JPH10504025A - 肺界面蛋白質ｓｐ−ｃの合成ペプチド類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 高い収率、高い純度で製造できかつその効力が天然の肺界面活性物質に劣らない、肺界面活性物質活性を有する、式（Ｉ）

Description

【発明の詳細な説明】 肺界面蛋白質ＳＰ−Ｃの合成ペプチド類似体 技術分野 本発明は、肺界面活性物質・活性のポリペプチド、その製造方法および該物質 を含有する治療組成物に関する。 技術水準 すべての脊椎動物の肺は、“肺界面活性物質（Ｌｕｎｇｅｎｓｕｒｆａｃｔａ ｎｔ）”と呼ばれる物質混合物を含有する。このものは界面活性の性質を示し、 肺の肺胞範囲内の表面張力を、呼息の際の最終的気道範囲の虚脱が回避される程 度に低下する。この物質混合物は表面張力を動的に調節し、その結果ラプラース （Ｌａｐｌａｃｅ）の法則により期待される小肺胞の虚脱は、大きい肺胞に有利 に表面張力を相応に適合することによって回避される。その結果として、良く平 衡した、組織的および生理的に安定な肺の構造が生じる。 肺界面活性物質は、ＩＩ型の肺胞の肺細胞からラメラ体（ｌａｍｅｒａｒ ｂ ｏｄｉｅｓ）の形で分泌される。これは、高割合のジパルミトイルホスファチジ ルコリン（ＤＰＰＣ）およびホスファチジルグリセリン（ＰＧ）を有するリン脂 質二重層（ｂｉｌａｙｅｒ ｎ）からなるコンパクトな単位である。他の重要な成分として、肺界面活性物質 中には、ＳＰ−Ａ，ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃで表示される蛋白質が含有されてい る。ＳＰ−Ａは分泌調節の際に重要な役割を演じる高分子の糖蛋白質である。 蛋白質ＳＰ−Ｃ、および僅かな分量で、ＳＰ−Ｂは、単分子の表面膜（狭議の 界面活性物質）の構成の際に、“熱力学的触媒（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｓｃ ｈｅｒ ｋａｔａｌｙｓａｔｏｒｅｎ）”の役目を引き受ける。この蛋白質の存 在により、拡張動力学が大きく促進される。これにより初めて、界面活性物質組 成をその都度の表面張力必要条件に対し遅滞なく適合させることが可能である。 この性質が、蛋白質、殊にＳＰ−Ｃの極端な疎水特性に再び反映する。 肺組織の抽出または動物の肺の洗浄によって、動物モデルにおけるような物理 化学的測定装置中でならびに臨床適用の際に、界面活性物質不足を補償し、それ とともに子供の呼吸困難症候群（ＩＲＤＳ）の治療のために適当である界面活性 物質製剤を製造することができた。しかし、これらの製剤には重大な欠点がある ： リン脂質の組成は、動物の種類、動物の健康状態および栄養状態に強く依存し 、定義された成分の混入によって殆ど補償することができない。界面活性物質蛋 白質の含量ならびにＳＰ−Ｂ／ＳＰ−Ｃの比は、同じ 不確実性を受ける。これに加えて、場合により蛋白質の蛋白質分解生成物および 修飾誘導体（たとえばメチオニンの酸化による）が同様に治療に使用される混合 物中に含有されている。たとえば成人性呼吸困難症候群（ショック、ＡＲＤＳ） の場合または他の適用分野において、たとえば肺適用の際に他の物質の“曳行体 （Ｓｃｈｌｅｐｐｅｒ）”として界面活性物質を利用する場合に必要になること のある界面活性物質の長期適用または大量の界面活性物質の適用の際に物質補給 の問題が未解決である。 従って、これらの問題を遺伝子技術的に蛋白質を製造することによって解決す ることが提案される。組換え蛋白質は、殊に細菌の発現系の使用下に実際に無制 限量で製造することができかつ最近の分析法および性質制御が可能であるので、 合成リン脂質の使用下に正確に定義された組成を有する界面活性物質を製造する ことができる。この界面活性物質は治療要件に最適に適合させることができる。 拡張力学にとり殊に重要であるヒト蛋白質ＳＰ−Ｃ（式１参照、Ａ＝Ｈまたは Ｐｈｅ、Ｂ＝ＣｙｓおよびＣ＝Ｍｅｔ）は、その中心部が専らバリン、ロイシン およびイソロイシンのような脂肪族の非常に疎水性のアミノ酸からなっている。 この中心部（アミノ酸１２〜３４）の長さは、単分子リン脂質膜へのペプチドの 組込みを許容する。配列Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ（位 置３〜６）中の双方のＣｙｓ基はパルミチン酸によりＳＨ基にチオエステル化さ れている。パルミチン酸は、全蛋白質の疎水性をさらに高め、同時にシステイン の双方のＳＨ基を閉鎖し、該基を酸化およびジスルフィド架橋結合に対して保護 する。中心部（アミノ酸１３〜３４）は、トランスメンブランヘリックスを構成 する。この部分は、Ｎ末端が、正荷電のアミノ酸（Ｌｙｓ，１０；Ａｒｇ，１１ ）を含有する極性配列によってフランキングされている。 ＷＯ９１／１８０１５号には、組換えＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｃの突然変異体の 製造が記載される。そこには就中、４位および５位における双方のシステインを ２個のセリンによって置換することが提案される。これは、製造の際に、非常に 疎水性の蛋白質を単離した後の技術的に費用のかかる双方のシステインのパルミ トイル化が無くなるという利点を有する。 発明の記述 ところで意外にも、ヒトＳＰ−Ｃとは、４位および５位のシステインがフェニ ルアラニンまたはトリプトファンにより置換され、３２位のメチオニンがイソロ イシン、ロイシンまたはセリンにより置換されることで異なるＳＰ−Ｃ突然変異 体は、天然のＳＰ−Ｃに比べて機能損失を有せずかつむしろ安定性に関してこれ よりも優れていることが判明した。遺伝子工学的製造は著しく簡単でありかつ高 い収率を生じる。肺界面活 性物質・活性を有する新規ポリペプチドは非常に高い純度で製造することができ る。 従って、本発明の対象は、一般式１ ［式中ＡはＨまたはＰｈｅを表わし、 ＢはＰｈｅまたはＴｒｐを表わしかつ ＣはＩｌｅ、ＬｅｕまたはＳｅｒを表わす］によるアミノ酸配列を有する肺界 面活性物質・活性を有するポリペプチドである。 本発明の好ましい対象は、式中ＡがＨまたはＰｈｅを表わし、ＢがＰｈｅを表 わし、ＣがＩｌｅを表わすポリペプチドであり、その際Ａ＝Ｈ，Ｂ＝Ｐｈｅかつ Ｃ＝Ｉｌｅの意味がとくに好ましい一般式のポリペプチドである。 本発明の他の対象は、本発明による１種または数種のポリペプチドを含有する ことを特徴としかつ所望により付加的にＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｂの群、とくにＳ Ｐ−Ｂ群からの１種または数種の肺界面活性物質・活性のポリペプチドを含有す る医薬組成物である。 本発明によるポリペプチドは、固相ペプチド合成の公知方法によるかまたは宿 主細胞中の相応する組換えベクターを用いて製造することができる。ベクターを 構築する技術、細胞を形質転換する技術、形質転換した細胞中で蛋白質の発現を 惹起する技術および発現した蛋白質を単離および生成する技術は、当業者には自 体公知である（たとえば」ＷＯ８６／０３４０８号、ＷＯ８７／０６５８８号お よびＷＯ９１／１８０１５号）。細菌中系中にＳＰ−Ｃを発現するためのベクタ ーの製造は、組換えＤＮＡ工学の慣用法による。 細菌中での疎水性ＳＰ−Ｃ蛋白質の発現は、大量にかつ宿主細胞の損傷なしに は、、たとえばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）と 一緒のような適当な融合蛋白質の形で可能であるにすぎない。たとえば、ベクタ ーｐＴｒｐＡｍｐＣＡＴ１５２はＣＡＴのＮ末端部分をコードし、ＳＰ−Ｃをコ ードするＤＮＡフラグメントの“インフレーム”クローニングに対し（５′−） ＥｃｏＲ１−および（３′−）ｐｓｔ１切断位置を提供する。この場合、ＣＡＴ およびＳＰ−Ｃは蛋白質平面上でヒドロキシルアミン敏感性融合位置（ＡｓＮ↓ Ｇｌｙ）を介して互いに結合される。このようなベクター、たとえばｐＴｒｐＡ ｍｐＣＡＴ１５２：：ＳＰＣは、相応する融合蛋白質の制御された発現を生産規 模（発酵）にまで許容する。融合蛋白質の発現は、宿主細胞中に封入体の形成を 惹起する。その際、融合蛋白質中のＣＡＴ成分の長さは、高いＳＰ−Ｃ成分にお いて封入体の高い収率が得られるように変えることができる。 発現は、細菌中の他に多数の宿主系、たとえば哺乳動物細胞、酵母細胞および 昆虫細胞中で行うことができる。種々の宿主細胞に適当なＤＮＡ構築は、公知方 法により合成し、通常相応する制御配列を用いて宿主細胞のゲノム中に組込まれ る。 ２個のＤＮＡオリゴヌクレオチドは、慣用のリンアミジット法により、Ｍｉｌ ｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｃｙｃｌｏｎｅ ＤＮＡ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉ ｚｅｒで合成することができる。 最初のＤＮＡオリゴヌクレオチドは、１１８個のヌクレオチドの長さを有する センス−ＤＮＡ鎖を形成する。これは、ＳＰ−Ｃ前駆配列のＧｌｙ−２５で始ま り、Ｌｅｕ−５８（式１のＧｌｙ−１ないしはＬｅｕ−３４に相当）で終わり、 後でのサブクローニングに対するＥｃｏＲ１−特異的５′末端、Ａｓｎ／Ｇｌｙ ヒドロキシルアミン切断箇所およびヒトＳＰ−Ｃを（５′→３′方向に）コード する。この場合、ヒトＳＰ−Ｃ蛋白質の公知アミノ酸配列は、遺伝コードの規則 に従ってＤＮＡに翻訳された。しかし、配列はＳＰ−Ｃ前駆配列の２８位および ２９位の双方のシステインがフェニルアラニンまたはトリプトファンにより置換 され、かつ前駆蛋白質配列の５６位のメチオニンがイ ソロイシン、ロイシンまたはセリンにより置換されるように変更される。こうし て付加的になお、宿主細胞のコドン利用頻度を考慮することができる。４位およ び５位にフェニルアラニンを有し、３２位にイソロイシンを有する（式１に従い 番号付け）変更されたＳＰ−Ｃ配列は、この双方のアミノ酸に対する通常の一文 字記号コードによりＳＰＣ３４（ＦＦ／Ｉ）と表示される。さらに、センス−Ｄ ＮＡ鎖はリボソームの翻訳を終結するためのＴＡＡ停止コドンならびにＰｓｔ１ −特異的３′末端を含有する。第二のＤＮＡオリゴヌクレオチドは、１１０個の ヌクレオチドからなる相補的非コード（アンチセンス）鎖である。 合成により製造したＳＰ−Ｃ ＤＮＡフラグメントは、たとえばｐＴｒｐＡｍ ｐＣＡＴ１５２のような適当な発現ベクター中にクローニングされる。このベク ターは、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＫＫ２３３から構成されかつｐＢＲ ３２２の誘導体である。ｔｒｃ−プロモーターは、ｐＴｒｐＡｍｐＣＡＴ１５２ におけるようなｔｒｐ−プロモーターにより置換することができる。他の誘導プ ロモーターも同様に使用できる。 ＳＰ−Ｃフラグメントのサブクローニングのためには、相補ＤＮＡオリゴヌク レオチドを差し当たり互いにハイブリッド形成する。これから得られるＤＮＡ二 本鎖は、突出する一本鎖末端（ＥｃｏＲ１／Ｐｓｔ１ ）を有する。 ベクターＤＮＡ中への組込みは、常法でベクターＤＮＡのＥｃｏＲ１／Ｐｓｔ １消化、アガロースゲル電気泳動による所望のベクターＤＮＡフラグメントの精 製およびＳＰ−Ｃ ＤＮＡおよびベクターフラグメントの付着末端によるハイブ リッド形成により行われる。引き続き、双方のフラグメントを公知方法により連 結反応により互いに共有結合する。 ＤＮＡ増幅およびプラスミド単離のために、慣用の実験記録に従いたとえば塩 化カルシウム受容Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４細胞に形質転換し、プラスミド担持細 胞を選択するためにＬＢ寒天板上でアンピシリンを用いて平板培養する。得られ るＡｍｐ耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、これを適当な制限酵素組 合せを用いて分析する。期待されるＤＮＡ制限フラグメントモデルを有するクロ ーンを選択する。プラスミド配列の完全な配列決定により、ＳＰＣ３４（ＦＦ／ ｌ）配列の挿入が正しく行われたことが確認される。 こうして得られたプラスミドベクターは、Ｔｒｐプロモーター（または他のプ ロモーター）の制御下に融合蛋白質の発現を許容する。組換え融合蛋白質は、誘 導後宿主細胞中に封入体の形で生じる。 融合蛋白質ＣＡＴ１５２：：ＳＰＣ３４（ＦＦ／１）は、次の通常の一文字記 号コードで表示されるアミノ酸配列を有する： 融合蛋白質の１５３〜１８６位におけるＳＰ−Ｃ（ＦＦ／１）の３４個のアミ ノ酸は、アンダーラインおよび位置１〜３４の記載によって特性表示されている 。 後でＣＴＡおよびＳＰ−Ｃを分離するためのヒドロキシルアミンを用いる分割 は、Ａｓｎ−１５２とＧｌｙ−１５３（ＳＰ−Ｃペプチド中の一番目のアミノ酸 に相当）の間で行われる。ＳＰ−Ｃペプチドの分離および精製は、蛋白質化学に おける常法によって行なわれる。 本発明によるポリペプチドは、単独でまたは互いに組会わせて、気道治療の要 件に適合した医薬組成物中に利用することができる。組成物は、早産児および成 人における呼吸困難症候群の治療だけでなく、肺炎および気管支カタルの治療の ためにも適当である。さらに、本発明によるポリペプチドは、吸入投与しうる医 薬の運搬体としても適している。 組成物は、ポリペプチドの他に、リン脂質、とくに天然の肺界面活性物質組成 物中に含まれているようなリン脂質、たとぺばとくにジパルミトイルホスファチ ジルコリン（ＤＰＰＣ），パルミトイルオレイルホスファチジルグリセロール（ ＰＯＰＧ）および／またはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を含有する。有 利な粘度を調節するために、組成物はカルシウムイオンまたはマグネシウムイオ ンならびに塩化ナトリウムを含有する。当業者は組成物の個々の成分の種類およ び量を決める場合、一方で天然肺界面活性物質の公知組成および他方でたとえば ヨーロッパ特許（ＥＰ−Ａ）０１１９０５６号およびヨーロッパ特許（ＥＰ−Ａ ）０４０６７３２号のような技術水準による多数の提案に適応させる。 本発明による好ましい組成物は、リン脂質８０〜９５重量％、ポリペプチド０ ．５〜３．０重量％、脂肪酸、とくにパルミチン酸４〜７重量％および塩化カル シウム１〜３重量％を含有する。製造例 １．生産菌株 使用した生産菌株Ｅ．ｃｏｌｉ１９９は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２菌株ＭＭ２９４ から誘導され、該菌株はドイツ微生物および細胞培養物寄託社（Ｄｅｕｔｓｃｈ ｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ））から番号５２０８で入手す ることができる。 融合蛋白質ＣＡＴ１５２：：ＳＰＣ３４（ＦＦ／１）の遺伝子を含有する発現 ベクターｐＴｒｐＡｍｐＣＡＴ１５２：：ＳＰＣ３４（ＦＦ／１）は、ＤＳＮ配 列ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１誘導体［Ｅ．Ｗｅｂｅｒ（ｅｄ）（１９８８），Ｂ ｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｓｉｃｈｅｒｈｅｉｔ，ｂｕｎｄｅｓｍｉｎｉｓｔｅｒ ｉｕｍ ｆｕｅｒ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ｎｕｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，Ｂ ｏｎｎ］から誘導された。Ｐｈａｒｍａｃｉａから得られるプラスミドｐＫＫ２ ３３−２中のＴｒｐプロモーターをＥｃｏＲ１／Ｈｉｎｄ３を用いて切り取り、 合成Ｔｒｐプロモーターにより置換した（ｐＴｒｐ２３３）。これは、プロモー ター領域（ＲＮＡポリメラーゼの結合位置）、オペレーター領域（Ｔｒｐリプレ ッサーの結合位置）、シャイン・ダルガルノ（Ｓ／Ｄ）配列ならびにクローニン グのための制限位置からなる。Ｔｒｐプロモーターの後方には、細菌のクロラム フェニコールアセチルトランスフェラーゼの５′部分の１５２アミノ酸をコード する遺伝子（ＣＡＴ１５２）が挿入された。ＣＡＴ１５２ＤＮＡ部分配列に、ヒ ト類似ＳＰ−Ｃ（ＦＦ／１）の３４個のアミノ酸をコードする合成遺伝子フラグ メントが融合された。機能的ＣＡＴ：：ＳＴＣ（ＦＦ／１）転写単位は、細菌ｒ ｒｎＢ転写ターミネーター 配列Ｔ１Ｔ２により閉鎖される。得られる構築は、ｐＴｒｐＡｍｐ−ＣＡＴ１５ ２：：ＳＰＣ３４（ＦＦ／１）で表示される。 ベクターｐＴｒｐＡｍｐＣＡＴ１５２：：ＳＰＣ３４（ＦＦ／１）は、次の機 能要素を有する： −ＣＡＴ１５２：：ＳＰＣ３４（ＦＦ／１）遺伝子、Ｔｒｐプロモーターおよび Ｔ１Ｔ２転写ターミネーターにより制御される； −ｏｒｉ領域および隣接領域、それによりプラスミドのコピー数が制御される； 宿主細胞中ヘプラスミドを入れた後、これはＴｒｐプロモーター制御されるＣ ＡＴ：：ＳＰＣ（ＦＦ／１）遺伝子の高いコピー数を処理できる。Ｔｒｐリプレ ッサーは宿主細胞自体により提供される。 ｒＣＡＴ：：ＳＰＣの発酵的製造は、培養基中のトリプトファンの濃度ないし はβ−ＩＡＡ（β−インドリルアクリル酸）の添加により制御される。 ２．バッチ発酵 作業細胞バンク（グリセリン培養）の試験管を用いて、培養基（組成は下記参 照）を振盪フラスコ中に接種し（準備培養または接種培養１ｌ）、３７℃で振盪 および強いアンピシリン選択圧下にインキュベートする。成長を５７８ｎｍにお ける光学濃度により追跡する。Ｅ．ｃｏｌｉ１９９接種培養が３以上の光学濃度 を達成する場合、１０ｌの発酵槽を培養液で接種し、細菌の成長を軽減したアン ピシリン選択圧下に継続する。光学濃度が５と６の間の値に到達したら直ちに、 １０ｌの培養液１００ｌの発酵槽に移し、同じ条件下でさらにインキュベートす る。十分な成長後、たとえばβ−ｌＡＡ ４０ｍｇ／ｌの添加によりＴｒｐプロ モーター制御されたＣＡＴ：：ＳＰＣ（ＦＦ／ｌ）転写単位を誘導する。誘導後 、細胞採取までさらに４〜５時間発酵させる。 発酵の間、発酵槽液の酸素分圧（ｐＯ₂）、ｐＨ値および温度をオンラインで 検出し、制御する。ｐＨ値をカセイソーダで一定に保ち、酸素分圧（ｐＯ₂）は 酸素送入および撹拌機回転数により制御する。オフラインで、５７８ｎｍの光学 濃度および培養液中の炭素源の濃度を測定し、起泡を泡センサーで検出し、場合 により抑泡のため泡止め剤を配量する、 培養液の分割量を種々の時点で取出す。細菌の溶解後、発現を制御するために Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質をポリアクリルアミドゲル上で分離し、染色する。Ｅ．ｃｏ ｌｉ全蛋白質における（優性）蛋白質の分量を、デンシトメーターで測定する。 組換え遺伝子の誘導直後に新規優性蛋白質バンドが生じる（ｒＣＡＴ：：ＳＰＣ ）。 培養基は次の組成を有する： 大豆ペプトン２７．０ｇ／ｌ、酵母自己分解物ＫＡ Ｖ１４．０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５．０ｇ／ｌ、Ｋ₂ＨＰＯ₄×３Ｈ₂Ｏ６．０ｇ／ｌ 、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ０．５ｇ／ｌ、グリセリン（９ ９．５％）３０．ｇ／ｌ、泡止め剤Ｊ６７３（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ Ｃｏｍｐ．） ０．２ｍｌ／ｌ、Ｌ−トリプトファン８０．０ｍｇ／ｌおよびアンピシリン第１ 準備培養に対して２０ｍｇ／ｌおよび第２準備培養に対して５ｍｇ／ｌおよび発 酵槽１００ｌ。 複雑な培養基をオートクレーブ処理および滅菌する前に、ｐＨ値を２ＮＮａＯ ＨでｐＨ６．８に調節する。１０ｌの発酵槽中での準備培養に対して３７℃で７ ５０ｒｐｍの撹拌速度および１０ｌ／分の空気送入量を適用し、１００ｍｌ発酵 槽中での主培養に対しては３７℃で４００ｒｐｍの撹拌速度および７０ｌ／分の 空気送入量を適用する。泡止め剤は必要に応じ、隔壁を介して１回噴射で添加す る。 誘導してから約４時間後に、細胞を濾過および／または遠心分離により培養液 から分離する。湿った細胞物質を特殊鋼容器中に集め、分解緩衝液（ｐＨ８．０ ）１０ｌと共に冷蔵室中で一晩撹拌する（１６時間、４０℃）。撹拌した細胞懸 濁液は高圧ホモジナイザー（≦７００ｂａｒ）中で分解し（室温）、改めて滅菌 特殊鋼容器中に集める。引き続き、封入体を直ちに４℃で濾過および／または遠 心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離器ＲＣ２−Ｂ，２７０００ｇ）することにより 採取し、緩衝液中に懸濁させ（約１ｌ）、たとえば約３５０ｍｌの分量で１ｌの 丸底フラスコ中に移し、約９６時間凍結乾燥する。１００ｌの発酵液から２０重 量％以上の融合蛋白質含量を有する乾燥封入体約２００ｇが得られる。凍結乾燥 した封入体は−２０℃で数カ月貯蔵できる。 ３．融合蛋白質の分割および親油性ペプチドＳＰ−Ｃ（ＦＦ／ｌ）の精製 乾燥封入体１００ｇを、８モルのグアニジン塩酸塩溶液（９１７．１ｇ）１． ６ｌに軽度の加熱下に溶解する。不溶の残留物を濾紙により濾過する。融合蛋白 質をＡｓｎ−Ｇｌｙ結合位置で分割するために、溶液に塩化ヒドロキシルアンモ ニウム１６７ｇを添加し、溶液のｐＨを２ＮＮａＯＨで９．６に調節する。次に 、分割溶液を室温で撹拌下に３〜４日放置する。反応時間の終わりに、トリス緩 衝液（ｐＨ８．０）６．４ｌの添加によりＳＰ−Ｃ（ＦＦ／ｌ）を析出させ、遠 心分離器（Ｓｏｒｖａｌｌｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ＲＣ２−Ｂ，２００００ｇ） を用いて沈殿させた。上澄みをデカントし、ＳＰＣペレットをトリス緩衝液４０ ０〜５００ｍｌに改めて懸濁させ、同じ条件下に新たに３０分間遠心分離する。 ＳＰＣ−ペレットを、塩酸酸性クロロホルム／メタノール混合物（ＣＨＣｌ₃ １．７５ｌ＋ＣＨ₃ＯＨ１．７５ｌ＋２ＮＨＣｌ約３０ｍｌ）３．５ｌにとる。 こ の粗製ＳＰＣ溶液をＣ８逆相材料上での分取ＨＰＬＣによりさらに精製する。ク ロロホルム／メタノール抽出物を分取ＨＰＬＣカラムに挿入するに先立ち、９０ ％のメタノールで約１：２の割合に希釈する。この溶液から、たとえばカラム（ 直径５ｃｍ）にＳＰ−ｃ（ＦＦ／ｌ）約４００ｍｇを装入する（たとえば希釈粗 製抽出物２ｌ）。ＳＰ−Ｃ（ＦＦ／ｌ）を、酸性条件（ｐＨ２〜３）下に水／イ ソプロパノール勾配溶離する（分離条件参照）。約３０分のクロマトグラフィー 後、ＳＰ−Ｃが溶離する範囲（２２０ｎｍにおけるＵＶ検出）内に、４〜６個の 画分が２００ｍｌ宛集まる。画分を分析ＨＰＬＣで検査し、相応にプールする。 試料を貯蔵する場合には、試料を液体窒素中で冷凍し、冷凍庫中に−８０℃で保 存する。ＳＰ−Ｃ（ＦＦ／ｌ）は９８．５〜９９．５％の純度で得られる。 分離条件： ４．リン脂質マトリックス中へのＳＰ−Ｃ（ＦＦ／ｌ）の組込み 親油性ペプチドＳＰ−ｃ（ＦＦ／ｌ）をイソプロパノール溶液で、リン脂質マ トリックスの成分を加え、室温で希食塩溶液（ＮａＣｌ０．０６５％ｗ／ｗ）中 へ噴射することにより、リン脂質マトリックスの成分との均質な混合物で沈殿さ せる。肺界面活性物質懸濁液から、ＬＳＦをＳｏｒｖａｌｌ社製遠心分離器を用 いて分離し、電解質溶液（ＮａＣｌ，ＣａＣｌ₂）に再懸濁し、ｐＨ値を０．１ ＮＮａＯＨで６．５に調節する。この水性懸濁液を２０ｍｌの小瓶に詰め、凍結 乾燥する。次の製造例において行った重量および容量の記載は、肺界面活性物質 製剤１０ｇの製造に関する： ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ） ７．００ｇ、パルミトイルオレイルホスファチジルグリセロールアンモニウム塩 （ＰＯＰＧ×ＮＨ₄）３．０８ｇおよびパルミチン酸０．２５ｇを、４０℃で９ ０％のイソプロパノール２００ｍｌに溶解し、次に室温に冷却する。得られるリ ン脂質溶液を、ＨＰＬＣ精製から得られる、精製されたＳＰ−Ｃ（ＦＦ／ｌ）２ ００ｍｇを含有する溶液と合する。得られる“噴霧溶液”を、撹拌下に重炭酸塩 溶液（約５％のＮａＨＣＯ₃溶液５ｍｌ）でｐＨ４．５に調節する。 “噴霧溶液”は、室温で１成分ノズルにより２５ｍｌ／分の噴霧速度で希薄Ｎ ａＣｌ溶液（０．０６５％ｗ／ｗ）９．６ｌ中に激しい撹拌下に導入する。乳白 光溶液が生成し、この溶液から４〜８℃で２時間の貯蔵後、肺界面活性物質製剤 は電解質溶液（Ｈ₂Ｏ３００ｍｌ中、ＣａＣｌ₂×２Ｈ₂Ｏ３．０ｇおよびＮａＣ ｌ６１．３ｇ）を噴霧することにより沈殿する。肺界面活性物質懸濁液（全容積 １０．８〜１１．０ｌ）を、４℃で夜通し貯蔵し、次いでＳｏｒｖａｌｌ社製遠 心分離器（ＲＣ２−Ｂ）を用い１６０００ｇでその都度３０分遠心分離する。遠 心分離ケークをその都度付着する残留イソプロパノールを除去するために０．６ ５％の食塩溶液１／２容積中に再懸濁させ、改めて遠心分離する。この手順を合 計３〜４回繰り返す。最後の遠心分離のケークを、０．６５％のＮａＣｌ溶液４ ００ｍｌにとり、０．１ＮＮａＯＨでｐＨ６．５に調 節し、６．２ｇ宛２０ｍｌの瓶に分配する。瓶の内容物を次のように凍結乾燥す る：−４５℃および常圧で６時間冷凍、０．１６ｍｂａｒおよび−２０℃で５４ 時間凍結乾燥、その後さらに強く乾燥するため−２０℃および０．０２ｍｂａｒ でなお５時間。 それぞれ肺界面活性物質０．１５０ｇ（ＮａＣｌなしで計算）を含有する６５ 〜６６個の瓶が得られる。 乾燥肺界面活性物質試料を冷凍庫中に４℃で貯蔵し、使用前に水または生理食 塩水で懸濁させなければならない（懸濁液濃度２５ｍｇ／ｍｌ）． 瓶１個あたり下記のものが含有されていた： ジパルミトイルホスファチジルコリン９５．６ｍｇ パルミトイルオレイルホスファチジルグリセロール （アンモニウム塩）４２．１ｍｇ ＳＰ−Ｃ（ＦＦ／ｌ） ２．７ｍｇ パルミチン酸 ６．８ｍｇ 塩化カルシウム（無水） ２．９ｍｇ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＥ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/09 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 ヴォルフ−リューディガー ウルリッヒ ドイツ連邦共和国 Ｄ−78464 コンスタ ンツ ヘーベルシュトラーセ ３ (72)発明者 エルンスト シュトゥルム ドイツ連邦共和国 Ｄ−78465 コンスタ ンツ ボールシュトラーセ ９ (72)発明者 ウーヴェ クリューガー ドイツ連邦共和国 Ｄ−78464 コンスタ ンツ ノイハウザー シュトラーセ 11 (72)発明者 ディートリッヒ ヘーフナー ドイツ連邦共和国 Ｄ−78464 コンスタ ンツ ベートーヴェンシュトラーセ ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式１ ［式中ＡはＨまたはＰｈｅを表わし、 ＢはＰｈｅまたはＴｒｐを表わしかつ ＣはＩｌｅ、ＬｅｕまたはＳｅｒを表わす］の肺界面活性物質活性を有する ポリペプチド。 ２．ＡがＨまたはＰｈｅを表わし、ＢがＰｈｅを表わしかつＣがＩｌｅを表わす ことを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。 ３．ＡがＰｈｅを表わし、ＢがＰｈｅを表わしかつＣがＩｌｅを表わすことを特 徴とする請求項１記載のポリペプチド。 ４．請求項１から３までのいずれか１項記載の肺界面活性物質活性ポリペプチド を含有することを特徴とする、哺乳動物における呼吸困難症候群を治療するため の医薬組成物。 ５．ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｂ群からの少なくとも１種 の他の肺界面活性物質が含有されていることを特徴とする請求項４記載の医薬組 成物。 ６．ＳＰ−Ｂが含有されていることを特徴とする請求項５記載に医薬組成物。 ７．リン脂質が含有されていることを特徴とする請求項４または５記載の医薬組 成物。 ８．ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレイル ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）および／またはホスファチジルグリセ ロール（ＰＧ）が含有されていることを特徴とする請求項７記載の医薬組成物。 ９．パルミチン酸および電解質が含有されていることを特徴とする請求項７記載 の医薬組成物。 １０．電解質としてカルシウム塩および／またはナトリウム塩が含有されている ことを特徴とする請求項９記載の医薬組成物。