JPS594664B2 - イオン交換クロマトグラフイ− - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明はイオン交換クロマトグラフィーに係り、特に分
離カラムに複数の溶離液を段階的に切換えて供給し試料
成分を分離するイオン交換クロマトグラフィーに関する
。

〔発明の背景〕

従来、生体液試料をイオン交換クロマトグラフ５ 装置
で分析する場合は２本の分離カラムを使用し、中酸性成
分と塩基性成分を別々に分離して全成分を約８時間で分
離していた。

このような例には特開昭５１−４２５８５がある。しか
し、この方法は、試料を２分して導入しなければならな
いので１０貴重な試料を浪費することが多く装置は複雑
になつていた。最近、１本のカラムで全生体アミノ酸を
５時間余りで分離した報告がなされた。この方法は、５
種類の溶離液を順次切換える多段階溶離法を採用して生
体液中のアミノ酸４７成分を約１５５．５時間で分析し
ている。そのクロマトグラムによると中酸性アミノ酸約
３０成分を１６０分、塩基性アミノ酸１７成分を１７０
分を要して分離分析している。したがつて、１成分当り
に要する時間は塩基性アミノ酸の方が遥かに多く、それ
だけ２０全分析時間が長くなるという欠点をもつている
。〔発明の目的〕本発明の目的は、塩基性成分の溶離時
間が短縮されるにもかかわらず、成分分離が良好である
イオン交換クロマトグラフィーを提供することにあ２５
る。

〔発明の要点〕

本発明は、溶離の途中で溶離液のｐＨを一たん下げると
ともにカウンターイオン濃度を高め、その後ｐＨおよび
カウンターイオン濃度を上昇して、３０塩基性成分のピ
ークの分離向上と迅速化をはかつたものである。

〔発明の実施例〕

第１図は組成の異なる５種の溶離液を用いて生体アミノ
酸を分析するアミノ酸分析計の説明図で３５ある。

組成の異なる溶離液１〜５は切換バルブＴを介して送液
ポンプ８に選択的に送られ、試料導入器９を経て分離カ
ラム１０に供給される。第１段の溶離液１が流れている
ときに試料導入を行うのであるが、試料管に一定量採取
された生体液は試料導入器９の例えば切換バルブを回転
することによつて第１段の溶離液の流れに乗せて分離カ
ラム１０に送られる。分離カラム１０には架橋度８〜１
２７０程度で均一な粒径の強酸性陽イオン交換樹脂が充
てんされており、試料中の生体アミノ酸各成分は、充て
ん剤との親和性の差によつて分離され順次分離カラム１
０より流出し、ミキサー１４に入る。分離カラム１０の
外側には所定温度の水が循環恒温槽１１より供給される
が、この温度も何段かに変化させる。

カラム温度の調節は上記方法に依らずドライオーブン方
式で行なつてもよい。組成の異なる溶離液を段階的に切
換えて用いるのは、試料中の各種アミノ酸相互の分離と
溶離速度を高めるためである。生体アミノ酸全成分を溶
離流出させるには第５段の溶離液を用いなくとも可能で
あるが、ただしこの場合はそれに要する分析時間が長く
なる。ミキサー１４にはニンヒドリン試薬槽１２よりの
ニンヒドリン試薬液が送液ポンプ１３で常時送られてい
る。このミキサー１４で混合された混合液は一定時間一
定温度で加熱されながら反応槽１５を通過する。この間
に発色したアミノ酸は流動セルを備えた光度計１６で吸
光度測定され、その吸光度の変化は記録計にクロマトグ
ラム１７として記録される〇最終段の溶離液まで順次使
用して試料中のアミノ酸成分が完全に溶出した後は、再
生液６を流して分離カラム１０内の残留成分を流出させ
、再び第１段溶離液を流してカラム充てん剤を平衡状態
に戻してから再び試料液を導入して次回の分析を行なう
。

以上はアミノ酸検出法としてニンヒドリン発色法を用い
たものであるが、螢光検出法を用いて試料成分の螢光を
測定してそのクロマトグラムを得ることもできる。第２
図は前記した従来法を参考にして発明者らが検討した分
析法による生体液のクロマトグラムの一例である。

このクロマトグラムでは、ホスホセリン１８からアルギ
ニン６１まで４４成分を約５時間で分離可能である。こ
の分析に用いたイオン交換樹脂は三菱化成ＫＫ製強酸性
陽イオン交換樹脂ＣＫ−１２、粒径５〜６μｍで分離カ
ラムの内径は２．６Ｗ！１１長さは２４８詣である。溶
離液の組成および条件を第１表に示した。また、第２表
は溶離液および分離カラム温度の切換時刻を示したもの
である。Ｍはモル濃度を示す。第２図のクロマトグラム
においては、中酸性アミノ酸であるホスホセリン１８か
らβ−アミノ−１一酪酸４６までの２９成分を分析する
時間は１辱０分であり、ホモシスチン４７以下の塩基性
アミノ酸１５成分を分析する時間も約１５０分を要して
いる。

前者は１成分当り平均約５分であるが、後者では約１０
分を要しているので塩基性アミノ酸の分析効率が悪い。
第１表に見られるように通常の分析では溶離液のＰＨは
段が進むごとに上昇させる。

このように陽イオン交換クロマトグラフイ一においてＰ
Ｈ値を段階的に増加させた溶離液を用いているのは次の
理由による。これをグリシン３１を例にして説明する。
第３図はグリシンの解離度を示す線図である。

縦軸は解離度αを、横軸はＰＨ値を示している。アミノ
酸は両性電解質であるので、その１つであるグリシン（
αＹｃｉｎｅ）はＰＨ２では５０７０以上が陽イオン、
ＰＨ６では電荷は０，．ｐＨ９，５以上では５０％以上
が陰イオンとして存在する。したがつて、溶離液のＰＨ
値を適当に選択すれば、各アミノ酸の解離度の差によつ
て成分分離させることができる。第４図は溶離液を段階
的に切換えたときの分離カラム内の成分バンドの変化を
説明する図である。

実線は第１段溶離液（ＰＨ−３）におけるグリシンの成
分バンドを示すものとする。この成分バンドはガウス分
布曲線状をしているが、ここでＰＨ値の高い例えばＰＨ
６の第２段溶離液に切換えたとすると、バンドの移動方
向（矢印）の後方から溶離液が置き代わるので、グリシ
ンは鉗↓からＡピとなりイオン交換性がなくなり、破線
で示したように成分バンドの後側の移動速度が大となつ
て成分ピークが鋭くなる。第４図Ａはそれを示すもので
、この現象を一般にセルフシヤープニング効果と呼んで
いる。これとは反対に、第４図Ｂに示すごとくＰＨ３の
第１段溶離液からＰＨ２の第２段溶離液に切換えると、
成分バンドの後側部分はＭむφ生成率が増すためにイオ
ン交換樹脂に対してより強い親和力を示すので後側は遅
れて成分バンドは引伸ばされることになる。

したがつて、成分バンドは巾広くなりそのヒータは低く
なる。以上の理由によつて陽イオン交換クロマトグラフ
イ一の段階溶離法のときは、溶離液のＰＨ値を順次上昇
させるのが分離能を上げ分析時間を短縮する上に有効な
方法であるとされている。前記第１表では上記原理に基
づいて溶離液のＰＨ値を段階的に上昇させているので塩
基性アミノ酸は非常に良く分離していることが第２図よ
り知れる。

しかし、アルギニン６１を分析するまでに長時間を要す
るのが欠点である。そこで、本実施例では第３段溶離液
中のカウンターイオン濃度を上げて分析時間の短縮を計
つた。溶離液中のカウンターイオン濃度とイオン交換樹
脂相のアミノ酸分配係数Ｋｄとの間には次の関係がある
。

ＡＨ２− 但し、ＫＭはイオン交換平衡定数、〔ＭＬ〔Ｍ〕はイオ
ン交換樹脂相および溶離液相のカウンターイオン濃度を
示している。

（１）式より、アミノ酸の分配係数は溶離液中のカウン
ターイオン濃度が高くなる程小となる。したがつて、ア
ミノ酸の溶出が速くなる。この原理に従つて、発明者は
第１表に示した第３段溶離液中のカウンターイオン濃度
を０．３５Ｍ，０．５５Ｍおよび０．８０Ｍと増加させ
て実験したところ、β−アミノ−１一酪酸４６とホモシ
スチン４７、エタノールアミン５０からヒドロキシリジ
ン５２，５３までおよびヒスチジン５５からカルノシン
６０までの分離が悪くなつた。

しかし、これら成分の溶出が促進され分析時間は短縮さ
れた。このように（１）式に示したごとく溶離液中のカ
ウンターイオン濃度が増すとセルフシヤープニング効果
を生ずることがわかつた。したがつて、溶離液のＰＨ値
とカウンターイオン濃度を適正に組合わせることによつ
て、その一方を変化させることによる成分ピークのブロ
ー×化を防ぐことが可能である。具体的な例として、カ
ウンターイオン濃度を０．３５Ｍから０．８０Ｍに変化
させた上記実験の場合、０．３５ＭのときＰＨ３．６と
の組合わせに対してカウンターイオ７濃度を０．８０Ｍ
としたときはＰＨ値を３．６よりも更に低い値にしても
成分バンドのシヤープさは変化しないということも判明
した。このことはアミノ酸の相互分離に好都合な因子が
増したことを意味する。実施例 １ 第５図は第３段溶離液のカウンターイオ７濃度を０．８
０ＭとしそのＰＨ値を変化させたときの各種アミノ酸の
保持時間の変化を示す線図である。

縦軸はＰＨ値であり、横軸は保持時間を分ω［相］で示
している。第１段溶離液のカウンターイオン濃度は０．
１５Ｍ，．ｐＨ値は２．９５であり、第２段溶離液のカ
ウンターイオン濃度は０．２５Ｍ，ｐＨ値は３．７０で
ある。第５図において、ＰＨ４，３と３．８とでは若干
の変化はあるが、β−アミノｉ一酪酸４６とホモシスチ
ン４７、トリプトフアン４９からカルノシン６０までの
分離が困難である。更にＰＨを３．３まで下げると全体
の溶出時間は遅れるが、フエニールアラニン４４からカ
ルノシン６０までのアミノ酸をほぼ完全に分離させるこ
とができた。なお、このときカルノシン６０の保持時間
は１７０分余であつた。第２図の分析条件である第１表
の第３段溶離液のカウンターイオン濃度０．３５Ｍ，ｐ
Ｈ４．３の場合のカルノシン６０の保持時間は２８０分
を要したものであるが、上記第５図の実験では大巾に改
善されていることになる。しかも第２段溶離液よりも第
３段溶離液のＰＨ値を低下させたことによる成分バンド
のプロード化は全く認められず、対称形のシヤープな成
分ピークが得られた。即ち、カウンターイオン濃度調節
による効果が顕著に現われている。第６図は第５図の実
験結果のクロマトグラムの一部を比較し成分ピークの分
離状態を示す線図である。

第６図Ｃは第３段溶離液のカウンターイオン濃度が０．
８０Ｍ，ｐＨ４．３のクロマトグラムであり、第６図Ｂ
は第３段溶離液のカウンターイオン濃度が０．８０Ｍ，
ｐＨ３．８のクロマトグラムであり、第６図Ａは同じく
第３段溶離液のカウンターイオン濃度０．８０Ｍ，ｐＨ
３．３のクロマトグラ婦ムである。トリプトフアン４９
、ヒスチジン５５、１−メチルヒスチジン５６、リジン
５７、３−メチルヒスチジン５８の５成分は、第６図Ａ
では完全に分離しているが、第６図Ｂ，Ｃでは分離され
ていない。また、成分ピークのシヤープさは第６図Ｃが
最も良く、次に第６図Ａが同程度か僅かに劣り、第６図
Ｂは最も劣つていることが記録されたクロマトグラムに
より判断された。実施例 ２ 第１図は本発明の実施例の一つである生体アミノ酸分析
例を示すクロマトグラムである。

横軸は保持時間を示している。また、その溶離条件は第
３表および第４表にまとめて記入してある。ＹＢはジビ
ニルベンゼンの略号である。第５表には理解を助けるた
めに符号と成分名との関係を示した。第７図のクロマト
グラムにおいて、エタノアミン５０の直後からベースラ
インが浮上つるのは、第１、第２段溶離液に含まれ分離
カラムで濃縮されたアンモニウムイオンが第３段溶離液
のとき溶出されるからである。

この問題は、アンモニアカツトフイルタ一を設けること
によつて解消できる。本クロマトグラムのグリシン３１
は約１０ｍｇの微量であるが、流動セルの長さを長くし
たり電気的検知信号をより増巾することによつてなお数
十倍感度を上げることができる。１成分当りの平均溶出
時間は、中酸性アミノ酸が約４分塩基性アミノ酸では４
．５分であり、第２図の場合に比べて大巾に改善された
。

第１段溶離液へのエタノールの添加は、スレオニン２３
とセリン２４の分離改善のためであり、第２段、第３段
溶離液への添加は吸着性の強いアミノ酸を選択的に移動
させるために用いたものである。

なお、第２段、第３段溶離液に０．１ｖ０１％程度のベ
ンジルアルコールを添加するとトリプトフアン４９のみ
の溶出を促進させることができる，上記実施例において
は第３段の溶離液を特定段の溶離液とし、第２段の溶離
液よりも低いＰＨ値として塩基性成分の溶離を促進して
いる。また、第３段の溶離液のＰＨ値を第２段の溶離液
のＰＨ値よりも低くしたことに起因するピークテーリン
グ現象の出現を第３段の溶離液中のカウンターイオン濃
度を調節して抑制しているものである。以上の条件を満
すものであれば、段階的に流通させる複数段の溶離液の
組成は第２表の数値に限定されるものでなくＰＨ値およ
びカウンターイオン濃度の範囲を第６表に示すごとく拡
張させることが可能である。本実施例は以上のごとく生
体アミノ酸の分離を良くすると共に溶出時間を大巾に短
縮できるという効果がある。

実施例 ３ 第８図は第７図の実施例と同一クロマト条件で人間の尿
を分析したクロマトグラムである。

このクロマトグラムより明らかなように尿試料には、ニ
ンヒドリン試薬で発色する未知の成分が多数認められる
。なお、これに用いた尿試料は、採取後若干のトルエン
を添加し、苛性ソーダを加えてＰＨを約１２とした後、
真空脱気を６時間行なつてアンモニアをストリツピング
し、更に、塩酸で約ＰＨ２とし濃縮することなくそのま
ま２０μｌを導入分析したものである。本実施例は本発
明のイオン交換クロマトグラフイ一の応用面の広いこと
を示すものである。

上記実施例は生体液を分析した例であるが、蛋白質構成
アミノ酸や有機酸等のイオン交換クロマトグラフイ一に
応用することができる。〔発明の効果〕 以上本発明の効果は、溶離液のＰＨ値を前段溶離液より
も低下させることによる成分ピークのプロード化をカウ
ンターイオン濃度を調節することによつて低減できるの
で、好適な溶離条件を選択する自由度が増加し、試料成
分の分離度を増すと共に迅速な多成分アミノ酸試料の分
析が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は組成の異なる５種の溶離液を用いて生体アミノ
酸を分析するアミノ酸分析計の説明図、第２図は従来法
を参考にして検討した分析法による生体試料のクロマト
グラムの一例、第３図はグリシンの解離度を示す線図、
第４図は溶離液を段階的に切換えたときの分離カラム内
の成分バンドの変化を説明する図、第５図は本発明の一
実施例である第３段溶離液のカウンターイオン濃度を０
．８０ＭとしそのＰＨ値を変化させたときの各種アミノ
酸の保持時間の変化を示す線図、第６図は第５図の実験
結果のクロマトグラムの一部を比較し成分ピークの分離
状況を示す線図、第７図は本発明の実施例の一つである
生体アミノ酸分析例を示すクロマトグラム、第８図は第
７図の実施例と同一クロマト条件で人間の尿を分析した
実施例でのクロマトグラムである。 １〜５・・・・・・溶離液、６・・・・・・再生液、１
０・・・・・・分離カラム、１７・・・・・・クロマト
グラム。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ １回の溶離操作の間にｐＨ値およびカウンターイオ
   ン濃度の異なる複数の溶離液を段階的に切換えて分離カ
   ラムに供給し、試料成分を溶離するイオン交換クロマト
   グラフィーにおいて、特定段の溶離液としては、この特
   定段より１つ前段の溶離液のｐＨ値よりもｐＨ値が低く
   、かつ上記特定段の溶離液のｐＨ値を低くしたことに起
   因する分離成分ピークのテーリングを低減する濃度まで
   カウンターイオン濃度を高めた溶離液を用いること、上
   記特定段のあとに上記分離カラムに供給する溶離液は、
   上記１つ前段の溶離液のｐＨ値よりも高いｐＨ値を有し
   上記１つ前段および上記特定段の溶離液よりも高いカウ
   ンターイオン濃度を有すること、を含むことを特徴とす
   るイオン交換クロマトグラフィー。