JPS59231055A - ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化され、酵素加水分解に対する高い抵抗性及び長いイン
ビボ活性持続性を有する特異的レニン阻害剤であるウマ
アンジオテンシノーゲンの（５−１４）デカペプチドの
類似体に係わる。

レニンは、後述するレニンーアンジオテンシン系の酵素
成分の１つであり、その生成物は心臓血管のホメオスタ
シスの維持において重要な役割を果し、各種の高血圧状
態における動脈血圧の上昇に関与する（　Ｓ、　０ｐａ
ｒｉｌ及びＥ、　）−１ａｌ）ｃｒ　　ｌニューイング
ランド・ジャーナル・オブ・メディカル（Ｎｃｗ　ｌ；
ｒ＋ｇｌａｎｄ　Ｊ、　１Ｖ１ｃｄ、　）　Ｊ　２９１
　、３８９　（１９７４）　；Ｗ、Ｓ　、　Ｐｃ；ｒｒ
　１　Ｆニューイングランド・ジャーナル・オプ・メデ
ィカル」２９２　、３０２　（１９７５）　；　ＥｏＨ
ａｂｅｒ　　［Ｃｌ１ｎ、　Ｓｃｉ、　Ｍｏ１．Ｍｃｄ
。Ｊ４８，４９Ｓ（１９７５）　；　Ｊ。Ｏ，Ｄａｖｉ
ｓ　ＵＣｌｉｎ。Ｓｃｉ　、Ｍｏｌ。Ｍｃｄ。」４８、
３０（１９７５）　）。

＜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ベ人 ぺ １へ へ レニンは腎臓近〜球体細胞により生成、放出されるが、
レニン基質（アンジオテンシノーゲン）と反応してアン
ジオテンシン（Ｉ）（不活性なデカペプチド）を生成す
る。このアンジオテンシン（１）自体は主に肺において
アンジオテンシン転化酵素（ＡＣＥ）によりアンジオテ
ンシン（Ｉｔ）に転化される。

アンジオテンシン（ＩＩ）は現在公知の昇圧作用の最も
強力な内因性基質であり、ダイレフトンイードバックシ
ステムによりレニン放出の調節に関与する。

レニン−アンジオテンシン系は副腎皮質カラノアルドス
テロンの分泌の調節に係わる主要なメカニズムの１つを
構成する。

レニン−アンジオテンシン系の阻害剤である化合物は、
現在、高血圧症の治療に使用されている。

しかしながら、これらの化合物は、補償性過レニン症（
ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ　ｈｙｐｅｒｒｅｎｉｎｅｍ
ｉａ　）の如き副作用を生ずる欠点を有している。

さらに、最近の研究によれば、レニンは血管の平滑筋組
織に存在し、ここで合成され、血圧の維持に少なからぬ
役割を果すことが示されている。

したがって、高血圧症の治療に関して、特殊なレニン阻
害剤の分野で検索を行なうことは適切なものと考えられ
る。

このような阻害剤は以下の３つのクラスに属する。

１）ペプスタテイン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　）及び類似
体２）脂質及びリン脂質 ３）レニン基質類似体 しかしながら、ペブスタテイン及び類似体は動物性高血
圧症モデルにおいてのみ血圧低下作用があり（■、。０
゜１　μＭ）、正常血圧のラットでは無効である。しか
も阻害特異性にも乏しく、レニンだけでなくペプシン、
イソレニン及びカテブシンＤの如き他の酸グロテアーゼ
にも作用する。脂質及びリン脂質の抗高血圧症活性につ
いては、インビトロにおいて繰返し試験が行なわれてい
るが、レニン−アンジオテンシン系の生理学的調節剤と
して重要性をもつものであるため、凝間視されている（
　Ｍ、Ｊ、　Ａｎｔｏｎａｃｃｉｏ及びＤ　、Ｗ　、　
Ｃｕ　ｓ　ｈｍ　ａ　ｎ　「Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　　
Ｐｒｏｃ、Ｊ　　４０，２２７５　（１９８１））。

多くの興味は、レニンにより加水分解されるＬｅｕ”　
−Ｌｅｕｌｌ　及びＬｅｕ　ｉｏ、　−Ｖａ　Ｉ　”結
合を含むレニン基質フラグメントの構造類似体形の第３
クラスの化合物（合成ペプチド阻害剤）に集中している
。

かかる化合物は非常に強力な阻害剤であり（■５０５゜
９μＭないし１０μＭ）、高度の特異性をもつ（Ｊｌｌ
Ｂｕｒｔｏｎら「ＰｒｏｃＩｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ　、
　Ｕ　＠Ｓ　、　Ａ　ｊ７７　、５４７６　（１９８０
）　：　Ｍ、　Ｓ＋ｚｃｌｋｅらヨーロッパ特許願０−
０４５−６６５　（１９８２）　；　Ｍ、　５ｚｅｌｋ
ｃら［ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　Ｊ　２９９　、５
５５　（１９８２）　）。

これらの化合物の中でも、ヒトアジオテンシノｉゲンＮ
−末端セクエンスのオクタペプチドＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｂｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ−１１ｅ　−Ｈｉｓ及
びデカペプチドＰｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｂｅ−Ｉ−
Ｉｉｓ−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ　−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ
　（加水分解可能なＬｅｕ　−Ｖａｌ結合を、レニンに
」；る加水分解を阻止するために、−ＣＨ２−ＮＨ−に
還元１している）、及びウマアンジオテンシノーゲンの
Ｎ−末端セクエンスのデカペプチドＰｒｏ　−Ｈｌｓ　
−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ　
−Ｔｙｒ　−Ｌｙｓが合成されている。

しかしながら、後者のデカペプチド（インビトロにおい
てヒトレニンの特異的阻害剤であり、インビボでの抗高
血圧症剤として有効である）は作用期間が極めて短かく
（約４分）、それ故、臨床上の適用が制限されている（
米国特許第４，２６９，８２７号）。

発明者らは、レニンに対して特異性を有し、しかも酵素
加水分解に対する高度の抵抗性及び長い活性持続性を治
するペプチド阻害剤を見出し、本発明に至った。

持続形の作用をもつレニン阻害剤を使用する場合には、
以下の効果が得られる。

（１）　現在のレニン−アンジオテンシン系の阻害剤を
使用する間に一般的に生ずる補償性過レニン症の発生を
防止できる。

（２）　　慢性のレニン依存性高血圧症についての研究
において長期間のインビボ実験が可能となる。

該デカペプチドが限られたインビボ安定性しか持ち得な
い゛こと及び抗高血圧作用の持続性が極めて短時間であ
ることの主原因の１つは　レニン自体及び血漿の他のペ
プチダーゼの作用により容易に加水分解され、ることに
あると思イっれる。

そのため、グロテアーゼのタンパク質分解作用からペプ
チド物質を適切に保護するために、酵素加水分解に対し
て最も鋭敏なペプチド結合をｒｅｔｒ。

転化する方法を利用することが非常に有利であることを
見出した。

特開昭５８−１４６５３８号、特開昭５８−１１６４４
３号、ヨーロッパ特許公告第９７９９４号、イタリー国
特許願第２０９２６Ａ／８２、同第２３４１７Ａ／８２
に記載されている如く、ペプチド結合の方向を逆により
、元のペプチドの構造異性でありかつ生理活性をそのま
ま保持するが、一般に酵素加水分解に対してより強い抵
抗性を示す類似体（一般に「ｒｅｔｒｏ　−１ｎｖｅｒ
ｓｏペプチド」として知られている）が生成される。

本発明では、デカペプチドＰｒｏ　−）−ｉｉ　ｓ　−
Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−Ｈｌｓ−Ｐｈｅ−Ｐｂｅ−Ｖａｌ
　−Ｔｙｒ−Ｌｙｓのレニン加水分解作用部位に近接す
るＰｈｅ　−Ｖａｌ結合を逆転し、酵素阻害作用を保持
すると共に、正常なペプチド結合をもつ阻害剤よりも持
続性の長いインビボ活性をもつ類似体を得ている。

セクエンス中の唯一つのペプチド結合のみを転化（逆転
）させる方法は、逆転した結合を形成するように２つの
結合するアミノ酸残基を変換する工程、特に、元のペプ
チドのアミノ末端に最も近いアミノ酸残基なジェム−ジ
アミノ残基に変換する工程及びカルボニル末端に最も近
いアミノ酸残基ヲマロニル又は２−置換マロニル残基に
変換する工程を包含する［　Ｇｏｏｄｍａｎ　Ｍ、らｌ
　Ａｃｃ、　ＣＩ＋ｅｍ。

Ｒｅｓ、　Ｊ　１２　（１９７９）　）。

マロニル又は２−置換マロニル残基ヲペフチド骨格に組
入れることは、格別の問題点を生じない。

これに対して、ジェム−ジアミノ残基を組入れる際には
、一般にデリケートな合成手法が要求され、前記特許願
に開示されている如く、ｌ、１−ビス（トリフルオロア
セトキシ）ヨードベンゼン（ＴＩＢ）の使用により達成
される。この試薬は、以前は、中間体のインシアネート
を単離又は分離する必要なく第１級の簡単な構造をもつ
アミドをアミンに直換変化するために使用されていた。

（ＲａｄｈａｋｒｉｓｈｎａＡ、Ｓ。ら［ジャーナル・
オプ・オルガニック・ケミ　ス　ト　リ　−　（Ｊ、　
　Ｏｒｇ、　　Ｃｈｅｍ、　　）　　Ｊ　　　４　４　
　、　　１７４６（１９７９）　〕。

本発明によるｒｅｔｒｏ　−１ｎｖｅｒｓｏペプチドは
、構造式（１） ％式％ 式中、アミノ酸はいずれもＬ配置であり、ジェム−ジア
ミノ残基の不斉炭素はＬ−フェニルアラニンと同じ配置
をもち、マロニル残基の不斉炭素はＲ又はＳ配置又はこ
れら２つの配置の混合であってもよい。

本発明によるペプチドは、固相における合成により簡単
に生成される。まず、残基７及び８を２−　イ／　７’
ロピルーマロニル−Ｄ−フェニルアラニンアミドの中に
挿入し、ついで第１アミンを１゜１−ビス（トリフルオ
ロアセトキシ）ヨードベンゼンの作用によりアミドに変
化させる。

この合成は、通常行なわれる固相でのペプチド合成の手
法に従って実施される。当分野で公知のを連続して伺加
することによりセクエンスを形成すると共に、合成の終
了時までペプチドを結合した状態に維持し、最後に適当
な試薬による処理を介してペプチドを離脱するものであ
る。

本発明による合成で使用される重合体は、置換ベンジル
アルコール残基により適当に官能化されたポリアミド樹
脂ビーズでなる（　Ｒ，Ａｒ５ｈａｄｙら「ジャーナル
・オブ串ザ・ケミカル・ンサエテイ−（Ｊ、　Ｃｈｅｍ
、　Ｓｏｃ、）　Ｊ　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｉ　５２９（１９
８１）　）。

適当な条件下で別に活性化された第１のりシンアミノ酸
残基は対称無水物としてエステル結合によってこれら残
基に結合される。合成の間圧溶性樹脂にペプチドを結合
しておく置換ベンジルアルコール残基は、合成終了時、
トリフルオロ酢酸による処理を介してペプチドが樹脂か
ら離脱されうるように選ばれる。

本発明によるペプチド類似体のレニン阻害作用の測定試
験については、Ｍｉｌｌａｒ及び共同研究者らの方法を
利用する（　Ｊ、Ａ、　Ｍｉｌｌａｒら［クリニカキミ
力、アクタ（Ｃ１１ｎｉｃａ　Ｃ１１１ｍ、　Ａｃｔａ
　）　ｊ　　１０１　。

５　（１９８０）　）。この試験では、ヒト血漿レニン
によりｐＨｃｏにおいてヒトアンジオテンシノーゲンか
ら生成されるアンジオテンシン（１）の生成率を、抗体
結合体の放射線免疫検定法により測定する。阻害剤の存
在下におけるアンジオテンシン（Ｉ）の生成率を、一般
に、阻害剤不存在下で測定したもののパーセント割合と
して表示する。

阻害試験条件下において、逆転した結合をもたないペプ
チドに比べて、ペプチダーゼに対するｒｅｔｒｏ　−１
ｎｖｅｒｓｏペプチドの安定性が増加していることは、
ＥＤＴＡ、ｏ−フェナントロリン、ベンズアミジン塩酸
塩及びＴｒａｓｙｌｏｌ　　（登録商標）の如きペプチ
ダーゼ阻害剤の不存在下又は存在下においても、またヒ
ト血漿中での予培養を行なった場合又は行なわない場合
でも認められる。

本発明のｒｅｔｒｏ　−１ｎｖｅｒｓｏペプチドは、す
べてのペプチド結合が正常であるペプチドのものよりも
長い活性持続性をもつ強力な特異的レニン阻害剤である
。

実施例 Ｐｒｏ−Ｈｉ　５−Ｐｒｏ−Ｐｌｌｅ−Ｈｉ　５−Ｐｈ
ｅ−ＮＨ−ＣＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＯ−１”ｙｒ−
Ｌｙｓ１ Ｓｂｅｐｐａｒｄらの方法［Ｅ、　Ａｔｈｅｒｔｏｎら
１゛ジヤーナル・オプ・ザ・ケミカル・ソサエティー］
Ｐｅｒｋｉｎ　Ｉ　、　５３８　（１９８１）　）によ
り若干の変更を加えて、固相において合成を行なった。

Ｎ　、　Ｎ’−エチレン−ビス−アクリルアミドで架橋
したポリジメ、チルアミドーコーアクリロイルサルコシ
ンメチルエステルのビーズでなる重合体支持体１ｇを１
，２−ジアミノエタンによる処理を介して活性化した。

この活性化した樹脂を（ｐｍｏｃＮｌｅ）２０１゜８ミ
リモルと反応させ、ついで２０％ピペリジンのジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）溶液による処理を介してＦｍｏ
ｃを除去したのち、２゜４．５−トリクロロフェノール
−ｐ−ヒドロキシメチル安息香酸１．８ミリモルでアシ
ル化した。このように変性した樹脂はノルロイシン０．
５２５ミリモチルアミノピリジンＯ〕ミリモルの存在下
、ＤＭＦ１６ｍｅ中に溶解した（Ｆｍｏｃ　Ｌｙｓ）２
０１．８ミリモルで前記の変性樹脂を３０分間処理する
ことにより第１のアミノ酸によりエステル結合を形成し
た。

なお、自動［Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ合成機モデ／ｌ／９９
０Ｂの反応器において、この反応及びヘキサペプチドが
合成されるまでの一連の反応を行なった。

引き続いて、第１表に記載する順序でかつ第２表に示す
方法のいずれかに従って連続してアミノ酸を重合体に導
入した。

際に予じめ調製した。すなわち、保護されたアミノ酸３
．６ミリモルを、ＣＨ２Ｃｅ２中、室温で、１゜分間、
Ｎ、Ｎ’−、ジシクロへキシルカルボジイミド１．８ミ
リモルと反応させ、生成したジシクロヘキシル尿素を１
去し、ＣＨ２Ｃｅ２を減圧上蒸発させ、対称無水物をＤ
ＭＦ　１６　ｍｌに再び溶解させた。

各アシル化に関して、アミド結合の形成の終了を、Ｋａ
ｉｓｅｒ法（Ｅ、Ｋａｉｓｅｒ　［Ａｎａｌ。Ｂ　ｉ　
ｏ　ｃ　ｂ　ｅｍ　、　Ｊ３４　、５９５　（１９７０
）　］に従って、樹脂ザンプルをニンヒドリンと反応さ
せることにより確認した。

アミノ酸の分析については、閉止した試験管内において
、真空中、フェノールの存在下、沸点に維持して、Ｈ（
Ｊ？により１１０℃で１８時間加水分解したザンプルに
ついて実施した。

Ｄ−フェニルアラニンアミドが完全に相当するジェム−
ジアミノ残基に変化したことを、ＴＩＢによる処理後取
出した樹脂ザンプルについて行なったアミノ酸分析にお
けるフェニルアラニンの消失によって確認した。最終ア
ミノ酸の付加後、樹脂をエチルエーテルで洗浄し、乾燥
し、ついで９５チドリフルオロ酢酸中に３時間懸濁した
。樹脂をｒ取し、２Ｎ酢酸で洗浄し、ペプチド含有溶液
を凍結乾燥した。得られたペプチドをＡｃ０Ｈｒ８０％
）ｚ５ｍ１．中に溶解し、活性炭上に担持した１０係金
属パラジウム５００ｍ９及びギ酸アンモニウム５００ｍ
ｙをこの溶液に添加したＣ　Ｍ、に、　Ａｎｗｃｒ及び
Ａ、Ｆ。

５ｐａｔｏｌａ　［合成（５ｙｎｌｂｅｓｉｓ　）　Ｊ
　９２９　（１９８０）　）。

２時間後、Ｐａｕｌｙ反応ににり確認した如く、ヒスタ
ジン保護基ば完全に除去されていた。ついで混合物を遠
心分離し、溶液を水で希釈したのち数回凍結乾燥した。

粗製ペプチドを、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ−
５２）カラム上、濃度範囲０゜ｏｓＮないし０゜５Ｎの
直線勾配をもつ酢酸アンモニウムにより溶離して、ｐＨ
７，０においてクロマトグラフィー処理した。ペプチド
を含有するンラクションを凍結乾燥し、再び、５ｅｐｂ
ａｄｅｘ　５ＰＣ２５カラム上で、濃度範囲００２５Ｎ
ないしＩＮの直線勾配をもつ酢酸アンモニウムにより溶
離して、ｐＨ４，５でクロマトグラフィー処理した。ペ
プテドな含有するフラクションを集め、凍結乾燥した。

アミノ酸分析： Ｐｒｏ　　２．０７（２）：　　Ｈｉｓ　　２，１０（
２１；　　Ｐｂｅ　　２，１０（２１；Ｔｙｒ　　Ｏ，
９９（１）；　　Ｌｙｓ　　１．００（１）！ 得られたペプチド（〜ラミ形の２−イソプロピルマロニ
ル残基を鎖中に導入した結果、２種のジアステレオ異性
体の混合物でなる）は、分析用Ｈｉ　ｂａｒ　ＲＰ−１
８（５μＭ　）カラム上での高圧り０７トグラフ分析（
溶離剤はトリフルオロ酢酸（０゜１係）を含有するアセ
トニトリル／　）ｉ２０　（’　３８／６２　）齢物で
ある）において、２つのピークを示した。

また、このペプチドサンプルは、ミクロ結晶性セルロー
スの薄層上での高圧電気泳動（使用した緩衝剤：ギ酸−
酢酸、ｐＨｚ。１；酢酸ナトリウム−酢酸、ｐＨ３゜５
）において単一スポットを示したにンヒドリンテスト及
びＰａｕｌｙ試薬によるテスト　）　。

２種類のジアステレオ異性体の混合物を、Ｌｉｃｈ−ｒ
ｏｐｒｅｐ　（登録商標）　ＲＰ−１８（Ｍｅｒｃｋｌ
ｌＤａｒｍｓｔａｄｔ　）を充填したカラム（７゜ｓｘ
３ｏｍｍ）を使用し、最初の２０分間ばｌ・リフルオロ
酢酸（０゜１％）を含有するアセトニトリル／Ｈ２０（
２６／７４　）混合物で、つづいて８分間はトリフルオ
ロ酢酸（０゜１係）を含有するアセトニトリル７　ｌ−
Ｉ２０　（３９／６１　）混合で゛ 物〜溶離して、逆転相半調製高圧液クロマトグラフィー
によりラセミ分割した。個々のジアステレオ異性体の分
離を、各々約０．５μモルな含有する各サンプルについ
て行なった。２種の異性体に相当するフラクションを凍
結乾燥し、分析カラム上での高圧液クロマトグラフィー
試験により再度チェックした。

アミノ酸分析： 異性体Ａ　：　　Ｐｒｏ　　１．８３（２１：　　Ｈｉ
ｓ　　１，９９（２１：Ｐｈｅ　　１，９９（２１；　
　Ｔｙｒ　　Ｏ，９４（１，１：Ｌｙｓ　　ｔ、ｏｏ（
ｇ 異性体Ｂ　：　　Ｐｒｏ　　ｌ、８６（２１；　　Ｈｉ
ｓ　　１．９９（２１；、Ｐｂｅ　　２．０５（２）　
；　　　Ｔｙｒ　　Ｏ，９６（１）　；Ｌｙｓ　　１゜
ＯＯ（１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　式（Ｉ） で表わされ、特異性レニン阻害剤として使用されると共
   に、酵素加水分解に対する強い抵抗性及びインビボ阻害
   活性の長い持続性を有する、Ｐｈｅ　−Ｖａｌ結合部位
   で部分的にｒｅｔｒｏ転化されたペプチド。 ２　ジェム−ジアミノ残基 −Ｎｌ（−Ｃｌ−１−ＮＨ− ＣＨ２Ｐｌｌ がＳ配置であり、マロニル残基 −ＣＯ−ＣＭ　−ＣＯ− Ｈ がＲ及びＳ対掌体の混合である特許請求の範囲第１項記
   載のペプチド。 ３　ジェム−ジアミノ残基がＳ配置であり、マロニル残
   基がＳ配置である特許請求の範囲第１項記載のペプチド
   。 ４　ジェム−ジアミノ残基がＳ配置であり、マロニル残
   基がＩζ配置である特許請求の範囲第１項記載のペプチ
   ド。