JPH10504037A - 内毒素関連疾患の予防および治療に用いられる方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 内毒素によって引き起こされる毒性の治療および予防が開示される。これは、リン脂質を含む組成物を被験者に投与することによって行なわれる。この組成物は、タンパク質およびペプチドを含まず、かつトリグリセリド、他の極性または中性の脂質、胆汁酸または胆汁酸塩を含むことができる。

Description

【発明の詳細な説明】 内毒素関連疾患の予防および治療に用いられる方法および組成物発明の分野 本発明は、内毒素に関連した内毒素血症の治療に関する。更に具体的には、本 発明は、生体由来の内毒素を中和しおよび／または除去する作用を有する各種組 成物を投与することによる中毒の治療、ならびにこれらの組成物を用いる予防に 関する。背景技術 正常な血清は、密度によって特定される多数のリポタンパク質、すなわちキロ ミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬを含んでいる。それらは、遊離および エステル化されたコレステロール、トリグリセリド、リン脂質、数種類の他の微 量指質成分およびタンパク質から構成されている。密度が極めて低いリポタンパ ク質（ＶＬＤＬ）は、トリグリセリドの形態でエネルギーを体細胞に輸送して、 保存および使用する。トリグリセリドが放出されると、ＶＬＤＬは低密度のリポ タンパク質（ＬＤＬ）に転換される。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、コレ ステロールおよび他の脂溶性物質を体内の細胞へ輸送し、高密度リポタンパク質 （ＨＤＬ）は、過剰のまたは使用できない脂溶性物質を肝臓へ輸送して除去する 。正常な状態では、これらのリポタンパク質は釣り合いがとれており、脂溶性物 質の適正な放出と除去が行なわれるようになっている。異常な状態では、ＨＤＬ が低濃度であることにより、多くの病的状態を引き起こしたり、他の物質で二次 的複合体を構成することがある。 正常な状態では、天然のＨＤＬは固形粒子であって、その表面はリン脂質単層 によって覆われ、疎水性コアが包まれている。アポリポタンパク質Ａ−Ｉおよび Ａ−IIは、その表面にそれらのアルファ螺旋ドメインの疎水性面の相互作用によ って結合している。粒子は、その初期のまたは新たに分泌された形態では、ディ スク状をしており、その二重層中に遊離コレステロールを受け入れる。コレステ ロールはレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作 用によってエステル化されて、ディスクの中央へと移動する。中央へのコレステ ロールエステルの移動は、二重層内部の空隙と溶解度とが限定されている結果で ある。ＨＤＬ粒子は、コレステロールがエステルされて中央へ移動すればするほ ど、「膨脹」して回転楕円体状粒子となる。ＨＤＬの「膨脹したコア」に集まる コレステロールと他の水不溶性の脂質とは、肝臓で浄化される。 Segrest ら，Meth．Enzymol.，128: 627-647（1986）においてAnantharamaiah は、ペプチド中のアミノ酸相互の相互作用の結果として、「螺旋ホイール」（he lical wheels）を形成する一連のペプチドを記載している。このような螺旋ホイ ールは、それらの配置に無極性面と極性面とを有している。この文献は、総体的 にペプチドはこれらの粒子においてアポタンパク質(aproproteins)を置換するこ とができることを示している。 Jonas ら，Meth．Enzym.，128A: 553-582(1986)は、ＨＤＬに類似した多種多 様の再構成粒子を製造した。この手法は、標準的方法(Hatchら，Adv．Lip．Res. ，6: 1-68(1968)；Scanu ら，Anal．Biochem.，44: 576-588(1971))によりＨＤ Ｌを単離して脱脂質化を行ない、アポ−ＨＤＬタンパク質を得ることを含んでい る。これらのアポタンパク質を分画して、界面活性剤透析を用いて、リン脂質と 、コレステロールとでまたはなしで再構成する。 Matzら，J．Biol．Chem.，257(8): 4535-4540（1982）は、ホスファチジルコ リンとアポリポタンパク質Ａ−Ｉとのミセルを記載している。これら２成分の各 種比率が記載されており、記載されている方法を用いて他のミセルを作成するこ とができることが示唆されている。また、これらのミセルを酵素基質としてまた はＨＤＬ分子のモデルとして使用することも示唆されている。しかしながら、こ の文献では、コレステロールの除去へのミセルの適用は記載されておらず、また 診断または治療上の使用については全く示唆されていない。 Williamsら，Biochem．& Biophys．Acta，875: 183-194（1986）は、血漿に導 入されるリン脂質リポソームであってアポタンパク質およびコレステロールを採 取するものを教示している。リポソームは、イン・ビボでアポタンパク質ならび にコレステロールを採取するものであることが開示されており、コレステロール の取り込みは、アポタンパク質と相互作用してこれを採取したリン脂質リポソー ムで増進されると思われる。 Williamsら，Pers．Biol．& Med.，27(3): 417-431（1984）には、コレステロ ールを除去するものとしてレシチンリポソームが記載されている。この文献には 初期の研究がまとめられており、アポタンパク質を含むリポソームはイン・ビト ロではこれを含まないリポソームより効果的に細胞からコレステロールを除去す ることが示されている。この文献には、リポソームまたはミセルを含むアポタン パク質のイン・ビボでの使用およびリポソームを用いるイン・ビボでの研究にお ける注意事項は記載されていない。 本発明の粒子と先行技術に記載のリポソームおよびミセルとの間には明確かつ 著しい差異がある点に留意することが肝要である。後者では、内部の水性コア空 隙を取り巻いている脂質を含む分子の二重層構造が関与している。リポソームの 構造では、内部空隙を脂溶性成分で満たすことは除外されているが、脂溶性成分 の分子取り込みはこれら２種類の脂質層の間に画定された空隙に限定されている 。その結果、コレステロールや他の脂溶性物質のような物質の取り込みおよび排 出に利用できる容積は本発明の粒子より著しく少なく、本発明の粒子は風船のよ うに膨脹し、特定の物質で内部空隙が満たされるのである。 内毒素ショックは、ほとんどのグラム陰性菌（例えば、Escherichia coli; Salmonella tymphimurium）の外膜からリポ多糖（ＬＰＳ）が放出されることに よって誘発される命に関わることの多い疾病である。細菌性ＬＰＳの構造はかな り詳しく解明されており、脂質Ａと呼ばれる独特な分子が脂質Ａ分子のグルコサ ミン主鎖を介してアシル鎖に結合している。これに関しては、Raetz，Ann．Rev ．Biochem.，59: 129-170（1990）を参照されたい。 脂質Ａ分子はリポ多糖構造（「ＬＰＳ」）の膜アンカーとして働き、内毒素の 発生に関与しているものはＬＰＳである。ＬＰＳ分子は、脂質Ａ型構造と多糖部 分とを特徴とする点に留意すべきである。この後者の残基は、ＬＰＳ分子が異な れば分子の細部が変化することがあるが、内毒素の一般的な構造上の特色は保持 される。ＬＰＳ分子はどの細菌でも同一であるということは妥当でないと思われ る（Raetz,上記引用を参照されたい）。当該技術分野では、様々なＬＰＳ分子を 「内毒素」と呼ぶことは普通に行なわれていることであり、この用語は以後ＬＰ Ｓ分子を集合的に表すのに用いることにする。 米国特許第５，１２８，３１８号明細書（この特許明細書の内容は、その開示 の一部として本明細書に引用される）では、ＨＤＬ関連アポリポタンパク質およ び内毒素に結合してそれを不活性化することができる脂質を両方共含んでいる再 構成粒子は、内毒素によって引き起こされる毒性を緩和するのに有効な物質とし て用いることができることが教示されている。 その内容がその開示の一部として本明細書に引用される原出願およびその原出 願では、各種の他の物質を用いて内毒素によって引き起こされる毒性を処理する ことができることが開示されていた。具体的には、再構成粒子ではアポリポタン パク質は必要でなく、また再構成粒子はペプチドと脂質とを含み、このペプチド はアポリポタンパク質ではないことが見いだされた。 本発明者らは、内毒素によって引き起こされた毒性はアポリポタンパク質また はペプチドの後に脂質を順次投与することによって処理することができることも 見いだした。逐次投与の後に、これらの成分は再構成粒子として会合し、続いて 内毒素を除去する作用を行なう。 少なくとも幾つかの個体は正常濃度より高いアポリポタンパク質(apoliprotei n)を固有の濃度として有し、アポリポタンパク質またはペプチドを含まないが開 示の脂質を含む再構成粒子を投与することによって効果的な内毒素血症の治療を 行なうことができることも見いだした。 また、これらの出願に開示されている発明には、本明細書に記載の再構成粒子 および成分を使用して、内毒素によって引き起こされる毒性の予防を必要とする 被験者に予防上有効量を投与することによって予防することも包含されている。 このような被験者としては、感染症に罹患しているまたは外科手術から回復しつ つある患者が挙げられる。これらの患者は、血漿中のＨＤＬ濃度が極めて低いこ とがあり、時には正常水準の２０％程度であることもある。これらの場合には、 ＨＤＬを用いて早期に予防して、これらの降下を補償するようにするのが極めて 望ましい。 極めて意外なことには、リン脂質を単独でまたは中性脂質、コール酸塩などの 付加物質と組合わせて有効な薬剤として用いて、内毒素血症を緩和および／また は予防することができることを見いだした。ホスファチジルコリン（以後、「Ｐ Ｃ」とする）を単独でまたはスフィンゴ脂質のような他のリン脂質と組合わせて 、アポリポタンパク質またはそれから誘導されるペプチドのようなペプチドおよ びタンパク質を本質的に含まない組成物で用いるのが特に好ましい。モノ−、ジ −およびトリグリセリドのような中性脂質は、組成物を静脈内ボーラスの形態で 用いるときに中性脂質の総量が所定の重量パーセント以下である限り、リン脂質 と組み合わせることができる。例えば、連続輸液による静脈内への投与の他の形 態に用いるときには、これらの重量パーセントはさほど決定的ではないが望まし い。 本発明の特に好ましい態様としては、胆汁酸または胆汁酸塩をリン脂質および 中世脂質と一緒に用いているエマルジョンが挙げられる。コール酸塩である胆汁 酸および胆汁酸塩の内毒素血症の治療における効果を、本明細書で示す。これら の胆汁酸は、単独で、またはホスファチジルコリンおよび／またはトリグリセリ ドのような１種類以上のリン脂質および／または中性脂質と組合わせて用いるこ とができる。 本発明を、下記の開示内容において更に詳細に説明する。図面の簡単な説明 第１図は、アポ−Ａ−Ｉ、リン脂質およびコール酸塩を含む再構成粒子の形成 法を示す。 第２図は、再構成粒子によるＬＰＳ分子の受容を示す。 第３図は、マウスモデルでの内毒素によって引き起こされた毒性の減少を検討 するのに用いた実験を示す。 第４図の分類した（labelled）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイー ルの形成を示す。Anantharamaiah，上記引用を参照されたい。 第５Ａおよび５Ｂ図は、ヒト全血モデルにおけるＴＮＦ放出を決定することに よって内毒素の中和を決定したモデルで各種の組成物を試験したときに得られる 結果を示す。第５Ａ図はタンパク質の役割を示し、第５Ｂ図はリン脂質の役割を 示す。試験した組成物としては、天然のリポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、 びにリン脂質およびタンパク質を含むエマルジョンが挙げられる。 第６Ａおよび６Ｂ図では、同じモデルでのトリグリセリド（中性脂質）、およ びリン脂質であるホスファチジルコリンの役割を比較している。 第７図は、E．coli LPS を投与したときの５５％致死モデルを用いて、マウス モデルでの各種ＰＣおよびＰＣ／ＴＧ組成物の投与に関連した毒性についての情 報を示している。 第８図は、上記引用したヒト全血分析法を、トリグリセリドの代わりにリン脂 質とエステル化されていないコレステロール、スフィンゴミエリン、または両者 の混合物とを用いて行なったものに共通するデーターを示す。 第９Ａおよび９Ｂ図は、これらの新たな図において、リン脂質、エステル化さ れていないコレステロールおよび／またはスフィンゴミエリンを中性脂質として のトリグリセリドまたはエステル化されたコレステロールと混合することを除き 第５Ａおよび５Ｂ図に示したものに共通する結果を示している。 第１０図は、イン・ビボでのマウスモデルにおけるコレステロールエステルお よびトリグリセリドを含むエマルジョンから得られる結果を比較している。 第１１図は、各種のＴＧを含む組成物を投与した後に血中に放出されるトリグ リセリドの理論量を毒性閾値と共にグラフに示したものである。「ＴＰＮ」は「 総非経口栄養」を表し、「ＲＩ」は本発明による組成物を表す。態様の詳細な説明 実施例１ S．tymphimurium 内毒素で行なったマウスの生存率を決定する目的で、検討を 行なった。異系交配した雄Swiss-Webster マウスに、塩水（２０匹のマウス）再 構成ＨＤＬ粒子（４０匹のマウス）、または再構成ペプチド１８Ａ（２０匹のマ ウス）に尾静脈から注射により投与した。注射材料の詳細は、下記の通りである 。 ａ． ＨＤＬ粒子 粒子は、Matzら，J．Biol．Chem.，257: 4535-4540（1982）および米国特許第 ５，１２８，３１８号明細書に準じて界面活性剤透析を用い、純度９５％の卵ホ スファチジルコリン（２：１重量／重量）で再構成したａｐｏ−Ｈｕ−ＨＤＬ（ ８５％−ＡＩ；１５％Ａ−IIおよびアポＣ）から調製した。上記文献および特許 明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。 ｂ． ペプチド粒子 ペプチド１８Ａは下記のアミノ酸配列を有する。 また、ペプチドの試料を、界面活性剤透析を用いてMatzら，上記引用（２：１ 重量／重量）および米国特許第５，１２８，３１８号明細書に従って重ど９５％ の卵ホスファチジルコリンと混合して再構成した。生成する粒子は、Matzおよび 特許文献のａｐｏ−ＨＤＬではなくペプチド成分が含まれていることを除き、米 国特許第５，１２８，３１８号明細書に開示されたものと同一であった。 再構成物質の投与から１５分以内に、マウスにSalmonella LPS１０ｍｇ／ｋｇ 体重を腹腔内に投与した。評価基準は、生存数であった。第３図にこれらの結果 を示しており、塩水コントロールと比較してほぼ４倍優れている。合成ペプチド は、再構成アポ−ＨＤＬを含む粒子とほぼ同程度の効果を有する。実施例２ 血漿タンパク質と血液の細胞成分との相互作用の完全性を保存しながら、ＴＮ Ｆ−αのＬＰＳによって媒介される刺激に影響を与える因子は、イン・ビトロで のヒト全血系で適当に検討することができる。このような系を用いて、リポタン パク質の成分のいずれがＬＰＳを中和するのに重要であるかを決定した。 試験を行なった材料は、再構成高密度リポタンパク質（Ｒ−ＨＤＬ）、天然の 血漿リポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＬＤＳ、ＨＤＬ）、リポタンパク質欠損血清、 グリセリドおよびリン脂質）であった。 血液をヘパリン処理したチューブに集めて、Hank′s Balanced Salt Solution （以後「ＨＢＳＳ」とする）または試験を行なう材料をＨＢＳＳに溶解したもの で希釈した。生成する材料をStarstedt チューブに移した（２５０μｌ／チュー ブ）。ＬＰＳを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むパイロジェン不含塩水に溶解し、 （２．５μｌを）最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように加えた。３７℃で４時間 インキュベーションした後、チューブを４℃まで冷却し、１０，０００×ｇで５ 分間遠心分離した。上清を集めて、市販のＥＬＩＳＡを用いてＴＮＦ−αを測定 した。 下記の第１表では、試験を行なった材料の組成を比較している。第５Ａおよび ５Ｂ図にその結果を示す。データーは、添加したタンパク質（第５Ａ図）および リン脂質（第５Ｂ図）の濃度に対してプロットした生成したＴＮＦ−αの量とし てプロットしている。対数尺度を用いて、使用した濃度を広範囲に示すようにし 、１０°を１ｍｇ／ｍｌとした。総ての全血インキュベーションはE．coli 0111 : B4 LPS１０ｎｇ／ｍｌを含んでおり、第５Ａおよび５Ｂ図のキーが示すように 、組成物の一つを補足していた。 タンパク質含量をプロットすると（第５Ａ図）、材料の効果が異なり、リン脂 質含量をプロットすると（第５Ｂ図）極めて類似していることから、リン脂質は 重要な成分であると思われる。これは、タンパク質を含まない脂質エマルジョン が天然のＨＤＬより有効であるが、Ｒ−ＨＤＬより効果が低いことによって確か められる。タンパク質は、中和には重要ではないと思われる。 実施例３ 次の段階として、様々な量の中性脂質を含むタンパク質不含脂質エマルジョン を、ヒト全血で試験した。実施例２に記載したのと同じイン・ビトロでのヒト全 血分析法を用いた。 本明細書に記載の総ての粒子は、同じプロトコールによって作成し、これはリ ン脂質、スフィンゴミエリン、またはホスファチジルコリン、トリオレインおよ び／またはエステル化されていないコレステロールエステルを混合し、クロロホ ルムに溶解して、これをフラスコに秤り取ることを含んでいた。ビタミンＥ（０ ．０２％、重量／容量）を酸化防止剤として加えた。次に、乾燥脂質フィルムを 、試料上に窒素またはアルゴンガスを吹き付けることによって調製した。次いで 、非パイロジェン塩水の一定容量をフラスコに加えた後、渦流ミキサーで混合し て総ての脂質を懸濁させた。次に、溶液を高圧ホモゲナイザーでホモゲナイズし た。ホスファチジルコリンをトリオレインと共にまたはトリオレインなしで含む 試料を、２０，０００ｐｓｉで１０回ホモゲナイザー中を循環させた。コレステ ロールを１種類以上の他の脂質と共に含む試料を、３０，０００ｐｓｉで１５〜 ２０回循環させた。ホモゲナイズした溶液を０．４５μｍシリンジ・フィルター で濾過し、濾液を使用するまで（３日以内）室温で保存した。第６Ａおよび６Ｂ 図にこれらの結果を示す。これらの検討では、ＬＰＳによって変化するＴＮＦ− α産生を添加したトリグリセリド（第６Ａ図）またはリン脂質（第６Ｂ図）の濃 度に対してプロットした。キーによって示される組成物は、（重量で）７％トリ グリセリド（「ＴＧ」）、４５％ＴＧ、８９％ＴＧ、９４％ＴＧ、Ｒ−ＨＤＬま たはＴＧを含まないリン脂質（第６Ｂ図だけに示される）を含んで ％INTRALIPIDに相当する。総ての他の試験では、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ ）およびトリオレインを用いた。 これらの結果は、タンパク質を含まない組成物は、トリグリセリド含量によっ て比較すると、非常に異なっていることを示している。それらは、リン脂質（Ｐ Ｃ）含量によって試験すると、極めて類似している。これにより、特にリン脂質 のみが有効であるが、４５％までのＴＧを含むエマルジョンより効果が低いので 、リン脂質の役割が立証される。実施例４ 次に、マウスモデルでのイン・ビボでの実験について検討を行なうが、これは ヒトでの効果を予測するための信頼性のある系として認められている。 これらの実験では、リン脂質投与量（２００ｍｇ／ｋｇまたは４００ｍｇ／ｋ ｇ）を与える十分な量の実施例３に記載の処方物並びに他のもの（純ホスファチ ジルコリン、７％ＴＧ、２５％ＴＧ、４５％ＴＧ、７１％ＴＧ、８１％ＴＧ、８ ９％ＴＧ、９４％ＴＧ）または塩水コントロールを、E．coli 0111:B4 LPS２５ ｍｇ／ｋｇと共にボーラス形態でマウスに注射した。コントロール群には、エマ ルジョンの容積に匹敵する十分な容積の生理食塩水を静脈内投与した。７２時間 後の生存数を、第７図に示す。コントロール群中の３４４匹の動物の内、１５５ 匹が生存した。 ＰＣ単独では、保護効果はあまり高くなく、９５％信頼水準では統計上有意で はなかったが、７％、４５％および７１％ＴＧ組成物では、生存数が有意に改良 された。８０％および８９％ＴＧ組成物では、効果は閾値ぎりぎりであり、９４ ％ＴＧでは生存数が減少した。 投与量を増加してＰＣ４００ｍｇ／ｋｇを供給したところ、８９％および９４ ％ＴＧエマルジョンでは生存時間が減少したが、これは上記に説明したように、 ＴＧ中毒によるものと思われる。実施例５ 実施例２〜４に記載した研究により、リン脂質は内毒素血症の抑制に有用な活 性薬剤であることが明らかになった。トリグリセリド以外の無極性脂質はＰＣ以 外の鱗翅室とエマルジョンを形成することができることから、他のものを試みる こともできると思われた。典型的な物はスフィンゴミエリン（もう一つのリン脂 質）およびエステル化されていないコレステロール（極性の中性脂質）、および これらの混合物である。従って、エステル化されたコレステロール（無極性エス テル）、スクワレン（炭化水素）、およびビタミンＥ（無極性の酸化防止剤）を 用いることもできる。一連の実験を、上記の実施例２のヒト全血分析法および実 施例４のマウス生存数分析法を用いてこれらを試験する目的で設計した。 エマルジョンは、上記と同様にして、純ホスファチジルコリン、ホスファチジ ルコリンと、１０％（重量／重量）のエステル化されていないコレステロール、 １０％（重量／重量）のスフィンゴミエリン、または両者の混合物を総量で１０ ％とを用いて調製した。エマルジョンを、ＰＣについては１００ｍｇ／ｄｌの濃 度で、ＬＰＳは１０ｎｇ／ｍｌで、全血に加えた。混合物をインキュベーション して、ＴＮＦ−αの放出を測定した。 結果を第８図に示す。ＴＮＦ−αの産生は、ＰＣ単独では実質的に減少した。 エステル化されていないコレステロール、スフィンゴミエリンまたは両者の混合 物を含むエマルジョンも、ＴＮＦ−αの放出を抑制した。実施例６ また、全血分析法を用いて、中性脂質を含むエマルジョンに対するエステル化 されていないコレステロールおよび／またはスフィンゴミエリンの効果を測定し た。再度、エマルジョンをＰＣ１００ｍｇ／ｄｌで加えた。各種組成（重量／重 量）を下表に示す。 第９Ａおよび９Ｂ図に結果を示す。中性脂質で作成したＰＣエマルジョンは、 極性脂質を加えてもまたは加えなくとも、抑制を示した。また、ＬＰＳ濃度は１ ０ｎｇ／ｍｌであり、これは内毒素の臨床的に相当する濃度である。コレステロ ールを含むエマルジョンはＴＧを含むエマルジョンより効果が低く、エステル化 されていないコレステロールを含むエマルジョンは、それを含まないエマルジョ ンと同様にＴＮＦ−αを抑制しなかった。スフィンゴミエリンをエマルジョンに 添加すると、ＴＮＦ−α産生の抑制が向上すると思われた。実施例７ コレステロールエステルを含むエマルジョンを、致死投与量の内毒素を用いて イン・ビボモデル（すなわち、実施例４で用いたもの）で試験した。エマルジョ ンはＰＣおよびＴＧ、またはＰＣおよびコレステロールエステル（ＣＥ）を用い て調製し、ＰＣ２００ｍｇ／ｋｇをE．coli 0111:B4 LPS ２５ｍｇ／ｋｇ（致死 投与量）と共に単回ボーラス投与量を提供するため尾静脈から投与した。コント ロール群には、生理食塩水をエマルジョンの容量に相当する容量で静脈内投与し た。 第１０図では、これらのデーターでＣＥおよびＴＧを含むエマルジョン空の結 果を比較する。それぞれのエマルジョンを、総数が１６以上の動物を用いて、最 低２回の実験で試験した。 図示されているように、７％または４５％ＣＥ（重量％）を含むエマルジョン では、生存数が有意に向上した。実施例６のものを用いて得たこれらの結果は、 ＣＥをＴＧの代わりに用いて内毒素を中和するエマルジョンを生成させることが できることを示している。実施例８ リン脂質とトリグリセリドとのタンパク質を含まないエマルジョンはＬＰＳで 刺激した全血においてＴＮＦ−αの産生を遮断する。理論的には、これらのエマ ルジョンは、血漿中でリン脂質の保護濃度を提供する投与量で安全に投与するこ とができれば、イン・ビボでも有効である可能性がある。本発明者らのＲ−ＨＤ Ｌを用いた前の実験では、リン脂質の最低投与量は約２００ｍｇ／ｋｇであるこ とが示唆されている。この投与量と体重の４．５％の血漿容積を用いれば、トリ グリセリド含量の増加する一連のエマルジョンを投与した後に血漿中で予想され るトリグリセリドの濃度を計算することができる。この結果を、第１１図におい て重量％ＴＧの増加と共に上向きの滑らかな線として示す。血漿ＴＧ濃度は、脂 肪の多い食事の後でも健康な成人では１０００ｍｇ／ｄｌを上回ることはほとん どない。膵臓炎は、血漿ＴＧが２０００ｍｇ／ｄｌを上回る患者で報告されてい る（Farmerら，Amer．J．Med.，54: 161-164(1973); Krause ら，Amer．J．Med. ，62: 144-149(1977); Glueck ら，J．Lab．Clin．Med.，123: 59-61）。血漿Ｔ Ｇが４０００ｍｇ／ｄｌを上回ることは極めてまれであり、重大な問題を引き起 こす。これらの２つの閾値は、上記の図で水平線で示される。２００ｍｇ ると、安全限界を大きく上回る血漿ＴＧ濃度（２個の白抜き丸を参照されたい） を生じることが予想される。対照的に、７％、４５％、７１％または７８％を含 むエマルジョン（左から右へ黒塗り四角形）を投与すると、血漿ＴＧはそれぞれ １３６、４７７、１３００または２０００ｍｇ／ｄｌに上昇する。ＴＧ含量が約 ５０％までのエマルジョンは、ＴＧからの毒性がないことが予想される。実施例９ リン脂質と胆汁酸、すなわちコール酸ナトリウムとの組合わせの効果を、前実 施例で記載したのと同じ種類の実験で試験した。 しかしながら、試験動物に投与した処方物を調製した手順は異なっていた。 この実施例およびこれ以後の実施例では、処方物は、Microfluidizer高圧ホモ ゲナイザーを用いて調製した。この装置は、スケールアップが容易である。 液状トリオレインまたは液状の大豆トリグリセリドのいずれかを適当な量の水 、または水にコール酸ナトリウム９ｍＭ、１８ｍＭまたは３６ｍＭを加えたもの に秤取った。固形の顆粒状ホスファチジルコリンを秤紙上に秤取った後、攪拌し ながら徐々に溶液に加えた。脂質を分散させるには凡そ３〜５分かかる。分散の 後、材料を微小流動化装置に投入した。この装置は水圧を用いてポンプを作動し 、次にこれが２個の互いに対向している試料のジェットを指示する。圧力は、平 方インチ当たり２５，０００ポンド程度であることができる。衝突により、ジェ ットがプラス印の形状のオリフィスに押しやられることによって、試料をホモゲ ナイズする。 試料はマイクロフルイダイザー中を再循環し、「１回通過」が、総ての試料を 装置中に送液するのに要する時間の量として画定した。試料を循環させて２０回 通過させ、ホモゲナイズした試料を生成した。デキストロースを、最終濃度５％ まで加えた。 E．coli 0111:B4 から精製した内毒素（４０ｍｇ／ｋｇ）と上記のエマルジョ ン（２００ｍｇホスファチジルコリン／ｋｇ）を室温で混合し、直ちにC57BL6/J マウス（体重１９〜３０ｇ）に尾静脈から静脈内注射により投与した。コール酸 塩のみを投与されたマウスは、コール酸塩／ＥＭＬ（エマルジョン）製剤に等し い体積のコール酸ナトリウムを同じコール酸塩濃度で与えられた。コントロール マウスには、同体積の５％デキストロースを投与して血漿の重量オスモル濃度に 相当するようにした。 結果を、直ぐ下の表に示す。エマルジョンは、前実施例に記載されているホス ファチジルコリン／７％トリグリセリドエマルジョンである。コール酸ナトリウ ムを用いるときには、これを所定の濃度で原材料に加えた後、材料を乳化した。 便宜上、エマルジョンの重量パーセントは、次の通りである。９ｍＭのコール 酸塩を用いるときには、エマルジョンに対する重量パーセントは７％コール酸塩 、６．１％トリグリセリド、および８６．９％ホスファチジルコリンである。１ ８ｍＭコール酸塩では、重量パーセントは１３．１％コール酸塩、５．７％トリ グリセリド、および８１．２％ホスファチジルコリンである。３６ｍＭコール酸 塩では、相対値は２３．２％コール酸塩、５％トリグリセリド、および７１．８ ％ホスファチジルコリンである。 これらの実験で投与されるＬＰＳの量（４０ｍｇ／ｋｇ）は前の実験で死亡率 の検討に用いた量よりもはるかに多い点に留意すべきである。これらの高投与量 を用いる意図は、ホスファチジルコリンおよび／またはトリグリセリドに起因す ると考えられる総ての保護効果を圧倒することである。従って、これらの実験の 後に得られる結論は、胆汁酸塩であるコール酸ナトリウムに起因する保護効果が あることである。 ここに示されていないものは、他の胆汁酸塩およびタウリンを含む胆汁塩を用 いて行なった検討である。胆汁酸の追加例としては、アロデオキシコール酸、リ トコール酸、ヒオデオキシコール酸、ヒオコール酸、α、βおよびω−ムリコー ル酸、ムロデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ウルソコール酸、およ びこれらの塩の総て、例えばナトリウム塩、またはタウリンまたはグリシン抱合 体が挙げられる。Hoffmann、上記引用を参照されたい。実施例１０ 次いで、更に検討を行なったが、その第一は被験動物としてマウスを用いる生 存数の検討であった。 生存数の検討では、被験動物を４群に分けた。第一の群には５％デキストロー ス溶液を投与し、コントロールとして用いた。第二の群には、上記のようにして 調製した９３％（重量）ホスファチジルコリンおよび７％（重量）トリグリセリ ドのエマルジョンを投与した。エマルジョンは、５％デキストロース、および脂 質の約５０ｍｇ／ｍｌでの大豆リン脂質を含んでいた。 第三および第四の群では、動物は第二群に投与したのと同様のエマルジョンに １８ｍＭコール酸ナトリウムまたは１８ｍＭデオキシコール酸ナトリウムを補足 したものを投与された。この実験では、用いたプロトコールは実施例９に記載し たものと同一であった。 生存数を投与から７２時間後に測定し、下表にまとめた。 群の生存数の比較の統計的有意性を、コンピュータープログラムを用いて一般 化したWilcox法によって検定した点に留意されたい。群１のコントロールに対す る比較を「１」の下に示し、群２の７％エマルジョンで処理した動物に対する比 較を「２」の下に示し、群３のエマルジョンとコール酸ナトリウムとで処理した 動物に対する比較を「３」の下に示す。 生存率および統計分析のいずれも、胆汁酸塩を含む処方物が明らかに予想外に 優れていることを示している。実施例１１ 実験の第二の組では、ウサギモデルを用いた。このモデルでは、ＴＮＦ（腫瘍 壊死因子）−αの放出を測定した。 ウサギを３群に分け、５％デキストロース溶液、上記のリン脂質とトリグリセ リドとのエマルジョン（９３％／７％）、または１８ｍＭコール酸をも含む９３ ％／７％エマルジョンを投与した。総てのエマルジョンは、実施例１０と同様に ５％デキストロースに調整した。ウサギにエマルジョンのプライミング・ボーラ ス(priming bolus)を投与し、２時間後にE．coli 0111:B4 LPS １００μｇを作 用させた。プライミング・ボーラスの後に、処方物を投与して、体重１ｋｇ当た り１時間当たり脂質５０ｍｇを静脈内投与により連続保持輸液を行なった。静脈 内投与は、作用の後３時間継続した。 血液を、ベースラインにおいて最初のボーラスの投与から３０分後、および投 与から５時間に亙り１時間毎にウサギから採取した。 下記の表に、ピークＴＮＦ−α値を示す。これらは、ないどくその投与から２ 時間後に起きた。 周知のStudent 検定を用いて、統計的有意性を決定した。表に示されるように 、ＴＮＦ−α値は１８ｍＭコール酸を投与した後有意に減少した。 上記の実施例は、一つの態様では、内毒素が会合するリン脂質の有効量を投与 することにより被験者における内毒素血症の緩和または予防を包含する本発明を 詳細に説明したものである。次に、リン脂質と内毒素との会合（結合）を、リポ タンパク質粒子を除去することによる方法に習熟している者には周知の標準的な 生物学的方法によって被験者から除去する。内毒素がリン脂質と会合(associate )することにより、これが不活性化される。 これらの実施例は、胆汁酸または胆汁酸塩のようなコラン酸またはコラン酸塩 の群の１つの投与を用いて、リン脂質と同じ目的を達成する、すなわち内毒素血 症の緩和または予防することもできることも示している。従って、胆汁酸／胆汁 酸塩およびリン脂質の一方または両方を含むペプチドおよびタンパク質を含まな い組成物を、内毒素血症の治療に用いることができる。コラン酸は、例えばHofm ann，Hepatology，4(5): 4S-14S(1984)に記載されており、この文献の内容は、 その開示の一部として本明細書に引用される。特に、コラン酸に特徴的な構造を 示している５Ｓ頁、第１および２図が注目され、これらの内容は、その開示の一 部として本明細書に引用される。 治療を行なう被験動物はヒトであることが好ましいが、本発明の実施はヒト以 外の動物にも同様に適用できる。 ここで用いられる「緩和」とは、グラム陰性菌(S．tymphimurium，E．coli な ど)によって産生される各種の内毒素のいずれかによって引き起こされる内毒素 血症の苦しみを軽減する治療を表す。予防は、被験者が、内毒素へ暴露されるこ とによって生じる症状にあるかまたはこの症状を引き起こしそうな時点で薬剤を 投与することによって行なうことができる。従って、外科処置を受けようとする 被験者に、この処置の前に活性成分を投与することができる。 この被験者の治療に要するリン脂質と胆汁酸との配合物の有効量は、変化する ことがある。一般に、被験者の体重１ｋｇ当たりリン脂質を総量で約２００ｍｇ 〜約８００ｍｇまでの投与量が好ましいが、この量は内毒素血症の重篤度または 予防の状況における危険性の程度によって増減することができる。胆汁酸および それらの塩のようなコラン酸および塩については、約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ／ ｋｇ体重、更に好ましくは１５ｍｇ〜約２７５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量が用いら れる。 中性脂質を含まないリン脂質のエマルジョンも想像されるように、胆汁酸／胆 汁酸塩およびリン脂質を、中性脂質をも含む組成物中で投与するのが望ましいが 、 これは必要ではない。リン脂質を組合わせて投与することが望ましいことは、中 性脂質とリン脂質とは会合してリポタンパク質に類似した粒子となるが、それら は、当然のことであるが常にリポタンパク質に含まれているペプチド成分のタン パク質を含まないという点でリポタンパク質とは異なっていることに起因してい る。 治療の特に望ましい形態は、リン脂質が卵黄ホスファチジルコリン、大豆を基 剤としたホスファチジルコリンまたはスフィンゴ脂質のようなホスファチジルコ リンである。胆汁酸／胆汁酸塩については、コール酸ナトリウム、デオキシコー ル酸ナトリウムおよびケノデオキシコール酸ナトリウムのようなコール酸および ／またはその塩が好ましい。 中性脂質に関しては、コレステロールエステルまたはトリグリセリドを用いる のが好ましいが、スクワレンまたは他の炭化水素油、ジ−およびモノ−グリセリ ドのような他の中性脂質、およびビタミンＥのような酸化防止剤も用いることが できる。 組成物を投与することができる形態は変化することができ、ボーラスまたは他 の静脈内形態が特に好ましい。ボーラス形態を用い、組成物がトリグリセリドな どを含むときには、投与に幾分注意しなければならない。トリグリセリドは多量 に投与しすぎると、毒性を有することはかなり広く知られていることである。し かしながら、通常の技術を有する技術者であれば、トリグリセリド中毒の危険性 を減少させまたは除くようにした組成物を容易に処方することができる。一般に 、ボーラス形態を用いるときには、組成物はトリグリセリドまたは他の中性脂質 を重量で約８０重量％だけ、好ましくは７０重量％だけを含むべきである。最も 好ましくは、組成物は、ボーラスを投与するときには、中性脂質を約５０重量％ 含むにすぎないようにすべきである。 しかしながら、他の静脈内形態のような非ボーラス形態を用いるときには、中 毒の危険性は減少する。それでもなお、上記範囲が静脈内または他の投与形態に 好ましいが、それらは必須とされるものではないことを理解しなければならない 。胆汁酸および胆汁酸塩については、投与量は、約２５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ ０ｍｇ／ｋｇ体重が好ましく、約５０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重 が特に好ましい。リン脂質については、約１００ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０００ｍ ｇ／ｋｇ体重の投与量が好ましい。しかしながら、投与量は一般的なものであり 、被験者および投与の様式によって変化する。 上記のように、タンパク質およびペプチドを含まない処方物は、少なくとも１ 種類のリン脂質または胆汁酸／胆汁酸塩が含まれていることが必要である。リン 脂質については、トリグリセリド、ジグリセリドまたはモノグリセリドのような 少なくとも１種類の中性脂質が含まれていることが好ましい。組成物は、ステロ ール（例えば、コレステロール、β−シトステロール）、エステル化下またはエ ステル化されていない脂質（例えば、コレステロールエステルまたはエステル化 されていないコレステロール）、スクワレンのような炭化水素油、ビタミンＥの ような酸化防止剤などの追加材料を含むことができるが、これらは必須とされる ものではない。２種類以上のリン脂質および／または２種類以上の中性脂質をこ れらの如何なる処方物に用いることもできることは勿論である。中性脂質とリン 脂質との配合物を用いるときは、中性脂質は組成物の脂質の総量に対して約３重 量％〜約５０重量％で含まれるべきである。 胆汁酸／胆汁酸塩の場合には、これらは、リン脂質、中性脂質、または両者を 単独にまたは組合わせて用いることができる。これらの追加材料（例えば、リン 脂質および中性脂質）に関しては、好ましいものは上記に記載し、述べたもので ある。任意の追加成分としては、上記の者が挙げられる。 また、内毒素血症の治療に用いられる組成物も、本発明の一部である。本発明 のこの特徴の一つの態様は、胆汁酸／胆汁酸塩、リン脂質および中性脂質のそれ ぞれの少なくとも一つを含む組成物であって、全体として内毒素血症を緩和する 量の活性成分を含む組成物である。この組成物は、重量パーセントで、胆汁酸／ 胆汁酸塩約５重量％〜約３０重量％、中性脂質約３重量％〜約５０重量％、およ びリン脂質約１０重量％〜約９５重量％を含むのが好ましい。特に好ましいもの は、胆汁酸／胆汁酸塩約１０〜１５重量％、中性脂質約５重量％〜約１０重量％ を含む組成物であって、組成物の残部がリン脂質であるものである。 これらの重量百分率は、３成分からなる組成物に対するものである点に留意す べきである。この３成分系を、例えばキャリヤー、アジュバント、上記のような 任意成分と組み合わせると、総組成物に対する重量百分率は降下する。このよう な治療組成物は、常にタンパク質を含まずかつペプチドを含まないことに留意す べきである。 胆汁酸または胆汁酸塩を含まない組成物の場合には、このようなタンパク質を 含まず、ペプチドを含まない組成物は、中性脂質を少なくとも約３重量％から中 性脂質を約５０重量％まで含み、残部は少なくとも１種類のリン脂質であるのが 好ましい。好ましくは、中性脂質はトリグリセリドであるが、上記下追加の中性 脂質のいずれであることもできる。また、リン脂質は、ホスファチジルコリンで あるのが好ましい。 本発明の他の態様は当業者には明らかになるであろうし、ここでは繰り返し記 載する必要はない。 詳細な説明および実施例は例示のためのものであり、本発明の制限のためのも のではなく、本発明の精神および範囲内の他の態様は当業者に理解されることが 分かるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，Ｔ Ｊ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ルービン，アルバート エル. アメリカ合衆国ニュージャージー州、イン グルウッド、アリソン、コート、220 (72)発明者 ゴードン，ブルース アール. アメリカ合衆国ニューヨーク州、ニューヨ ーク、ヨーク、アベニュ、1161 (72)発明者 サール，ステュアート ディー. アメリカ合衆国ニューヨーク州、ニューヨ ーク、イースト、フィフティセブンス、ス トリート、345

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 被験者の内毒素血症の治療法であって、上記被験者に、上記被験者の内 毒素血症を緩和するのに十分な量のコラン酸またはコラン酸塩、およびリン脂質 を含み、タンパク質を含まずペプチドを含まない組成物の有効量を投与すること を含む、方法。 ２． 上記コラン酸またはコラン酸塩が胆汁酸または胆汁酸塩である、請求の 範囲第１項に記載の方法。 ３． 上記リン脂質がホスファチジルコリンである、請求の範囲第２項に記載 の方法。 ４． 上記組成物が中性脂質をも含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ５． 上記中性脂質がトリグリセリドである、請求の範囲第４項に記載の方法 。 ６． 上記胆汁酸がコール酸である、請求の範囲第１項に記載の方法。 ７． 上記胆汁酸塩がコール酸塩である、請求の範囲第１項に記載の方法。 ８． 上記コール酸塩がコール酸ナトリウムである、請求の範囲第７項に記載 の方法。 ９． 上記組成物が中性脂質を更に含む、請求の範囲第２項に記載の方法。 １０． 上記リン脂質がホスファチジルコリンであり、上記中性脂質がトリグ リセリドである、請求の範囲第９項に記載の方法。 １１． 上記組成物を静脈内投与することを含む、請求の範囲第１項に記載の 方法。 １２． 上記組成物を経口投与することを含む、請求の範囲第１項に記載の方 法。 １３． (i)コラン酸またはコラン酸塩、(ii)中性脂質、および(iii)リン脂質 の治療上有効量を含んでなる内毒素血症の治療に用いられる物質の組成物 であって、上記組成物がタンパク質を含まずかつペプチドを含まない、組成物。 １４． 上記コラン酸またはコラン酸塩が胆汁酸または胆汁酸塩である、請求 の範囲第１３項に記載の組成物。 １５． 上記胆汁酸塩がコール酸ナトリウムである、請求の範囲第１４項に記 載の組成物。 １６． 上記中性脂質がトリグリセリドである、請求の範囲第１３項に記載の 組成物。 １７． 上記リン脂質がホスファチジルコリンである請求の範囲第１３項に記 載の組成物。 １８． 上記胆汁酸塩がコール酸塩であり、上記中性脂質がトリグリセリドで あり、上記リン脂質がホスファチジルコリンである、請求の範囲第１３項に記載 の組成物。 １９． 内毒素血症の治療に用いられるタンパク質およびペプチドを含まない 組成物であって、 (a) 上記組成物中の総脂質の約３重量％〜約５０重量％に等しい量の少なく とも１種類の中性脂質、および (b) 少なくとも１種類のリン脂質 を含んでなる、組成物。 ２０． 上記中性脂質がトリグリセリドである、請求の範囲第１９項に記載の タンパク質およびペプチドを含まない組成物。 ２１． 上記リン脂質がホスファチジルコリンである、請求の範囲第１９項に 記載のタンパク質およびペプチドを含まない組成物。 ２２． 上記の少なくとも１種類の中性脂質がコレステリルエステルを含む、 請求の範囲第１９項に記載のタンパク質およびペプチドを含まない組成物。 ２３． スフィンゴシンを更に含む、請求の範囲第１９項に記載のタンパク質 およびペプチドを含まない組成物。 ２４． 内毒素血症の緩和を必要とする被験者で内毒素血症を緩和する方法で あって、上記被験者に、タンパク質を含まずペプチドを含まない組成物であって 内毒素血症に関連した内毒素が会合（アソシエート）する少なくとも１種類のリ ン脂質を含む組成物を投与することを含んでなる、方法。 ２５． 上記組成物が、少なくとも１種類の中性脂質をも含む、請求の範囲第 ２４項に記載の方法。 ２６． 上記組成物をボーラスの形態で投与する、請求の範囲第２４項に記載 の方法。 ２７． 上記組成物を静脈内に投与する、請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２８． 上記組成物を、上記被験者の体重１ｋｇ当たりリン脂質約８００ｍｇ までを供給するのに十分な量で投与する、請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２９． 上記組成物を、上記被験者の体重１ｋｇ当たりリン脂質約４００ｍｇ までを供給するのに十分な量で投与する、請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３０． 上記組成物を、上記被験者の体重１ｋｇ当たりリン脂質約２００ｍｇ までを供給するのに十分な量で投与する、請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３１． 上記組成物を、上記被験者の体重１ｋｇ当たりリン脂質約１００ｍｇ までを供給するのに十分な量で投与する、請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３２． 上記リン脂質がホスファチジルコリンである、請求の範囲第２４項に 記載の方法。 ３３． 上記リン脂質がスフィンゴ脂質である、請求の範囲第２４項に記載の 方法。 ３４． 上記中性脂質がトリグリセリドである、請求の範囲第２５項に記載の 方法。 ３５． 上記中性脂質がコレステロールエステルである、請求の範囲第２５項 に記載の方法。 ３６． 上記組成物が、中性脂質を、上記組成物の約８０重量％までの量で含 む、請求の範囲第２５項に記載の方法。 ３７． 上記中性脂質が、上記組成物の約７０重量％までの量で含まれる、請 求の範囲第３６項に記載の方法。 ３８． 上記中性脂質が、上記組成物の約５０重量％までの量で含まれる、請 求の範囲第３７項に記載の方法。 ３９． 上記中性脂質が、上記組成物の約１０重量％までの量で含まれる、請 求の範囲第３８項に記載の方法。 ４０． 上記組成物が、ステロールをも含む、請求の範囲第２４項に記載の方 法。 ４１． 上記ステロールがβ−シトステロールまたは植物ステロールである、 請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４２． 上記中性脂質がエステル化された脂質である、請求の範囲第２５項に 記載の方法。 ４３． 上記中性脂質がエステル化されていない脂質である、請求の範囲第２ ５項に記載の方法。 ４４． 上記のエステル化された脂質がエステル化されたコレステロールであ る、請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４５． 上記のエステル化されていない脂質がエステル化されていないコレス テロールである、請求の範囲第４３項に記載の方法。 ４６． 内毒素血症の緩和を必要とする被験者で内毒素血症を緩和する方法で あって、上記被験者に、タンパク質を含まずペプチドを含まない組成物であって 内毒素血症に関連した内毒素が会合する少なくとも１種類のリン脂質を含む組成 物を投与することを含んでなる、方法。 ４７． 上記組成物が、少なくとも１種類の中性脂質をも含む、請求の範囲第 ４６項に記載の方法。 ４８． 上記組成物をボーラスの形態で投与する、請求の範囲第４６項に記載 の方法。 ４９． 上記組成物を静脈内に投与する、請求の範囲第４６項に記載の方法。 ５０． 上記組成物を、上記被験者の体重１ｋｇ当たりリン脂質約８００ｍｇ までを供給するのに十分な量で投与する、請求の範囲第４６項に記載の方法。 ５１． 上記組成物を、上記被験者の体重１ｋｇ当たりリン脂質約４００ｍｇ までを供給するのに十分な量で投与する、請求の範囲第５０項に記載の方法。 ５２． 上記組成物を、上記被験者の体重１ｋｇ当たりリン脂質約２００ｍｇ までを供給するのに十分な量で投与する、請求の範囲第５０項に記載の方法。 ５３． 上記組成物を、上記被験者の体重１ｋｇ当たりリン脂質約１００ｍｇ までを供給するのに十分な量で投与する、請求の範囲第５０項に記載の方法。 ５４． 上記リン脂質がホスファチジルコリンである、請求の範囲第４６項に 記載の方法。 ５５． 上記リン脂質がスフィンゴ脂質である、請求の範囲第４６項に記載の 方法。 ５６． 上記中性脂質がトリグリセリドである、請求の範囲第４７項に記載の 方法。 ５７． 上記中性脂質がコレステロールエステルである、請求の範囲第４７項 に記載の方法。 ５８． 上記組成物が、この組成物の約８０重量％までの量の中性脂質を含む 、請求の範囲第４７項に記載の方法。 ５９． 上記中性脂質が、上記組成物の約７０重量％までの量で含まれる、請 求の範囲第５８項に記載の方法。 ６０． 上記中性脂質が、上記組成物の約５０重量％までの量で含まれる、請 求の範囲第５９項に記載の方法。 ６１． 上記中性脂質が、上記組成物の約１０重量％までの量で含まれる、請 求の範囲第６０項に記載の方法。 ６２． 上記組成物が、ステロールをも含む、請求の範囲第４６項に記載の方 法。 ６３． 上記ステロールがβ−シトステロールまたは植物ステロールである、 請求の範囲第６２項に記載の方法。 ６４． 上記中性脂質がエステル化された脂質である、請求の範囲第４７項に 記載の方法。 ６５． 上記中性脂質がエステル化されていない脂質である、請求の範囲第４ ７項に記載の方法。 ６６． 上記のエステル化された脂質がエステル化されたコレステロールであ る、請求の範囲第６５項に記載の方法。 ６７． 上記のエステル化されていない脂質がエステル化されていないコレス テロールである、請求の範囲第６６項に記載の方法。