JP3270127B2 - 新規なペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、例えば高血圧の予防
等を目的とする医薬品、健康食品等として有用なアンジ
オテンシン変換酵素の作用を阻害する新規なペプチドに
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】わが国における主要疾病別受診状況をみ
ると、年々高血圧によるものが増加している。これは日
本人の食事パターンが欧米型食事へと変化してきたこと
など、食物による影響が大きな原因になっていると考え
られる。また、高血圧は長期間続くと、心疾患や脳血管
疾患の発症率が高くなることが知られており、早期の改
善が必要である。

【０００３】現在、この高血圧症を改善するために種々
の方法が用いられているが、その中で食事との関連が深
いと言われるタンパク質加水分解酵素であるレニンと高
血圧の原因物質であるアンジオテンシンとの調整が最も
有効な方法の一つとされている。

【０００４】このレニン−アンジオテンシン系の調整に
はアンジオテンシン変換酵素（Angiotensin Converting
Enzyme、以下ＡＣＥと言う）が介在する。ＡＣＥはペ
プチドからジペプチドを遊離させるジペプチジルカルボ
キシラーゼであり、アンジオテンシンI から血圧を上昇
させる昇圧ペプチドであるアンジオテンシンIIの生成を
促進すると共に、血圧を低下させる降圧物質であるブラ
ジキニンの分解に関与している。従って、このＡＣＥの
作用を阻害する物質は血圧降下作用を有する。

【０００５】一方、最近大豆、米ぬか、魚肉など各種食
品中にＡＣＥ阻害ペプチドが存在することが報告されて
いる〔食品工業、Vol.33, No.2, 20〜30（1990）、Vol.
4 ,20〜25（1990）、Vol34,No.22, 18 〜26（1991)
〕。そして、現在までにこのような食品から多数のＡ
ＣＥ阻害ペプチドが単離されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、そのような食
品中からＡＣＥ阻害ペプチドを単離精製するには各種ク
ロマトグラフィー等を用いなければならず、操作が煩雑
で、いずれも極めて低収率である場合が多い。本発明者
らもすでにローヤルゼリー中にＡＣＥ阻害ペプチドが存
在することを見出し、これを酵素により加水分解する方
法によって取得したペプチドについて特許出願を行った
（特願平３−４２０２２号）。

【０００７】この発明は上記従来の技術に鑑みてなされ
たものであって、その目的は、ＡＣＥ阻害作用を有する
とともに、製造が容易で収率良く得られる新規なペプチ
ドを提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この発明はPhe−Val−Ty
r−Thr−Proなる構造からなるペプチド（以下、ＳＰ５
と称する）である。なお、Leu−Tyr−Leu−Proなる構造
を有するペプチドを以下ＳＰ４と称し、Trp−Lys−Tyr
なる構造を有するペプチドを以下ＳＰ３と称する。ま
た、Pheはフェニルアラニン、Valはバリン、Tyrはチロ
シン、Thrはトレオニン、Proはプロリン、Leuはロイシ
ン、Trpはトリプトファン、Lysはリジンを意味する。

【０００９】ペプチドの化学合成法は技術的にはほぼ確
立しており、この発明のペプチドも公知の方法によって
合成することが可能である。なお、用いるアミノ酸は通
常Ｌ体が使用され、側鎖の官能基等は必要があれば公知
の保護基で保護される。

【００１０】得られたペプチドの構造確認は、例えば島
津製作所製全自動蛋白質一次構造分析装置ＰＳＱ−１に
より行うことができる。また、アミノ酸組成分析はWate
rs社製ＰＩＣＯ−ＴＡＧシステムにより行うことができ
る。

【００１１】次に、このようにして得られるペプチドを
そのＡＣＥ阻害作用に基づいて、食品（特に機能性食
品）として利用するためには、安全性等の問題から化学
合成法より、酵素合成法が適当であると考えられる。

【００１２】ペプチドの酵素合成法については、すでに
優れた総説が多数報告されている（「酵素の新機能開
発」、ｐ７５〜１２９、発行元：講談社サイエンティフ
ィク（１９８９年）など）が、ペプチド結合の種類によ
って合成の難易があり、またペプチド結合の種類に応じ
て適した酵素を選ぶ必要がある。従って、酵素合成法は
化学合成法とは異なり、完全な方法ではなく、まだ確立
した技術となっていないのが現状であり、目的とするペ
プチドごとに詳細な検討をすることが必要となる。

【００１３】用いる酵素としてはトリプシン、キモトリ
プシン、パパイン、パンクレアチン、ブロメライン、プ
ロリンエンドペプチターゼなどの蛋白分解酵素のほか、
細菌性蛋白分解酵素、例えば、ズブチリシン、サーモラ
イシン、ナガーゼ、プロテアーゼＡ，プロテアーゼＢ、
プロテアーゼＭ、プロテアーゼＮ、プロテアーゼＰ、プ
ロテアーゼＰ−６などが適当である。

【００１４】アミノ酸Ｃ端の官能基を反応に関与させな
いようにする保護基としては、メチル、エチル、プロピ
ルなどの短鎖アルキル基及びアミド型保護基を、アミノ
酸Ｎ端の保護基としてはアセチル、ベンゾイルなどのア
シル基及びベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカ
ルボニルなどのウレタン型保護基が用いられる。反応溶
媒は、酵素の至適ｐＨに合わせて公知の緩衝液を使用
し、これに適宜メタノール、エタノール、プロパノー
ル、ブタノール、グリセリン、エチレングリコール、
１，４−ブタンジオール、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシドなどの有機溶媒を加えることができ
る。

【００１５】

【実施例】（実施例１） 以下に、Trp−Lys−Tyrなる構造を有するペプチド（Ｓ
Ｐ３）の酵素による合成法を示す。

【００１６】グリセリン40mlと炭酸塩緩衝液（ｐＨ10.
4）7ml の混合溶媒に、Ｌ−アセチルトリプトファンメ
チルエステル1.3 g （最終濃度0.1 Ｍ）、Ｌ−リジンメ
チルエステル塩酸塩0.98 g（最終濃度0.1 Ｍ）を添加し
て懸濁液を調製した。そして、室温で激しく攪拌しなが
ら、α−キモトリプシン62.5mg（最終濃度 50 μＭ）を
炭酸塩緩衝液3ml に溶解した溶液を約２分かけて滴下
し、さらに３分間攪拌した後、酢酸を加えて反応を停止
させることにより、直線的に反応が進む速度論的制御反
応を行った。

【００１７】そして、アンモニア水にて中和後、酢酸エ
チル100ml を加え、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗
浄、さらに飽和食塩水で数回洗浄した。次に、１０％ク
エン酸溶液５０mlを加え、水層を抽出した後再び炭酸水
素ナトリウムで塩基性とし酢酸エチルで再抽出した。酢
酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム
で乾燥し減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲル
のショートカラムに通し、クロロホルム：メタノール：
トリエチルアミン＝51： 1： 0.1の混合溶媒にて溶出
し、Ac -Trp −Lys −OMe を無色結晶として1.59g （83
％）を得た。

【００１８】次に、エタノール 2mlと前記炭酸塩緩衝液
3mlの混合溶媒に、Trp −Lys −Tyr −OMe 232mg （最
終濃度0.1 Ｍ）、Ｌ−チロシンエチルエステル塩酸塩 1
48mg（最終濃度0.1 Ｍ）を添加して懸濁液を得た。そし
て、室温で激しく攪拌しながら、トリプシン 3mg（最終
濃度 20 μＭ）を炭酸塩緩衝液１mlに溶解した溶液を約
２分間かけて滴下し、さらに３分間攪拌した後、酢酸を
加えて反応を停止させることにより速度論的制御反応を
行った。

【００１９】この反応の収率を液体クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）によって測定した。すなわち、反応混合物
にメタノールを加えて 100mlとし、その５μl をＨＰＬ
Ｃに注入することによりクロマトグラムを得た。そし
て、化学合成した標準品との面積比より収率を求めたと
ころ、約６８％という良好な収率で Ac −Trp −Lys −
Tyr −OEt が得られていることが判明した。なお、ＨＰ
ＬＣの測定条件は次のとおりである。

【００２０】カラム：ＯＤＰ−５０、φ4.6 ×150mm 、
移動相：アセトニトリル／水混合溶媒（30/70)、検出：
紫外線（ＵＶ）280nm 、温度：室温、流量：0.6ml/ｍin
また、常法に従って精製した保護ペプチドは、Ｃ端及び
Ｎ端の保護基を公知の塩基又は酸加水分解法により脱保
護を行い、ＳＰ３を無色の結晶として得た。得られたペ
プチドは、液体クロマト質量分析計（島津製作所製の商
品名ＬＣ−ＭＳ、ＱＰ1000ＥＸ）により分子量を測定し
たところ 495であり、ペプチドシーケンサー（島津製作
所製の商品名ＰＳＱ−１）及びアミノ酸分析装置（Wate
rs社製商品名ＰＩＣＯ−ＴＡＧシステム）により構造分
析を行ったところ、Trp −Lys −Tyr であることが判明
した。

【００２１】このように、酵素合成法によりＳＰ３を比
較的容易に、しかも収率良く収得できる。そして、ＡＣ
Ｅ阻害作用を有するこのペプチドは、適当な無毒性の経
口投与用担体と共に適宜な形状、形態からなる組成物と
して、高血圧の予防、高血圧傾向の緩和又は血圧調整を
目的として、医薬品又は健康食品として用いることがで
きる。 （実施例２）次に、この発明のPhe −Val −Tyr −Thr
−Pro なる構造を有するペプチド（ＳＰ５）の化学合成
法による製造法について説明する。なお、略号は次のと
おりである。

【００２２】Ｂｏｃ：tert-Butoxycarbonyl ＣＢＺ：Benzyloxycarbonyl ＡＡｎ：Ｃ端からｎ番目の原子に置換基を有するアミノ
酸 まず、Ｃ端アミノ酸であるプロリンメチルエステルをジ
クロロメタンに溶解し、ＣＢＺ−又はＢｏｃ−ＡＡ
₂ （トレオニン）（１等量）、Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミド（１．２等量）、ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（１．２等量）を加え、冷蔵庫内で２０〜４０時間攪
拌することによって縮合反応を行った。反応終了後、不
溶物（ジシクロヘキシルウレア）を留去し、有機層を５
％炭酸ナトリウム、水、１０％クエン酸、水で洗浄し、
無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮してジペプチ
ドＢｏｃ−Thr −Pro メチルエステルを得た。なお、必
要に応じてシリカゲルのカラムクラマトグラフィーによ
って精製してもよい。

【００２３】次に、チロシンメチルエステル及び上記ジ
ペプチドの各々１当量を、前述の縮合条件で縮合させ
て、トリペプチドTyr −Thr −Pro を得た。さらに、生
成したこのトリペプチドとＢｏｃ−Val を同様に縮合さ
せて、テトラペプチドVal −Tyr −Thr −Pro を得た。
最後に、このテトラペプチドとＢｏｃ−Phe を同様に縮
合させた。Ｎ端保護基は、ＣＢＺ基の場合は接触還元に
よって、Ｂｏｃ基の場合はトリフルオロ酢酸によって除
去した。以下同様の操作を繰り返し、最後に側鎖保護基
とＣ端のメチルエステルを常法により除去することによ
って目的のペプチドＳＰ５が得られた。このペプチドの
収率は３９％で良好であった。

【００２４】このように、化学合成法によりＳＰ５を容
易に、かつ収率良く収得できる。得られたペプチドの構
造確認は、島津製作所製全自動蛋白質一次構造分析装置
ＰＳＱ−１により行った。またWaters社製ＰＩＣＯ−Ｔ
ＡＧシステムにより、アミノ酸組成分析を行った。その
結果を以下に示す。 （ＳＰ５の一次構造） Phe−Val−Tyr−Thr−Pro （ＳＰ５のアミノ酸組成） Phe19.9％、Val20.4％、Tyr20.7％、Thr19.8％、Pro19.4％ （実施例３） 次に、実施例２と同様にして、Leu−Tyr−Leu−Proなる
構造を有するペプチド（ＳＰ４）の化学合成法による製
造法について説明する。

【００２５】実施例２において、ＣＢＺ−又はＢｏｃ−
ＡＡ₂ （トレオニン）（１等量）に代えてＣＢＺ−又は
Ｂｏｃ−ＡＡ₂ （ロイシン）（１等量）とし、縮合反応
によりジペプチド（Ｂｏｃ−Leu −Pro ）を得た。次
に、これにチロシンメチルエステルを加えて縮合反応さ
せ、トリペプチド（Tyr −Leu −Pro ）を得た。最後
に、これにＢｏｃ−Leu を加えて縮合反応させて、目的
とするテトラペプチドＳＰ４を得た。

【００２６】その収率は４７％と良好であった。このペ
プチドについて、一次構造とアミノ酸組成の分析を行っ
た。その結果を以下に示す。 （ＳＰ４の一次構造） Leu−Tyr−Leu−Pro （ＳＰ４のアミノ酸組成） Leu49.8％、Tyr25.8％、Pro24.4％ （実施例４） 次に、実施例２と同様にして、Trp−Lys−Tyrなる構造
を有するペプチド（ＳＰ３）の化学合成法による製造法
について説明する。

【００２７】実施例２において、プロリンメチルエステ
ルに代えてチロシンメチルエステルを用い、ＣＢＺ−又
はＢｏｃ−ＡＡ₂ （トレオニン）（１等量）に代えてＣ
ＢＺ−又はＢｏｃ−ＡＡ₃ （リジン）（１等量）とし、
縮合反応によりジペプチド（Ｂｏｃ−Lys −Tyr ）を得
た。次に、これにＢｏｃ−Trp を加えて縮合反応させ、
目的とするトリペプチドＳＰ３を得た。

【００２８】このトリペプチドの収率は５３％と良好で
あった。このペプチドについて、一次構造とアミノ酸組
成の分析を行った。その結果を以下に示す。 （ＳＰ３の一次構造） Trp −Lys −Tyr （ＳＰ３のアミノ酸組成）ＰＩＣＯ−ＴＡＧシステムに
よる測定では、Trp は分解して測定不能であった。従っ
て、残りのLys は51.1％、Tyr は48.9％であった。な
お、前記ＰＳＱ−１による３成分の測定結果は、Trp 3
2.1％、Lys 34.8％、Tyr 33.1％であった。 （実施例５）次に、前記ペプチドのＡＣＥ阻害活性の測
定について説明する。 （ＡＣＥ阻害活性測定）１ｇの家兎の肺をアセトン中で
沈降、乾燥した粉末（シグマ社製）を 5 ml のリン酸緩
衝液（ｐＨ 8.3) に溶解し、10000 Ｇ、３０分の遠心分
離処理後の上清液を上記緩衝液で３倍に希釈してＡＣＥ
酵素液として、酵素阻害を測定した。その測定法は Bio
chem. Pharm.,20,p1637 〜1648(1971)及び Anal. Bioch
em.,84,p361 〜369(1978) に記載の方法に準じた。

【００２９】即ち、100 mMリン酸カリウム緩衝液（ 300
mM塩化ナトリウムを含む、ｐＨ 8.3）に、基質として 1
mMトリペプチド（Hip −His −Leu ，ペプチド研究所
製）を100μl 、ＡＣＥ酵素液 100μl 及び試料液 100
μl を加え、３７℃、３０分間の反応後、沸騰水中で５
分間加熱することにより反応を終了させ、反応生成物の
馬尿酸をトリクロロトリアジン試薬で誘導体化し、測定
波長 382nmにおける吸光度を比色定量する方法である。

【００３０】また、阻害率は次式により算出した。 阻害率＝（Ｅ_O −Ｅ_S ）／Ｅ_O ×１００（％） Ｅ_O ：阻害剤を含まないときの 382nmの吸光度 Ｅ_S ：阻害剤を含むときの 382nmの吸光度 そして、阻害率50％のときの試料濃度をＩＣ₅₀（μg/m
l）とした。このＩＣ₅₀の値は低い方がＡＣＥ阻害活性
が高いことになる。また、対照例として、特願平３−４
２０２２号で開示したペプチド、即ち Tyr−Asn −Glu
−Val −Pro （ＲＪＰ₅ ）、Ser −Leu −Pro −Lys −
Leu −His −Glu −Trp （ＲＪＰ₈ ）、Ser −Leu −Pr
o −Ile −His −Glu −Trp −Lys （ＲＪＰ₉ ）につい
ても同様にＩＣ₅₀を測定した。その結果、次の表１のよ
うな結果が得られた。

【００３１】

【表１】

【００３２】表１に示したように、各実施例 5-1〜 5-3
のＩＣ₅₀の値は、各対照例 5-4〜 5-6とほぼ同等に低
く、十分なＡＣＥ阻害作用を有することがわかる。

【００３３】

【発明の効果】以上詳述したようにこの発明のペプチド
は、新規なペプチドであり、アンジオテンシン酵素阻害
作用を有するとともに、製造が容易で収率良く得られ、
高血圧の予防、治療などを目的とした医薬品や食品とし
て有用であるという優れた効果を奏する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 7/06 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Phe−Val−Tyr−Thr−Proなる構造から
   なるペプチド。