JPH02798A - 可溶性両親媒性タンパク質ならびにその製造および精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 集合体の形にある両親媒性細胞タンパク質およびこれら
タンパク質の製造、精製法 免肛立且１ 本発明は細１抱内でつくられる両親媒性可溶性タンパク
質ならびにこれらタンパク質の単離および精製法に関す
る。

発明の背景 生理活性のあるすべての細胞は、細胞の生３’ｒ機能を
維持するために必要なタンパク質をつくり出している。

合成されたこれらタンパク質は種々な機能をもら、ある
ものはＭ索として作用しく１１ち、これらは細胞内の代
１Ｍ反応を触媒する）、他のものはその細胞が属してい
る生体の生命過程の役割を果し、また他のものは細胞構
造を形づくることがある。しかし、これら細胞内でつく
られるタンパク質は他の生体に対して抗原効果も具えて
いる、即ちそれら生体に免疫反応を誘発することができ
る。ウィルスもまた、例えばその外被に抗原としで作用
しつるタンパク質を含む。

タンパク質合成の指令は細胞の遺伝子に見出され、これ
は遺伝学的物質の機能単位とみられている。現在、例え
ば動物またはヒトの細胞から遺伝子を他の細胞、しばし
ばａｌ菌の細胞へと移すことによって、ｉ＋！１Ｉ、例
えば細菌の遺伝子構成を変える技術が進歩しく来ている
。このようにして、その細菌は導入された外来遺伝子に
よりコード化されたタンパク質を合成りるであろう。こ
の技術の最もよく知られた例の一つはインシュリン合成
である。インシュリンはヒトの膵臓でつくられるタンパ
ク質であるが、これがインシュリン合成の遺伝子を含む
細菌［５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにより合成され
ている。

天然につくられるタンパク質ならびに細胞の遺伝子操作
によりつくられるタンパク質は、細胞から分泌されるか
または細胞内に蓄積される。つくられたタンパク質を単
離し精製するためには、細胞を溶解し、タンパク質を単
離し、そし−〇必要に応じ、この分野で公知の方法によ
り溶解する。この過程に対して、幾つかの分別と精製工
程の後で、一般に洗浄剤が使用される。これは単離、精
製すべき個々のタンパク質に非常に特異的に適合しなけ
ればならない。従って、望むタンパク質の単離および精
製のために正しい洗浄剤を見付番）ることが引続きこの
分野の一つの問題となっている。

発明の要約 本発明の目的は、生理活性のある１１Ｉ胞内でつくられ
たタンパク質を単離し精製することができると同時にそ
のタンパク質の生物活性を維持または向上させる方法を
提供することにある。

この目的は本発明方法に従って達成されるが、水沫は、
洗浄剤欠如下では電子顕微鏡下で見えるほぼ扁球状の電
気泳動で移動しない第一の集合体形■として存在し、第
一の非変性性洗浄剤の存在下では、電子顕微鏡下で見え
る電気泳動で移動しない第二のゆるい集合体形ＩＩとし
て存在し、ぞして第二の非変性性洗浄剤の存在）では電
子顕微鏡下で見えない電気泳動移動形■としで存在し、
そして前記形Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩは洗浄剤の存否の
関数として一つの形から他の形へと可逆的に変換できる
というタンパク質を入手できるようにするものである。

図面についての簡単な記述 第１図は糖タンパク質１６０のトリス緩衝液中の電子顕
微鏡写真（２７８，６４０倍に拡大）を示す。このタン
パク質は緻密な球状集合体形ｆとして存在する。

第２図は１％ＤＯＣを含む緩衝液中のＨＩ　Ｖの糖タン
パク′ｆｉｌ　６０の電子顕微鏡写真を示す。このタン
パク質はゆるい雲状の集合体形ＩＩとして存在する。

発明の詳細な記述 タンパク質の単離過程で、非変性性洗浄剤を使用したと
き、両親媒性タンパク質が分散形でなく集合体形で存在
することが烈外にも示された。これら集合体形は右利な
特徴をもつ。非変性性洗浄剤の欠如下で、この集合体形
は固く詰った構造を示す。本川ＷＡＮ中でこの構造を集
合体形■と呼ぶことにする。この形でこれら集合体形の
表面に存在する不純物をタンパク質から除去できる。そ
れ故に集合体形の緻密な形状によって活性タンパク質の
変性が保護される（酵素活性または免疫反応をひき起こ
すエピトープが保護される）。集合体形■における緻密
なタンパク質は生物活性があるが、電気泳動で移動しな
い。

非変性性洗浄剤の存在下で、集合タンパク質の緻密な球
状形Ｉは、多少ゆるんだ形に変換できる。

単離および精製過程の進行中では、集合体形Ｉが聞いて
形ＩＩになると、不純物が一層容易に処理し易くなり不
純物を更に除去できるのでこのゆるんだ形は有利である
。集合体タンパク質の形■では意外にもタンパク質の生
物学的活性も増加する。

例えば、これらの単離されたタンパク質の生物学的特性
が免疫化の抗原としでであるならば、単離タンパク質の
免疫発現性が増加する。それ故に、生物活性タンパク質
あるいは生物活性を示すこれらタンパク質の部分も膨張
形■で特に活性がある。

前記の理由のため、はぼ雲状の集合体形の中に封じ込ま
れた成分からタンパク質を容易に精製できる。集合体形
ＩＩのタンパク質も電気泳動で移動しない。

本発明方法により処理された粒状集合体タンパク質につ
いての特に驚くべきことは、集合体形■と■を第一の非
変性性洗浄剤の存否の関数として相互に可逆的に変換で
きるという事実である。記載の粒状集合体タンパクｖｌ
形は幾つかの付随する実際的な利点をもつ。これら集合
体形１およびＩＩの相互変換の可逆性のため、′Ｍ製過
程が単純化され、貯蔵性が向上し、単離タンパク質の生
物活性が増加する。

第二の非変性性洗浄剤を、目標を定めて用いると、集合
体形■からタンパク質の分散形■にタンパク質を変換で
きる。この予期Ｖざる状態は、もし第二の非変性性洗浄
剤を除去するとこの状態から元に戻る。それ改に、生理
活性細胞から単離されるタンパク質は、非変性性洗浄剤
の存否の関数として、意図した特定の工程または用途に
最適の望む形に変換できる。

貯蔵のため、あるいは単離されたタンパク質の生物学的
活性低下の尺度として、はぼ球形ＩＭ造をｂつ集合体形
Ｉが好ましい。更にまた、球形は精製工程中に変性を起
こす可能性のある処理から敏感な生物活性中心を保護す
る。

集合体形■は、処理の継続時間と非変性性洗浄剤の濃度
とにより、およそ雲状の構造を示すぐあろう。このタン
パク質は、広がりの度合により、例えばタンパク質製造
に用いた宿主細胞またはベクター系から生じうる不純物
に関してそれ以上の精製が行ない易くなる。タンパク質
の生物活性は形■で増加する。

扁球状集合体形■およびほぼ雲状の集合体形ＩＩの両方
共、らしつくられた個々のタンパク質の分子場が少なく
とも１０，０００ドルトンであれば電子顕微鏡下で見る
ことができる。しかし、ｂし例えば遺伝子操作によって
ごく少数のアミノ酸を含むタンパク質のある抗原決定子
だけが発現されるとすれば、集合体形■および■は電子
顕微鏡で可視度以下となるであろう。

集合体形ＩおよびＩＩにお４Ｊる電気泳動で移動しない
クンバク質集合体は８０％、なるべくは９８％の純度で
存在するのがよい。即ち、集合体形■と■は望むタンパ
ク￥【を比較的均一・な集合体として合むのがよい。

もしタンパク質が遺伝子−ｒ学により操作された細胞の
発現生成物であるなら、そして特にもし生成物が公知の
方法によりこれら細胞中で産生過多であるならば、細胞
内のタンパク質の凝集が特に適当な程喰に起こる。

望むタンパク質を発現する遺伝子を含む幾つかのベクタ
ーが存在するか、またはもし相当する遺伝子の前に特別
強いプロモーターが置かれているならば、過剰生産が起
こりうる。もし発現されたタンパク質が１ｉ８胞内で可
溶性のものであれば、それらは集合して記載の球状粒子
を形成するであろう。

遺伝子操作された宿主４Ｉ胞により発現されるタンパク
質は抗原機能を示すことが好ましい。これらタンパク質
はもし生きている接種材をつくろうとするならば、ある
いは対応する活性抗原による活性免疫化を意図するなら
ば、遺伝子操作されたタンパク質発現に特に適している
。これはとりわけヒト病原性または動物病原性のウィル
スの外被タンパク質を含む。

なるべくは、単離されたタンパク質が糖タンパク質、例
えばト１１Ｖの糖タンパク質ＧＰ１６０またはＢ型肝炎
ウィルスの表面抗原であるのがよい。

各場合におけるタンパク質の発現用遺伝子は、例えば哺
乳動物細胞系でワクシニアウィルスベクターにより発現
させることができる。如何にして特異的遺伝子をワクシ
ニアウィルスベクター中に挿入するかの方法はＨａｃｋ
ｅｔｔ　Ｌ８、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４９．８５７　（１
９８４）により記述されている。この分野で公知の方法
により、先ず外来遺伝子をワクシニアの転写制御エレメ
ント（７，５にプロモーター）から下流のプラスミドベ
クターに挿入する。

組み変えプラスミド中のこのキメラ遺伝子の側に、ウィ
ルスのグミジンキナ−ぜ遺伝子（ＴＫ）の遺伝情報を指
定づるワクシニアの配列が位置している。それによって
このプラスミドは野生型ワクシニアウィルス（ＷＲ株）
で前以て＠染させた細胞中に導入される。このようにし
てＴＫ領領域組み変えが起こる。この領域はウィルスＤ
ＮＡおよびプラスミドの両方に対して相同であり、ワク
シニアウィルスのゲノム中にキメラ遺伝子を挿入できる
ようにする。この方法で得られた組み変え体ウィルスは
、表現型Ｔ　Ｋを示す。換言すれば、このものは最早チ
ミジンキナーゼを産生せず、５−プロジンデオキシウリ
ジンを含む選択的培地中で発育する。この方法で、タン
パク質を恐らく過剰生産的につくり出し、従ってこれが
哺乳動物ｍ胞中で凝集して記載の集合体形を形成する遺
伝子をもった組み変え体ワクシニアウィルスをつくるこ
とができる。この集合体形は多数の個々のタンパク質を
含む。同様な発現系が他の抗原タンパク質に対して知ら
れている。例えば、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原の遺伝
暗号を指定する幾つかのワクシニアウィルス組み換え体
が設計されている。この目的のため、ワクシニアウィル
スの調整機構の下で、幾つかのワクシニア特異的プロモ
ーターを使用して、外来遺伝子に対する発現レベルを増
加させるという目標でＢ型肝炎ウィルス表面抗原を発現
させた。更にまた、一つ以上のＢ型肝炎ウィルス遺伝子
を発現させるワクシニアウィルス組み換え体をつくった
。

望むタンパク質の遺伝子工学による生産のための組み換
え体発現系の製造は、ｗｔｎｎａｃｋａｒ　　［、ｔ。

（ｃｅｎｅ　ｕｎｄ旧ｏｎｅ、ｅｉｎｅ　Ｅｉｎｆｊｈ
ｒｕｎｇ　１ｎｄｉｅＧｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｏｉｅ　
　（Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｃ１ｏｎｅｓ　　ＡｎＩｎｔ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）ＶＣＩＩ−Ｖｅｒｌａｏｓｏｅｓｅｌｌｓｃｈ
ａｆｔ　ｍｂｔｌ　、　Ｗａｉｎｈｅｉｎ＋　（１９８
４）１に一般的に記載されている。

多くのタンパク質を含有する集合体形で存在しつる、ｌ
ｌｌ１１１内で発現したタンパク質の生物学的機陽は酵
素機能であるのがよい。特に集合体形ＩＩにおいては酸
Ｘ機能増加が見られる。この増加は、酵県活性中心がゆ
るんだ集合体形■で露出しているという事実と関連する
と考えられ、そしてこれにも拘らずすべての酵素活性タ
ンパク質の空間的なつながりが存在する。従って、タン
パク質の酵素活性により変換される物質が［活性域と出
会う確率の増加がある。

もし酵素タンパク質が凝固因子■であれば、とりわけ好
ましい。Ｆ■の遺伝子工学生産はこの分野で数回記述さ
れ°Ｃ来た。粒子形で集められたタンパク質は、もう一
つの物質、特に高分子はタンパク質へ抱合により結合さ
せることが好ましい。

この結果、安定性、活性、ｉｎ　Ｖ＋ｔｒＯ回収率、お
よびタンパク質の生物学的半減期が改善される。望むタ
ンパク質と高分子量の別の物質とのこのような抱合の例
は、凝固因子■とＷｉ　Ｉ　Ｉｅｂｒａｎｄｓ囚子のそ
れにより代表される。

粒子状集合体タンパク質は真核細胞、とりわｔプ動物ま
たはヒトの細胞で発現するのがよい。

もし望むタンパク質を初代細胞培養で、あるいは細胞系
から得たベロー細胞、ＣＨＯ細胞、または初代ニワトリ
胚ｉｌｌ雑芽細胞で発現させることができるなら特に好
ましい。例えば、発現されたタンパク質のグリコジル化
といった翻訳侵に生ずる最終生成物の修飾のため、記載
の宿主細胞は発現系として特に好ましい。これらのグリ
コジル化タンパク質は次に凝集して粒子形を形づくり、
このものは記載の球状形Ｉとなるか、あるいは第一の非
変性性洗浄剤での処理後に雲状の形■となることができ
、また第二の非変性性洗浄剤での処理後に第三の集合体
形■に変化することができる。

前述したように、ＨＩＶの糖タンパク質１６０の製造に
はベロー１１１１１１１が特に好ましい。この細胞系が
特によいのは、発育速度が比較的早く、ヒ＋−の接種材
の製造によく適合づるからである。本発明方法により単
離しようとする望むタンパク質を発現する遺伝子を含む
組み換え体ワクシニアウィルスによるベロー細胞の感染
の結果として、望むタンパク質の正常な合成、そのグリ
コジル化ならびに可能なそれ以上の処理工程が生れる。

二つの組み換え体による二重感染方式の使用により、望
むタンパク質の量を有意に増すことができる。この方式
は、ワタシニアのＰ７−６プロモーターの制御下でファ
ージ１７のポリメラーゼを発現する組み換え体を含む。

この組み換え体をＴ７プロモーターおよびＨＩＶの糖タ
ンパク質１６０遺伝子を含む組み換え体で一緒に感染さ
せる。Ｔ７プ１］モーターは非常に強いプロモーターで
あり、ｎレベルの、例えば望むタンパク質問の１０倍の
発現を確実にする。

２ａの方式は特に適当な方式として理解される筈′Ｃあ
る。望む遺伝子の組み換えに幾つかのベクターを使用し
たしてこれらベクターを望む細胞中で増殖ざＶｌそして
外来遺伝子により発現されたタンパク質をつくる多くの
異なる可能性の一般的Ｐｒｅｓｓ、　ｒｌ、Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓｏｎ編（１９８２）またはＳｐｅｋｔｒｕｍ　ｄ
ｅｒ　Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｒｔ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　
ｏｒｓｃｉｅｎｃｅ　＞　、ｒｎｃｔｕｓｔｒｔｅ＋＋
ｅ　Ｈｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏ（ＩＶ　）　　（１９８５）
に見出される。

その存否が、異なる集合体形またはタンパク質の分散形
における生理活性細胞から単離されたタンパク質の存在
に、有意に影響を及ぼす非変性性洗浄剤はなるべく非イ
オン性、非イオン性、または混成イオン性洗浄剤である
のがよい。望むタンパク質を、一方にＪ３いては高純度
の形で、また他方では生物学的に活性ある状態で回収す
るための洗浄剤の選択が常に挑戦を意味するということ
は、タンパク質化学でまたタンパク質精製法で公知の問
題である。ある種のイオン性、非イオン性、または混成
イオン性の非変性性洗浄剤を使用すると、タンパク質精
製法に対する上記の必要条性が完全に満されることが意
外にもここに発現された。そのト、予想外の進歩はタン
パク質東合体の構造であり、これらタンパク質をつくり
出す細胞内にそれらが存在するままで記載の要件を非常
によく満足する。前記のように、とりわけゆるんだ構造
または雲のような構造をもつ集合体形ＩＩにおいては、
個々のタンパク質に本来備なねっている生物活性が、そ
れが酵素活性であれ抗原活性であれ、明らかに増加する
。

特に適当な非イオン洗浄剤は、オクチルグルコシドある
いはこの洗浄剤の誘導体の一つであり、濃度はなるべく
０．２５から５％、特に１％がよい。

また、胆汁酸の塩、ならびにその誘導体の一つの洗浄剤
、なるべくは洗浄剤デオキシコーレート（ＤＯＣ＞を用
いるのがよい。この洗浄剤はＨＩ　Ｖ糖タンパク質１６
０の球形の多くのタンパク質の単離および精製に、なる
べくは０．２５から５％、なるべくは１％の濃度で用い
るのに適当であり、またもしＧＰ１６０の精製にデオキ
シコーレートを使用するとすれば、例えば水酸化アルミ
ニウムと組み合わせて用いるのがよい。

タンパク質集合体を■形から車間体形■に変換するため
に使用するのに適した非変性性洗浄剤はＺｗｉｔｔｅｒ
ｇｅｎｔ　Ｒシリーズの混成イオン性洗浄剤で、これを
０．２５〜５％、なるべくは１％の濃度で使用する。

Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　’洗浄剤はスルホベタインと
して知られる合成双性イオン型洗浄剤で次の一般構造を
もつ： ＣＨ２０ 集合体形■のタンパク質は、タンパク質の安定貯蔵に特
によく適している。しかし、これらはまたψむ生物学的
変換あるいは反応にも使用できるのは集合体形■におけ
る組み合わせタンパク質も生物活性を示すからである。

タンパク質をその集合体形■で用いると、タンパク質の
生物学的機能の強化が起こる。

タンパク質の集合体形はいずれも、記載された扁球状、
雲状または非集合形で、また高分子間の他のタンパク質
との前記抱合形で、治療、予防または診断用に適してい
る。

タンパク質集合体のもう一つの用途は、置き換え処理、
接種材またはモノク【］−ン抗体の生産、ならびに体液
中の物質の定性的検出および定が的測定のための物質の
生ｌｆ′Ｃ−ある。

更に、本発明は細胞内で、なるべくは遺伝子操作した細
胞内でつくられた望むタンパク質の単離ｄ３よび精製法
にも関する。この場合、最初の精製工程で、第一の集合
体形Ｉとして存在するタンパク質から、表面に存在する
不純物を取り除き、次に非変性性洗浄剤を用いてこれら
タンパク質を第二の集合体形ＩＩに変換する。二番目の
精製工程で、この集合体形ＩＩにおいて処理し易くなっ
た不純物を除去し、そして第二の１１変性性洗浄剤の添
加によりタンパク質を非集合形■に変換できる。このタ
ンパク質は非変性性洗浄剤を除くことにより、集合した
形工または■へ可逆的に変換し戻りことができる。

この方法の利点は本質的に前述して来たが、これはタン
パク質の種々＜【集合形を互に可逆的に変換できること
にある。

例えば、およそ球状の彫工は、これらタンパク質の緻密
な構造のため、多少なりとも球形のタンパク質集合体の
表面から、媒地成分を最初に簡単に除いてきれいにする
ことができる。次に、もし第二の不純物除去工程を行な
うならば（開いた構造のため不純物は集合体形■では除
去し易くなっている）、非変性性洗浄剤の除去により集
合体形■を再び可逆的につくることができる。例えば、
形Ｉにおいでは、タンパク質の活性中心はタンパク質の
球形配列の内側で特によく保護されている。

従って、集合体形Ｉにおいては、特に良いタンパク質貯
蔵が可能である。既に述べたように集合体形■は、タン
パク質が発現される宿主細胞、あるいは組み換えの仕方
で単離タンパク質に対する遺伝子を含むベクターのＩＲ
Ｋ１成分除去の単純化ということに関して利点を有する
だけでなく、タンパク質の特別な集合状態により多（の
活性中心の空間的な接近のためタンパク質の生物活性を
有意に強化できるというもう一つの利点をもつ。

実験の構成により、細胞または細胞膜を遠心し、非変性
性洗浄剤ならびにプロテアーゼ阻害系を含む緩衝溶液で
抽出するか、あるいはもし高分子量の望む物質が細胞か
ら培地の中に分泌されるなら、その培地を非変性性洗浄
剤およびプロテアーゼ阻害系と混合する。この非変性性
洗浄剤は、例えば、デＡキシコーレート（Ｄ　ＯＣ）で
その濃度は約０．２５から５％、なるべくは１％である
。

この方法で得られた溶液を濃縮するが、もし単離し精製
しようと１６物質が糖タンパク質であるならレクチンを
用いて濃縮する。このものは固体マトリックスに結合し
、ぞの非炭水化物性不純物を除去する。この段階で用い
る非変性性洗浄剤は、物質を形ＩＩに変換づる性質に加
えて、非特異的吸着を防止する能力をもつ。グリコシド
で溶離が起こる。

もう一つの重要な意味をもつ精製工程は、高分子量の予
備純化物質を免疫吸着カラムに特別に結合させることに
より行なわれる。！！１ＴｔＩ液で一奮分に洗浄後、カ
オトロピック剤、例えば尿素またはＫＳＣＮ　（２〜８
Ｍ、なるべくは３Ｍ）、を溶離に使用する。その後Ｎ衝
液に対して透析することにより、物質を粒子形に変換さ
せる。必要に応じ、ある種の混成イオン性洗浄剤を用い
て、高分子量をもつこの物質を非集合性の形■に変え、
イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。洗浄剤
を含まない緩衝液に対して透析すると、非集合形■から
集合体形■またはＩが回復する。

記載した細胞内でつくられるタンパク質の種々な集合体
形は電子顕微鏡により見えるようにできる。

本発明を下記の例で詳細に説明する。

例１ ＨＩ　Ｖの糖タンパク質１６０の単離と精製ＨＩＶの糖
タンパク質１６０の単離および精製を下記の段階に従っ
て行なった： １）遺伝子工学により操作したベロー細胞（ＨＩＶの糖
タンパク質１６０をつくる）を望む密度で遠心した。

２）遠心で得たペレットをＴＢＳ　（ｐＨ７，４）＋１
１ＩＩＨＣｕＳＯ４＋０．５ｎ＋ＨＺｎＣｌ２に再懸濁
した。

再懸濁したベレツ１〜を５０ＢＩＨトリストＩＣｌｐＨ
８，３，１％ＤＯＣ，１ｍＨＣｕＳＯ４、オに　（Ｆ　
０　、５　ｍＨＺ　ｎ　Ｃ１２′Ｃ−抽出した。

この懸濁液を２５℃で３０分間遠心づることにより清澄
させた。

一番上の両分を、望むタンパク質をカラ゛ムに吸着さｔ
！、ＤＯＣ緩衝液で洗浄することにより、レンチル−レ
クチンクロマトグラフィーにかけた。このタンパク質を
洗浄用緩衝液中５％メチルグリコシドで溶離した。

レクチンカラムからの溶１ｌＩＩｌ液をｒｗｅｅｎ　１
１１ｍ液で希釈した。次に、免疫アフィニティークロマ
トグラフィーカラム上に吸着させ、これをＴＳ　　Ｔｗ
ｅｅｎ、その（Ｉ　Ｔ　１３　Ｓで洗浄した。これに続
いてＤＮＡおよびＲＮＡ処理を行ｔ１つた。溶離を３Ｍ
　　ＫＳＣＮで行ない、洗浄剤を含まない緩衝液に対し
て透析した。

６）透析した溶離液を１％混成洗浄剤および５％ベタイ
ンで調節し、次に陰イオン交換体としてのモノーＱ／マ
トリックス上に吸着させ、次にＫＳＣＮ勾配で溶離し、
緩衝液に対して透析した。

７）二番目のレンチル−レクチンクロマトグラフィーは
吸着および無洗浄剤緩衝液での洗浄により行なった。５
％メチルグリコシドで溶離し、その後ＴＢＳに対して透
析した。

このプロセス工程はタンパク質の濃縮を行なうものであ
る。

例２ 例１記載の方法に従って精製したＨＩＶの糖タンパク質
（ＧＰ）１６０を用いて、効力試験を行なった。この試
験は、緻密な球状形■、ならびにゆるんだ雲状の形ＩＩ
の状態にある糖タンパク質１６０の免疫発現有効性を示
す。

ワクチン当り１０μり、２．５μす、 ０．６２５μグ、０．１５８μり、および０．０４μり
　ＧＰ１６０／ｄの５通りの希釈液をつくった。１希釈
液当り１０匹のＢＡＬＢＧマウスを皮下免疫化した。従
って、ワクチンの型−つ当り５０匹の動物を必要とした
。この実験で、４通りの異なる吸着法を試験した。

１）　　ＧＰ１６０＋０．２％Ａｌ（ＯＨ）３２）／Ｇ
Ｐ１６０＋０．２．５％ＤＯＣ／＋−０，２％Ａｊ！（
ＯＨ）３ ３）　　／ＧＰ１６０＋０．２５％Ｄ　ＯＣ／　十１０
．２％Ａｌ　（ＯＨ）３＋０．２５％ＤＯＣ／ ４）　　／ＧＰ１６０＋０．２５％ＤＯＣ／十１０．２
％Ａｌ　（ＯＨ）３洗浄／ 全動物を１ａｌｌで皮下免疫化し、６週１ｆｆｉ褒に１
匹ずつ採血した。個々の動物の血清を、抗ＨＩ　ＶＥＬ
　ｒｓＡ　（ＳＯＲＩＮ）を用いてＧＰＩ　６０抗体の
存在について調べた。公知のｓｐｅａｒｍａｎＫａｅｒ
ｂｅｒ法により反応する動物に基づき各型のワクチンに
対してＧＰＩ　６０の右効用量５０を計算する。

結　　果 Ｉ Ｉ〜ｖ１０μｇＧＰ１６０／Ｉｄ＋０．２％△ｊ！　（
ＯＨ）３　（皮下） 反応する動物　最大タイター ｌｌ　　　　　　１　　　　　１００ １　：４　　　　　１　　　　　　　１０１：１６０／ １：６４　　　　１　　　　　　　１０１：２５６　　
　１　　　　　　　１０ＥＤ５ｏ−１０μ５７／ｄ　　
ＧＰ１６０■〜ｘ１０μｇ　ＧＰ１６０／Ｉ１１！＋Ｄ
ＯＣ十０．２％Ａｌ（ＯＨ）３　（皮下） 淵　　　　　　　７　　　　１．０００１　：４　　　
　　５　　　　　　２００１：１６　　　　１　　　　
　　　１０１：６４　　　　０　　　　　　　　　／１
：２５６　　　０　　　　　　　　　／ＥＤ５ｏ＝３．
３μｇ／１ｔｔｌｌ　　ＧＰ１６０ＸＩ　〜ＸＶＩ　Ｏ
μｇＧＰ１６０／＃Ｉｅ＋ＤＯｃ−＋ＤＯＣ−／ｌ　（
ＯＨ）３　（皮下） ｍ　　　　　　　　７　　　　　　８００Ｘｌｌ　　　
１：４　　　　　　　　５　　　　　　１，０００Ｘｌ
ｌｌ　　１：１６　　　　　　６　　　　　　　　　１
００ＸＩＶ　　　１：６４　　　　　　２　　　　　　
　　　１００ＸＶ　　　　１：２５６　　　　　１　　
　　　　　　　１００Ｅ　Ｄ５０＝　１　、０９μｇ／
ｄ　　ＧＰ１６０４）　　ＸＶＩ　　〜ＸＸ　　１０μ
９ＧＰ１６０／ｄ＋ＤＯｃ＋Ａｌ（ＯＨ）３洗ｒｐ（皮
下） ＸＶＩ　　　濃　　　　　　　　　　Ｏ／ＸＶＩＩＩ：
４　　　　　　　　１　　　　　　　　　　１０ＸＶＩ
ＩＩ　　１　　：　　１６　　　　　　０　　　　　　
　　　　　　／ＸＩＸＩ：６４　　　　　　０　　　　
　　　　　　　　　／ＸＸ　　　　１：２５６　　　　
０　　　　　　　　　　　　／ＥＤ５ｏ＝１０μｇ／Ｉ
ｄ　ＧＰ１６０＋１Ｔ　Ｖの糖タンパク質１６０につい
ての効力試験の結果は、糖タンパク質１６０の免疫発現
性がその集合体形によって種々に変ることを示している
。接種動物の５０％が血清変換を起こす使用物質量を示
すＥＤ５ｏｒｆｉは、洗浄剤ＤＯＣが存在するとき意味
をもつ程に減少した。洗浄剤ＤＯＣ存右下で、糖タンパ
ク質１６０が集合体形ＩＩとして存在すると、その場合
一方においては抗原エビトー１が無く、他方においては
空間的につながっているので、強い免疫反応を起こした
。

本発明をＨＩＶの糖タンパク質１６０の例を用いて説明
したが、決してこのタンパク質に限定するものではない
。

【図面の簡単な説明】

第１図は糖タンパク質１６０のトリス緩衝液中の粒子構
造を示す電子類ｍ鏡写真（２７８，６４０佑）であり、
第２図は１％ＤＯＣを含む緩衝液中のＨＩＶ糖タンパク
質１６０の粒子構造を示す電子顕微鏡写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）細胞内でつくられる両親媒性可溶性タンパク質に
   おいて、前記タンパク質は、洗浄剤欠如下では電子顕微
   鏡下で任意に見ることのできるほぼ扁球状の、電気泳動
   で移動しない第一の集合体形 I として存在し、そして
   第一の非変性性洗浄剤の存在下では、電子顕微鏡下で任
   意に見ることのできる電気泳動で移動しない第二のゆる
   い集合体形IIとして存在し、そして第二の非変性性洗浄
   剤の存在下では電子顕微鏡下で見えない電気泳動移動形
   IIIとして存在し、そして前記の形 I 、形IIおよび形I
   IIは前記洗浄剤の存否の関数として相互に可逆的に変換
   できるという特徴をもつ上記タンパク質。 （２）タンパク質は少なくとも８０％の純度で存在する
   、特許請求の範囲第１項記載のタンパク質。 （３）タンパク質は少なくとも９８％の純度で存在する
   、特許請求の範囲第２項記載のタンパク質。 （４）タンパク質は遺伝子工学により操作した細胞、と
   りわけタンパク質を過剰発現する細胞の発現産物である
   、特許請求の範囲第１項記載のタンパク質。 （５）タンパク質は抗原機能をもつ、特許請求の範囲第
   １項または第４項に記載のタンパク質。 （６）タンパク質は糖タンパク質である、特許請求の範
   囲第５項記載のタンパク質。 （７）糖タンパク質はＨＩＶ糖タンパク質１６０または
   Ｂ型肝炎ウィルスの表面タンパク質である、特許請求の
   範囲第６項記載のタンパク質。 （８）タンパク質は酵素機能をもつ、特許請求の範囲第
   １項または第４項記載のタンパク質。 （９）タンパク質は凝集因子である、特許請求の範囲第
   ８項記載のタンパク質。 （１０）タンパク質の安定性、活性、￥ｉｎ　ｖｉｖｏ
   ￥回収率、および生物学的半減期を改善するため、タン
   パク質を抱合により別の物質に結合させる、特許請求の
   範囲第８項記載のタンパク質。 （１１）物質は高分子量タンパク質である、特許請求の
   範囲第１０項記載のタンパク質。（１２）細胞は真核細
   胞である、特許請求の範囲第１項または第４項記載のタ
   ンパク質。（１３）真核細胞は動物またはヒトの細胞で
   ある、特許請求の範囲第１２項記載のタンパク質。 （１４）細胞は初代細胞培養からまたは細胞系から得た
   ものである、特許請求の範囲第１２項記載のタンパク質
   。 （１５）細胞はベロー細胞、ＣＨＯ細胞、または初代ニ
   ワトリ胚繊維芽細胞である、特許請求の範囲第１４項記
   載のタンパク質。 （１６）洗浄剤はイオン性、非イオン性、混成イオン性
   洗浄剤である、特許請求の範囲第１項記載のタンパク質
   。 （１７）第一の非イオン洗浄剤は濃度０．２５から５％
   、とりわけ１％のオクチルグルコシドまたはその誘導体
   にあり、第二の混成イオン性洗浄剤は濃度０．２５から
   ５％、とりわけ１％の Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ＾■シリーズの一つである、特
   許請求の範囲第１６項記載のタンパク質。 （１８）第一の非イオン洗浄剤は、濃度０．２５から５
   ％、とりわけ１％の胆汁酸の塩またはその誘導体である
   、特許請求の範囲第１６項記載のタンパク質。 （１９）洗浄剤はデオキシコーレート（ＤＯＣ）である
   、特許請求の範囲第１８項記載のタンパク質。 （２０）タンパク質を特許請求の範囲第１項記載の集合
   体形 I として使用することからなる、タンパク質の安
   定貯蔵法。 （２１）タンパク質を特許請求の範囲第１項記載の集合
   体形IIとして使用することからなる、タンパク質の生物
   学的機能の強化法。 （２２）特許請求の範囲第２０項または第２１項記載の
   方法において、タンパク質をその本来の形よたは抱合形
   で治療、予防または診断用として更に使用する上記方法
   。 （２３）ワクチンを得るためにタンパク質を用いる、特
   許請求の範囲第２２項記載の方法。 （２４）体液中の物質の定性的検出あるいは定量的測定
   用の物質を得るためにタンパク質を使用する、特許請求
   の範囲第２２項記載の方法。 （２５）細胞内でつくられた両親媒性タンパク質の単離
   および精製法において、下記工程： （イ）最初の精製工程で、第一の集合体形 I のタンパ
   ク質から表面に存在する不純物を除去し、 （ロ）非変性性洗浄剤を用いてタンパク質を第二の集合
   体形IIに変換し、 （ハ）この集合体形IIにおける処理し易い不純物を第二
   の精製工程で除去し、 （ニ）第二の非変性性洗浄剤を添加することにより集合
   体形IIのタンパク質を非集合体形IIIに変換し、 （ホ）非変性性洗浄剤の除去により、タンパク質を集合
   体形 I またはIIに可逆的に変換し戻す、 からなる上記方法。 （２６）集合体形 I はおよそ球形の構造をもちそして
   安定貯蔵に適する、特許請求の範囲第２５項記載の方法
   。 （２７）集合体形IIはおよそ雲に似た構造をもちそして
   生物学的活性を示す、特許請求の範囲第２５項記載の方
   法。 （２８）タンパク質の純度を高めるため、集合体形 I
   、II、およびIIIの可逆的変換を数回行なう、特許請求
   の範囲第２５項記載の方法。 （２９）タンパク質は、遺伝子工学により操作された細
   胞、特に前記タンパク質を過剰発現する細胞の発現産物
   である、特許請求の範囲第２５項から第２８項のいずれ
   か１項に記載の方法。 （３０）タンパク質は抗原機能をもつ、特許請求の範囲
   第２９項記載の方法。 （３１）タンパク質はＨＩＶ糖タンパク質またはＢ型肝
   炎ウィルスの表面抗原である、特許請求の範囲第３０項
   記載の方法。 （３２）タンパク質は酵素機能をもつ、特許請求の範囲
   第２９項記載の方法。 （３３）タンパク質は凝固因子である、特許請求の範囲
   第３２項記載の方法。 （３４）タンパク質の安定性、活性、ｉｎ　ｖｉｖｏ回
   収率、および静物学的半減期を改善するため、タンパク
   質を他の物質に抱合により結合させる、特許請求の範囲
   第３３項記載の方法。 （３５）物質は高分子量タンパク質である、特許請求の
   範囲第３４項記載の方法。 （３６）細胞は真核細胞である、第２５項記載の方法。 （３７）真核細胞は動物またはヒトの細胞である、特許
   請求の範囲第３６項記載の方法。（３８）細胞は初代細
   胞培養からまたは細胞系から得る、特許請求の範囲第３
   ６項記載の方法。 （３９）細胞はベロー細胞、ＣＨＯ細胞、または初代ニ
   ワトリ胚繊維芽細胞である、第３８項記載の方法。 （４０）洗浄剤はイオン性、非イオン性、または混成イ
   オン性洗浄剤である、特許請求の範囲第２５項記載の方
   法。 （４１）第一の非イオン洗浄剤は濃度０．２５から５％
   、とりわけ１％のオクチルグルコシドまたはその誘導体
   であり、第二の混成イオン性洗浄剤は濃度０．２５から
   ５％、とりわけ１％の Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ＾■シリーズの一つである、特
   許請求の範囲第４０項記載の方法。 （４２）第一の非イオン洗浄剤は濃度０．２５から５％
   、とりわけ１％の胆汁酸の塩またはその誘導体である、
   特許請求の範囲第４０項記載の方法。 （４３）洗浄剤はデオキシコーレート（ＤＯＣ）である
   、特許請求の範囲第４２項記載の方法。