CN111040024A

CN111040024A - 4型禽腺病毒基因工程疫苗及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111040024A
Application number: CN201911359301.2A
Authority: CN
Inventors: 袁野; 岳建新; 王飞; 孙灵睿; 周蕾蕾; 陈秋阁; 向王震; 张秀美; 李浩鹏; 李浩哲; 朱昊敏; 魏杰; 安铁军
Original assignee: Qyh Biotech Co ltd
Current assignee: Qyh Biotech Co ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-04-21

Abstract

本发明提供一种4型禽腺病毒基因工程疫苗及其制备方法与应用。本发明将血清4型禽腺病毒保护性抗原五邻体及六邻体蛋白用连接子连接，通过昆虫细胞‑杆状病毒表达系统表达，使其在空间构象上形成4型禽腺病毒病毒样颗粒，加入佐剂，乳化，制备得到4型禽腺病毒的基因工程疫苗。本发明提供的疫苗制备方法简单，能大量制备4型禽腺病毒抗原蛋白，耗时短，表达量高，有利于大规模生产，所得基因工程疫苗免疫效果良好，能有效预防4型禽腺病毒的感染。

Description

4型禽腺病毒基因工程疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体地说，涉及一种4型禽腺病毒基因工程疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

1987年巴基斯坦安哥拉首次报道了由I群腺病毒血清4型(FowladenovirussgroupIserum type，FAdV-4)引起的心包积水肝炎综合征(Hydropericardiumhepatitissyndrom，HHS)大爆发，随后在厄瓜多尔、智利、伊拉克、墨西哥、印度、孟买等地相继爆发，并造成巨大的经济损失，FAdV-4对雏鸡的致病力最强，可通过接触水平传播及垂直传播。主要病变为心包腔积有清亮或淡黄色的水样或果冻状液体，偶见肝脏有局灶性坏死或褪色，肝细胞出现嗜碱性包涵体，致死率高。

FAdV-4归属腺病毒A群，病毒粒子呈球形，直径为70-90nm，无囊膜，呈20面体对称，有12个顶点，由20个正三角形组成的正20面体。表面由252个长11-11nm、宽5-6nm的中空颗粒组成，中间有直径60-65nm长的髓芯。其核酸是双股线状DNA，在细胞核内复制，分子量为3×10⁷Da，其占整个病毒粒子的11.2％-13.5％，剩余部分是蛋白质，五邻体和六邻体是FAdV-4的主要结构蛋白，它们共同构成病毒核衣壳。

目前国内无商品化FAdV-4疫苗，禽腺病毒的防控仍较薄弱。开发全病毒灭活苗需使用敏感细胞系鸡肝癌细胞，此细胞贴壁不牢，难以大规模培养，且培养条件苛刻，需胎牛血清，生产成本高。鸡肝癌细胞属于癌细胞，注射到鸡体内存在安全性风险。杆状病毒表达系统具有高效表达、安全、易操作等特点，昆虫细胞可以完全无血清悬浮培养，生产易放大，非常适合做基因工程亚单位疫苗开发。

因此研制一种生产成本低、生产效率高以及免疫效果好的血清4型禽腺病毒基因工程疫苗的生产方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种4型禽腺病毒基因工程疫苗及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)来自4型禽腺病毒五邻体及六邻体蛋白如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。

其中，五邻体及六邻体蛋白之间通过Linker连接。

第二方面，本发明提供编码所述多肽的核酸分子。其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系等。

第四方面，本发明提供一种组合物，其包含所述的多肽以及药学上可接受的载体。

第五方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述组合物。

第六方面，本发明提供一种4型禽腺病毒基因工程疫苗，其包含所述免疫原性组合物，任选包含佐剂。

优选地，所述佐剂为兽医学可接受的油性佐剂，包括白油、Span-80、吐温。

第七方面，本发明提供4型禽腺病毒基因工程疫苗的制备方法，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备包含编码如SEQ ID NO:1所示4型禽腺病毒五邻体及六邻体蛋白的核酸分子的重组杆状病毒，将收获的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养转染的细胞，待细胞病变，收集细胞培养上清，上清进行灭活和纯化后，与佐剂混合。

在本发明的一个具体实施方式中，前述方法包括以下步骤：

(1)合成如SEQ ID NO:2所示的目的基因片段后，分别双酶切含有目的基因片段的pMD19-T载体和pFastBac 1载体并胶回收；用T4 DNA连接酶将目的基因片段和pFastBac 1载体过夜连接，转化DH5α感受态细胞中，测序正确后，提取含有目的基因片段的pFastBac 1载体；将含有目的基因片段的pFastBac 1载体转化到DH10Bac中，通过蓝白斑筛选法挑选白斑；接种白斑到含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的液体培养基中过夜培养；收集菌液，提取重组穿梭质粒bacmid DNA并对重组穿梭质粒bacmid进行测序鉴定；

(2)取无血清悬浮培养的Sf9细胞，细胞密度为2.0×10⁶～3.0×10⁶cells/ml(优选2.5×10⁶cells/ml)，用重组穿梭质粒bacmid转染，转染后72-96h当细胞活率降至60-80％时收获培养上清，即为P0代重组杆状病毒；用Sf9无血清悬浮培养基将Sf9细胞培养至4.0×10⁶～8.0×10⁶cells/ml(优选5.0×10⁶cells/ml)，用新鲜无血清培养基将细胞密度稀释至2.0×10⁶～3.0×10⁶cells/ml(优选2.5×10⁶cells/ml)，按1‰-1％比例接种重组杆状病毒，培养至168-192h收获上清，经检测，其效价不低于1：32；

(3)将上清进行灭活和纯化后，取上清94～96份，加入吐温-80 4～6份，搅拌溶解，作为水相，另取白油94～96份，Span-80 4～6份混匀，作为油相，取油相2份，加入水相1份，乳化20～40min(优选地，取上清96份，加入吐温-80 4份，搅拌溶解，作为水相，另取白油94份，Span-80 6份混匀，作为油相，取油相2份，加入水相1份，乳化30min)，即得。

本发明中，所述份为重量份。

步骤(3)中，灭活上清可使用乙烯亚胺。

本发明中，用于培养Sf9细胞的培养液购自上海源培生物科技股份有限公司，InsectProSF9/SF21昆虫细胞无血清培养基，货号H810KJ。

第八方面，本发明提供所述多肽，或含有所述多肽的组合物，或所述基因工程疫苗，或者按照上述方法制备的基因工程疫苗在制备用于治疗或预防4型禽腺病毒感染的药物中的应用。

第九方面，本发明提供所述多肽，或含有所述多肽的组合物，或所述基因工程疫苗，或者按照上述方法制备的基因工程疫苗在治疗或预防4型禽腺病毒感染中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

利用本发明提供的基因工程疫苗免疫14日龄SPF鸡，免疫28日后经血清抗体检测，可产生符合规程标准的血清抗体，且能够抵抗禽腺病毒强毒攻击。本发明利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达4型禽腺病毒五邻体及六邻体蛋白，蛋白产量高，纯度高，作为制备疫苗的抗原免疫性更强，安全性更高。

附图说明

图1为本发明实施例2中健康Sf9细胞(左)与病变细胞(右)对比。

图2为本发明实施例2中目的蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果。

图3为本发明实施例2中电子显微镜下观察到的病毒样颗粒。

图4为本发明实施例2中抗原琼扩效价检测结果。

图5为本发明实施例2中健康SPF鸡(左)与发病SPF鸡(右)解剖情况比较。

具体实施方式

本发明提供一种用于预防血清4型禽腺病毒病的基因工程疫苗，所用抗原为灭活的重组抗原蛋白五邻体和六邻体，两种蛋白通过连接子(Linker)连接。

具体方案如下：

本发明首先提供一种4型禽腺病毒病保护性抗原及其编码基因，所述保护性抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

研究发现，通过构建带有所述保护性抗原编码基因的杆状病毒，侵染Sf9细胞，使Sf9细胞高效表达所述保护性抗原，将表达产生的保护性抗原收集纯化后，制备成基因工程亚单位疫苗，可有效弥补现有禽腺病毒抗原生产方面的缺陷，且所获得的疫苗具有良好的免疫原性。

进一步地，本发明提供了所述保护性抗原及其编码基因在制备禽腺病毒病疫苗中的应用；所述疫苗优选为基因工程亚单位疫苗。

所述疫苗的制备方法可采用本领域常规的基因工程亚单位疫苗制备方法。

优选地，制备方法包括：

用Bam HI和Hind III双酶切含有目的基因的pMD19-T载体，获得目的片段，胶回收纯化目的片段。同时双酶切pFastBac 1载体并胶回收。用T4 DNA连接酶将目的基因片段和pFastBac 1载体过夜连接。然后转化到DH5α感受态细胞中，挑菌培养后送测序。测序正确后，提取含有目的基因的pFastBac 1载体。

将含有目的基因的pFastBac 1载体转化到DH10Bac中，将转化产物在37℃ SOC培养基中培养5h后，稀释接种蓝白斑筛选平板，在条件37℃培养48h后，挑选白斑。接种白斑到含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的液体培养基中过夜培养。收集菌液，提取重组穿梭质粒bacmid DNA，采用pUC/M13正向和反向引物(M13F:GTTTTCCCAGTCACGAC，M13R：CAGGAAACAGCTATGAC)对重组bacmid进行测序鉴定。测序结果比对完全正确。

取无血清悬浮培养的sf9细胞，细胞密度为2.5×10⁶cells/ml，在125ml摇瓶中悬浮转染，培养体积25ml，用Opti-MEM分别稀释12.5μg重组Bacmid和30ul的昆虫细胞系细胞转染试剂，混匀后加入sf9细胞悬液中，27℃，120rpm摇床中培养。转染后72-96h当细胞活率降至60-80％时收获培养上清，即为P0代杆状病毒。

用Sf9无血清悬浮培养基将Sf9细胞培养至5×10⁶cells/ml，用新鲜无血清培养基将细胞密度稀释至2.5×10⁶cells/ml，按1‰-1％的比例接种杆状病毒，培养至168-192h收获培养上清。进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白分子量大小，电子显微镜观察是否形成病毒样颗粒，检测蛋白琼扩效价。后经工艺纯化处理，添加相应佐剂，可用于制备4型禽腺病毒病亚单位灭活疫苗，用于预防4型禽腺病毒病。

应理解的是，利用本发明所述编码基因制备的禽腺病毒病疫苗，或含有本发明所述保护性抗原的禽腺病毒病疫苗均属于本发明的保护范围。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 4型禽腺病毒基因工程疫苗的制备

1、目的基因的筛选与克隆

查找禽腺病毒五邻体及六邻体蛋白编码基因序列及蛋白序列，并对现有病毒提取RNA进行测序比对。根据前期研究结果，筛选出抗原性较强的区域进行拼接，并在其五邻体和六邻体蛋白中间加入连接子(Linker)，以保证其空间构象和病毒样颗粒(VLPs)的形成。

检查优化所得序列中的限制性内切酶酶切位点，保证其不含Bam H I和Hind III酶切位点，将所拼接序列送至生物公司进行合成。

用Primer5.0软件设计了一对扩增禽腺病毒基因片段拼接引物，并在上游引物5’端和下游引物的5’端加入保护性碱基和酶切位点。引物序列为：

FAdV-BamH I-F：CGCGGATCCATGATGGGAAGCTACTTTGA

FAdV-Hind III-R：CCCAAGCTTTCAGCAGAATAACGATGATA

使用pfu酶对所合成序列进行PCR扩增，体系为50μL：10×PCR Buffer 5μL，dNTP(各10mM)1μL，上、下游引物(10nM)各1μL，合成DNA1μL，pfu酶1μL，ddH₂O40μL。

PCR反应参数：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃120s，30个循环；72℃7min。

产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在1400bp左右的位置有一条单一明亮的条带。使用DNA产物回收试剂盒将产物进行回收和测序，比对结果发现与预期完全一致。

2、FAdV-4重组蛋白的构建与表达

分别将回收的目的序列和pFastBac 1载体进行双酶切，并回收片段。估算目的片段与pFastBac 1载体的浓度，将其按照1：4的比例进行混合，加入T4 Buffer和T4连接酶，16℃酶连过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒验证完全正确后，提取含有目的基因的pFastBac 1载体转化到DH10Bac中，通过蓝白斑筛选法筛选出阳性克隆。

取无血清悬浮培养的Sf9细胞，细胞密度为2.5×10⁶cells/ml，在125ml摇瓶中悬浮转染，培养体积25ml，用Opti-MEM分别稀释12.5μg重组Bacmid和30ul的ExpiFectamineSf转染试剂，混匀后加入Sf9细胞悬液中，27℃，120rpm摇床中培养。转染后72-96h当细胞活率降至60-80％时收获培养上清，即为P0代杆状病毒。

用Sf9无血清悬浮培养基将sf9细胞培养至5×10⁶cells/ml，用新鲜无血清培养基将细胞密度稀释至2.5×10⁶cells/ml，按1‰的比例接种杆状病毒，培养至168h收获培养上清。进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白分子量大小，电子显微镜观察是否形成病毒样颗粒，检测蛋白琼扩效价。

3、基因工程疫苗乳化、配制

收获琼扩效价不低于1:32的培养上清，加入终浓度为3mM的乙烯亚胺30℃灭活28h，取96份上清，加入4份吐温-80，搅拌溶解，作为水相，取白油94份，Span-80 6份，混合均匀，作为油相，取油相2份，徐徐加入1份水相，3000rpm乳化30分钟，制备血清4型禽腺病毒基因工程疫苗(亚单位疫苗)，4℃保存。

实施例2 4型禽腺病毒基因工程疫苗的表达特性及免疫原性

1、表达特性

用Sf9无血清悬浮培养基将Sf9细胞培养至5×10⁶cells/ml，用新鲜无血清培养基将细胞密度稀释至2.5×10⁶cells/ml，按1‰比例接种重组杆状病毒，培养至96h收获上清。感染后96h的细胞相比健康细胞有明显膨大的现象。用噬斑法测定病毒滴度，重组杆状病毒P1代病毒效价10^8.25TCID₅₀/ml。

用Sf9无血清悬浮培养基将sf9细胞培养至5×10⁶cells/ml，用新鲜无血清培养基将细胞密度稀释至2.5×10⁶cells/ml，按1％-1‰的比例接种重组杆状病毒，培养至168-192h收获培养上清。进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白分子量大小约为54KD(图2)，电子显微镜观察确认形成病毒样颗粒(图3)，检测抗原琼扩效价为1：32(图4)。

2、免疫原性

利用实施例1制备的亚单位疫苗免疫14日龄SPF鸡，免疫28日后经血清抗体检测能产生符合规程标准的血清抗体，且能够抵抗禽法氏囊病毒强毒攻击。

攻毒方法：选取状态良好的SPF鸡，对照组和免疫后28日组各10只，分别颈部皮下注射FAdV-I群4型HB1510株病毒液(Lintao Li,Genome sequence of a fowl adenovirusserotype 4strain lethal to chickens,isolated from China[J].Genome Annouce,2016,4(2)e00140-16.doi:10.1128/genomeA.00140-16)0.5ml(含10⁶TCID₅₀)，逐日观察并记录发病和死亡情况，观察至72h-120h，扑杀存活鸡，所有鸡均解剖，观察试验用鸡心脏、肝脏的病变情况。试验结果显示，对照组试验用鸡3天全部死亡，解剖有明显的血清4型禽腺病毒病症状，免疫鸡全部正常(图5)，相对保护率为100％，无特异性病变，试验结果如表1所示。

表1免疫后28天抗体效价及攻毒结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 乾元浩生物股份有限公司

<120> 4型禽腺病毒基因工程疫苗及其制备方法与应用

<130> KHP191116883.8

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ser Tyr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Phe Arg Gln Thr Val Val

1 5 10 15

Ala Pro Thr Arg Asn Val Thr Thr Glu Lys Ala Gln Arg Leu Gln Ile

20 25 30

Arg Phe Tyr Pro Ile Gln Thr Asp Asp Thr Ser Thr Gly Tyr Arg Val

35 40 45

Arg Tyr Asn Ile Asn Val Gly Asp Gly Trp Val Leu Asp Met Gly Ser

50 55 60

Thr Tyr Phe Asp Ile Lys Gly Ile Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys

65 70 75 80

Pro Tyr Cys Gly Thr Ala Tyr Asn Pro Leu Ala Pro Lys Glu Ser Met

85 90 95

Phe Asn Asn Trp Ser Glu Thr Ala Pro Gly Gln Asn Val Ser Ala Ser

100 105 110

Gly Gln Leu Ser Asn Val Tyr Thr Asn Thr Ser Thr Thr Lys Asp Thr

115 120 125

Thr Ala Ala Gln Val Thr Lys Ile Ser Gly Val Phe Pro Asn Pro Asn

130 135 140

Gln Gly Pro Gly Ile Asn Pro Leu Arg Gln Val Glu Asn Ala Asn Thr

145 150 155 160

Gly Val Leu Gly Arg Phe Ala Lys Ser Gln Tyr Asn Tyr Ala Tyr Gly

165 170 175

Ala Tyr Val Lys Pro Val Ala Ala Asp Gly Ser Gln Ser Leu Thr Gln

180 185 190

Thr Pro Tyr Trp Ile Met Asn Asn Ala Gly Thr Glu Tyr Glu Phe Asn

195 200 205

Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Ser Ala Gly Ser

210 215 220

Tyr Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr

225 230 235 240

Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser

245 250 255

Gly Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser

260 265 270

Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr

275 280 285

Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr

290 295 300

Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn Thr Ser Ala Asn Gln

305 310 315 320

Thr Thr Leu Leu Thr Val Pro Asp Met Ala Gly Gly Ile Gly Ala Met

325 330 335

Tyr Thr Ser Leu Pro Asp Thr Phe Ile Ala Pro Thr Gly Phe Lys Glu

340 345 350

Asp Asn Thr Thr Asn Leu Cys Pro Val Val Gly Met Asn Leu Phe Pro

355 360 365

Thr Tyr Asn Lys Ile Tyr Tyr Gln Ala Ala Ser Thr Tyr Val Gln Arg

370 375 380

Leu Glu Asn Ser Cys Gln Ser Ala Thr Ala Ala Phe Asn Arg Phe Pro

385 390 395 400

Glu Asn Glu Ile Leu Lys Gln Ala Pro Pro Met Asn Val Ser Ser Val

405 410 415

Cys Asp Asn Gln Pro Ala Val Val Gln Gln Gly Val Leu Pro Val Lys

420 425 430

Ser Ser Leu Pro Gly Leu Gln Arg Val Leu Ile Thr Asp Asp Gln Arg

435 440 445

Arg Pro Ile Pro Tyr Val Tyr Lys Ser Ile Ala Thr Val Gln Pro Thr

450 455 460

Val Leu Ser Ser Ala Thr Leu Gln Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile

465 470 475 480

Ile Val Ile Leu Leu Ser

485

<210> 2

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggaagct actttgactt gaaaaacaag ttcagacaga cggtcgtggc gcccacccga 60

aatgtcacga cagaaaaggc tcaacggctg caaatccgct tttaccccat ccaaaccgac 120

gacacgtcga cgggctaccg cgtgcggtac aacatcaatg tgggcgacgg ttgggtcctg 180

gacatggggt cgacctattt cgacatcaag ggaatcctag accgagggcc gtccttcaag 240

ccctactgcg gcacggctta caacccgctg gctcccaagg agtccatgtt taacaactgg 300

tcggagacgg cacccgggca gaacgtgtcc gcctccggtc agctgtccaa tgtctatacc 360

aacacgagca ccaccaaaga cacgacggcg gcgcaggtga cgaagatttc cggcgtcttt 420

cccaacccca accagggacc cggaataaat cctctgcggc aggtagaaaa cgccaacacc 480

ggcgtgctcg gtcgcttcgc caagtctcag tacaattacg cttacggtgc ctacgtcaag 540

cccgtcgccg ccgacggttc ccagtccctc acgcagaccc cctactggat catgaataac 600

gcgggcaccg aatacgaatt caacacattt tactgctgtg aactttgttg taatcctgcc 660

agtgctggaa gttataacac acaaatatat acgataaatg acaagatact atcatatacg 720

gaatcgatgg caggcaaaag agaaatggtt atcattacat ttaagagcgg cgaaacattt 780

caggtcgaag tcccgggcag tcaacatata gactcccaga aaaaagccat tgaaaggatg 840

aaggacacat taagaatcac atatctgacc gagaccaaaa ttgataaatt atgtgtatgg 900

aataataaaa cccccaattc aattgcggca atcagtatga aaaacactag tgccaatcag 960

acgaccttgc tgacggtgcc cgatatggcg ggcgggatcg gggcgatgta cacgtccctg 1020

cccgatacct ttatcgcgcc taccgggttc aaggaagata acacgaccaa cctttgcccg 1080

gtcgtcggca tgaacctgtt ccccacctac aataaaattt attaccaggc ggcgtccacg 1140

tacgtgcaac gcctggaaaa ttcctgccag tcggccacag ccgccttcaa ccgctttccc 1200

gaaaacgaga ttctgaagca agcgcccccc atgaatgttt cgtccgtgtg cgataaccaa 1260

cccgccgtcg ttcagcaggg tgtgttgcct gtgaagagct cgctccccgg actgcagcgc 1320

gtgctgatca cagacgacca gcgtcgtccg ataccctacg tgtataagtc tatcgcgacg 1380

gttcagccga ccgttctgag ttccgcgacc ttgcagatca ccaccattat tatcgttatc 1440

atcgttattc tgctgagcta a 1461

Claims

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽包含如下的氨基酸序列或由其组成：

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

2.编码权利要求1所述多肽的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

5.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。

6.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包含权利要求5所述的组合物。

7.4型禽腺病毒基因工程疫苗，其特征在于，其包含权利要求6所述的免疫原性组合物，任选包含佐剂；

8.4型禽腺病毒基因工程疫苗的制备方法，其特征在于，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备包含权利要求2或3所述核酸分子的重组杆状病毒，将收获的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养转染的细胞，待细胞病变，收集细胞培养上清，上清进行灭活和纯化后，与佐剂混合。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)取无血清悬浮培养的Sf9细胞，细胞密度为2.0×10⁶～3.0×10⁶cells/ml，用重组穿梭质粒bacmid转染，转染后72-96h当细胞活率降至60-80％时收获培养上清，即为P0代重组杆状病毒；用Sf9无血清悬浮培养基将Sf9细胞培养至4.0×10⁶～8.0×10⁶cells/ml，用新鲜无血清培养基将细胞密度稀释至2.0×10⁶～3.0×10⁶cells/ml，按1‰-1％比例接种重组杆状病毒，培养至168-192h收获上清，经检测，其效价不低于1：32；

(3)将上清进行灭活和纯化后，取上清94～96份，加入吐温-80 4～6份，搅拌溶解，作为水相，另取白油94～96份，Span-80 4～6份混匀，作为油相，取油相2份，加入水相1份，乳化20～40min，即得；其中，所述份为重量份。

10.权利要求1所述多肽，或权利要求5或6所述组合物，或权利要求7所述基因工程疫苗，或者按照权利要求8或9所述方法制备的基因工程疫苗在制备用于治疗或预防4型禽腺病毒感染的药物中的应用。