JP3508710B2 - アミノ酸分析方法および装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臨床分野に好適な
アミノ酸分析方法および装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】アミノ酸分析計は大別して、蛋白加水分
解物アミノ酸約２０成分を対象とした標準分析法と、生
体液アミノ酸類縁物質約４０成分を対象とした生体液分
析法を行うものに分類できる。ここでは生体液分析法、
すなわち、血清や尿，髄液などの生体液を分析し、これ
を臨床的に利用して、病気の診断や、治療に役立てるこ
とができる分析法について述べる。

【０００３】生体液分析法を示した例としては、特開昭
５３−６０２９１号公報，特開昭５９−１０８４９号公
報,特開平４−１９４７５０号公報,特開平９−８００３
７号公報等がある。また、報告文として、Journal of C
hromatograhy，224 ; 315-321(1981)「Resolution of 5
2 ninhydrin-positive compounds with a High-speed a
mino acid analyzer」Clinical Chemistry 43 ; 8，142
1−1428(1997)「Amino Acid determination inbiologic
al fluids by automated ion-exchange chromatograph
y:performance of Hitachi L-8500A」がある。

【０００４】これら、従来の生体液分析法は、複数の緩
衝液を混合し、混合した緩衝液に試料を添加し、分離カ
ラムを通過させて検出するという一連の分析手法は変わ
るところはないが、分離カラムや緩衝液の流速などを工
夫することにより、時代と共に分析時間が早くなり、通
常は１１０分，高速の場合でも９０−６０分で分析でき
るようになった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】生体液分析法では、現
在上記に示したように約４０成分（厳密には、表１に示
した＊印の付されていない４１成分）の分析を一斉に行
うことができる。ところが最近、これまで分析対象とな
っていなかったような成分が特定の病気を知るために有
効であることが発見され、上記４１成分に加え、それら
の成分を合わせて分析したいという要求が高まりつつあ
る。具体的には、表１の＊印の付された１２成分が従来
にない新たな分析対象成分である。当然、これら新たな
１２成分は、既存の４１成分と同時に分析でき、且つそ
れぞれのピークが分離できることが望ましい。即ち、５
３成分のアミノ酸を一斉同時分析しようという要求が生
じつつある。

【０００６】

【０００７】ところがこれらの追加成分のほとんどは、
特定の時間帯に集中して溶出されるので、従来からある
４１成分用の分析法では、既存の何れかの成分の溶出時
間と重複してしまい、ほとんど分離ができない状態にあ
った。

【０００８】本発明の目的は、新たに着目されるように
なった１２成分を含む全５３成分のアミノ酸を一斉に分
析でき、且つ出来るだけ効率良く短い時間で分析を行う
ことが出来るアミノ酸分析方法および装置を提供するこ
とである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らが、分離実験
を重ねたところ、これら追加成分を含めた５３成分を一
斉に分析可能な分析法を見出した。

【００１０】本発明の特徴は、緩衝液のリチウムイオン
濃度を、少なくともβ−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢ
Ａ）が溶出される時間まで０.３mol／Ｌ以下とすること
である。

【００１１】また、好ましくは、β−アミノイソ酪酸
（β−ＡｉＢＡ）が溶出される時間まで、前記緩衝液の
ｐＨを３.５以下とすることである。

【００１２】更に好ましくは、γ−アミノ−ｎ−酪酸
（γ−ＡＢＡ）からハイドロオキシリジン（Ｈｙｌｙ
ｓ）までの溶出時間で、リチウムイオン濃度とｐＨをグ
ラジェントに上昇させることである。

【００１３】更に好ましくは、ハイドロオキシリジン
(Ｈｙｌｙｓ)からヒスチジン(Ｈｉｓ)までの溶出時間
で、０.８１mol／Ｌに保持することである。

【００１４】上記に示すように、本発明においては、緩
衝液の切替え時間，混合比，グラジェント勾配などの分
離改善要因を組み合わせることで、部分的なアミノ酸の
分離バランスをよくすることが出来、総合的に５３成分
のアミノ酸を分離することができた。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、従来実施例と比較しながら
本発明の実施例の詳細を述べる。

【００１６】図２は本発明のアミノ酸分析計の装置構成
及び流路説明図である。１〜４はそれぞれ第１〜第４緩
衝液、５はカラム再生液である。この中から電磁弁シリ
ーズ６によって何れかの緩衝液が選ばれ、緩衝液ポンプ
７によってアンモニアフィルタカラム８，オートサンプ
ラ９を経由して分離カラム１０に送られる。オートサン
プラ９によって導入されたアミノ酸試料は分離カラム１
０で分離される。ここで分離した各アミノ酸は、ニンヒ
ドリンポンプ１２によって送られてきたニンヒドリン試
薬１１とミキサ１３で混合し、加熱された反応コイル１
４で反応する。反応によって発色したアミノ酸は検出器
１５で連続的に検知され、データ処理装置１６によって
クロマトグラム及びデータとして出力され、記録，保存
される。

【００１７】上記第１緩衝液１〜第４緩衝液４およびカ
ラム再生液５としては、市販のＬ−８５００−ＰＦ−Ｋ
ＩＴ（三菱化学（株）製）を用いた（表２）。ニンヒド
リン試薬１１は市販のニンヒドリン試液Ｌ−８５００セ
ット(和光純薬工業（株）製)を用いた。分離カラム１０
にはパックドカラム４.６mmＩＤｘ６０mm、充填剤とし
ては、イオン交換樹脂２６２２ＳＣ（日立製作所製）を
用いた。

【００１８】次に本発明の分析プログラムを図３に示
す。また、図３の緩衝液のグラジェント混合プログラム
を図表化したものを図５（Ａ）に示す。

【００１９】ここで図３の分析プログラムについて説明
する。「％Ｂ１−％Ｂ５」欄は、それぞれ第１緩衝液１
〜カラム再生液５に相当する。時間０で、％Ｂ１−％Ｂ
５の欄に１００.０ とあるのは相当する電磁弁が１００
％開くという意味である。８０と２０は、相当する二つ
の電磁弁が時間比で８０％と２０％に開く、すなわち８
０％と２０％に液が混合するという意味である。さらに
時間と共に混合比を変えると、グラジェント混合が可能
となる。図１の構成であれば、最大５液までグラジェン
トができる。

【００２０】「温度」は、分離カラムの温度プログラム
を示す。３８とあるのは次の指定時間まで３８℃一定を
保つという意味である。

【００２１】「流量１」は、緩衝液ポンプの流量、「流
量２」はニンヒドリンポンプの流量である。

【００２２】「％Ｒ１−％Ｒ３」欄は、ニンヒドリン試
薬の混合比である。通常ニンヒドリン試薬は２液に分か
れて市販されており、使用時にＲ１とＲ２は５０％ずつ
混合するようになっている。Ｒ３は蒸留水が設置してあ
り、分析終了時の洗浄などに使用する。

【００２３】ここで、図４に従来行われていた分析プロ
グラムを示す。また、図４の緩衝液のグラジェント混合
プログラムを図表化したものを図５（Ｂ）に示す。

【００２４】図５から分かるように、従来は基本的に緩
衝液は段階的に切替えが行われていた。これに対して、
本発明においては、全体の分析時間は長くなるものの、
グラジェントを多用し、ゆっくりとした緩衝液の切替え
を行うようにしている。

【００２５】図１（Ａ）に、図３の分析プログラムを使
用して得られた、本発明の結果である分析クロマトグラ
ムを示す。また比較のため、図１（Ｂ）に従来の図４の
分析プログラムによるクラマトグラムを示す。どちらの
クロマトグラムも表１に示すアミノ酸試料５３成分を測
定したものである。尚、図１（Ａ）には各ピークに成分
の略語が記載してあるが、表１にはアミノ酸の和文名，
英文名のほかに、クロマトグラムで使用している略語を
記載してあるので参照願いたい。また、図１（Ｃ）は、
図１（Ａ）のクロマトグラムと図１（Ｂ）のクロマトグ
ラムのそれぞれ同じ成分のピークを線で結び表したもの
である。

【００２６】図１から分かるように、図１（Ｂ）ではＶ
ａｌ〜γ−ＡＢＡの成分の間に多くの成分が集中して、
良く分離出来ていない。図１（Ｂ）のＶａｌ〜γ−ＡＢ
Ａ間に相当する部分の拡大を図６に示す。Ｓａｃｃｈａ
とＣｙｓや、ＴｙｒとＣｙｓ−Ｈｃｙｓなどピークが重
なっている成分が多く見られる。これに対して、図１
（Ａ）では各成分が良く分離されていることが分かる。

【００２７】次に、図１（Ａ）に示すように、５３成分
の一斉分析を可能にした本発明の分析プログラムの作成
過程について述べる。

【００２８】まず各成分のピーク分離をよくするための
要因であるが、分離カラムを固定し、緩衝液の処方を表
２に固定した場合、次の要因が考えられる。

【００２９】１.Ｌｉイオン濃度の強さによるピーク位
置の移動 ２.ｐＨの強さによるピーク位置の移動 ３.カラム温度によるピーク位置の移動 ４.上記１.２.３.の組み合わせ このほかに、緩衝液ポンプの流速が考えられるがここで
は述べない。なお、例えば通常緩衝液ポンプの流速を２
倍にすると、ほぼ比例的に分析時間が１／２に変わるこ
とは、よく知られていることである。この場合、全体的
に各ピーク間の分離が悪くなることも同時に知られてい
ることである。

【００３０】以上の要因に基づいて、分離改善する具体
的手段としては、次の項目が考えられる。

【００３１】ａ：緩衝液の一定の混合比またはグラジェ
ント混合比を変える。

【００３２】ｂ：緩衝液の一定の混合比またはグラジェ
ント混合比の切替え開始時間を変える。

【００３３】ｃ：緩衝液の一定の混合比またはグラジェ
ント混合比の切替え終了時間を変える。

【００３４】ｄ：緩衝液の一定の混合比またはグラジェ
ント混合比を３液以上にする。

【００３５】ｅ：カラム温度を変える。

【００３６】ｆ：カラム温度を切替える開始時間を変え
る ｇ：カラム温度を切替える終了時間を変える ｈ：上記ａ〜ｇの組み合わせ。

【００３７】以上の手段を用いた具体的分離改善の実施
例を図９〜図１７を用いて説明する。

【００３８】尚、分析プログラムの時間（緩衝液切替え
時間，カラム温度切替え時間等）は、図２の電磁弁シリ
ーズ６における時間を基準としているため、クロマトグ
ラムに示された各成分が溶出した時間（保持時間）とは
異なるものであるから、その点留意願いたい。分析プロ
グラムの時間と保持時間は、緩衝液が電磁弁シリーズ６
から検出器１５に至るまでに相当する程度のタイムラグ
を有しており、具体的には、約５〜１０分位のずれがあ
る。

【００３９】図９は、分析プログラムの８７分〜１０９
分の間で、緩衝液Ｂ３＝１００％の場合（Ｂ）と、三つ
の緩衝液をグラジェントにした場合（Ａ）の分離の状態
を示したものである。図９から緩衝液Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４
を３液グラジェントにした方が、γ−ＡＢＡ〜Ｌｙｓ間
の分離バランスが良くなることが分かる。特にＡＳＡ−
Ａｎｈｙ１とＥＯＨＮＨ2 の分離が良くなる。これは、
リチウムイオン濃度とｐＨがＢ３のレベル(Ｌｉ濃度：
０.７２１mol／Ｌ，ｐＨ：３.６）で一定であるより
も、グラジェントに上昇させた方（Ｌｉ濃度：０.４４
１mol／Ｌ→１.００mol／Ｌ，ｐＨ：３.６６→４.１）
が良いことを示す。

【００４０】図１０は、上記図９の場合から観点を変え
て、９２分〜１１７分でＢ２〜Ｂ４の３液グラジェント
にした場合（Ａ）と、Ｂ３とＢ４の２液グラジェントに
した場合（Ｂ）の状態を示す。図１０から、２液グラジ
ェント（Ｂ）よりも３液グラジェント（Ａ）の方がＡＳ
Ａ−Ａｎｈｙ１とＥＯＨＮＨ2 の分離が良くなることが
分かる。同時にＴｒｐとＮＨ3の分離も良くなる。これ
は、リチウムイオン濃度とｐＨの観点で見ると、（Ｂ）
Ｌｉ濃度：０.７２１mol／Ｌ→１.００mol／Ｌ，ｐＨ：
３.６→４.１よりも、（Ａ）Ｌｉ濃度：０.４４１mol／
Ｌ→１.００mol／Ｌ，ｐＨ：３.６６→４.１のグラジェ
ントの方が好ましいといえる。

【００４１】したがって、上記図９の検討も合わせて考
慮すると、γ−ＡＢＡ〜Ｌｙｓあたりにおいては、Ｂ２
〜Ｂ４の３液グラジェントにする方法が最も良い分離バ
ランスを得られることが分かる。本発明の分析プログラ
ムでは、この結果を基に、９２分〜１１７分までをＢ２
〜Ｂ４の３液グラジェントとするようにしている。

【００４２】図１１は、４５分から始まるＢ３のグラジ
ェント勾配による分離改善の様子を示したものである。
グラジェント勾配を２５％（Ａ）から１０％（Ｃ）まで
低くすると、Ｐｈｅ〜β−ＡｉＢＡ間の分離のバランス
が良くなることが分かる。ここで、リチウムイオン濃度
の変化を観ると、(Ｃ）が０.１２３→０.２７７mol／
Ｌ、（Ｂ）が０.１２３→０.２８０mol／Ｌ、（Ａ）が
０.１２３→０.３１６mol／Ｌである。結果は、（Ｂ）
の状態では各ピークが何とか分離しているが、(Ａ)の状
態ではまだ分離しきれていない。このことから、リチウ
ムイオン濃度が０.３０mol／Ｌ 以上であるとＰｈｅ〜
β−ＡｉＢＡ間の分離バランスが悪く不適切といえる。
従って、本発明の分析プログラムにおいては、（Ａ）の
状態を目標にし、Ｂ３については、４５分から８４分に
かけて、１０％のグラジェント勾配を有するように設定
している。また、９２分まで、８４分時点の組成を変化
させない様にしている。

【００４３】図１２は、緩衝液Ｂ４のグラジェント開始
時間を８６分〜９０分で変化させた場合の様子を示す。
図１２に示されるように、緩衝液Ｂ４のグラジェント開
始時間を遅くすると、γ−ＡＢＡとＨｃｙｓが分離し、
同時にＥＯＨＮＨ2 とＴｒｐの分離が改善されることが
分かる。従って、本発明の分析プログラムでは、９２分
からＢ４を切替えるようにしている。

【００４４】図１３は、１１７〜１３０分におけるＢ２
とＢ４の混合比について検討したものである。図から分
かるように、Ｂ４の比率を８０％から７５％に低くする
と、ＡｎｓとＣａｒの分離が改善されることが分かる。
リチウムイオン濃度とｐＨで観ると、Ｂ４比率８０％で
は、Ｌｉ濃度：０.８５１mol／Ｌ，ｐＨ：４.０２ であ
り、Ｂ４比率７５％では、Ｌｉ濃度：０.８１４mol／
Ｌ、ｐＨ：４.００ である。よって、本発明の分析プロ
グラムでは、１１７〜１３０分のＢ２とＢ４の混合比を
１：３（Ｂ４比率７５％）とするようにしている。

【００４５】図１４は、Ｂ４を１００％の状態に切替え
る開始時刻を１２８分から１３５分に遅らせた場合につ
いて検討したものである。切替える時刻を遅くすると、
AnsとＣａｒの分離がよくなるが、Ａｒｇの溶出時間が
遅くなることを示している。したがって、本発明の分析
プログラムでは、バランスを考慮して、Ｂ４を１００％
の状態に切替える開始時刻を１３０分からとしている。

【００４６】上記は緩衝液の組成について検討したもの
であるが、カラム温度についての検討も行ったので図１
５〜図１７に示す。尚、カラム温度の変化をグラフ化し
たものを図１８に示す。図１８において、実線（Ａ）
は、図３で示した本発明の分析プログラム、破線（Ｂ）
は参考として示した図４の従来の分析プログラムであ
る。

【００４７】図１５は、カラム温度によるＭｅｔ〜Ｃｙ
ｓｔｈｉ間の分離改善を試みたものである。カラム温度
を７０℃にする時間範囲を、分析プログラムにおいて４
５分〜５０分の場合と、４５分〜５５分の場合で実験を
行った。この結果、４５分〜５５分にすると、バランス
の良い分離改善ができることが分かった。従って、本発
明の分析プログラムでは、カラム温度を４５分〜５５分
で７０℃とするようにしている。

【００４８】図１６は、カラム温度切替え開始時間の変
更によるＰｈｅ〜β−ＡｉＢＡ間の分離改善を試みたも
のである。カラム温度を７０℃にする切替え開始時間を
８０分から７０分に早めていくと、分離が改善されるこ
とが分かる。従って、本発明の分析プログラムにおいて
は、カラム温度７０℃の切替え開始時間を７３分で行う
ことを採用している。

【００４９】図１７は、８５分〜１１０分間で、カラム
温度を７０℃〜６０℃の範囲で変化させた場合の様子を
示す。カラム温度が下がると、ＥＯＨＮＨ2 とＴｒｐの
分離が改善されることが分かる。従って、本発明の分析
プログラムでは、８５分〜１１０分の時間帯において
は、６３℃を採用している。

【００５０】以上、図９−図１７に示した部分分離改善
を組合わせることにより、図３及び図５（Ａ）に示す本
発明の分析プログラムが求められ、図１（Ａ）の分離結
果が実現する。

【００５１】上記本発明の分析プログラムにおいては、
複数の緩衝液を混合し、且つカラム温度を調整している
が、５３成分のピークを上手く分離できた要因として
は、前述したように、「Ｌｉイオン濃度の強さ」「ｐＨ
の強さ」「カラム温度」が大きな要因である。そこで、
図７，図８に分析プログラムに沿ったＬｉイオン濃度と
ｐＨの変化の様子を示す。

【００５２】図７は、本発明と従来の分析プログラムに
おけるＬｉイオン濃度の変化をグラフ化したものであ
る。実線（Ａ）は図３に示す本発明の分析プログラム、
破線（Ｂ）は図４の従来の分析プログラムに対応する。
このグラフから分かるように、（Ａ）に示す本発明のプ
ログラムは、（Ｂ）の従来のプログラムに比べて、Ｌｉ
イオン濃度の上昇が非常にゆっくりであり、且つ徐々に
上昇するようになっている。

【００５３】また図８は、図７と同様に（Ａ）が本発明
の図３の分析プログラム、（Ｂ）が図４の従来の分析プ
ログラムに対応するものであり、ｐＨについての変化を
測定しグラフ化したものである。本発明の分析プログラ
ムにおいては、ｐＨもその上昇を大幅に抑えるようにし
ている。

【００５４】ここで、本発明の分析プログラムについ
て、図９−図１７に示した部分分離改善を基に、そのポ
イントを纏めると以下の様になる。１．γ−ＡＢＡ〜Ｌ
ｙｓ間の分離バランスを改善するためには、Ｌｉ濃度を
0.44mol／Ｌから１.００mol／Ｌに、ｐＨを３.６６から
４.１ にグラジェントに上昇させる。本発明ではこれを
３液グラジェントで実施する。また、この３液グラジェ
ントを行う時間は、分析プログラムと保持時間のずれを
考慮し、β−ＡｉＢＡからＨｙｌｙｓが溶出される時間
（保持時間）で行うようにする。本発明の分析プログラ
ムでは、８７分〜１０９分の間となる。２．Ｐｈｅ〜β
−ＡｉＢＡ間の分離バランスを改善するためには、Ｌｉ
濃度が０.３０mol／Ｌ以下となるようにグラジェントさ
せる。具体的には、分析プログラムと保持時間のずれを
考慮し、ｖａｌからβ−ＡｉＢＡが溶出される時間（保
持時間）で緩衝液Ｂ３のグラジェントの勾配を１０％に
保ち、β−ＡｉＢＡ溶出時でＬｉ濃度が０.３０mol／Ｌ
以下となるようにする。本発明の分析プログラムでは、
４５分〜９２分間の動作となる。３．γ−ＡＢＡとＨｃ
ｙｓ間の分離バランスを改善するためには、緩衝液Ｂ４
のグラジェント開始時間を（分析プログラムと保持時間
のずれを考慮し、）β−ＡｉＢＡが溶出される時間（保
持時間）からとする。本発明の分析プログラムでは、９
２分からとなる。４．ＡｎｓとＡｒｇ間の分離バランス
を改善するためには、Ｌｉ濃度を０.８１mol／Ｌ、ｐＨ
を４.００とする。本発明ではこれをＢ２とＢ４の混合
（Ｂ４比率７５％）で実施する。また、このＬｉ濃度・
ｐＨにする時間は、分析プログラムと保持時間のずれを
考慮し、ＨｙｌｙｓからＨｉｓが溶出される時間(保持
時間)で行うようにする。本発明の分析プログラムで
は、１１７分〜１３０分の間となる。

【００５５】また、Ｈｉｓ溶出後（分析プログラム１３
０分以降）は、緩衝液Ｂ４を１００％にし、Ｌｉ濃度を
１.００mol／Ｌ、ｐＨを４.１とする。５．Ｍｅｔ〜Ｃ
ｙｓｔｈｉ間の分離バランスを改善するために、分析プ
ログラムと保持時間のずれを考慮し、ｖａｌからＨｃｉ
ｔの溶出時間（分析プログラムで４５分〜５５分）中、
カラム温度を７０℃に保つようにする。６．Ｐｈｅ〜β
−ＡｉＢＡ間の分離バランスを改善するために、分析プ
ログラムと保持時間のずれを考慮し、Ｔｙｒの溶出時間
（分析プログラムで７３分）から、カラム温度を７０℃
に切替える。７．ＥＯＨＮＨ2とＴｒｐの分離バランス
を改善するために、分析プログラムと保持時間のずれを
考慮し、Ｃｙｓ−ＨＣｙｓからＴｒｐの溶出時間（分析
プログラムで８５分〜１１０分）中、カラム温度を６３
℃に保つようにする。

【００５６】上記に示すように、５３成分全体の分離が
可能となった要因としては数々のポイントが上げられる
が、代表的なものとして、Ｌｉイオン濃度、ｐＨについ
て、少なくともβ−ＡｉＢＡの溶出時間まで低いレベル
に抑えたことが挙げられる。これにより、最もピークが
密集した部分の分離バランスが大きく改善している。

【００５７】本発明の分析プログラムを採用したことに
よる効果を纏めると以下の様になる。 １）緩衝液切替え時間の適正化によって、５３成分を同
時に分析した場合でも各成分のピークがバランス良く分
離でき、且つ、分析時間も１４８分に抑えることができ
た。 ２）緩衝液の処方に手を加えることなく、従来と同じ緩
衝液をそのまま活用することができた。 ３）分析装置のハードウエアや、分離カラムを変更する
ことなく、分析プログラムのみの改善によって、５３成
分の分離が実現した。

【００５８】

【発明の効果】本発明により、臨床分野において重要な
５３成分の一斉同時分析が行える。これにより、臨床分
野に好適なアミノ酸分析計を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）は本発明の分析プログラムによる５３成
分のアミノ酸を分離したクロマトグラム、（Ｂ）は従来
の分析プログラムによるクロマトグラムである。

【図２】使用する装置の流路説明図である。

【図３】本発明の分析プログラムである。

【図４】従来の分析プログラムである。

【図５】（Ａ）が図３の分析プログラムを図表化したも
の、（Ｂ）が図４の分析プログラムを図表化したもので
ある。

【図６】図５（Ｂ）のクロマトグラムの部分拡大図であ
る。

【図７】本発明の分析プログラムのＬｉイオン濃度グラ
フである。

【図８】本発明の分析プログラムのｐＨグラフである。

【図９】（Ａ）は８７分〜１０９分において三つの緩衝
液をグラジェントにした場合の分離の状態、（Ｂ）は緩
衝液Ｂ３＝１００％の場合の分離の状態を示す図であ
る。

【図１０】（Ａ）は９２分〜１１７分でＢ２〜Ｂ４の３
液グラジェントにした場合、(Ｂ)はＢ３とＢ４の２液グ
ラジェントにした場合の状態を示す図である。

【図１１】Ｂ３のグラジェント勾配による分離改善の様
子を示したものである。

【図１２】緩衝液Ｂ４のグラジェント開始時間を８６分
〜９０分で変化させた場合の様子を示した図である。

【図１３】Ｂ３とＢ４の混合比を変更した場合の図であ
る。

【図１４】Ｂ４を１００％の状態に切替える開始時刻を
１２８分から１３５分に遅らせた場合について検討した
図である。

【図１５】カラム温度変化によるＭｅｔ〜Ｃｙｓｔｈｉ
間の分離改善を示す図である。

【図１６】カラム温度切替え開始時間を変化させた場合
のＰｈｅ〜β−ＡｉＢＡ間の分離改善を示す図である。

【図１７】８５分〜１１０分でカラム温度を７０℃から
６０℃に下げた場合の様子を示す図である。

【図１８】本発明と従来の分析プログラムにおけるカラ
ム温度変化を示すグラフである。

【符号の説明】

１〜４…緩衝液、５…再生液、６…電磁弁シリーズ、７
…緩衝液ポンプ、８…フィルタ、９…オートサンプラ、
１０…分離カラム、１４…反応装置、１５…検出器、１
０１〜１５３…アミノ酸成分リスト。

フロントページの続き (56)参考文献 特開2002−243715（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−80037（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−133946（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−194750（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−10849（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−60291（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−223625（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−223824（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−28659（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−94815（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 30/00 - 30/96

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一つまたは複数種が混合された緩衝液に試
   料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液アミノ酸
   類縁物質を検出対象とした生体液分析を行うアミノ酸分
   析方法において、 前記試料が導入される緩衝液のリチウムイオン濃度を、
   少なくともβ−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出
   される時間まで０.３mol／Ｌ以下とすることを特徴とす
   るアミノ酸分析方法。
2. 【請求項２】請求項１のアミノ酸分析方法において、 前記β−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出される
   時間まで、前記緩衝液のｐＨを３.５ 以下とすることを
   特徴とするアミノ酸分析方法。
3. 【請求項３】請求項１のアミノ酸分析方法において、 γ−アミノ−ｎ−酪酸（γ−ＡＢＡ）からハイドロオキ
   シリジン(Ｈｙｌｙｓ)までの溶出時間で、前記緩衝液の
   リチウムイオン濃度とｐＨをグラジェントに上昇させる
   ことを特徴とするアミノ酸分析方法。
4. 【請求項４】請求項３のアミノ酸分析方法において、 前記リチウムイオン濃度は、０.４４mol／Ｌから１.０
   ０mol／Ｌにかけて、前記ｐＨは、３.６６から４.１に
   かけて上昇させることを特徴とするアミノ酸分析方法。
5. 【請求項５】請求項１のアミノ酸分析方法において、 ハイドロオキシリジン（Ｈｙｌｙｓ）からヒスチジン
   （Ｈｉｓ）までの溶出時間で、前記緩衝液のリチウムイ
   オン濃度を０.８１mol／Ｌ、ｐＨを４.００ とすること
   を特徴とするアミノ酸分析方法。
6. 【請求項６】請求項５のアミノ酸分析方法において、 ヒスチジン（Ｈｉｓ）溶出後は、前記緩衝液のリチウム
   イオン濃度を１.００mol／Ｌ、ｐＨを４.１とすること
   を特徴とするアミノ酸分析方法。
7. 【請求項７】請求項１のアミノ酸分析方法において、 バリン（ｖａｌ）からホモシトルリン（ＨＣｉｔ）の溶
   出時間で、カラム温度を７０℃とすることを特徴とする
   アミノ酸分析方法。
8. 【請求項８】請求項１のアミノ酸分析方法において、 チロシン（Ｔｙｒ）の溶出時間から、カラム温度を７０
   ℃とすることを特徴とするアミノ酸分析方法。
9. 【請求項９】請求項１のアミノ酸分析方法において、 システイン−ホモシステイン ミクスド ジスルフィド
   （Ｃｙｓ−ＨＣｙｓ）からトリプトファン（Ｔｒｐ）の
   溶出時間で、カラム温度を６３℃とすることを特徴とす
   るアミノ酸分析方法。
10. 【請求項１０】一つまたは複数種が混合された緩衝液を
    用いて、ホスホセリン（Ｐ−Ｓｅｒ），タウリン（Ｔａ
    ｕ），ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ），ウレア(Ｕ
    ｒｅａ)，アスパラギン酸（Ａｓｐ），ハイドロオキシ
    プロリン（Ｈｙｐｒｏ），メチオニンスルホキシド（Ｍ
    ｅｔＳＯＸ），スレオニン（Ｔｈｒ），セリン（Ｓｅ
    ｒ），アスパラギン（ＡｓｐＮＨ2），グルタミン酸
    （Ｇｌｕ），グルタミン（ＧｌｕＮＨ2），サルコシン
    (Ｓａｒ），α−アミノ アデピン酸(α−ＡＡＡ)，プ
    ロリン（Ｐｒｏ），グリシン（Ｇｌｙ），アラニン（Ａ
    ｌａ），シトルリン（Ｃｉｔ），α−アミノ−ｎ−酪酸
    （α−ＡＢＡ），バリン（Ｖａｌ），ピペコリン酸（Ｐ
    ｉｐｅｃｏ），ホモシステイン（ＨＣｙｓＨ），メチオ
    ニン(Ｍｅｔ)，ホモシトルリン（ＨＣｉｔ），アローイ
    ソロイシン（Ａｌｌｏ−Ｉｌｅ），シスチン（Ｃｙ
    ｓ），サッカロピン（Ｓａｃｃｈａ），イソロイシン
    （Ｉｌｅ），ロイシン（Ｌｅｕ），チロシン（Ｔｙ
    ｒ），シスタチオニン（Ｃｙｓｔｈｉ），フェニルアラ
    ニン（Ｐｈｅ），アルギニノコハク酸（ＡＳＡ），シス
    テイン−ホモシステイン ミクスド ジスルフィド（Ｃ
    ｙｓ−Ｈｃｙｓ），β−アラニン（β−Ａｌａ），アミ
    ノ レブリン酸（ＡＬｅｖＡ），β−アミノイソ酪酸
    （β−ＡｉＢＡ），γ−アミノ−ｎ−酪酸（γ−ＡＢ
    Ａ），ホモシスチン(ＨＣｙｓ)，アルギニノコハク酸
    アンヒドライド １（ＡＳＡ−Ａｎｈｙ１），エタノー
    ルアミン（ＥＯＨＮＨ2），トリプトファン(Ｔｒｐ），
    アンモニア(ＮＨ3），ハイドロオキシリジン（Ｈｙｌｙ
    ｓ），アミノエチルシステイン（ＡＥＣ），オルニチン
    （Ｏｒｎ），リジン（Ｌｙｓ），１−メチル ヒスチジ
    ン(１Ｍｅｈｉｓ)，ヒスチジン（Ｈｉｓ），３−メチル
    ヒスチジン（３Ｍｅｈｉｓ），アンセリン（Ａｎ
    ｓ），カルノシン（Ｃａｒ），アルギニン（Ａｒｇ）の
    各成分を分析対象成分として分析を行うアミノ酸分析方
    法であって、 前記緩衝液のリチウムイオン濃度を、少なくとも前記β
    −アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出される時間ま
    で０.３mol／Ｌ以下とし、ハイドロオキシリジン（Ｈｙ
    ｌｙｓ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）までの溶出時間で、
    ０.８１mol／Ｌに保持することを特徴とするアミノ酸分
    析方法。
11. 【請求項１１】複数の緩衝液を各緩衝液毎に設けられた
    バルブを調整することで混合し、当該混合された緩衝液
    に試料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液アミ
    ノ酸類縁物質を検出対象とした生体液分析を行うアミノ
    酸分析装置において、 前記混合後の緩衝液のリチウムイオン濃度が、少なくと
    も前記β−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出され
    る時間まで０.３mol／Ｌ以下であり、ハイドロオキシリ
    ジン(Ｈｙｌｙｓ）からヒスチジン(Ｈｉｓ)までの溶出
    時間で、０.８１mol／Ｌに保持されるように、前記バル
    ブを制御して緩衝液の流量調整を行うことを特徴とする
    アミノ酸分析装置。