át Brason 350 szonikátorban ultrahangos kezeléssel szétnyirjuk a bakteriális DNS-t. 0,1 vegyes% végkoncentrációban nátrium-dezoxi-kolátot adunk az elegyhez, és 30 percen át centrifugálva eltávolítjuk a sejt-törmelékeket. A felülúszót egy lombikban összegyűjtjük és forró vízfürdőn 10 percen át inkubáljuk, majd 12000g-vel 30 percen át centrifugáljuk. Azt tapasztaltuk, hogy közel az összes E. coli protein kicsapódott a hőkezelési lépés alatt, és kiülepedett a centrifugáláskor, míg az R16tet32 protein oldatban maradt és a felülúszóban gyűlt össze. A felülúszót öszszegyűjtjük és 20%-os telítettséget biztosító koncentrációban lassan ammónium-szulfátot adunk hozzá. A fenti módon szelektíven kicsapódott R16tet32-t centrifugálással (12000 g, 30 perc) öszszegyűjtjük. Ezen a ponton az R16tet32 protein 95%-nál nagyobb tisztaságú, az egyéb szennyező bakteriális proteinek tekintetében.
Az egyéb anyagok - például proteinek, szénhidrátok, nukleinsavak vagy lipopoliszacharidok - által okozott maradék szennyezést egy végső kromatográfiás tisztítással - például ioncserélőskromatográfiával, fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával, fenil-Sepharose kromatográfiával,
-5HU 201803Β méret szerinti elválasztással stb. - távolíthat jukel. A képződött tisztított R16tet32 közel 5%-át teszi ki az összes E. coli proteinnek, azaz 30-60 mg/1 koncentrációjú, amintaztCoomassieBluefestésselmegállapítottuk.
Az Rl 6tet32 szekvenciája az alábbi:
N-Met-Asp-Pro- [(Asna-Ala-Asn-Pro) 1 s(AsnVal-Asp-Pro)i]n-T32-C, n értéke 1 és T32 a tetraciklin rezisztencia génből származó 32 aminosavat jelenti. Közelebbről, a T32 szekvenciája az alábbi:
-Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His
-Arg-Arg-His-Arg-Cys-Gly-Cis-Trp-Arg-Leu-Ty r-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser-Gly-Se r-C, a megmaradt Bán Π hely a 30. és 31. aminosav között van.
3A. példa
R32tet32& R48tet32polipeptidek
Lényegében a 3. példa szerint eljárva állítjuk elő az R32tet32-t és R48tet32-t (azaz egy olyan R16tet32-nek megfelelő szekvenciát, amelyben n értéke 2, illetve 3) E. coliban, és azonos hozammal és tisztasági fokkal izoláljuk, mint azR16tet32-t. Kiindulási vektorként pR32tet86-ot, illetve R48tet86-ot használunk.
3B. példa
R64tet32 és R80tet32 polipeptid p,g tisztított pR48tet32 plazmid DNS-t 25 egység Bam ΗΙ-val emésztünk 200 μΐ puffer-közegben, 37 ’C-on, 2 órán át. 100 ng fenti DNS-t ezután 1 ^g fent ismertetett, 192 bázispárt tartalmazó Xho Π fragmentummal kapcsolunk össze. Előállítjuk az alábbi szekvenciájú polipeptideket kódoló plazmid expressziós vektorokat:
N-Met-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) 1s-(AsnVal-Asp-Pro)i]nT32-C, ahol n értéke 4 (R64tet32) vagy n értéke 5 (R80tet32), ésazokatE. coliban kifejezzük. Azokat apASl kiónokat, amelyekben n értéke 4 vagy 5, azoktól a kiónoktól, amelyekben n értéke 4-től vagy 5 tői eltérő, a fent leírt módon elválasztjuk. Az R64tet32, és az R80tet32 közel azonos mértékben expresszálódott, mint az R48tet32. Az R64tet32-t lényegében az R16tet32, R32tet32 és R48tet32 előállításával kapcsolatban ismertetett módon tisztítjuk.
3C. példa
R96tet32 és Rll 2tet32 polipeptid
Lényegében a 3B. példában leírtak szerint eljárva állítjuk elő az R96tet32 és Rl 12tet32 polipeptideket (amelyek képletében n értéke 6, illetve 7), az R48tet32-vel közel azonos mennyiségben.Kiindulásí vektorként pR80tet32-t használunk.
Noha a tisztított Rtet32 polipeptidekben észlelhető bizonyos mértékű heterogenitás immun-lenyomatos módszerrel a reakcióképes fő foltok összhangban vannak a protein-festéssel kimutatható sávokkal. Az SDS-PAGE módszerrel meghatározott molekulatömegek a vártnál kb. kétszer nagyobbak, noha az egyes proteinek vándorlása minden egyes előállított polipeptid esetén arányos a tetrapeptid ismétlődő egységek számával. Néhány esetben meghatároztuk az Rtet32 peptidek aminosav-összetételét is, amelyek a várt értékeknek megfeleltek.
4. példa
R16G polipeptid
A pAS 1 Bam Hl helyére egy
5’-AGTCCCGGGTGACTAGCTGA -3’
3’ GGCCCACTGACTGACTCTAG -5’ szekvenciájú szintetikus kötőt illesztve pTerm-et állítunk elő. 10 pg pASl-et 25 egység Bam Hl-vel emésztünk. 100 ng Bam ΙΠ-vel hasított pASl-et 20 ng szintetikus kötővel kötünk össze, és a pTerm plazmidot mint a pASl Bam Hl helyén egy beépült kötő-szekvenciát tartalmazó plazmidot azonosítjuk. A fenti vektorban megmarad a Bam Hl hely, és a TGA terminációs kodonoknak a cH protein ÁTG iniciációs kodonjától lefelé való beillesztését eredményezi, mind a három leolvasási rendszerben.
ApRl 6G plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pUC8
1. kiónjából származó 192 bázispárból álló Xho Π fragmentumot a pTerm Bam Hl helyre illesztjük, és kiválasztjuk a fent ismertetett módon azokat a kiónokat, amelyek megfelelő orientációban tartalmaznak egyetlen Xho Π betoldást.
A pR16G-t lényegében a fent ismertetett módon klónozzuk és fejezzük ki E. coliN5151 törzsben.
Az Rl 6G szekvenciája az alábbi:
N-Met-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) 15-(AsnVal-Asp-Pro) i]n-Gly-C, ahol n értéke 1.
A fenti proteinben nincs aromás gyűrűs aminosavmaradék, így a képződött polipeptid mennyiségét nem tudjuk Coomassie Brilliant Blue R-25-es festéssel vizuálisan meghatározni. A CS-proteinre specifikus 5 monoklonális antitesttel végzett immun-lenyomatos analízis (lásd Dame és munkatársai fent idézett munkája) szerint a kívánt polipeptid közel 1%-át teszi ki az összes sejt-proteinnek, az R16tct32-vel összehasonlítva, amely utóbbinál lehetséges Coomassie Brilliant Blue R-25-es festéssel meghatározni a protein-tartalmat.
4A. példa
R32G, R48G, R64 G, R80G és R112G polipeptid
Az R32G, R48G, R64G, R80G és Rl 12G polipeptideket - amelyek szekvenciája azonos azRl 6Gvel, de n ér teke 2,3,4,5, illetve - a 4. példában ismertetett módon E. coli N5151 törzsben termeljük. A fenti polipeptidek közel azonos mennyiségben képződnek, mint az R16G. Az R48G-t lényegében a 3. példában leírtak szerint tisztítjuk.
5. példa
Rl 6LA és R32LA polipeptid
A pAS 1 Bam Hl helyére egy
5’-AGTCCCGCTGCGTT -3’
GCGACGACAACTAG-5’ szekvenciájú szintetikus kötőt illesztve pTerm2-t állítunk elő, lényegében a 4. példában leírt módon. A pTerm2-ben megmarad a Bam Hl hely. A pUC8 1. kiónból származó 192 bázispárból álló Xho Π frag-6HU 201803Β mentumot a fent ismertett módon illesztjük be a pTerm2 Bam Hl helyére. ApRl 6LA és pR32La kiónokat, amelyek egy, illetve kétXhoII beillesztést tartalmaznak a megfelelő orientációban, lényegében a fent ismertetett módon választjuk ki. Az R32LA-t lényegében a 3. példában leírt módon tisztítjuk
ApR16LA-t és pR32LA-tafenti ismertetettmódon klóznozzuk és fejezzük ki E. coli N5151 törzsben.
Az R16LA és R32La szekvenciája az alábbi:
N-Met-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) 15-(AsnVal-Asp-Pro) i ]n-Leu-Arg-C, ahol n értéke 1, illetve 2. A C-termínális leucin és arginin a pTerm2-ben levő szintetikus kötőből származik.
Az R16LA közel 1%-át teszi ki az E. coli összes proteinjének, míg az R32La az összes sejt-proteinnek közel 5%-a.
6. példa
R16NS1 polipeptid
A pAS2deltaEH plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pAS 1 pBR322 eredetű nem létfontosságú Eco Rí Hind ΙΠ régióját töröljük 10 pg pASl-et 20 egység Eco Rl-vel és 20 egység Hind ΠΙ-mal hasítunk, 200 pl puffer-közegben, DNS-polimerázzal (Klenow) kezeljük, ligázzal zárjuk, és E. coliba transzfomráljuk, lényegében a fent ismertetett módon. Azonosítunk egy olyan kiónt, amelyből a 29 bázispárból álló Eco Rí - Hind ΙΠ fragmens törölve van.ApASldeltaEH Bam Hl helyére beillesztjük a pAPR8011236 bázispárból álló Bam Hl fragmentumát (Young és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S A,, 80,6105 /1983/), amely az influenza vírus (A/PR/8/34) NS1 kódoló régióját tartalmazza, ami 861 virális eredetű bázispárból és a pBR322-ből származó 375 bázispárból áll. A kapott pASldeItaEH/801 plazmid az autentikus NSl-et (230 aminosav) kódolja. A fenti plazmidban megmarad a Bam Hl hely, a cll transzlációt indító hely és az NS1 kódoló szekvencia között.
pg pASldeltaEH/801 plazmidot 20 egység Eco Rl-vel és 20 egység Sál I-gyel hasítunk, 200 pl nagy ionerősségű pufferben (50 mmól/1 Tris-HCl, pH7,5,1 mmól/lDTT, 10 mmól/1 MgCl2,100 mmól/1 NaCl), 37 ’C-on 2 órán keresztül, DNS-pollmeráz nagy fragmentummal (Klenow) kezeljük és ligázzal zárjuk, lényegében a fenti leírtak szerint. Izolálunk egy olyan kiónt, amelyből a650 bázispárt tartalmazó EcoRI-SalIrégiótörölvevan.AfentipNSldeltaES plazmid az autentikus NS 1 -et kódolja.
A pR16NSl plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pUC8 1. kiónjából származó 192 bázispárt tartalmazó Xho Π fragmentumot a pNSldeltaES plazmid Bam Hl helyére illesztjük, és lényegében a fent ismertetett módon kiválasztjuk azokat a kiónokat, amelyek megfelelő orientációban tartalmaznak egyetlen Xho Π betoldást.
A pR16NSl-et E. coliban klónozzuk és kifejezzük, és az RÍ6NSl-et lényegében a fentiek szerint tisztítjuk, azzal az eltéréssel, hogy a forralást elhagyjuk.
AzRlőNSl szekvenciája az alábbi:
N-Met-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) i s-(AsnVal-Asp-Pro)i]n-N227, ahol n értéke 1 és N227 az NS1 -bői származó 227 aminosavat jelenti.
A fenti módon előállított R16NS1 készítményben az R16NS1 a protein-tartalom több, mint 80%ára becsülhető, a forralás vagy ioncserélős lépés nélkül. AzRlőNSl meglepően magas, közel 25%-át képezi az összes sejt-proteinnek.
6A. példa
R32NS1.R48NS1 ésR64NSl polipeptid
Az R32NSl-et (amelynek szekvenciája az Rl6NSl-ével azonos, azn értéke 2) lényegében a 3. példában leírtak szerint fejezzük ki E. coliban és tisztítjuk abból, a forralás elhagyásával. Az R32NS1 az R16NSl-gyel közel azonos mértékben képződik, cs tisztasága is közel azonos.
Az R48NSl-et (amelynek szekvenciája az R16NSl-ével azonos, és n értéke 3), és az R64NS1et (n értéke 4 az R16NS1 képletében) lényegében a fentiek szerint eljárva állítjuk elő E. coliban. Az R48NS1 közel 10%-át, azR64NSl közel 5%-át teszi ki az E. coli összes protein-tartalmának.
7. példa
NS1R48 polipeptid
A pR48tet86plazmldot Bam ΗΙ-vel hasítjuk és DNS-polimerázzal (Klenow) töltjük be a véget, lényegében a fent leírt módon. A plazmidot eztuán Bán Π-vel hasítjuk, a fent ismertetett módon, ily módon egy 672 bázispárból álló, 3 Xho fragmentumot hordozó fragmentum és 96 bázispár válik szabaddá a tetraciklin rezisztencia génből.
pg pASldeltaEH/801 plazmidot 20 egység Nco I-gyel hasítunk 200 pl nagy ionerősségű pufferben, 37 °C-on 2 órán át, és a véget DNS-polimeráz nagy fragmentummal (Klenow) töltjük be, a fent ismertetett módon. Az NSl-ben az Nco I hely a 81. aminosavnak megfelelő kodonban van. A plazmidot ezután Bán Π-vel hasítjuk a fent ismertetett módon, ezáltal töröljük a megmaradt NS1 kodonokat és a tetraciklin rezisztencia gén egy részét, és pASldelta/801-1 plazmidot kapunk.
A 672 bázispárból álló Bam Hl (betöltött végű) Bán Π fragmentumot a pASldetaEH/801-1 plazmádba illesztve állítjuk elő a pNS 1R48 plazmidot. A fentiplazmidotazelőzőekben ismertetett módon fejezzük ki E. coliban. A kapott NS1R48 szekvenciája az alábbi:
N-81N-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) 15-(AsnVal-Asp-Pro)i]n-T32-C, ahol 8 IN az NS1 N-terminális 81 amiuosavját jelenti, n értéke 3, és T32 jeletnése a fent megadott. Az NS 1R48 az összes sejt-protein közel 5%-át képezi.
8. példa
R32N polipeptid pg pR32NSl plazmidot 25 egység Hind ΙΠmal hasítunk, 200 pl puffer-közegben, 2 órán át 37 ’C-on, és a véget DNS-polimerázzal töltjük be, afent ismertetett módon, pR32NSl-l plazmidot kapunk. A Hind ΙΠ hely az NS 1 kódoló régiójában az 5. aminosav-maradékot kódoló kodonban van. 100 ng p32NSl-l -et ezután a fent ismertetett módon ligázzal zárunk. A kapott pR32N plazmid most egy TAA terminációs kodont tartalmaz az NS1 kódoló szekvencia 5. kodonjában. A pR32N plazmidot a fenti7
-7HU 201803Β ekben ismertetett módon használjuk az R32N polipeptid előállítására E. coliban.
AzR32N szekvenciája az alábbi:
N-Met-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) i s-(AsnVal-Asp-Pro)i]n-N5-C, 5 ahol n értéke 2 és N5 az NS1 génből származó 5 aminosavat jelenti. Közelebbről, az N5 az alábbi szekvenciának felel meg:
Asn-Thr-Val-Ser-Ser-C.
Az R32N az E. coli összes proteinjének közel 5%- 10 át teszi ki.
9. példa
Antitest-válasz -ELISA
AzR16tet32, R32tet32 és R48tet32 rekombináns 15 proteineket a fentiek szerint tisztítjuk, 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfáttal puff erőit sóoldattal (pH 7,0) szemben (PBS) dializáljuk, alikvotokra osztjuk és -80 ’C-on tárol juk. Az előállított proteineket PBSsel, alumínium-hidroxiddal (alum) vagy komplett 20 Freund-féle adjuvánssal (CFA) összekeverve 0,5 ml-es dózisokat készítünk, amelyek protein-tartalma 50 gg. A CFA-t (GIBCO, Grand Island, New York,USA)ésantigéntPBS-ben 1:1 arányban emulgeáljuk, 30 perces keveréssel, mechanikus keverő- 25 berendezésben. Az alumot gyógyszerkönyvi tisztaságú alumínium-hidroxid-gélből készítjük, PBS-sel végzett hígítással. Az antigént 4 ’C-on, 12 órán át rotációs keverőben keverve adszorbeáljuk az alumon. A szuszpenziót további 12 órán át ülepedni 30 hagyjuk, majd a felülúszó megfelelő mennyiségét leöntjük, hogy0,80 mg Al-t és50 pg rekombináns proteint kapjunk dózisonként.
6-8 hetes C57B1/6 egereket (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine USA) (csoportonként 5 álla- 35 tót) szubkután vagy intraperitoneális úton összesen 50 pg proteinnel immunizálunk. Az állatoknak az első immunizálás után 4 héttel ugyanezen módon újabb dózist adunk, azzal azeltéréssel, hogy azoknak az állatoknak, amelyek az immunogént CFA-ban 40 kapták, a proteint nem-komplett Freund-féle adjuvánsban (IFA) emulgeálva adjuk. Egy hét elteltével a farok elvéreztetésével kapott teljes vért összegyűjtve, 4 ‘C-on megakaszt juk és centrifugálással elkülönít jük és a felhasználásig -80 ’C-on tároljuk a szérű- 45 mókát.
Az egyes szérumok reakcióképességét egy 16 aminosavból álló szintetikus pepiiddel szemben amely a P. falciparum CS-protein négy ismétlődő egységének [(Asn-Ala-Asn-Pro)4] felel meg - en- 50 zimhez kötött immun-szorbens vizsgálattal (ELISA) vizsgáljuk, Dame és munkatársai (Science225, 593/1984/) módszere szerint. A mikrotitráló lemezek lyukainak bevonására marha-szérumalbuminhoz (BSA) kapcsolt szintetikus peptid anti- 55 gént használunk. 50 pl (0,1 pg) 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfáttal puff erőit sóoldattal (pH 7,0) (PBS) hígított vizsgálandó antigént pipettázunk a polisztirol mikrotitráló lemezek (Immunion 2 DynatechLaboratories, Alexandria, VA, USA) lyukaiba, és egy 60 éjszakán át szobahőmérsékleten (kb. 22 ’C) tartjuk.
A lyukak tartalmát ezután leszivatjuk, gátló pufferral (BB, amelynek összetétele: 1,0% BSA, 0,5% kazein, 0,005% timerszol és 0,0005% fenolvörös PBSben) tölt jük fel és 1 órán át szobahőmérsékleten tart- 65 juk. Az egér-szcrumot sorozathígításos módszerrel BB-vel hígítjuk, és minden egyes lyukba 50 pJ-t mérünk belőle. A lemezeket szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk, majd a lyukakat leszivatjuk, háromszor mossuk PBS-0,05% Tween 20 (PBS-TW20) eleggyel és 50 pl, 10% hővel inaktivált emberi szérumot tartalmazó PBS-sel 1/500-szorosára hígított kecske anti-egér IgG-vel konjugált torma-peroxidázt (H+I) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) mérünk az egyes lyukakba. Egy óra elteltével a lyukak tartalmát leszivatjuk, háromszor mossuk PBS-TW20-szal és 150 pl szubsztrátot (1 mg 2,2’azino-di(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav)/l ml
O, 005% hidrogén-peroxidot tartalmazó 0,1 mól/1 koncentrációjú cilrát-foszfát puffer, pH 4,0, a hidrogén-peroxidot közvetlenül felhasználás előtt adjuk a pufferhez) mérünk minden egyes lyukba. Egy óra elteltével 414 nm-en meghatározzuk az abszorpciót, ELISA lemez-leolvasó (Titertek Multiskan, Flow Laboratories Inc., McLcan, VA) segítségével.
AzR16tet32, R32tet32 ésR48tet32 polipeptidek mindegyike olyan antitest-termelést váltott ki, amely ELISA tesztben reakcióképes volt. Az R16tet32, önmagában alkalmazva, kevésbé volt immunogén tulajdonságú, mint az R32tet32 vagy az R48tel32. Az alum és a CFA növelte a három találmány szerinti eljárással előállított protein immunogén tulajdonságát, és még 102 000-en felüli titer esetén is észlelhető antitest legalább egy vizsgálatban.
10. példa
Antitest-válasz - IFA
A 9. példa szerinti antiszérum vizsgálataink szerint erősen reagált autentikus P. falciparum CS-proteinnel, indirekt immunofluoreszcens antitest vizsgálatban (IFA). P. knowlesi, P. cynomologi, P. viva és
P. gallunaceum elleni reaktivitást nem tapasztaltunk. Az R32tet32-vel szembeni antiszérum csekély reaktivitást mutatott P. berghei ellen. Ez az eredmény összhangban van Hockmeyer és munkatársai (Proc. 3d Int’l. Symp. Immunobioi. Proteins Peptides, szerk. Atassi, M.Z., Plenum New York /nyomdában/) azon megfigyelésével, miszerint a P. falcíparummal szembeni bizonyos Mab-ok (minőklonális antitestek) reagálnak a P. breghei sporozoitokkal IFA vizsgálatban.
A sporozotikat fertőzött moszkitók nyálmirigyéből preparáljuk, lényegében Bosworth (J. Párásítók. 61, 769 /1975/) módszere szerint, sóoldattal vagy 0,5% BSA-t tartalmazó Médium 199-cel (GIBCO) hígítjuk, hemaci tóméiért alkalmazva számoljuk és 2000-5000 sporozoit/10 pl értékre hígítjuk. 10 ples alikvotokat mérünk a többlyukú, nyomott IFA-lemez minden egyes lyukába, szobahőmérsékleten, levegővel szárítjuk és -80 ’C-on tároljuk.
Az IFA-vizsgálatokat azzal kezdjük, hogy 20 pl térfogatú, BB-vel 1/100-szorosára hígított szérumot szélesztünk a szárított sporozoitokat tartalmazó IFA-lemez lyukaiba. Nedves kamrában, szobahőmérsékleten, 20 percen át végzett inkubálás után a szérumoldatokat leszivatjuk és a lyukakat 2 csepp PBS-sel mossuk. Az egyes lyukakba ezután 20 pl, BB-vel l:40-szeresére hígított, fluoreszcein-izotiocianáthoz kapcsolt kecske anti-egér antitestet (Kirkegard és Perry, Gaithersburgh, MD, USA) adunk.
-8HU 201803Β
Szobahőmérsékleten 20 percen át tartó inkubálás után a lyukakat ismét kimossuk 2 csepp PBS-sel, glicerinben tárgylemezre helyezzük és UV-fényben 500-szoros nagyítással meghatározzuk a fluoreszcenciát.
7. példa
CSP-reakció
R16tet32-vel, R32tet32-vel és R48tet32-vel immunizált egerekből származó szérumok erős CSPpozitív reakciókat adnak, amint az az 1. táblázat adataiból látható. Adjuváns nélkül alkalmazva csak az R16tet32-re nem termelődik olyan antitest, ami pozitív CSP-reakciót adna, míg CFA-val vagy atommal együtt adva mind a három találmány szerinti eljárással előállított protein olyan antitest-termelést indukál, amely erős CSP-reakciókat ad.
1. táblázat: R16tet32, R32tet32 ésR48tet32 elleni antiszérum CSP-reaktivitása
| Adjuváns | Antiszérum R32tet32 | R48tet32 | |
| R16tet32 | |||
| - | 0/25(-) | 17/25(2+) | 21/25(4+) |
| CFA | 23/25(4+) | 21/25(4+) | 21/25(4+) |
| atom | 25/25(4+) | 25/25(4+) | 16/27(2+-4+) |
A CSP-reakciókat lényegében Vanderberg és munkatársai (Mii. Med. 734(Supp. 1), 1183 /1969/) módszere szerint hajtjuk végre. 5 μΐ mintát, amely 500-1000 moszkitó nyálmirigyből származó P. falciparum sporozitot tartalmaz Médium 199-ben újraszuszpendálva, mikroszkóp tárgylemezen 5 μΐ szérummal keverünk össze, vazelinnel szegélyezett zárólemezzel lefedjük és 37 ’C-on 1 órán át inkubáljuk. A reakciót fázis-kontraszt mikroszkóppal értékeljük ki, 400-szoros nagyítást alkalmazva. Minden egyes szérum-mintában 25 véletlenszerűen választott sporozoitot vizsgálunk meg, és feljegyezzük a CSP-pozitív organizmusok számát. A CSP-reaktivitás mértékét - Vanderberg és munkatársai fenti idézett módszere szerint meghatározva - zárójelben tüntet jük fel. A (-) érték azt jelenti, hogy nem észlelhető CSP-reaktivitás; (2+) szemcsés csapadék megjelenését jelenti a sporozoitokfelületén; (4+) hosszú, fonalszerű filamentum megjelenését jelzi a sporozoitok egyik végén. A normál egérszérum, vagy a csak CFA-val immunizált egérből származó szérum nem váltki kimutathatómértékű CSP-reakciót,párhuzamos vizsgálatokban.
12. példa
Hepatocita-blokkolás
A 9. példa szerinti szérumokat in vitro inváziógátlás szempontjából is megvizsgáljuk, az eredményeket a 2. táblázatban ismertet jük.
2. táblázat: P. falciparum sporozoitok HepG2 A16 hepatoma sejtek elleni inváziójának gátlása
Adjuváns Antiszérum
| R16 | R32 | R48 | |
| — | 46 | 95 | 92 |
| CFA | 76 | 92 | 94 |
| alum | 100 | 100 | 96 |
Az eredmények szerint az R32tet32 és R48tet32 proteinek erősen blokkoló hatású antitestek képződését indukálják, meg adjuváns nélkül is. Az R16tet32 kevésbé hatásos erősen blokkoló hatású antitestek kiváltásában, csak atomhoz adszorbeálva fejt ki megfelelő hatást. Afen ti eredmény összhangban van az R16tet32-re termelt antiszérum esetén megfigyelt gyenge CSP-reaktivitással és alacsony ELISA-titerekkel.
A sporozoit-invázió gátlásának vizsgálatát tenyésztett sejteken lényegében Hollingdale és munkatársai (J. Immunoi. 32,909 /1984/) módszere szerint végezzük. Az R16tet32-vel, R32tct32-vel és R48tet32-vel immunizált egerekből nyert szérumot azon képessége szempontjából vizsgáljuk, hogy milyen mértékben tudja meggátolni A P. falciparum sporozoitok invázióját tenyésztett sejtek ellen. A szérumot a tápközeggel hígítjuk és l;20-szoros végső hígításban (térfogat/térfogat) HepG2-A16 sejttenyészethez (Am. J. Trop. Med. Hyg. 32, 682-684 (1983) adjuk. A tenyészetekhez ezután 1200040000 moszkitó nyálmirigyből nyert P. falciparum sporozoitot adunk és 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában 37 'C-on 3 órán át inkubáljuk, Dulbecco-féle foszfáttal puffferőit sóoldattal (PBS) öblítjük, metanolban fixáljuk és PBS-sel kétszer öblítjük
Azokat a sporozoitokat, amelyek bejutottak a sejtbe, immunperoxidáz antitest vizsgálattal (IPA) tesszük láthatóvá (Hollingdale és munkatársai fent idézett munkája szerint). Az IPA vizsgálatot úgy végezzük, hogy a fixált tenyészetet először P. falciparummal szembeni Mab-bal (2F1.1, lásd Dame cs munkatársai fent idézett munkája) kezeljük, majd torma-peroxidázhoz kapcsolt nyúl anti-egér immun-globulinnal inkubáljuk és 3,3-diamino-benzidinnel megfestjük. A tenyésztett sejtekbe bejutott sporozoitok számát úgy határozzuk meg, hogy megszámoljuk a teljes preparátumban a sejten belüli parazitákat, Leitz mikroszkópot használva, 250-szeres nagyítás mellett, sötétkét színszűrővel. A vizsgálatokat vagy két, vagy három párhuzamos mintát vizsgálva hajtjuk végre, és minden egyes sejttenyészethez azonos számú sporozoitot adunk egy kísérlctsorozaton belül. Agátlást a találmány szerinti polipeptidekkel szembeni immunszérum által kifejtett sporozoit-inváziós %-os csökkentésével adjuk meg, normál egérszérum kontrollokhoz viszonyítva, ahol a CS-reaktív Mab 2F1.1 100%-os gátlást fejt ki a sporozoit-invázió ellen, 1/20-as hígításban.
A találmány szerinti eljárással előállított RLA, R16NS1 és R32NS1 rekombináns polipeptidekct is hasonlóképpen vizsgáltuk, ELISA és IFA vizsgálatokkal, és azt tapasztaltuk, hogy azok hasonlóképpen olyan antitestet indukálnak, amely reagál a 16 aminosavból álló szintetikus polipeptiddel, és így pozitív CSP-reakciót adnak. Előnyösek az R32tet32 és R32LA proteinek, viszonylagos homogenitásuk,
-9HU 201803Β képződési szintjük és könnyű előállításuk következtében.
A szintetikusan előállított vakcinák esetén elsődleges fontosságú, hogy a szintetikus immunogénnel szemben termelődő antitest felismeri-e az autenti- 5 kus molekulát, és vajon az antitest rendelkezik-e a megfelelő védelem kialakításához szükséges biológiai tulajdonságokkal. Az immunfluoreszcencia vizsgálat és a CSP-reakció eredménye szerint az E. coliban termelt polipeptidekkel szemben képződő 10 antitest reagál a sporozoit felületével, és így felismeri az autentikus GS-proteint. Állatkísérletekben és emberben is kimutatták, hogy a CSP-antitest jelenléte jelentősen összefügg a protektív immunitással.
Az a tény, hogy a találmány szerinti eljárással előál- 15 lított proteinek ellen termelődő an titestek gátol ják a humán hepatoma sejtek sporozoitok általi invázióját in vitro, igen jelentős. Hollingdale ésmunkatársai (lásd fent idézett munkájuk) kimutatták, hogy mind a P.falciparúm, mint a P. vivax elleni Mab-ok, vala- 20 mint a fenti malária-fajok ellen immunis emberekből nyert poliklonális szérum is gátolják a sporozoitinváziót. Ezért a sporozoitok invázió-gátlásának in vitro vizsgálata megfelelő vizsgálati módszert jelent a protektiv antitestek kimutatására. Afent ismerte- 25 tett vizsgálatok eredményei összességükben azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vakcinát a humán gyógyászatban P. falciparum által okozott fertőzések elleni védelemre használhatjuk. 30
Á találmány szerinti eljárással előállított rekombináns proteinek immun-válasza Freund-féle komplett ad juvánssal vagy alummal egyaránt növelhető, amint azt ELISA-titerük, felületi reaktivitásuk (IFA és CSP) és sporozoit-inváziót gátló hatásuk 35 vizsgálatakor megállapítottuk. A Freund-féle komplett adjuváns emberben nem használható, mivel lázat okoz,granulomákat vált ki és tuberkulin-túlérzékenységet eredményez. Az alumot jelenleg már bevezetett vakcinákban - például a dif téria és a teta- 40 nusz toxoid valamint az egyik legújabb vakcina, a Hepatitis B esetén - is használják adjuvánsként. Hatékonysága és a humán gyógyászatban régóta tartó biztonságos használata bizonyított.
13. példa
Vakcina előállítása
A találmány szerinti eljárás értelmében például az alábbi módon készíthetünk vakcinát.
3%-os vizes, pufferolt alumínium-hidroxid-ol- 50 dathoz (10 mmól/1 nátrium-foszfát, 150 mmól/1 NaCl, pH 6,8; szűréssel sterilizálva) ugyanezen összetételű pufferben oldva adjuk keverés közben a talalmanyszerinti eljárássá! előállított polipeptidet, a pepiidre nézve 100 ug/ml, az Al -ra nézve
1,0 mg/ml végkoncentrációban. A pH-t 6,6 értéken tartjuk. Az elegyet egy éjszakán át 0 ‘C körüli hőmérsékleten tartjuk. 0,005% végkoncentrációban timerszolt adunk hozzá. A pH-t ellenőrizzük, és szükséges esetben 6,8-ra állítjuk. 60
Noha a találmány szerinti eljárást a fentiekben részletesen ismertettük, beleértve az előnyös megoldásokat is, nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi körét nem kívánjuk a fenti megoldásokra korlátozni, hanem az ismertetett megoldások összes módosítá- 65 sai is a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Claims (9)
1. Eljárás az ember Plasmodium falciparum által okozott fér tőzése elleni vakcina hatóanyagát képező polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a Plasmodium falciparum CS-protein 16-112 AsnAla(Val)-Asn(Asp)-Pro ismétlődő egységét - ahol az Asn-Ala-Asn-Pro ismétlődő egység az összes ismétlődő egység legalább 80%-át teszi ki - kódoló DNS-szekvenciát és kívánt esetben ehhez fuzionálva egy heterológ peptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-t egy regulátor elemhez működőképesen kapcsolva valamely E. coli expressziós vektorba illesztjük, a vektorral E. colit transzformálunk, a transzformált E. colit tenyésztjük ésa képződött polipeptidet a tenyészetből elválasztjuk és tisztítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ismétlődő egységet kódoló szekvenciaként a CS-proteint kódoló szekvencia XhoIIXhoII régióját vagy annak egymás utáni ismétlődéseit használjuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (Asn-Ala-Asn-Pro)is-(Asn-ValAsp-Pro) i ismétlődő egységet kódoló szekvenciát illesztjük az expressziós vektorba.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kódoló szekvenciaként az Rtet32 polipeptidet, Rtet86 polipeptidet, RNS1 polipeptidet, NS ÍR polipeptidet, RG polipeptidet, RLA polipeptidet, RN polipeptidet kódoló szekvencia egyikét illesztjük az expressziós vektorba.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kódoló szekveniaként az
Rl6tet86,
R32tet86,
R48tct86,
R16tet32,
R32tet32,
R48tet32,
R64tet32,
R80tet32,
R96tet32,
R112tet32,
R16G
NS1R48,
R32G,
R48G,
R64G,
R80G,
R112G,
R16LA,
R32LA,
R16NS1,
R32NS1
R48NS1,
R64NS1
R32N polipeptidek egyikét kódoló szekvenciát illesztjük az expressziós vektorba.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kódoló szekvenciaként az R32tet32 vagy R32LA polipeptidet kódoló szekvenciát illesztjük az expressziós vektorba.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kódoló szekvenciát regulátor elemként a PL-promotert és a cll transzlációt iniciáló helyet magában foglaló cll riboszoma-kötőhelyet tartalmazó elemhez kapcsoljuk működőképesen.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kódoló szekvenciát regulátor elemként a pASl regulátor elemhez kapcsoljuk működőképe-10HU 201803Β sen.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy elválasztási és tisztítási lépésként először a transzformált E. coli sejtek extraktumához detergenstadunk,azextraktumotmelegítveabakteriális proteineket kicsapjuk, és a felülúszóban levő polipeptidet szokásos módon tovább tisztítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69911585A | 1985-02-07 | 1985-02-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT40917A HUT40917A (en) | 1987-03-30 |
| HU201803B true HU201803B (en) | 1990-12-28 |
Family
ID=24808000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU86505A HU201803B (en) | 1985-02-07 | 1986-02-06 | Process for producing polypeptides forming the agent of anti-malaria vaccine |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0191748B1 (hu) |
| JP (2) | JPH0698005B2 (hu) |
| CN (1) | CN86100979A (hu) |
| AP (1) | AP17A (hu) |
| AT (1) | ATE82322T1 (hu) |
| AU (1) | AU603054B2 (hu) |
| DE (1) | DE3687071T2 (hu) |
| DK (1) | DK62486A (hu) |
| EG (1) | EG17878A (hu) |
| ES (1) | ES8704975A1 (hu) |
| GR (1) | GR860351B (hu) |
| HU (1) | HU201803B (hu) |
| IL (1) | IL77788A0 (hu) |
| MY (1) | MY102249A (hu) |
| NZ (1) | NZ215034A (hu) |
| OA (1) | OA08199A (hu) |
| PT (1) | PT81967B (hu) |
| YU (1) | YU18186A (hu) |
| ZA (1) | ZA86797B (hu) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE78869T1 (de) * | 1985-02-07 | 1992-08-15 | Smithkline Beecham Corp | Malaria-impfstoff. |
| IT1187710B (it) * | 1985-07-25 | 1987-12-23 | Eniricerche Spa | Composizione peptidica utile per la preparazione di vaccini per la malaria e di kit diagnostici per la determinazione di affezioni malariche |
| EP0252588A3 (en) * | 1986-05-12 | 1989-07-12 | Smithkline Beecham Corporation | Process for the isolation and purification of p. falciparum cs protein expressed in recombinant e. coli, and its use as a vaccine |
| EP0254862A1 (en) * | 1986-06-26 | 1988-02-03 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Vaccines against protozoan parasites |
| WO1988003533A1 (en) * | 1986-11-04 | 1988-05-19 | Syntro Corporation | Construction of synthetic dna and its use in large polypeptide synthesis |
| IT1198225B (it) * | 1986-12-04 | 1988-12-21 | Eniricerche Spa | Polipeptidi immunologicamente attivi utili per la preparazione di vaccini antimalaria e di kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antisporozoita |
| EP0278940A3 (en) * | 1987-01-30 | 1988-12-07 | Smithkline Biologicals S.A. | Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them |
| JPH0222300A (ja) * | 1987-02-02 | 1990-01-25 | Swiss Serum & Vaccine Inst Bern | 免疫原性接合体およびその製法ならびに免疫を生ぜしめる方法 |
| AT388934B (de) * | 1987-11-13 | 1989-09-25 | Wellcome Found | Rekombinationskonjugatprotein und neue vakzinen |
| ATE95188T1 (de) * | 1987-12-23 | 1993-10-15 | Immuno Ag | Zellulaere amphipatische proteine in aggregierten formen und verfahren zur herstellung und reinigung diese proteine. |
| NZ233494A (en) * | 1989-05-03 | 1993-08-26 | Smithkline Beecham Corp | Polypeptides comprising plasmodium surface protein with a reduced number of repeating immunogenic determinants fused to a carrier protein; vectors coding therefor and vaccines |
| CA2031468A1 (en) * | 1989-12-08 | 1991-06-09 | Mitchell S. Gross | Malaria vaccine |
| NZ596223A (en) | 2009-05-05 | 2014-04-30 | Cadila Healthcare Ltd | Combined measles-malaria vaccine |
| US20180153945A1 (en) * | 2016-12-05 | 2018-06-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Oral e. coli vector-based vaccine for prevention of coccidiosis in poultry |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4466917A (en) * | 1981-02-12 | 1984-08-21 | New York University | Malaria vaccine |
| GB2145092B (en) * | 1983-01-28 | 1988-04-07 | Univ New York | Protective peptide antigen |
| AU569722B2 (en) * | 1983-01-28 | 1988-02-18 | Saramane Pty Ltd | Expression of plasmodium falciparum polypeptides from cloned cdna |
| WO1985003724A1 (en) * | 1984-02-21 | 1985-08-29 | National Research Development Corporation | Improvements in or relating to the production of malaria vaccines |
| US4707357A (en) * | 1984-06-26 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Immunologically active peptides capable of inducing immunization against malaria and genes encoding therefor |
-
1985
- 1985-02-07 CN CN198686100979A patent/CN86100979A/zh active Pending
-
1986
- 1986-02-03 AU AU52936/86A patent/AU603054B2/en not_active Ceased
- 1986-02-03 DE DE8686870013T patent/DE3687071T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-03 EP EP86870013A patent/EP0191748B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-03 AT AT86870013T patent/ATE82322T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-02-04 IL IL77788A patent/IL77788A0/xx unknown
- 1986-02-04 NZ NZ215034A patent/NZ215034A/xx unknown
- 1986-02-04 ZA ZA86797A patent/ZA86797B/xx unknown
- 1986-02-04 PT PT81967A patent/PT81967B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-02-05 GR GR860351A patent/GR860351B/el unknown
- 1986-02-05 ES ES551656A patent/ES8704975A1/es not_active Expired
- 1986-02-06 EG EG64/86A patent/EG17878A/xx active
- 1986-02-06 OA OA58779A patent/OA08199A/xx unknown
- 1986-02-06 JP JP61025660A patent/JPH0698005B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-06 HU HU86505A patent/HU201803B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-02-07 YU YU00181/86A patent/YU18186A/xx unknown
- 1986-02-07 DK DK62486A patent/DK62486A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-02-07 AP APAP/P/1986/000020A patent/AP17A/en active
-
1987
- 1987-10-12 MY MYPI87002891A patent/MY102249A/en unknown
-
1994
- 1994-05-20 JP JP6106595A patent/JPH07102150B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| YU18186A (en) | 1988-06-30 |
| JPS61181387A (ja) | 1986-08-14 |
| DK62486A (da) | 1986-08-08 |
| NZ215034A (en) | 1989-07-27 |
| OA08199A (en) | 1987-10-30 |
| DE3687071D1 (de) | 1992-12-17 |
| AP17A (en) | 1988-04-02 |
| PT81967A (en) | 1986-03-01 |
| DK62486D0 (da) | 1986-02-07 |
| IL77788A0 (en) | 1986-07-31 |
| DE3687071T2 (de) | 1993-03-25 |
| EP0191748A1 (en) | 1986-08-20 |
| HUT40917A (en) | 1987-03-30 |
| JPH0698005B2 (ja) | 1994-12-07 |
| AU603054B2 (en) | 1990-11-08 |
| AP8600020A0 (en) | 1986-02-01 |
| ZA86797B (en) | 1986-09-24 |
| ES551656A0 (es) | 1987-04-16 |
| CN86100979A (zh) | 1986-12-17 |
| JPH07102150B2 (ja) | 1995-11-08 |
| MY102249A (en) | 1992-05-15 |
| EP0191748B1 (en) | 1992-11-11 |
| JPH07170995A (ja) | 1995-07-11 |
| AU5293686A (en) | 1986-08-14 |
| ATE82322T1 (de) | 1992-11-15 |
| PT81967B (pt) | 1988-07-01 |
| ES8704975A1 (es) | 1987-04-16 |
| EG17878A (en) | 1991-06-30 |
| GR860351B (en) | 1986-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Anders et al. | Immunisation with recombinant AMA-1 protects mice against infection with Plasmodium chabaudi | |
| Young et al. | Expression of Plasmodium falciparum circumsporozoite proteins in Escherichia coli for potential use in a human malaria vaccine | |
| Lowell et al. | Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides | |
| HU201803B (en) | Process for producing polypeptides forming the agent of anti-malaria vaccine | |
| AU639588B2 (en) | Malaria vaccine comprising an immunogenic polypeptide | |
| Pessi et al. | Lack of H‐2 restriction of the Plasmodium falciparum (NANP) sequence as multiple antigen peptide | |
| JP4145145B2 (ja) | マラリア・プラスモジウム抗原ポリペプチドｓｅ３６、その精製方法、並びにこれより得られる抗原を用いるワクチン及び診断剤 | |
| US9028843B2 (en) | Malaria vaccine | |
| EP0544781B1 (en) | New peptides and their use | |
| AU634837B2 (en) | Malaria vaccine | |
| JP2000506381A (ja) | マラリア原虫ｍｓｐ―１のｃ末端断片を含む組換えタンパク質 | |
| Locher et al. | Reduction of disulfide bonds in Plasmodium falciparum gp195 abolishes the production of growth-inhibitory antibodies | |
| Itoh et al. | The correlation of protective effects and antibody production in immunized chickens with recombinant R7 vaccine against Leucocytozoon caulleryi | |
| EP0398540A1 (en) | Malaria vaccine | |
| Millet et al. | Inhibitory activity against sporozoites induced by antibodies directed against nonrepetitive regions of the circumsporozoite protein of Plasmodium vivax | |
| Chai | The humoral response to a chemically defined synthetic vaccine comprised of epitopes derived from the circumsporozoite protein of Plasmodium berghei | |
| PT100757A (pt) | Polipeptidos aptos para induzir "in vivo"anticorpos capazes de inibir a invasao de globulos vermelhos por merozoitos de "p.falciparum", produtos aparentados e sua aplicacao na producao de composicoes de vacinacao |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |