JPH11504018A - 硫酸化オリゴ糖の製造および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 オリゴ糖が一般式(Ｉ)：Ｒ₁−(Ｒ_x)_n−Ｒ₂［式中、Ｒ₁およびＲ₂ならびに各Ｒ_xは、単糖単位を表し、その全ては、同一または異なっており、隣接する単糖単位は、１→２、１→３、１→４および／または１→６グリコシド結合によって結合されており、ｎは、１〜６の整数である］で示される硫酸化オリゴ糖、ならびに抗脈管形成剤、抗転移剤および／または抗炎症剤としてのそれらの使用。

Description

【発明の詳細な説明】 硫酸化オリゴ糖の製造および使用 発明の分野 本発明は、硫酸化オリゴ糖、それらの製造および抗脈管形成剤、抗転移剤およ び／または抗炎症剤としての使用に関する。 発明の背景 ヘパラン硫酸は、多糖のグリコサミノグリカン・ファミリーに属する。それら は、ほとんどの多細胞動物中に存在し、偏在性分布を有しており、ほとんどの組 織の細胞表面および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で発現する（1，2）。ヘパラ ン硫酸は、通常、プロテオグリカンとして存在しており、分子の核ポリペプチド を配列決定しクローニングする際にかなり進行した。ある程度まで、例えば、少 なくとも８種類のヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）核ポリペプチドが 細胞表面で同定された（3）。 まず、ＨＳＰＧは、細胞表面およびＥＣＭで構造的役割を充分に果たすと思わ れた。しかしながら、ヘパリン硫酸鎖は、多くの生物学的プロセスのための重要 なシグナル発生情報を提供すると思われる顕著な構造的多様性を示す（2，4）。 かくして、ヘパリン硫酸鎖は、まず、β１−４およびα１−４結合によって結合 されたグルクロノシルおよびＮ−アセチルグルコサミニル残基の単純な交互反復 体として合成されるが、結果として多くの修飾が起こる。多糖は、Ｎ−脱アセチ ルされ、Ｎ−硫酸化され、次いで、グルクロノシル単位からイズロノシル単位へ のＣ５エピマー化、ならびにウロノシルおよびグルコサミニル残基の種々のＯ− 硫酸化を受ける。これらの修飾の多様性は、ヘパリン硫酸鎖に沿って異なるオー ダーで配列された場合に理論的には莫大な数の異なるヘパリン硫酸構造を生じる ことができる約３０種類の二糖配列を斟酌する。これに関して、マスト細胞顆粒 中にのみ存在する抗凝固性多糖ヘパリンは、エピマー化および硫酸化が最大にな ったヘパリン硫酸の最高の形態を表す。ほとんどのヘパリン硫酸は、非硫酸化単 位 の比較的長いストレッチによって結合された非常によく硫酸化された残基の短い ストレッチを含有する。 現在、ヘパリン硫酸が広範囲の生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす という明らかな証拠がある（2-4）。特に、それらは、細胞間相互作用に含まれ る付着分子のためのリガンドとして作用し（5，6）、細胞−ＥＣＭ相互作用にお いて沈殿し（5，6）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（7，8）および血 管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（9）などの成長因子のための必須細胞表面受容体 として作用することができる。ＨＳＰＧは、また、細胞移動に対する主要な障壁 を表す基底膜の重要な成分である（10）。基底膜障壁は、細胞が、ヘパラン硫酸 鎖を切断する（12，13）ヘパラナーゼと称されるエンドグリコシダーゼを含む分 解酵素（11）の範囲を展開する場合に破ることができるだけである。 ヘパラン硫酸が沈殿する生物学的プロセスの多くが、固有のヘパラン硫酸構造 の認識を重要なものである多糖鎖における硫酸化物の位置と関係させることが示 された（3）。例えば、所定のヘパラン硫酸配列が酸性および塩基性ＦＧＦによ って認識され（14-16）、ヘパラナーゼによって切断されることを示した。これ らの観察結果に基づいて、本発明の目的は、成長因子によるヘパラン硫酸認識を 遮断し、ヘパラナーゼによるヘパラン硫酸の切断を阻害する硫酸化オリゴ糖を合 成することであった。現在、細胞表面ヘパラン硫酸がそれらの受容体に結合した 成長因子の架橋結合を媒介すると思われているので、成長因子の遮断の場合、ヘ パラン硫酸の低分子量擬態は、特に有効であると考えられた（17）。さらにまた 、硫酸化オリゴ糖は、ヘパラナーゼの切断不可能な基質として作用することによ る有効なヘパラナーゼ阻害剤である。 成長因子阻害活性を有する硫酸化オリゴ糖は、多くの臨床用途を有する。ｂＦ ＧＦおよびＶＥＧＦなどのヘパリン／ヘパラン硫酸結合性成長因子は、脈管形成 の有効なインデューサーである（18）。成人では、脈管形成は、創傷治癒の間以 外は比較的稀な出来事である。しかしながら、脈管形成が臨床的に重要である成 人における多くの「脈管形成依存性疾患」がある（18-20）。これらのうち最も 重要なものは、充実性腫瘍の増殖、増殖性網膜症および慢性関節リウマチに関連 する脈管形成である。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦなどの重要な脈管形成性成長因子 の作用を遮断した硫酸化オリゴ糖は、これらの脈管形成依存性疾患の治療に特に 有用であろう。 同様に、ヘパラナーゼ作用を阻害する硫酸化オリゴ糖は、数多くの臨床用途を 有する。内皮下基底膜は、血管壁を介する内皮細胞、腫瘍細胞および白血球の移 動に関する主要な物理的障壁を表す。ヘパラナーゼ酵素は、タンパク質溶解酵素 の範囲（例えば、プラスミン、マトリックスメタロプロテイナーゼ）と組み合わ せて、細胞を侵すことによって基底膜分解における実質的な役割を果たす（11-1 3，21）。かくして、基底膜分解を防止することによって、ヘパラナーゼ阻害活 性を有する硫酸化オリゴ糖は、抗転移活性および抗炎症活性を示し、さらに、脈 管形成の初期段階を示す。同時に脈管形成性成長因子作用を同時に阻害する硫酸 化オリゴ糖およびヘパラナーゼ酵素の使用は、例えば、非常に転移性のある充実 性腫瘍および慢性関節リウマチの治療など、多くの臨床状態において好ましい。 従前の国際特許出願番号PCT/AU88/00017（公開番号WO88/05301）には、動物ま たはヒト患者の抗転移性および／または抗炎症性治療法における、ヘパラナーゼ 活性を遮断または阻害する、ヘパリンおよび修飾ヘパリン、フコイジン、ペント サン硫酸、デキストラン硫酸およびカラゲニンラムダなどの硫酸化多糖の使用が 開示されている。 本発明に導く研究において、本発明者らは、天然オリゴ糖またはヘキソース含 有ホモポリマーからなる全合成オリゴ糖を用いて硫酸化オリゴ糖を調製した。こ れらの化合物のうちいくつかは、ヒト脈管形成、腫瘍転移および炎症の有効な阻 害剤であることが示された。得られたデータは、脈管形成性成長因子作用および ／またはヘパラナーゼ機能を阻害することによって生物学的効果を示す硫酸化オ リゴ糖と一致しており、脈管形成およびヘパラナーゼ活性の両方の有効な阻害剤 であるある種の硫酸化オリゴ糖が得られた。 発明の概要 １つの態様に関して、本発明は、オリゴ糖が一般式Ｉ： Ｒ₁−(Ｒ_x)_n−Ｒ₂ （Ｉ） ［式中、Ｒ₁およびＲ₂ならびに各Ｒ_xは、同一または異なっていてもよい単糖単 位を表し、隣接する単糖単位は、１→２、１→３、１→４および／または１→６ グリコシド結合によって結合されており； ｎは、１〜６の整数である］ で示される硫酸化オリゴ糖を提供するものである。 本発明の硫酸化オリゴ糖は、１→２、１→３、１→４および／または１→６グ リコシド結合によって結合されており、３〜８個の単糖単位からなる単糖単位の ポリマーに基づいている。好ましくは、該オリゴ糖は、３〜６個の単糖単位（す なわち、ｎは、１〜４である）、より好ましくは、５〜６個の単糖単位（ｎは、 ３〜４である）からなる。ポリマーは、唯一のタイプの単糖単位を含有するホモ ポリマー、または２種類以上のタイプの単糖単位を含有するヘテロポリマーから なっていてもよい。 一緒に結合してオリゴ糖を形成する単糖単位は、好ましくは、ヘキソースであ り、フルクトースなどのフラノースまたはグルコース、マンノース、アルトロー ス、アロース、ガラクトース、イドースまたはグロースなどのピラノースのいず れであってもよい。ヘキソースは、Ｄ−またはＬ−配座のいずれであってもよい 。 本発明の１つの特定の態様では、オリゴ糖が一般式II： Ｒ_y−(Ｒ_y)_n−Ｒ_y （II） ［式中、各Ｒ_y基は、同一であり、各々、単糖単位を表し、隣接する単糖単位は 、１→３、１→４および／または１→６グリコシド結合によって連結されており ； ｎは、１〜６の整数である］ で示される新規合成オリゴ糖を提供するものである。 この特定の態様では、本発明は、前記一般式IIで示される硫酸化オリゴ糖を提 供するものである。 好ましくは、式IIで示されるホモポリマーオリゴ糖では、単糖単位は、グルコ ース、マンノース、アルトロース、アロース。タロース、ガラクトース、イドー スまたはグロースなどのヘキソースである。好ましくは、また、これらのオリゴ 糖において、ｎは、１〜４、好ましくは、３〜４である。 一般式ＩおよびIIで示されるオリゴ糖としては、単糖単位が誘導されている、 特に、単位が単糖のリン酸化、アセチルまたは他のエステル誘導体である化合物 が挙げられる。 一般に、本発明の硫酸化オリゴ糖は、自体公知の方法によってオリゴ糖を硫酸 化して、対応する該オリゴ糖のＯ−硫酸化誘導体を得ることによって調製される 。適切な硫酸化方法を以下に例示する。硫酸化しようとするオリゴ糖は、そのま まで自然生じるオリゴ糖（例えば、ラフィノースおよびスタキオース）を含む天 然生成物、ならびに天然多糖（例えば、マルトテトラオース、マルトペントアー スおよびマルトヘキサオース；グルコトリオース、グルコテトラオースおよびグ ルコペンタオース；コンドロイチン四糖、六糖および八糖；ならびに酵母ピキア ・ホルスティ（Ｐichia holstii）由来のマンノペンタオースリン酸）の酵素分 解または化学分解によって調製されたオリゴ糖であってもよい。 前記したとおり、本発明の範囲内である硫酸化オリゴ糖は、ヘパラナーゼ阻害 および／または成長因子阻害活性を示すことを示した。したがって、別の態様で は、本発明は、温血動物（ヒトを含む）患者の治療における抗脈管形成剤、抗転 移剤および／または抗炎症剤としての前記硫酸化オリゴ糖の使用に及ぶ。 かくして、本発明は、前記した少なくとも１つの硫酸化オリゴ糖の有効量を患 者に投与することを特徴とする、治療を必要とするヒトまたは他の温血動物患者 の抗脈管形成治療方法、抗転移治療方法および／または抗炎症治療方法に及ぶ。 活性成分は、治療的に有効な量で投与される。治療的に有効な量は、所望の効 果を得るために、または治療される特定の症状の発症を遅延させるため、または 、該症状の進行を阻害するため、または、該症状の発症もしくは進行を停止させ るために少なくとも部分的に必要な量を意味する。かかる量は、もちろん、治療 される特定の症状、該症状の重篤度、ならびに年齢、全身状態、大きさ、体重お よび並列治療などの個々の患者のパラメーターに依存するであろう。これらの因 子は、当業者によく知られており、慣用的な実験だけと一緒に取り扱うことがで きる。一般的、最大投与量を用いること、すなわち、サウンドメディカル判定（ sound medical judgement）による最高の安全な投与量を用いることが好まし い。しかしながら、医薬的理由、生理学的理由または実質的には他の理由のため に低投与量または耐量が投与されることは、当業者によって理解されるであろう 。 本発明は、前記少なくとも１つの硫酸化オリゴ糖の、ヒトまたは他の温血動物 患者の抗脈管形成治療薬、抗転移治療薬および／または抗炎症治療薬の製造にお ける使用にも及ぶ。 さらにまた、本発明は、また、医薬的および獣医学的に許容される担体または 希釈剤と一緒に前記の少なくとも１つの硫酸化オリゴ糖を含有してなる、抗脈管 形成治療用、抗転移治療用および／または抗炎症治療のための医薬または獣医学 的組成物を提供するものでもある。 かかる治療用組成物の処方は、当業者によく知られている。適切な医薬的また は獣医学的に許容される担体および／または希釈剤としては、いずれかまたは全 ての慣用的な溶媒、分散媒質、充填剤、固体担体、水性溶液、コーティング、抗 菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬的および獣 医学的に活性な物質のためのかかる媒質および薬剤の使用は、当該技術分野でよ く知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，18th Editio n，Mack Publishing Company，Pennsylvania，USAに開示されている。いずれか の慣用的な媒質または薬剤が活性成分と適合しない範囲を除いては、本発明の医 薬および獣医学的組成物におけるその使用が考えられる。追加の活性成分を該組 成物と混合することもできる。 投与の容易性および投与の均一性のために投与単位形態の組成物を処方するの が特に好都合である。本明細書で用いる場合ま投与単位形態は、治療しようとす るヒトまたは動物患者のための単位投与として適している物理的に分離している 単位を表す；各単位は、所望の医薬的または獣医学的担体および／または希釈剤 に関連する所望の治療効果を生じるように算出された予め決定された量の活性成 分を含有する。本発明の新規投与単位形態のための明細は、（ａ）活性成分の固 有の特徴および達成しようとする特定の治療効果、ならびに（ｂ）特定の治療の ためのかかる活性成分を化合する技術分野において固有の制限によって、これら に直接依存して指図される。 本発明の硫酸化オリゴ糖は、充実性腫瘍の成長、増殖性網膜症および慢性関節 リウマチに関連する脈管形成を含む脈管形成依存性疾患の治療において、ならび に、硫酸化オリゴ糖のヘパラナーゼ−阻害活性が、慢性関節リウマチ、多発性硬 化症、インスリン依存性真性糖尿病、潰瘍性大腸炎およびクローン（Chron）病 などの炎症性腸疾患、同種異系移植片拒絶ならびに慢性喘息のような白血球浸潤 が重要な要素である慢性炎症性疾患を含む白血球浸潤を阻害するのに特に有用で ある炎症性疾患および症状の治療において用いられる。 本明細書の全体を通して、特記しない限り、「を含有してなる」という語句ま たは「を含有してなること」などの派生語は、所定の整数または整数のグループ の包含を意味するが、いずれの他の整数または整数のグループの排除を意味しな いと理解されるであろう。 発明の詳細な説明 前記で広く記載したとおり、本発明は、硫酸化オリゴ糖ならびに抗脈管形成剤 、抗転移剤および／または抗炎症剤としてのそれらの使用に関する。 いくつかのオリゴ糖は、次の硫酸化のために天然原料から得ることができるが 、所定の鎖長および立体化学のオリゴ糖を合成するための簡単な方法が非常に望 まれている。本発明は、オリゴマーの糖モノマーが１→３、１→４および／また は１→６結合で結合される、良好な収率で簡単な出発物質からヘキソース糖のオ リゴマーを合成し単離するための改良された方法を提供するものである。このヘ キソース糖のオリゴマーの製造方法は、良好な収率が得られ、オリゴマー化の程 度が容易に制御され、この方法により得られた生成物が簡単なクロマトグラフィ ー法を用いて容易に単離され精製される同一の直鎖状オリゴマーであるという点 で、かかる糖オリゴマーが従前に製造されていた方法と非常に対照的である。 糖ポリマーおよびオリゴマーを調製するための方法が開示されている多くの例 が科学文献および特許文献において見ることができる。例えば、一般的に用いら れる方法では、非修飾糖モノマーを単独または溶媒の存在下で、触媒の存在下、 加熱して、種々のおよびしばしば不明確な化学結合を有する分枝鎖状および直鎖 状ポリマー生成物が得られる（22，23）。糖が陽イオン交換樹脂の存在下で溶融 する別の方法（24）によると、高分子量の非常に枝分かれしたポリマーが得られ る。これらの２つの例では、該ポリマーは、形成された各ポリマー結合のための １分子の水の付随的損失をもって形成される。公知の段階重合方法の別の例は、 １位に非ヒドロキシル基（例えば、臭素または塩素原子など）、および他の糖ヒ ドロキシ基に保護基（例えば、アセチルなど）を有している糖が別の糖のヒドロ キシル基と１位で反応させる、ケニクス−クノール（Ｋoenigs−Ｋnorr）反応を 利用することを含む（24）。これらの方法では、水以外の分子、例えばＨＢrは 、ポリマー結合形成の間に失われる。このオリゴ糖の製造方法は、長時間に及び 、複雑な出発物質の調製を必要とし、全収率が悪い（25）。 同様の方法で、炭素６に主要なアルコール基、ならびに２、３および４位にＯ −保護基（例えば、アセチルなど）、および１位に臭素などの離脱基を含有する ヘキソース糖が、特に酸化銀などの触媒の存在下で、自己縮合して、１,６結合 ポリマーが得られることは知られている；一連のゲンチオデキストリンは、この 方法で１−ブロモ−２,３,４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコースから製 造された；しかしながら、該オリゴ糖の収率は、分子内縮合により誘導された１ ,６−アンヒドロ−β−Ｄ−グルコースの形成のために低かった；二量体の収率 （１４％）および三量体の収率（２２％）は、良好ではなく、四量体および五量 体の収率は、悪く（＜５％）、六量体は、ほんの１％の収率で単離されただけで あった（26）。 より最近の刊行物には、無水糖誘導体の開環重合反応によって製造された１, ６−結合−β−ピラノシル単位（27）およびＤ−デキストラン（28）のポリマー の化学的合成が開示されている。この方法は、無水糖出発物質を製造するために 必要とされる相当な試みによって妨げられ、反応が例えば−６０℃で行われたと してもこの方法によってオリゴ糖を容易に製造することができるという証拠が全 くない。別の方法は、１,２,３,４−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコー スの酸性触媒化溶融重合化を用いて、１,６'−結合オリゴ糖酢酸の混合物を製造 し、これは、脱アセチルし、クロマトグラフィー試験に付すと、ほとんどが単糖 および二糖、すなわち、グルコース（１５％）、レボグルコサン（４％）および ゲンチオビオース（４％）を含有することが示されたが、オリゴ糖収率は、容認 されないほど低く、特に、ゲンチオトリオース（４％）およびゲンチオテトラオ ース（０.６％）であった（29）。この方法は、後により詳細に開示され（30） 、重合化生成物の収率がわずかに改良されたが、予想されるオリゴマーの収率は 非常に悪かった。 かくして、該文献から、数多くのオリゴ糖を製造するために数種類の方法が既 に存在するが、容易に入手可能かつ廉価な出発物質からの良好な収率なホモ−オ リゴ糖の合成方法は、現在までに全く開示されていなかったことが明らかである 。 本発明に導く研究において、本発明者らは、特定のヘキソピラノ−オリゴ糖が 容易に入手可能かつ廉価な出発物質から良好な収率で合成され得る方法を見いだ した。この態様に関して、本発明は、減圧下、ルイス酸または他の触媒の存在下 、不活性溶媒中、ヘキソースのアセチルまたは他のエステル誘導体を加熱するこ とを特徴とする、ヘキソピラノ−オリゴ糖の製造方法を提供するものである。 この方法に関して、グルコース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、 タロース、グロース、イドースおよびアロースの１,２,３,４−テトラ−Ｏ−ア セチル誘導体を含むがこれらに限定されない、誘導されたヘキソース糖のオリゴ マー化は、制御された方法で行われて、Ｏ−アセチル化ヘキソースオリゴ糖を得 ることができる。この方法では、オリゴマー化の程度（鎖長）は、オリゴマー化 反応が起こる温度の操作によって、および反応が進行する時間を変化させること によって容易に制御することができる。オリゴマー化反応後、粗製生成混合物を さらにアセチル化に付して、残存するオリゴ糖の遊離ヒドロキシル基をアセチル 化する。次いで、アセチル化オリゴ糖を吸着クロマトグラフィーによって容易に 分離することができる。アセチル基は、アセチル化オリゴ糖が次にカラムから溶 出されるので、アセチル化オリゴ糖を同定するために吸光分光分析の使用を容易 にする紫外線吸収を有する。オリゴ糖混合物からアセチル保護基を除去し、得ら れたオリゴ糖をゲル濾過（サイズ排除）クロマトグラフィーによって大きさにし たがって分離することができる。 本明細書に記載する実施例では、硫酸化オリゴ糖は、それらの個々のナトリウ ム塩として単離され用いられる。カルシウムなどの他の医薬的に許容される塩ま たは医薬的に許容されるアミン塩は、対応する方法で単離され用いられると理解 されるであろう。したがって、「硫酸化オリゴ糖」の本明細書における引用は、 硫酸化オリゴ糖のかかるナトリウムまたは他の医薬的に許容される塩を含むと理 解されるべきである。 本発明のさらなる特徴は、以下の実施例においてより充分に記載される。しか しながら、この詳細な説明は、単に本発明を例示するために含まれており、如何 なる場合も前記した本発明の広い説明についての制限として理解されるべきでは ないと理解されるべきである。 実施例１、２および３は、本明細書に記載した新規方法によって合成オリゴ糖 の製造を例示し、実施例４、５および６は、オリゴ糖の硫酸化方法を例示し、実 施例７は、抗脈管形成剤、抗転移剤および／または抗炎症剤としての硫酸化オリ ゴ糖の使用を例示する（実施例１および２では、「ＮＤ」は、「測定されなかっ た」ことを表す）。 添付図面において： 図１は、イン・ビトロでのヒト脈管形成に対するマルトヘキサオース硫酸の効 果を示す。上図は、培養開始後１４日目の対照脈管形成のデジタル画像である。 下図は、２０μg／mlのマルトヘキサオース硫酸の存在下での脈管形成を示す。 図２は、イン・ビトロでのヒト脈管形成に対する種々の濃度のマルトース硫酸 （□）、マルトテトラオース硫酸（○）およびマルトヘキサオース硫酸（■）の 効果を示す。データは、培養開始後１４日目の脈管形成応答のデジタル画像から 得た。各値は、平均値±標準誤差である（ｎ＝４）。 図３は、イン・ビトロでのヒト脈管形成に対するピキア・ホルスティ（Ｐichi a holstii）由来の種々の濃度（μg／ml）の硫酸化マンノペンタオースリン酸の 効果を示す。データは、培養開始後１９日目の脈管形成応答のデータ画像から得 た。各値は、平均値±標準誤差である（ｎ＝４）。 図４は、ラット乳腺癌１３７６２ＭＡＴの転移に対する種々の鎖長の硫酸化マ ルトースオリゴ糖の効果を示す。対照動物には、オリゴ糖不在下の１３７６２ ＭＡＴ細胞を投与した。パネルＡでは、処置動物には、腫瘍細胞注射時に各化合 物２mgを静脈内投与した。パネルＢでは、処置動物には、腫瘍細胞注射時に各化 合物４mgを皮下投与した。垂直バーは、平均の標準誤差を表す。 図５は、固定されたａＦＧＦへのＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３上の細胞表面ヘパラン 硫酸の結合を阻害することができる種々の鎖長の硫酸化マルトースオリゴ糖の能 力の測定値である。結合した３Ｔ３細胞は、ローズ・ベンガル染色法によって、 および５４０nmでの色素吸光度を測定することによって定量化した。種々のマル トースオリゴ糖の硫酸化の程度は、表２に記載する。 図６は、ラット乳腺癌１３７６２ＭＡＴの転移を阻害する能力に対するマルト ヘキサオース硫酸の硫酸化の程度の効果を示す。ｘ軸に沿った数字は、硫酸基／ マルトヘキサオース分子の数を表す。対照動物には、化合物不在下の腫瘍細胞を 投与した。オリゴ糖は、腫瘍細胞注射時に２mg／ラットの投与量で静脈内投与し た。垂直バーは、平均の標準誤差を表す。 図７は、イン・ビトロでのヒト脈管形成に対する種々の数の硫酸基／分子を有 するマルトヘキサオースの効果を示す。オリゴ糖を２０μg／mlで添加し、無血 清培地中でアッセイを行った。該アッセイが血清含有（２０％ＦＣＳ）培地中で 行われようとまたは無血清（無ＦＣＳ）培地中で行われようと、この実験では類 似の脈管形成応答が観察された。硫酸化物２０個／分子を有するマルトヘキサオ ースは、最大に硫酸化された分子を表す。データは、４つの測定の平均値±標準 誤差である。 図８は、イン・ビトロでのヒト脈管形成に対する硫酸化オリゴ糖を含有する種 々のマンノースの効果を示す。括弧内の値は、オリゴ糖の硫酸化％を表す。オリ ゴ糖を２００μg／mlで添加し、血清含有培地中で該アッセイを行った。データ は、４つの測定の平均値±標準誤差である。 図９は、ラット乳腺癌１３７６２ＭＡＴの転移に対する種々の鎖長の硫酸化マ ンノースオリゴ糖の効果を示す。括弧内の値は、オリゴ糖の硫酸化％を表す。対 照動物には、オリゴ糖不在下の１３７６２ＭＡＴ細胞を投与した。処置動物には 、腫瘍細胞を静脈内注射した直後、各化合物２mg（Ａ）または４mg（Ｂ）を 皮下投与した。垂直バーは、平均値の標準誤差を表す。 図１０は、ラット乳腺癌１３７６２ＭＡＴの転移に対する種々の鎖長の硫酸化 ガラクトースおよびグルコースオリゴ糖の効果を示す。括弧内の値は、オリゴ糖 の硫酸化％を表す。対照動物には、オリゴ糖不在下の１３７６２ＭＡＴ細胞を投 与した。処置動物には、腫瘍細胞の静脈内注射の直後、各化合物２mgを皮下投与 した。 実施例１ 以下の方法でマンノースのオリゴ糖を得た：１,２,３,４−テトラ−Ｏ−アセ チルマンノース（31）（１５.０g、４３mmol）および塩化亜鉛（１.５g）をテト ラメチレン−スルホン（７ml）中で完全に混合し、この混合物を、約１１０℃で ６時間、撹拌しつつ、減圧下で加熱した；この時、該反応マスは、固まり、蒸気 （酢酸）発生が止んだ。反応時間の間、反応容器と真空源との間にソーダ石灰管 を配置した。該反応混合物を冷却し、生成混合物の一部（１１.０g）を乾燥ピリ ジン（２０ml）に溶解し、この溶液に無水酢酸（２ml）を添加し、この混合物を 大気水分から保護し、約５０℃で撹拌しつつ２時間加熱した。冷却後、エタノー ル（１０ml）を添加し、混合物を２時間放置した。ピリジン、エタノールおよび 形成されたいずれの酢酸エチルも減圧下で蒸発させ、残留物を水で広範囲に洗浄 して、塩化亜鉛、テトラメチレンスルホンおよびピリジンを除去した。残留物を ジクロロメタンに溶解させ、水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥さ せた。まず該ジクロロメタン溶液をシリカゲル６０（１３０g）の短いカラム（ ４×４０cm）に添加し、まずクロロホルムで溶離し、次いで、アセトンで溶離す ることによって、誘導されたオリゴ糖を２つのフラクションに分離した。クロロ ホルムでの溶離により、完全にアセチル化された単糖およびマンノース３〜５単 位を含有するオリゴマーの混合物（混合物Ａ）が得られた。次のアセトンでの溶 離により、分子当たり６ないし１２までのマンノース単位を主に含有する完全に Ｏ−アセチル化されたオリゴマーの混合物（混合物Ｂ）が得られた。 混合物Ａ（４g）を、ｔｌｃ用シリカゲル（Ｈ）を充填したカラム（３.３×１ ３５cm）に添加した。該カラムを、１：５で開始し、最終比１：１が達成される までアセトンのパーセンテージを増加させるアセトン／石油エーテル（沸点６０ −８０°）勾配液で溶離した。流速は、＜０.５ml／分であった。適切なフラク ション（シリカゲルｔｌｃ分析によって決定された）を回収しプールし、減圧下 で溶媒を除去することによって、以下のとおり、完全にＯ−アセチル化されたマ ンノースオリゴ糖１ａ−１ｄを得た（ｎ＝マンノース残基数；収率，分子回転（ ｃ＝２,ＣＨＣｌ₃））：１a,(３；０.７g，４.２％，[α]²⁷ _D＝＋ＮＤ)；１ｂ,( ４；４.１g，８.４％，[α]²⁷ _D＝＋５０)；１ｃ,(５；１.２g，７.９％，[α]²⁷ _D ＝＋４７.３)；１ｄ,(６；０.８g，５.２％，[α]²⁷ _D＝＋３６.０)。混合物Ｂ( ７.０g)を、溶離勾配液が４：５のアセトン／石油エーテル（沸点６０−８０° ）で開始し、アセトンのパーセンテージを１００％まで増加させること以外は、 混合物Ａと同様の方法でクロマトグラフィーに付した。この方法で、以下のとお り、完全にＯ−アセチル化したマンノースオリゴ糖１ｄ−１ｊを得た（ｎ＝マン ノース残基数；収率，分子回転（ｃ＝１,ＣＨＣl₃））：１ｄ,(６；１.６g，１ ０.４％，[α]²⁷ _D＝＋ＮＤ)；１ｅ,(７；３.２g，２１.２％，[α]²⁷ _D＝＋５０. ０)；１ｆ,(８；０.５g，３.４％，[α]²⁷ _D＝＋４７.０）；１g,(９；０.７g， ４.７％，[α]²⁷ _D＝＋５９);１ｈ,(１０；０.９g，５.７％，[α]²⁷ _D＝＋５４); １ｉ,(１１；０.０２g，０.１％，[α]²⁷ _D＝＋ＮＤ)；１ｊ,(１２；０.０３g， ０.２％，[α]²⁷ _D＝＋ＮＤ)。 化合物１ａ（１.５５g）を乾燥メタノール（４０ml）に溶解させ、室温で撹拌 しつつ、１Ｍメタノール性ナトリウムメトキシド（８.６ml）を添加した。得ら れた沈殿物を濾去し、メタノールで完全に洗浄し、乾燥させた。生成物（２ａ； ０.６１g，７０％[α]²⁷ _D＝＋７２°）を、元素分析（ＣＨＮ値は、予想の±０. ４％であった）、エレクトロスプレイマススペクトロメトリー（Ｍ⁺５０４）お よびｎｍｒ分光分析法によってマンノトリオースと同定した。オリゴマー１ｂ− １ｊを同様に処理して、以下のマンノースオリゴ糖を得た（ｎ＝マンノース残基 数；アセチル化誘導体からの収率％，分子回転（ｃ＝１,Ｈ₂Ｏ））：２ｂ,(４； ７５％，[α]²⁷ _D＝＋７８°)；２ｃ,(５；８５％，[α]²⁷ _D＝＋８０°)；２ｄ,( ６；９８％，[α]²⁷ _D＝８４°)；２e,(７；９８％，[α]²⁷ _D＝８６.３°)；２f, (８；９９％，[α]²⁷ _D＝＋９８.０°)；２ｇ,(９；９９％,[α]²⁷ _D＝＋１０６° )；２ｈ,(１０；９９％，[α]²⁷ _D=＋１００°)；２ｉ,(１１；９８％[α]²⁷ _D＝ ＮＤ)；２ｊ,(１２；９８％，[α]²⁷ _D＝ＮＤ)。 別法として、ゲル濾過（サイズ排除）クロマトグラフィーによって、これらの マンノースオリゴ糖を単離することができる。かくして、前記と同様に約１１０ ℃で６時間、減圧下で、テトラメチレン−スルホン（７ml）中での１,２,３,４ −テトラ−Ｏ−アセチルマンノース（１５.０g、４３mmol）および塩化亜鉛（１ .５g）の完全撹拌混合物を加熱することによって、アセチル化マンノースオリゴ 糖の混合物を得た。該反応混合物を冷却し、水（５０ml）を添加し、反応混合物 を室温で５分間撹拌し、水層を廃棄した。この洗浄工程を繰り返し、次いで、該 マスをクロロホルムに溶解させ、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた 。濾過後、減圧下、クロロホルムを除去して、粗製アセチル化オリゴ糖混合物（ １１.３g）を得た。この混合物をイソプロパノール（２０ml）およびメタノール （６０ml）に溶解させ、次いで、メタノール中１Ｍナトリウムメトキシド（８ml ）を添加し、該混合物を室温で１時間放置した。得られた沈殿物を濾去し、メタ ノール（３０ml）で２回洗浄した。乾燥後、この生成混合物（６.５g）を、６０ ℃で２日間水を流す（流速０.５ml／分）ことによって安定化させたファイン用 Ｐ２ゲル（バイオラッド（ＢioＲad））ゲル濾過カラム（ジャケット付；５×９ ０cm）の上部に添加した。該カラムを流速０.５ml／分で水で溶離した。該カラ ムから溶出する生成物を示差屈折計によりピークと同定し、したがって、フラク ションを回収した。この方法で、１１個の別々のピーク下面積に対応するフラク ションを回収した。これらのフラクションの各々を、６０℃に維持した同一のＰ ２ゲルカラムで再クロマトグラフィーに付し、流速０.５ml／分で水で溶離した 。かくして、例えば、第１のゲル濾過操作からマンノペンタオース（０.９g）に 対応すると同定されたフラクションを再クロマトグラフィーに付して、いずれか の側に１つの肩を有する主要中心ピークを得た。中心ピークにおいて溶離する生 成物を、減圧下で水を除去して物質（０.５g）を得、これを流速０.３ml／分で ６０℃の同一Ｐ２ゲルカラムで再度再クロマトグラフィーに付すことによって、 単離 した。この方法で、前記２ｃと同一のマンノペンタオース（０.３g）を得た。測 定値：Ｃ,３８.４；Ｈ,６.７；Ｃ₃₀Ｈ₅₂Ｏ₂₆.６Ｈ₂Ｏの理論値：Ｃ,３８.５；Ｈ ,６.８％。窒素の値は、測定値０％および理論値０％であった。 該化合物は、ＨＰＬＣによって実質的に純粋であることが判明した。これは、 以下に記載のディオネックス（Ｄionex）ＨＰＬＣシステムで決定した。 カラム： コード−ＣＰＭＡ１＃１２９１（＋ガード＃１１７２）。第４級ア ンモニウムイオン交換カラム。 検出器： 電気化学検出器（ＥＤ４０：ＩＡＭＰ）。 流速： １ml／分。 溶媒： 溶液Ａ： ０.１Ｍ ＮaＯＨ 溶液Ｂ： ０.１Ｍ ＮaＯＨ中１Ｍアセテート。 エレクトロスプレイマススペクトロメトリーは、この化合物が、マンノペンタ オースの正しい分子量、質量Ｍ⁺８２８を有することを示した。同様の方法で、 前記２ａ、２ｂ、２ｄおよび２ｅと同一のマンノトリオース、マンノテトラオー ス、マンノヘキサオースおよびマンノヘプタオースを単離した。 実施例２ この実施例は、実施例１よりも低い温度で重合反応を行う効果を示す。重合反 応が９０℃で８時間行われた以外は、前記実施例１で概略記載した方法によって 生成されたマンノースオリゴ糖についてと同様の方法で、１,２,３,４−テトラ −Ｏ−アセチルグルコースの重合化によって、グルコースのオリゴ糖を得た。該 反応混合物を実施例１におけると同様に処理し、該生成物を、カラム（７cm×１ ５５cm）にｔｌｃ用シリカゲル（Ｈ）を充填したカラムクロマトグラフィーに付 すことによって単離した。実施例１に記載のものと同様の溶離方法を用いて、以 下のとおり、完全にＯ−アセチル化グルコースオリゴ糖３ａ−３ｅを得た（ｎ＝ グルコース残基数；収率，分子回転(ｃ＝２,ＣＨＣｌ₃)）：３ａ,(３；４.１４g ，２４.９％，[α]²⁷ _D＝＋３７.５°)；３ｂ,(４；２.９２g，１８.４％，[α]^{2 7} _D ＝＋４４°)；３c,(５；２.９９g，１９.１％，[α]²⁷ _D＝＋３７.５°)；３ｄ ,(６；１.３７g，８.９％，[α]²⁷ _D＝＋３６°)；３ｅ,(７；０.１８g，１.２％ ，[α]²⁷ _D＝＋３９°)。 化合物３ａ（１.０g）を乾燥メタノール（３０ml）に溶解させ、室温で撹拌し つつ、１Ｍメタノール性ナトリウムメトキシド（５.５ml）を添加した。得られ た沈殿物を濾去し、メタノールで完全に洗浄し、乾燥させた。生成物（４ａ；[ α]²⁷ _D＝６８.５°）を、元素分析、エレクトロスプレイマススペクトロメトリ ー（Ｍ⁺＝５０４）およびｎｍｒ分光分析法によりグルコトリオースと同定した 。オリゴマー４ｂ−４ｅを同様に処理して、以下のグルコースオリゴ糖を得た（ ｎ＝グルコース残基数；収率％，分子回転(ｃ＝２,Ｈ２Ｏ)）：４ｂ,(４；８５ ％,[α]²⁷ _D=＋８３°)；４ｃ,(５；９０％，［α]²⁷ _D＝＋８４°)；４ｄ,(６； ９０％,[α]²⁷ _D＝＋８６°)；４ｅ,(７；８９％，[α]²⁷ _D＝＋９２.５°)。 別法として、ゲル濾過（サイズ排除）クロマトグラフィーによって、これらの グルコースオリゴ糖を単離することができる。かくして、前記と同様に約１１０ ℃で６時間、減圧下、テトラメチレン−スルホン（７ml）中で１,２,３,４−テ トラ−Ｏ−アセチルグルコース（１５.０g、４３mmol）および塩化亜鉛（１.５g ）の完全撹拌混合物を加熱した後に、アセチル化グルコースオリゴ糖の混合物を 得た。該反応マスをジクロロメタンに溶解させ、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウ ムで乾燥させた。減圧下、ジクロロメタンを除去し、生成物を計量し、イソプロ パノール（２０ml）およびメタノール（６０ml）に溶解させ、次いで、メタノー ル中１Ｍナトリウムメトキシド（９ml）を添加し、該混合物を室温で１時間放置 した。得られた沈殿物を濾去し、メタノール（３０ml）で２回洗浄した。この混 合物の一部（７.６g）を水（１０ml）に溶解させ、ファイン用Ｐ２サイズ排除ゲ ル（バイオラッド（ＢioＲad））を充填した５×９０cmウォータージャケット付 クロマトグラフィーカラムに添加した。該カラムには、使用前２日間、充填し、 予 備加熱し、６０℃で流した。グルコースオリゴ糖の混合物の添加後、カラムを６ ０℃で維持し、水（１ml／分）で溶離した。カラムから溶離する生成物を、示差 屈折計によりピークと同定し、したがって、フラクションを回収した。この方法 で、１０個の別々のピーク下面積に対応するフラクションを回収した。これらの フラクションの各々を、６０℃の同一Ｐ２ゲルカラムで再クロマトグラフィーに 付し、流速０.５ml／分で水で溶離した。かくして、例えば、グルコペンタオー ス（０.５９g）に対応すると同定されたフラクションを再クロマトグラフィーに 付して、いずれかの側に１つの肩を有する主要中心ピークを得た。中心ピークに おいて溶離する生成物を、減圧下で水を除去して物質（０.５g）を得、これを流 速０.３ml／分で６０℃の同一Ｐ２ゲルカラムで再度再クロマトグラフィーに付 すことによって、単離した。この方法で、前記４ｃと同一のグルコペンタオース （０.２g）を得た。同様の方法で、前記４ａ、４ｂ、４ｄおよび４ｅと同一のグ ルコトリオース、グルコテトラオース、グルコヘキサオースおよびグルコヘプタ オースを単離した。 実施例３ 実施例１および２に記載の方法にしたがって、ガラクトース、アルトース、タ ロース、グロース、イドースおよびアロースを含む他のヘキソースのオリゴ糖を 得ることができる。 例えば、ガラクトースのオリゴ糖を得た。１,２,３,４−テトラ−Ｏ−アセチ ルガラクトース（２１.０g）および塩化亜鉛（２.１g）をテトラメチレン−スル ホン（1０ml）中で完全に混合物し、この混合物を、約９０℃で１７時間、撹拌 しつつ減圧下で加熱した；この時、該反応マスは、固まり、蒸気（酢酸）発生が 止んだ。反応時間の間、反応容器と真空源との間にソーダ石灰管を配置した。該 反応混合物を冷却し、次いで、該反応マスをジクロロメタンに溶解させ、水で洗 浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下、ジクロロメタンを除去し、生 成物を計量し、イソプロパノール（３０ml）およびメタノール（７０ml）に溶解 させ、次いで、メタノール中１Ｍナトリウムメトキシド（１０ml）を添加し、該 混合物を室温で１時間放置した。得られた沈殿物を濾去し、メタノール（３０ml ） で２回洗浄した。この混合物を、前記実施例１および２におけるマンノースおよ びグルコースポリマーについてと同様にゲル濾過クロマトグラフィーに付すこと によって単離した。カラムから溶離する生成物を、示差屈折計によりピークと同 定し、したがって、フラクションを回収した。この方法で８つのフラクションを 回収した。これらのフラクションのうち７つを、６０℃の同一Ｐ２ゲルカラムで ２回再クロマトグラフィーに付し、最初の操作の間は流速０.５ml／分で、次の 操作では０.３ml／分で水で溶離した。この方法で、以下のガラクトースオリゴ 糖を得た：ガラクトトリオース，１.０３g，５.３％；ガラクトテトラオース， １.１５g，６.０％；ガラクトペンタオース，１.２１g，６.３％；ガラクトヘキ サオース，４.２６g，２２.１％；ガラクトヘプタオース，２.１g，１１％；ガ ラクトオクタオース，１.９１g，９.９％およびガラクトノナオース，０.０８g ，０.４％。 実施例４ ８０℃の新しく蒸留したＤＭＦ（１ml）中の三酸化硫黄−ピリジン複合体（０ .８g）（アルドリッチ(Ａldrich)）の溶液に乾燥ピリジン（３ml）中のマンノペ ンタオース（２ｃ）（０.１g）の溶液を滴下し、全体を８０℃でさらに９０分間 加熱した。上清を加温しつつデカントし、粘性のある残留物をメタノール（２ml ）で３回完全に洗浄した。残存メタノールをデカントした後、該生成物を水（５ ml）に溶解させ、強く撹拌しつつ酢酸バリウム（水２ml中約０.４g）で中和した （ｐＨ〜６に）。遠心分離（３,０００×ｇ）した後、上層の液体をデカントし 、保留し、沈殿した硫酸バリウムペレットを水（３×１０ml）で完全に洗浄した 。保留した上層の液体および洗液を合わせ、ダウエックス（ＤＯＷＥＸ）５０Ｗ −Ｘ８−４００陽イオン交換樹脂（Ｈ⁺形）のカラム（１.０×１４cm）に入れた 。該カラムを、溶出液が中性になるまで水で溶離した。溶出液（〜５０ml）を撹 拌し、酢酸ナトリウム（０.７g）で中和した（pＨ〜７に）。該溶液をアセトン （２００ml）で希釈し、遠心分離（１,７５０×ｇ）して、生成物を分離した。 該ペレットを、メタノール下で破砕することによって微細に粉砕し、次いで、メ タノール下のまま撹拌し、次いで、濾去した。固体をメタノールで数回洗浄して 、 純粋な（無機塩遊離）化合物（０.２g；６６％）を得た。該生成物は、バリウム イオン（微量分析およびフレームイオン化による）および窒素（微量分析）を付 随しなかった。 硫酸化マンノペンタオース生成物は、硫酸化される可能な１７個の位置のうち １１個を有することが判明した。測定値：Ｃ,１４.１；Ｈ,５.２；Ｓ,１３.８； Ｎa,７.２％。Ｃ₃₀Ｈ₆₀Ｏ₅₉Ｓ₁₁Ｎa₈.３６Ｈ₂Ｏの理論値：Ｃ,１４.１；Ｈ,５. ２；Ｓ,１３.８；Ｎa,７.２％。窒素およびバリウムの値は、測定値０％および 理論値０％であった。 実施例５ 乾燥窒素雰囲気下、乾燥ＤＭＦ（５ml）中の三酸化硫黄−ピリジン複合体（ア ルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Ａldrich Ｃhemical Ｃompany)）（４g）の 混合物に乾燥ピリジン（１０ml）を添加した。この混合物を５０℃に加温し、迅 速に撹拌しつつ、前記実施例２に記載の方法によって単離されたグルコヘキサオ ース（４ｄ）（０.５g）を一度に添加した。さらにピリジン（５m）を添加し、 次いで、該混合物を、８０℃で９０分間、連続撹拌しつつ加熱した。次いで、該 反応混合物を４℃で一晩維持した。反応容器から液体をデカントし、メタノール （３ml）を添加し、半固体マスを粉砕し、メタノールと完全に混合した。沈殿後 、該メタノールをデカントし、この方法を繰り返した。残存する固体に水（５ml ）を添加し、得られた溶液を５０mlの試験管に入れた。反応容器をさらに水（５ ml）で濯ぎ、第１溶液と合わせ。得られた溶液を４０％ＮaＯＨでpＨ約７−８に 調節し、次いで、メタノール（４０ml）を添加した。得られた濁った溶液を２５ 分間遠心分離し（３,０００×ｇ）、透明溶液を沈殿物からデカントした。残存 する固体を水（１０ml）に再度溶解させ、メタノール（４０ml）を添加し、該試 験管を前のとおり遠心分離した。透明な上層溶液をデカントした後、固体を水（ １０ml）に溶解させ、Ｐ２ゲル脱塩カラム（２.５cm×２５０cm；ファイン用Ｐ ２ゲル−バイオラッド（ＢioＲad））を通して流して、予想される１,６−グル コヘキサオースの硫酸化誘導体のナトリウム塩を得た。 実施例６ ヘキソースホモポリマーの合成は、実施例１、２および３に記載されているが 、通常、ほとんどのオリゴ糖構造を合成するのは非常に困難である。かくして、 より簡単なアプローチは、天然原料から所定の構造のオリゴ糖を硫酸化すること である。この実施例で用いた天然生成物オリゴ糖は、２つのクラスのものであっ た。第１のクラスは、さらなる分解および分別を必要としないオリゴ糖を含有し ていた。このクラスの例としては、マルトース、ラフィノースおよびスタキオー スが挙げられる。第２のクラスは、酵素的または化学的に一部分解され、サイズ 分別された天然多糖から得られたオリゴ糖からなっていた。このクラスの例とし ては、酵母ピキア・ホルスティ（Ｐichia holstii）由来のアミロース−、コン ドロイトン−およびデキストラン−誘導オリゴ糖ならびにマンノペンタオースリ ン酸が挙げられる。 マルトース、ラフィノースおよびスタキオースは、ミズーリ州セント・ルイス のシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓigma Ｃhemical Ｃo）から購入した。マル トトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース およびマルトヘプタオースは、日本国東京のセイカガク（Ｓeikagaku）から入手 し、α１−４結合グルコースホモポリマー、アミロースの制限されたアミラーゼ 消化物から精製されたオリゴ糖を表す。コンドロイチン四糖、六糖および八糖は 、従前の開示（32）に従ってコンドロイチン−６−硫酸のウシ睾丸ヒアルロニダ ーゼ消化物のゲル濾過分別によって精製した。シクロヘキサー、ヘプターおよび オクターアミローズは、シグマ（Ｓigma）から入手した。これらのオリゴ糖は、 実施例５に記載したと同様に硫酸化してもよい。 例えば、以下の方法でマルトヘキサオース硫酸を製造した。８０℃の新しく蒸 留したＤＭＦ（５ml）中の三酸化硫黄−ピリジン複合体（４.０g）（アルドリッ チ）の溶液に乾燥ピリジン（１５ml）中のマルトヘキサオース（０.５g）の溶液 を滴下し、全体を８０℃でさらに９０分間加熱した。上清を加温しつつデカント し、粘性のある残留物をメタノール（１０ml）で３回完全に洗浄した。残存メタ ノールをデカントした後、該生成物を水（１５ml）に溶解させ、強く撹拌しつつ 酢酸バリウム（水１０ml中約２.０g）で中和した（pＨ〜６に）。遠心分離（３, ０００×ｇ）した後、上層の液体をデカントし、保留し、沈殿した硫酸バリウム ペレットを水（３×１０ml）で完全に洗浄した。保留した上層の液体および洗液 を合わせ、ダウエックス（ＤＯＷＥＸ）５０Ｗ−Ｘ８−４００陽イオン交換樹脂 （Ｈ⁺形）のカラム（２.５×１４cm）に入れた。該カラムを、溶出液が中性にな るまで水で溶離した。溶出液（〜２５０ml）を撹拌し、酢酸ナトリウム（３.５g ）で中和した（pＨ〜７に）。該溶液をアセトン（１Ｌ）で希釈し、遠心分離（ １,７５０×ｇ）して、生成物を分離した。該ペレットを、メタノール下で破砕 することによって微細に粉砕し、次いで、メタノール下のまま撹拌し、次いで、 濾去した。濾液をメタノールで数回洗浄して、純粋な（無機塩遊離）化合物（０ .８８g；５５％）を得た。該生成物は、バリウムイオン（微量分析およびフレー ムイオン化による）および窒素（微量分析）を付随しなかった。 この生成物は、硫酸化される可能な２０個の位置のうち１４個を有することが 判明した。測定値：Ｃ,１３.９；Ｈ,２.２；Ｓ,１４.３；Ｎa,６.７％。 Ｃ₃₆Ｈ₇₁Ｏ₇₃Ｓ₁₄Ｎa₉.４５Ｈ₂Ｏの理論値：Ｃ,１３.８；Ｈ,５.１；Ｓ,１４.３ ；Ｎa,６.６％。窒素およびバリウムの値は、各々、測定値０.３２％および０％ ならびにいずれの理論値も０％であった。 ¹Ｈ ＮＭＲデータ（３００ＭＨＺ−ジェミニ（Ｇemini）３００；ＴＭＳから 下部のアセチン２.２５ppmから参照した）；前記マルトヘキサオース硫酸につい て、可能な２０個の位置のうち１４個が硫酸化されたことを示した。これは、４ .１５ppm付近に集中した水素の化学シフト（２０時間の総和を示す）対４.４ppm 付近に集中した水素の化学シフト（１６時間の総和を示す））から決定した。主 要なＯＨ基のすべて、すなわち、６位のものは、これが最小に立体的妨害される 位置であるので、硫酸化されるであろうと仮定することができる。さらに、内部 糖残基において、唯一の他の位置が硫酸化されるであろうと仮定される。６位の ものに加えて、末端の糖残基は、各々、硫酸化される２つの他の位置を有するで あろう。 二倍体酵母ピキア・ホルスティ（以前はハンゼヌラ・ホルスティ（Ｈansenula holstii）であった株ＮＲＲＬ Ｙ−２４４８）によって生産されたエキソ多糖か らマンノペンタオースリン酸を製造した。ピキア・ホルスティの増殖およびマン ノペンタオースリン酸の単離の方法は、従前に開示されたもの（33，34）に基づ いた。すなわち、エタノール沈殿法によって、好気性増殖酵母培養液上清から粗 製エキソ多糖をカリウム塩として単離した。次いで、酸性加水分解法を用いて、 エキソ多糖のホスホマンナンモノエステル核（ＰＰＭＥ）からマンノペンタオー スリン酸を遊離した。次いで、ＰＰＭＥおよびマンノペンタオースリン酸を、示 差エタノール沈殿法により、次いで、ゲル濾過により、バリウム塩としてお互い に分離した。該オリゴ糖は、Ｐ−６−Ｍan−α−(１→３)−Ｍan−α−(１→３) −Ｍan−α−(１→３)−Ｍan−α−(１→２)Ｍanの構造を有する（34）。 以下の方法で、酵母のエキソ多糖から単離した酵母マンノペンタオースリン酸 の硫酸化（33，34）を製造した。ＤＭＦ（２ml）およびピリジン（３ml）中の酵 母マンノペンタオースリン酸（０.０９g）の懸濁液をＤＭＦ（１ml）中の三酸化 流黄−ピリジン複合体（０.８g）（アルドリッチ）の溶液に添加した。該混合物 を８０℃で２時間加熱した。上清を加温しつつデカントし、粘性のある残留物を メタノール（２ml）で３回完全に洗浄した。残存メタノールをデカントした後、 該生成物を水（５ml）に溶解させ、強く撹拌しつつ、酢酸バリウム（水５ml中約 ０.７g）で中和した（pＨ６に）。遠心分離（３,０００×ｇ）後、上層の液体を デカントし、沈殿した硫酸バリウムペレットを水（３×１０ml）で完全に洗浄し た。上層の液体および洗液を合わせ、ダウエックス（ＤＯＷＥＸ）５０Ｗ−Ｘ８ −４００陽イオン交換樹脂（Ｈ⁺形）のカラム（２.５×１４cm）に入れた。該カ ラムを、溶出液が中性になるまで水で溶離した。溶出液（約５０ml）を撹拌し、 酢酸ナトリウム（約０.４g）で中和した（pＨ７に）。該溶液をアセトン（１５ ０ml）で希釈し、遠心分離（１,７５０×ｇ）して、生成物を分離した。ペレッ トをメタノール下で粉砕することによって微細に粉砕し、メタノール下のまま撹 拌し、次いで、濾去した。固体をメタノールで数回洗浄して、硫酸化酵母マンノ ペンタオースリン酸（０.１８g）を得た。該生成物は、バリウムイオン（微量分 析およびフレームイオン化によって決定した）および窒素（微量分析）を付随し ていなかった。 この生成物は、硫酸化される可能な１６個の位置のうち１０個を有することが 判明した。測定値：Ｃ,１５.３５；Ｈ,２.７；Ｐ,１.２；Ｓ,１３.７；Ｎa,８. ５％；Ｃ₃₀Ｈ₄₁Ｏ₅₉ＰＳ₁₀Ｎa_9.２５Ｈ₂Ｏの理論値：Ｃ,１５.３；Ｈ,３.５；Ｐ １.３；Ｓ,１３.６；Ｎa,８.８％。窒素およびバリウムの値は、各々、０.１６ ％および０％であり、各理論値は０％であった。 デキストラン（平均ＭＷ７１,０００；シグマ・ケミカル・カンパニー）の産 生加水分解によって、１,６−α−グルコースオリゴ糖を製造した。かくして、 デキストラン（５g）を蒸留水（１００ml）に溶解させ、この溶液を１Ｍ塩酸でp Ｈ１.８に調節した。該混合物を４８時間還流した（１００℃）。該混合物を減 圧下で乾燥させ、蒸留水で１００mlに調製し、減圧下、再度乾燥させた。残留物 に無水エタノール（１００ml）を添加し、減圧下、留去した。残留物を蒸留水で ４mlに調製し、ファイン用Ｐ２サイズ排除ゲル（バイオラッド）を充填した５× ９０cmウォータージャケット付クロマトグラフィーカラムに添加した。該カラム は、使用前２日間、充填し、予備加熱し、６０℃で流した。１,６−α−グルコ ースオリゴ糖の混合物の添加後、該カラムを６０℃に維持し、水（１ml／分）で 溶離した。カラムから溶出する生成物を、示差屈折計によってピークと同定し、 したがって、フラクションを回収した。この方法で、別々のピーク下面積に対応 するフラクションを回収した。これらのフラクションの各々を６０℃の同一Ｐ２ ゲルカラムで再クロマトグラフィーに付し、流速０.５ml／分で水で溶離した。 かくして、例えば、１,６−α−グルコヘキサオース（０.１９g）に対応すると 同定されたフラクションを再クロマトグラフィーに付して、いずれかの側に１つ の肩を有する主要中心ピークを得た。中心ピークにおいて溶出する生成物を、減 圧下で水を除去して物質（０.５g）を得、これを流速０.３ml／分で６０℃の同 一Ｐ２ゲルカラムで再度再クロマトグラフィーに付すことによって、単離した。 この方法で、グルコヘキサオース（０.１４g）を得た（エレクトロスプレイＭ⁺ ＝９９０）。同様の方法で、１,６−α−グルコトリオース、１,６−α−グルコ テトラオース（０.２１g）および１,６−α−グルコペンタオース（０.１７g） を単離した。 実施例７ Ａ．物質および方法 硫酸化オリゴ糖の抗凝固活性 従前に開示された（35）と同様に、トロンビン時間法および活性化部分トロン ボプラスチン時間法の療法を用いて、各硫酸化オリゴ糖の抗凝固活性を評価した 。各調製物の活性を、ヘパリン対照と比較し、抗凝固活性は、ヘパリン活性のパ ーセンテージで表した。 ヒト脈管形成アッセイ 用いたアッセイ法は、国際特許出願番号PCT/AU95/00105に開示されている（そ の記載内容は、引用して本明細書の記載とする）。生後６時間以内のヒト胎盤の 表面から直径約１〜２mmおよび長さ２〜５cmの血管を切除した。該血管を２.５m g／mlのフンギゾンを含有するハンクスＢＳＳ中に置き、微細な切開用鉗子およ び虹彩切除用鋏を用いて、１〜２mmの長さの断片に切断した。血管の切開および 分断は、拡大鏡ランプ（オーストラリア、ニューサウスウェールズ、バルメイン 、ニューバウンドのマギーランプ（Ｍaggylamp））の助けを借りて行った。細静 脈および動脈由来の血管から同様の脈管形成応答が得られたが、各アッセイにつ いて、１つの血管のみからの血管断片を用いた。 脈管形成アッセイを２４または４８ウエル培養プレート（マサチューセッツ州 ケンブリッジのコスター（Ｃostar））中で行った。２４ウエルフォーマットに おいて、各ウエルにウシトロンビン（０.１５Ｍ ＮaＣl中５０ＮＩＨ単位／ml； ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー）３０μlを添加し、 次いで、培地１９９中３mg／mlのウシフィブリノーゲン（シグマ）を１.０ml／ ウエルで添加した。トロンビンおよびフィブリノーゲンを迅速に混合し、凝血形 成前に１つの血管断片を素早くウエルの中央に置いた。通常、３０秒以内にフィ ブリンゲル形成が生じ、血管断片をゲル中に浮遊したままにした。ゲル形成後、 ２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ε−アミノカプロン酸０.２mg、Ｌ−グルタミ ンおよび抗生物質（ゲンタマイシンおよびフンガゾン）で補足した培地１９９を １.０ml／ウエルで添加した。４８ウエルフォーマットにおいては、全ての試薬 容量を半分にした。培地を２週間毎に替えつつ、１４〜２１日間、増湿環境中、 ３７℃で血管を培養した。脈管形成を、倒立顕微鏡（日本国東京のオリンパス（ Ｏlympus））に設置したダイカム（Ｄycam）デジタルカメラで得られた培養物の デジタル画像の、ＮＩＨイメージソフトウエアを用いて、コンピューターによる 画像分析によって定量化した。 ヘパラナーゼアッセイ ヘパラナーゼアッセイは、血清タンパク質であるヒスチジンリッチ糖タンパク 質（ＨＲＧ）がヘパラン硫酸鎖に結合し、ヘパラナーゼ切断部位を遮蔽するとい う観察結果に基づく。ヘパラナーゼ切断ヘパラン硫酸がＨＲＧに結合しないとい う発見に基づいて、³Ｈ標識ヘパラン硫酸鎖をヘパラナーゼで消化し、消化され たヘパラン硫酸をビーズに結合したＨＲＧに結合させ、未結合³Ｈ標識を測定す ることを含むヘパラナーゼアッセイが開発された。基質の消化が増大するにした がって、ＨＲＧビーズに結合しない³Ｈ標識の量も増加する。かくして、この方 法は、組織抽出物中のヘパラナーゼ活性を測定し、種々の化合物によるヘパラナ ーゼ阻害を評価するための簡単かつ迅速な方法である。 まず、ウシ睾丸ヘパラン硫酸（Ｍr平均３２kＤa）をヒドラジン水和物（36） 中で加熱することによって部分的に脱Ｎ−アセチルし、³Ｈ−無水酢酸で再アセ チル化した。Rylattら（1981）（37）の方法によって精製したニワトリＨＲＧを 製造者の指示に従ってＣＮＢr活性化セファロース（Ｓepharose）４Ｂ（ファル マシア（Ｐharmacia））に結合させた。 精製したヒト血小板ヘパラナーゼ（非常に転移性のある培養ヒト癌ＨＣＴ １ １６、ラット腺癌１３７６２ ＭＡＴおよびマウス黒色腫Ｂ１６セルライン中に 存在するヘパラナーゼ活性とヘパラン硫酸に対して同一活性を有することを示し た）を６０ピコモルの³Ｈ−放射性標識ウシ睾丸ヘパラン硫酸と一緒にインキュ ベートすることによって（３７℃、３０分）、ヒト血小板ヘパラナーゼ活性を決 定した。活性は、大きな切断されない基質および部分的に切断された基質を保持 したＨＲＧ−セファロースミニカラム（ビーズを充填した２００μl）を介して インキュベーション混合物（１００μl）が通過した後に結合しなかった小さな （約５kＤa）ヘパラン硫酸断片の生産率によって決定した。 ヘパラナーゼ−阻害アッセイでは、放射性標識基質の添加前に酵素に種々の濃 度の阻害剤を添加した。該阻害剤は、インキュベーション期間の間、反応混合物 中に保持されている。 転移アッセイ 種々の硫酸化オリゴ糖の抗転移活性は、非常に転移性のあるラット乳腺癌１３ ７６２ ＭＡＴ（35）を用いて評価した。腫瘍細胞は、従前に開示された（35） と同様にイン・ビトロで維持した。雌性フィッシャー（Ｆisher）３４４ラット （１０〜１３週齢）に１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地０.６ml中 の２×１０⁵個の１３７６２ＭＡＴ細胞を静脈内注射した。腫瘍細胞注射時に、 動物に硫酸化オリゴ糖２mgも注射し、オリゴ糖を静脈内、腹腔内または皮下注射 した場合に同様の結果が得られた。腫瘍細胞注射後１３日目にラットから肺を取 り出し、少なくとも２４時間、ブアン（Ｂouin）溶液中に置き、次いで、切開用 顕微鏡下で肺転移を評価した。硫酸化オリゴ糖処置ラットにおける肺転移の数を 、対照動物において観察されたものと比較した。ここで、４匹の動物の最小値が 各グループに含まれる。 ＦＧＦ−ヘパリン／ヘパラン硫酸化相互作用に対する硫酸化オリゴ糖の効果 ほかに詳細に開示されている（38）結合アッセイを用いて、ａＦＧＦおよびｂ ＦＧＦのヘパリンへの結合を測定し、種々の硫酸化オリゴ糖のこの相互作用を阻 害する能力を評価した。すなわち、ＦＧＦを９６ウエルＰＶＰプレートのウエル 中に固定化し、放射性標識ヘパリンの固定されたＦＧＦへの結合を評価した。阻 害アッセイでは、硫酸化オリゴ糖の段階希釈を、それらのＦＧＦ−ヘパリン相互 作用を阻害する能力について試験した。阻害結果は、２０％または５０％による 固定したＦＧＦへのヘパリン結合を阻害するのに必要とされる硫酸化オリゴ糖の 濃度として表した。非標識ヘパリンは、全ての結合阻害試験において対照として 含んだ。 ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３線維芽細胞のＰＶＣ固定化ＦＧＦへの結合を測定するこ とによって、以前に報告されたように（39）、ＦＧＦ−ヘパラン硫酸相互作用を 評価した。細胞結合は、付着細胞のローズ・ベンガル染色によって検出した。硫 酸化オリゴ糖を、全体としてＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３細胞の表面のヘパラン硫酸構 造に依存する（39）、それらのこの細胞付着プロセスを阻害する能力について試 験した。データは、５０％による細胞付着を阻害した硫酸化オリゴ糖の濃度（Ｉ Ｃ５０）として表した。 気嚢（air pouch）炎症モデル 該アッセイは、従前に報告された方法（40）に基づく。１日目に麻酔したマウ スの肩甲骨の間の剃毛領域の皮膚の下に無菌空気５mlを注入することによって、 マウスの背中に皮下気嚢を形成した。３日目に、該気嚢を空気２.５mlの注入に よって再度膨張させた。５６mg／mlのチオグリコラート１.０mlまたは対照とし て生理食塩水１.０mlを気嚢中に直接注入することによって、６日目に炎症を誘 発した。チオグリコラート注入の約１７−２０時間後、動物を頸部脱臼により殺 し、気嚢の細胞性内容物を氷冷ＰＢＳ／５％ＦＣＳ ２.５mlの注射によって回収 した。硫酸化オリゴ糖を、チオグリコラートの投与直後に離れた部位において皮 下注射（ＰＢＳ中５０μl）することによって、それらの炎症反応を阻害する能 力について試験した。対照抗炎症薬としてプレドニゾロンを用い、２５mg／kgで 油中で皮下注射した。各気嚢の全細胞性内容物を、コールターカウンターを用い て決定し、免疫蛍光フローサイトメトリーによって種々の白血球サブポピュレー ションを評価した。 マウス喘息モデル 従前に報告されたマウスの喘息モデル（41）を用いて、硫酸化オリゴ糖の、肺 へのアエロアレルギン（オバルブミン、ＯＶＡ）誘発好酸球浸潤を阻害する能力 を試験した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６−１０週齢）を、０日目および１２日 目に０.９％無菌生理食塩水中のＯＶＡ ５０mg／アルヒドロゲル（Ａlhydrogel ）（オーストラリア、パークヴィルのシーエスエル・リミテッド（ＣＳＬ Ｌtd ））１mgを腹腔内注射することによって感作し、該マウスを０.９％生理食塩水 中のＯＶＡ（１０mg／ml）のエアロゾルに３０分間３回（１時間毎）暴露し、次 いで、 ２６日目および２８日目に同様の抗原投与に暴露した。エアロゾルは、密閉した チャンバー８００cm³中に、平均粒径３９μmを生成するネブライザーによって６ リッル／分で生じさせた。２９日目に、マウスを頸部脱臼によって殺した。気管 にカニューレ挿入し、気道管腔を、３７℃のＢＳＡ（０.１％wt／vol）を含有す る０.９％生理食塩水１mlで４回洗浄した。滴下した流体約０.８mlを洗浄毎に回 収した。１匹の動物から得られた気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）をプールし、標 準的な血球計算板を用いて細胞数を決定した。ＢＡＬＦ細胞を細胞遠心分離にか け、メイ−ギュルンワルド−ギムザ（Ｍay-Ｇrunwald−Ｇiemsa）溶液で別々に 染色し、好酸球を形態学的基準を用いて同定した。データは、ＢＡＬＦのml当た りの好酸球の数として算出した。硫酸化オリゴ糖を動物に、腹腔内に挿入したア ルツェット（Ａlzet）ミニ浸透圧ポンプ（miniosmotic pump）によるかまたはエ アロゾルとして肺を介して全身に投与した。２３日目にＯＶＡ抗原投与の２４時 間前にミニ浸透圧ポンプを挿入し、２９日目に動物を殺すまで、薬物を断続的に 送達した。エアロゾルデリバリーの場合、２３日目、２５日目および２７日目に 、マウスを、０.９％生理食塩水中硫酸化オリゴ糖のエアロゾルに３０分間３回 （１時間毎）暴露した。 実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデル 従前に開示された（43）と同様に、ＥＡＥの養子転移のために脾臓細胞を調製 した。すなわち、ルイス（Ｌewis）ラットをミエリン塩基性タンパク質に感作さ せ、免疫脾臓細胞をイン・ビトロでＣonＡにより活性化し、３０×１０⁶個のＣo nＡ活性化ＥＡＥエフェクター細胞を各レシピエントに静脈内転移させる。硫酸 化オリゴ糖を収容しているミニ浸透圧ポンプ（アルツェット）を細胞転移時に皮 下移植し、１４日間７０mg／kg／日の投与量で送達させた。臨床ＥＡＥは、以下 のスキームに従って等級付けた：０、無症候性；１、尾の末梢部半分の弛緩；２ 、尾全体の弛緩；３、運動失調、直立の困難さ；４、後ろ足の虚弱；および５、 後ろ足の麻痺。 炎症性大腸疾患モデル スウェーデン、ウプサラのティディビー・コンサルタンシー（ＴｄＢ Ｃonsultancy）によって供給された５％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム （ＤＳＳ）で飲料水を補足することによって、マウスにおいて炎症性大腸疾患を 誘発した。該溶液をpＨ８.０に調節し、０.４５μ中膜を介して濾過した。ＤＳ Ｓ溶液を毎日回収し、再濾過し、新しいＤＳＳ保存液で容量を調節した。６−７ 週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを体重によってふるい分けし、２０−２３gのマ ウスをマウス５匹／カゴでカゴの中にグループ分けした。 ０日目から１０日目まで８時間おきにマウスに硫酸化マンノペンタオースリン 酸（２０mg／kg／日）またはビヒクル（無菌水）を注射した。注射容量は、１０ ０μlに標準化し、首筋に皮下注射した。 全てのマウスについてＤＳＳ消費率、体重および症候を毎日評価した。下痢お よび直腸出血症候は、軽微または著しいと評価し、各々、１および４の数値を与 えた。粘液の存在も記され、軽微な下痢スコアとして含まれる。次いで、下痢お よび直腸出血スコアをその日のそのグループにおける生存動物数で割る。総スコ アは、下痢および直腸出血の両方のスコアの合計である。 Ｂ．結果 硫酸化天然オリゴ糖の抗脈管形成活性および抗転移活性 硫酸化天然オリゴ糖を合成するやいなや、それらを生物学的アッセイにおいて 試験した。表１には、１２個の天然オリゴ糖の硫酸化形について得られた結果を まとめる。スラミン（適度な抗脈管形成活性およびヘパラナーゼ阻害活性を有す る化合物）（42）およびヘパリンの生物学的活性もまた、比較のために表１に含 ませた。 まず、全ての試験された硫酸化オリゴ糖は、ごくわずかな抗凝固活性、すなわ ち、ヘパリンの活性＜２％を有した（表１）。これは、有効な抗転移化合物であ るヘパリンの重要な特性であり、その有効な抗凝固活性のためにこの適応症につ いて制限された臨床的利用性を有する。 硫酸化天然オリゴ糖のうちの３つは、ヒト脈管形成の有効な阻害剤であった； すなわち、硫酸化マンノペンタオースリン酸（ピキア・ホルスティ由来）、マル トテトラオース硫酸およびマルトヘキサオース硫酸。マンノペンタオースリン酸 およびマルトヘキサオースは、２μg／mlの５０％阻害濃度を有するこれらの化 合物のうち最も有効であり、一方、マルトテトラオースは、２０μg／mlで５０ ％阻害を与えた。２０μg／mlのマルトヘキサオース硫酸によって誘発された明 白な脈管形成阻害の例を図１に示す。ヘパリンがあまり抗脈管形成活性を有しな いことに注目するのは、関心のあることである。かくして、同様に、比較的短い 鎖長の硫酸化オリゴ糖がこのタイプの活性のために必要とされることは、明らか なことである。マルトースシリーズによる脈管形成阻害のより完全な滴定を図２ に示し、図３において硫酸化マンノペンタオースリン酸によるものを示す。マル トースシリーズについて、マルトース硫酸化はあまり阻害活性を有しなかったが 、マルトテトラオースおよびマルトヘキサオース硫酸は非常に有効な阻害剤であ ったことを示すことができる（図２）。 表１に示される脈管形成実験の全ては、脈管形成アッセイの開始時の培養培地 へのオリゴ糖の添加を含んだ。しかしながら、予備研究（データは、示さない） は、マルトヘキサオース硫酸の添加は、脈管形成応答の開始後、さらに血管生長 を阻害することもできるが、該化合物が培養開始時に添加される場合に最も有効 な阻害が生じることを示す。 硫酸化オリゴ糖は、それらのヘパラナーゼ阻害活性において著しく異なり、最 も有効な阻害剤は、硫酸化マンノペンタオースリン酸およびマンノヘキサオース 硫酸であり、これら２つの化合物の活性は、ヘパリンのものに似ている。おもし ろいことには、これら２つの化合物は、有効な抗脈管形成化合物でもある。しか しながら、脈管形成阻害は、多くの化合物のヘパラナーゼ阻害活性と相互に関係 しなかった。例えば、硫酸化シクロアミロースは、非常に有効なヘパラナーゼ阻 害剤であったが、不充分な脈管形成阻害剤であった。表３は、二糖（マルトース ）から七糖（マルトヘプタオース）までの範囲の完全なマルトースシリーズにつ いてのヘパラナーゼ阻害活性を表す。マルトースは、非阻害剤であり、マルトト リオースは、弱い阻害剤であり、マルトテトラオースは、適度な阻害活性を示し たが、五糖、六糖および七糖は、高い阻害活性を示した。かくして、硫酸化五糖 またはそれ以上の糖は、至適なヘパラナーゼ阻害のために必要とされる。 硫酸化糖の多くは、抗転移活性についてイン・ビボでも試験された（表１）。 一般に、ヘパラナーゼ阻害および抗転移活性の間に適度に良好な相互関係がある 。かくして、もつとも高いヘパラナーゼ阻害活性を有する２つの化合物である硫 酸化マンノペンタオースリン酸およびマルトヘキサオース硫酸は、最も大きな抗 転移活性を示し、実際、それらは、転移を予防する能力においてヘパリンと有意 には異ならない（表１）。２つの別の化合物であるシクロオクタ−アミロース硫 酸およびスタキオース硫酸は、適度に有効な抗転移剤でもあり、特性は、それら の適度なヘパラナーゼ阻害活性と一致する。ひとまとめにして、これらのデータ は、硫酸化マンノペンタオースリン酸およびマルトヘキサオース硫酸が同時に相 当な抗脈管形成活性、抗転移活性およびヘパラナーゼ阻害活性を有することを示 唆する。 硫酸化オリゴ糖のマルトースシリーズの抗転移活性は、図４に非常に詳細に示 される。鎖長が増加するにしたがって、最も活性である五糖、六糖および七糖を 有するオリゴ糖の抗転移活性の安定な増加があった。２mg／ラットの投与量で静 脈内投与した場合、マルトース硫酸は、転移に対して全く効果がなかったが（図 ４Ａ）、４mg／ラットで皮下投与した場合、有意な転移阻害が観察された（図４ Ｂ）。次の実験では、注射の経路（すなわち、静脈内、皮下または腹腔内）に関 係なく、硫酸化オリゴ糖が比較できる抗転移活性を示したことが明らかになった （データは、示さない）。実際、マルトース硫酸の抗転移活性は、高投与量を動 物に投与した場合にのみ観察された。マルトース硫酸は、非常に弱いヘパラナー ゼ阻害剤であるので、この結果は、特に、オリゴ糖の高投与量を用いる場合、ヘ パラナーゼ阻害が、硫酸化オリゴ糖が腫瘍転移を阻害する唯一の方法ではないこ とを示唆する。 シクロアミロースは、それらが直線状オリゴ糖を表すので、硫酸化され、該研 究に含まれる。これらの化合物が適度に活性なだけであったことに注目するのは 、関心のあることであり（表１）、直線状オリゴ糖が至適な活性のために必要と されることを意味する。さらにまた、最も活性な硫酸化オリゴ糖は、抗脈管形成 化合物として現在臨床試験を受けている薬物であるスラミン（42）よりも非常に 有 効な、脈管形成、転移およびヘパラナーゼ活性の阻害剤であった（表１）。 該化合物の抗脈管形成活性は、それらのヘパラナーゼ阻害活性と常に直接相互 関係するわけではないので、硫酸化オリゴ糖は、いくつかの他のメカニズムによ り脈管形成を阻害することができると思われた。前記のとおり、いくつかの硫酸 化オリゴ糖は、成長因子−ヘパラン硫酸相互作用を中断させることによって脈管 形成成長因子の作用を乱すことができると思われる。従前の分析（国際特許出願 番号PCT/AU95/00105を参照）は、この実施例において用いたヒト脈管形成アッセ イが内因性ｂＦＧＦに非常に依存しており、ａＦＧＦおよびＶＥＧＦ作用に対し ては低かったことを示した。かくして、種々の硫酸化オリゴ糖は、ｂＦＧＦ、ａ ＦＧＦおよびＶＥＧＦのヘパリンまたはヘパラン硫酸との相互作用の競争相手と して作用する能力について試験した。 鎖長の増加にしたがって、硫酸化オリゴ糖のマルトースシリーズがｂＦＧＦお よびａＦＧＦの細胞表面ヘパラン硫酸との相互作用のより有効な阻害剤となった こと（表２）、すなわち、マルトースは弱い阻害剤であったが、五糖、六糖およ び七糖は最も活性であったことが見いだされた。硫酸化マンノペンタオースリン 酸は、この系において相当な阻害活性をも示した（表２）。硫酸化オリゴ糖のマ ルトースシリーズによるａＦＧＦ−ヘパラン硫酸相互作用の阻害についての完全 な阻害曲線は、図５に示される。さらなる研究は、マルトヘキサオース硫酸が放 射性標識ヘパリンのｂＦＧＦおよびａＦＧＦへの結合の有効な阻害剤でもあった ことを示した（データは、示さない）。 マルトヘキサオース硫酸が最も活性な抗脈管形成および抗転移化合物の１つで あったので、その生物学的活性に対する硫酸化の程度の影響を幾分詳細に試験し た。まず、最もよく硫酸化されたマルトヘキサオースについて多少の抗凝固活性 が検出された場合でさえ、この活性は、ヘパリンと比較した場合に非常に低かっ たことに注目した（表２）。しかしながら、硫酸化の増大にしたがって、マルト ヘキサオースのヘパラナーゼ活性およびヘパラン硫酸へのＦＧＦ結合を阻害する 能力の安定な増加があった（表２）。しかしながら、阻害活性は、硫酸化が８５ ％以上であった場合に両方の系おいて安定状態に達した。 転移阻害研究（図６）は、硫酸化の程度の増加にしたがって、マルトヘキサオ ース硫酸がより有効な抗転移薬となったことも示した。対照的に、非常によく硫 酸化されたマルトヘキサオース（硫酸化９０−１００％）が脈管形成のあまり有 効ではない阻害剤であったことを示唆された（図７）。これらのデータは、脈管 形成および転移を阻害するために必要とされる至適な硫酸化オリゴ糖構造に微妙 な差異があることを示唆する。それにもかかわらず、有効な抗転移活性および抗 脈管形成活性を同時に示す、天然オリゴ糖から誘導された多くの硫酸化オリゴ糖 が同定された。これらの化合物は、ピキア・ホルスティ由来の硫酸化マンノペン タオースリン酸、ならびにマルトペンタオース硫酸、マルトヘキサオース硫酸お よびマルトヘプタオース硫酸である。 硫酸化合成オリゴ糖の抗脈管形成活性および抗転移活性 実施例１〜５に記載した硫酸化合成オリゴ糖は、それらの生物学的活性につい ても試験した。表３には、マンノース、ガラクトースまたはグルコースを含有す る硫酸化合成オリゴ糖の、凝固、ヘパラナーゼ作用および成長因子−ヘパラン硫 酸結合を阻害する能力をまとめる。試験された合成硫酸化オリゴ糖の全ては、ご くわずかな抗凝固活性を示した。しかしながら、マンノースおよびグルコースの 三糖を除いては、全ての他の硫酸化オリゴ糖は、ヘパラナーゼ活性および成長因 子−ヘパラン硫酸結合の適度に有効な阻害剤であった。実際に、全体的な結論は 、４〜６個のヘキソース単位（すなわち、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトースま たはＤ−グルコース）を含有する硫酸化合成オリゴ糖これらのアッセイにおいて 非常に活性であることである。例外は、ガラクトースシリーズの他のメンバーと 実質的に同程度に活性であったガラクトトリオース硫酸である。 ヒト脈管形成アッセイにおいて試験した場合、硫酸化マンノースオリゴ糖は、 阻害性があったが、五糖および六糖は、四糖よりも活性であり（図８）、それら の効力において硫酸化マンノペンタオースリン酸と似ている。同様に、硫酸化マ ンノース四糖、五糖および六糖は、抗転移薬として硫酸化マンノペンタオースリ ン酸と同程度に有効であった（図９）。硫酸化オリゴ糖を含有するガラクトース およびグルコヘキサオース硫酸もまた転移を阻害したが（図１０）、それらは、 マンノース含有化合物よりもわずかに低い活性の傾向がある。 硫酸化オリゴ糖の抗炎症活性 前記したとおり、白血球の炎症部位への侵入に対する重要な障壁は、内皮下の 基底膜である。この膜を通過させるために、白血球は、分解酵素のバッテリーを 用いなければならない（11）。基底膜関連ヘパラン硫酸鎖を切断し、白血球管外 遊出のために必須であるエンドグリコシダーゼ、ヘパラナーゼは、特に適当なも のである（12，13）。実際に、転移阻害研究（35）についてと同様に、ヘパラナ ーゼ活性を阻害する硫酸化多糖は、炎症の有効な阻害剤である（43，44）。これ らの観察に基づいて、有効な抗脈管形成剤および抗転移剤であった硫酸化オリゴ 糖が非常に有効な抗炎症化合物であることは、当業者に予想されるであろう。マ ルトヘキサオース硫酸およびマンノペンタオース硫酸は、これに関して特に重要 なものである。さらにまた、脈管形成は、慢性関節リウマチなどの慢性炎症性疾 患に関連しているので（18）、これらの化合物の抗脈管形成活性は、炎症の治療 においてさらに価値あるものである。 この予想に味方する証拠は、いくつかの動物炎症モデルにおいて得られた。第 １に、マルトヘキサオース硫酸、マンノペンタオース硫酸および硫酸化マンノペ ンタオースリン酸は、チオグリコラート誘発気嚢炎症を有意に阻害することがで きた（表４）。実際に、一の実験では、マンノペンタオース硫酸の単回注射は、 自然においては優先的に好中球であった白血球浸潤の阻害時にプレドニゾロンと 同程度に有効であったが、マルトヘキサオース硫酸は、幾分低い有効性であった 。硫酸化オリゴ糖を６時間おいて２回等しい投与量で注射した場合に、炎症応答 の大きな阻害でさえ観察された。 第２に、硫酸化オリゴ糖は、慢性喘息のマウスモデルを阻害する能力について 試験した。このモデルは、アエロアレルゲン抗原投与によって誘発されたマウス の肺への好酸球の大量の内向きフラックスによって特徴付けられる（41）。かか る炎症応答は、ヒトにおける慢性喘息の特徴である。ミニ浸透圧ポンプを介して 投与されると、マルトヘキサオース硫酸およびマンノペンタオース硫酸は、マウ スの肺における好酸球蓄積を有意に阻害した（表５）。マルトヘキサオース硫酸 は、また、エアロゾルとして投与されると（４０mg／ml溶液）、多少の抗炎症活 性を示した。 第３に、マンノペンタオース硫酸および硫酸化マンノペンタオースリン酸は、 共に、該疾患のラットモデルにおいてＥＡＥを有意に阻害した（表６）。実際に 、硫酸化オリゴ糖で処置された数匹の動物は、病徴を発症させなかった。これら のデータは、ヘパラナーゼ活性を阻害する硫酸化多糖がＥＡＥの重篤度を減少さ せることができるということを示す初期の研究と一致する（43）。 最後に、マンノペンタオースリン酸は、マウスにおける炎症性大腸疾患を阻害 する能力について試験した。飲料水中のデキストラン硫酸によって誘発されるこ のモデルは、潰瘍性大腸炎に似ている大腸炎および低い程度のクローン病を誘発 する。２０mg／kg／日の硫酸化マンノペンタオースリン酸により、急性大腸炎の 顕著な減衰を生じ、該疾患によって生じた体重減少も予防した（表７）。この実 験における対照は、硫酸化オリゴ糖注射を受けるが、それらの飲料水中にデキス トラン硫酸を含まない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０８Ｂ 37/10 Ｃ０８Ｂ 37/10 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．オリゴ糖が一般式Ｉ： Ｒ₁−(Ｒ_x)_n−Ｒ₂ （Ｉ） ［式中、Ｒ₁およびＲ₂ならびに各Ｒ_xは、単糖単位を表し、その全ては、同一ま たは異なっており、隣接する単糖単位は、１→２、１→３、１→４および／また は１→６グリコシド結合によって結合されており、 ｎは、１〜６の整数である］ で示される硫酸化オリゴ糖。 ２．ｎが１〜４、好ましくは、３または４である請求項１記載の硫酸化オリゴ 糖。 ３．単糖単位が、フルクトース、グルコース、マンノース、アルトロース、ア ロース、タロース、ガラクトース、イドースおよびグロースからなる群から選択 されるヘキソースである請求項１または２記載の硫酸化オリゴ糖。 ４．オリゴ糖が一般式II： Ｒ_y−(Ｒ_y)_n−Ｒ_y （II） ［式中、各Ｒ_yは、同一であり、各々、単糖単位を表しており、隣接する単糖単 位は、１→３、１→４および／または１→６グリコシド結合によって結合されて おり、 ｎは、１〜６の整数である］ で示される請求項１記載の硫酸化オリゴ糖。 ５．ｎが１〜４、好ましくは、３または４である請求項４記載の硫酸化オリゴ 糖。 ６．Ｒ_yが、グルコース、マンノース、アルトロース、アロース、タロース、 ガラクトース、イドースおよびグロースからなる群から選択されるヘキソースで ある単糖単位を表す請求項４または５記載の硫酸化オリゴ糖。 ７．Ｒ_yがグルコース、マンノースまたはガラクトースを表す請求項６記載の 硫酸化オリゴ糖。 ８．オリゴ糖が天然オリゴ糖である請求項１記載の硫酸化オリゴ糖。 ９．オリゴ糖がラフィノースおよびスタキオースから選択される請求項８記載 の硫酸化オリゴ糖。 １０．オリゴ糖が天然多糖の酵素的または化学的分解によって製造される請求 項１記載の硫酸化オリゴ糖。 １１．オリゴ糖が、アミロース−、コンドロイチン−またはデキストラン−誘 導オリゴ糖である請求項１０記載の硫酸化オリゴ糖。 １２．オリゴ糖が、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサ オース、グルコトリオース、グルコテトラオース、グルコペンタオース、ならび にコンドロイチン四糖、六糖および八糖から選択される請求項１１記載の硫酸化 オリゴ糖。 １３．オリゴ糖が酵母ピキア・ホルスティ（Ｐichia holstii）由来のマンノ ペンタオースリン酸である請求項１０記載の硫酸化オリゴ糖。 １４．請求項１〜１３のいずれか１項記載の少なくとも１つの硫酸化オリゴ糖 の有効量を患者に投与することを特徴とする、治療を必要とするヒトまたは他の 温血動物患者の抗脈管形成、抗転移および／または抗炎症治療方法。 １５．温血動物（ヒトを含む）患者の治療における抗脈管形成剤、抗転移剤お よび／または抗炎症剤としての請求項１〜１３のいずれか１項記載の硫酸化オリ ゴ糖の使用。 １６．治療が、充実性腫瘍の増殖、増殖性網膜症および慢性関節リウマチに関 連する脈管形成を含む脈管形成依存性疾患の治療からなる請求項１４または１５ 記載の方法または使用。 １７．治療が、慢性関節リウマチなどの慢性炎症性疾患、多発性硬化症、イン スリン依存性真性糖尿病、潰瘍性大腸炎およびクローン炎症性大腸疾患などの疾 患、同種異系移植片拒絶反応ならびに慢性喘息を含む、ヘパラナーゼ阻害活性が 白血球浸潤を阻害する炎症性疾患および症状の治療からなる請求項１４または１ ５記載の方法または使用。 １８．請求項１〜１３のいずれか１項記載の少なくとも１つの硫酸化オリゴ糖 を医薬的および獣医学的に許容される担体または希釈剤と一緒に含有してなる、 抗脈管形成、抗転移および／または抗炎症治療のための医薬組成物または獣医学 的組成物。 １９．ヒトまたは他の温血動物患者の抗脈管形成、抗転移および／または抗炎 症治療薬の製造における請求項１〜１３のいずれか１項記載の少なくとも１つの 硫酸化オリゴ糖の使用。 ２０．一般式II： Ｒ_y−(Ｒ_y)_n−Ｒ_y （II） ［式中、各Ｒ_yは、同一であり、各々、単糖単位を表しており、隣接する単糖単 位は、１→３、１→４および／または１→６グリコシド結合によって結合されて おり、 ｎは、１〜６の整数である］ で示されるオリゴ糖。 ２１．ｎが１〜４、好ましくは、３または４である請求項２０記載のオリゴ糖 。 ２２．Ｒ_yが、グルコース、マンノース、アルトロース、アロース、タロース 、ガラクトース、イドースおよびグロースからなる群から選択されるヘキソース である単糖単位を表す請求項２０または２１記載のオリゴ糖。 ２３．Ｒ_yがグルコース、マンノースまたはガラクトースを表す請求項２２記 載のオリゴ糖。 ２４．Ｒ_yが完全にＯ−アセチル化された単糖であるか、または、Ｒ_yがアセチ ル以外のアシル基で完全にＯ−アセチル化された単糖である請求項２０記載のオ リゴ糖。