CN109001466A

CN109001466A - 一种用于osa的肺表面活性蛋白试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109001466A
Application number: CN201810799462.2A
Authority: CN
Inventors: 李南方; 邵亮; 姚晓光; 木拉力别克·黑扎提
Original assignee: Peoples Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region
Current assignee: Peoples Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2018-12-14

Abstract

本发明提供了一种用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，用于OSA的肺表面活性蛋白包括从血清中检测的SP‑A和SP‑D与从血清或者肺灌洗液中检测的SP‑B和SP‑C，试剂盒有四个隔室，第一隔室存放待检测SP‑A和SP‑D的检测血清，第二隔室存放待检测SP‑B和SP‑C的血清或者肺灌洗液，第三隔室容纳用于检测肺表面活性剂的试剂，所述第四隔室容纳用于促进第三分区中的试剂检测的试剂。本发明试剂盒检测时间缩短到一天内，甚至能做到早晨采集血液下午获得检测结果，大大缩短了检测时间，加快了治疗进程，而且试验86例患者中无一例误诊或者漏诊，诊断准确性达到了100%，在OSA诊断领域具有广泛的适用性。

Description

一种用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，具体说，本发明具体涉及一种医疗试剂盒的技术领域。

背景技术

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)和高血压(HTN)被认为都会增加心血管事件及全因死亡的风险。在中年男性患者中，临床上二者的重叠非常常见并且会进一步增加心血管病时间的风险。随着近年研究的不断深入，OSA合并HTN患者靶器官损害的范围不断扩大，新的可能的作用机制不断被提出，但是诊断手段还需要进一步改进以便更加准确快速的实现诊疗。

自1929年Veergaard首先提出肺表面活性物质以来，我们已经知道肺表面活性物质的确切组成以及肺表面活性物质的合成、分泌、调节和代谢。肺表面活性物质的主要功能是降低肺泡表面张力和防止呼气末肺萎陷，对维持肺泡正常结构和稳定通气具有重要作用。对于肺表面活性物质的研究长期以来主要集中在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和新生儿呼吸窘迫综合征方面，随着对进一步研究发现，它不仅存在于肺泡中，也存在于气管及各级支气管中，呼吸道中的表面活性物质可以维持气道稳定性促进液体的清除，防止液体在管腔内聚集，并具有宿主防御、免疫调节等重要功能，但是将肺表面活性物质应用到阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)诊断中却鲜有报道，而且已有的诊断都效果不理想，可重复性差，诊断准确性和诊断速度都很差。

发明内容

针对现有技术中将肺表面活性物质应用到阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)诊断中却鲜有报道，而且已有的诊断都效果不理想，可重复性差，诊断准确性和诊断速度都很差的技术问题，本发明提供了一种用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，利用血液样本作为诊断材料，利用本发明试剂盒通过检测SP-A、SP-B、 SP-C和SP-D能够快速的进行确诊治疗，在OSA治疗领域具有广泛的适用性。

本发明提供了一种用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，所述用于OSA的肺表面活性蛋白包括SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。

本发明中，SP-A和SP-D从血清中检测、SP-B和SP-C从肺灌洗液中提取检测。

本发明中，SP-A、SP-D、SP-B和SP-C从血清中检测。

本发明中，试剂盒有四个隔室，第一隔室存放待检测SP-A和SP-D的检测血清，第二隔室存放待检测SP-B和SP-C的血清或者肺灌洗液，第三隔室容纳用于检测肺表面活性剂的试剂，所述第四隔室容纳用于促进第三分区中的试剂检测的试剂。

本发明中，用于检测肺表面活性剂的试剂为乙二胺四乙酸、酶标试剂与 SP-A、SP-D、SP-B和SP-C标准品稀释液。

本发明中，用于促进第三分区中的试剂检测的试剂为蒸馏水、底物TMB。

本发明中，试剂盒中检测方法包括如下步骤：

(1)血标本用乙二胺四乙酸3ml抗凝，经过抗凝处理的血标本或者肺灌洗液离心处理以去除沉淀颗粒获得血清或者澄清肺灌洗液，然后分装样品，封存入-80℃冰箱储存；

(2)测试前从冰箱取出室温下放置1h解冻血清或者澄清肺灌洗液，解冻后放入离心机以300转/分的转速离心20分钟，收集上清液用纯化的相应指标抗体包被微孔板，制成固相抗体；

(3)往包被单抗的微孔中依次加入相应指标SP-A、SP-B、SP-C和SP-D 再与HRP标记的相应指标抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；

(4)经过彻底洗涤后加底物TMB显色；

(5)用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，通过标准曲线计算样品中SP-A，SP-B，SP-C和SP-D浓度。

本发明中，试剂盒包括盒体和酶标包被板，盒体一侧底部设有两组酶标包被板。

本发明中，盒体设有第一隔室、第二隔室、第三隔室和第四隔室，第一隔室和第二隔室底部分别设有一组酶标包被板，酶标包被板上面设有密封板，第一隔室和第二隔室上部均设有离心管孔、移液管孔和密封板高度调节杆，离心管孔中设有离心管，移液管孔中设有移液管，第三隔室和第四隔室上部设有试剂瓶孔和移液管孔，第四隔室设有洗瓶，第三隔室上部设有洗耳球。

本发明中，盒体与酶标包被板相邻的两侧设有把手，盒体远离酶标包被板的一端设有四个挂钩，密封板端头设有拉环，试剂瓶孔和离心管孔旁边设有标签。

利用血清或者肺灌洗液中SP-A，SP-B，SP-C和SP-D浓度诊断的试剂盒在 OSA诊疗装置中的应用。

本发明的有益效果:

本发明提供的一种用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，用于OSA的肺表面活性蛋白包括SP-A、SP-B、SP-C和SP-D种，本申请检测时间缩短到一天内，甚至能做到早晨采集血液下午获得检测结果，大大缩短了检测时间，加快了治疗进程，而且试验86例患者中无一例误诊或者漏诊，诊断准确性达到了100％，在OSA诊断领域具有广泛的适用性。

附图说明

图1为本发明试剂盒结构示意图。

图1中，1-盒体、2-酶标包被板、3-密封板、4-拉环、5-定位棱、6-第一隔室、7-第二隔室、8-第三隔室、9-第四隔室、10-把手、11-移液管、12-密封板高度调节杆、13-试剂瓶孔、14-标签、15-洗瓶、16-洗耳球、17-离心管。

具体实施方式

下面结合附图1和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明的方法不限于下述实施例。

本发明中用到的酶标包被板，密封板，移液管，标签，洗瓶，洗耳球离心管，酶标仪，SP-A、SP-B、SP-C和SP-D标准液，乙二胺四乙酸，酶标试剂，蒸馏水，底物TMB都可从市场途径采购获得。

实施例一：本发明用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒

实施例二：本发明用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒

本发明提供了一种用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，所述用于OSA的肺表面活性蛋白包括SP-A、SP-B、SP-C和SP-D，SP-A、SP-D、SP-B和SP-C 从血清中检测。

本发明中，试剂盒有四个隔室，第一隔室存放待检测SP-A和SP-D的检测血清，第二隔室存放待检测SP-B和SP-C的血清或者肺灌洗液，第三隔室容纳用于检测肺表面活性剂的试剂，所述第四隔室容纳用于促进第三分区中的试剂检测的试剂，用于检测肺表面活性剂的试剂为乙二胺四乙酸、酶标试剂与SP-A、 SP-D、SP-B和SP-C标准品稀释液，用于促进第三分区中的试剂检测的试剂为蒸馏水、底物TMB。

实施例三：本发明用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒

本发明中，试剂盒中检测方法包括如下步骤：

(4)经过彻底洗涤后加底物TMB显色；

实施例四：本发明用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒

本发明中，试剂盒中检测方法包括如下步骤：

(1)标本储存：首先将血标本用乙二胺四乙酸(EDTA)3ml抗凝，离心处理以去除血标本或者肺灌洗液中大量沉淀颗粒，然后分装样品，封存入-80℃冰箱储存，在进行浓度测定之前避免反复取出样品。

(2)测定前处理：从实验室冰箱中取出冻存盒并在室内放置1小时充分解冻，放入离心机以300转/分的转速离心20分钟，收集血清或者肺灌洗液上清液。

(3)固相抗体制备：取出酶标包被板，在此微孔板上设定标准品孔10个，往十孔中反复加入或取出标准品及标准品稀释液，最终标准品孔中的加样量均为50μl，十孔浓度分别为18ng/L，18ng/L，12ng/L，12ng/L，6ng/L，6ng/L， 3ng/L，3ng/L，1.5ng/L，1.5ng/L。

(4)加样：在固相抗体包被的微孔中设置待测样品孔及空白对照孔，在上述待测样品孔中用加样枪加入样品稀释液40μl、待测样品10μl，操作过程中注意样品应加到孔底部，且尽量保持枪头不接触孔底。空白对照孔中不做任何处理。晃动酶标包被板尽量使液体混匀，用封板膜封存后温浴箱放置30分钟，温度37℃。此时样品与相应指标抗体形成抗原抗体复合物。

(5)加酶：将密封板揭去，将酶标包被板取出，将孔中液体弃掉并甩干，将事先用蒸馏水30倍稀释好的浓缩洗涤液加入各孔，静止30秒后重新弃掉液体，重复洗涤液加入、静止、弃掉过程五次，而后除空白对照孔外每孔加入酶标试剂50μl，重新放入温浴箱，取出后加入洗涤液，操作步骤同上。此时形成抗原-抗体-酶标试剂复合物。

(6)显色及终止反应：在酶标包被板各孔中加入底物TMB显色50μl，混匀后在阴暗处静止15分钟，此时孔中液体成蓝色，加入终止液50μl，液体酸化后从蓝色转变为黄色，且黄色的深浅与孔中样品浓度呈正比。

(7)测定计算浓度：在加入终止液的15分钟内，酶标仪测定各孔液体的吸光度值即OD值，以空白对照孔调零，酶标仪波长控制在450nm。结合标准物浓度及吸光度值，通过标准曲线及回归方程式计算出样品的实际浓度。

实施例五：本发明用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒

本发明中，试剂盒包括盒体1和酶标包被板2，盒体1一侧底部设有两组酶标包被板2。

本发明中，盒体1设有第一隔室6、第二隔室7、第三隔室8和第四隔室9，第一隔室6和第二隔室7底部分别设有一组酶标包被板2，酶标包被板2上面设有密封板3，第一隔室6和第二隔室7上部均设有离心管孔、移液管孔和密封板高度调节杆12，离心管孔中设有离心管17，移液管孔中设有移液管11，第三隔室8和第四隔室9上部设有试剂瓶孔13和移液管孔，第四隔室9设有洗瓶15，第三隔室8上部设有洗耳球16，盒体1与酶标包被板2相邻的两侧设有把手10，盒体1远离酶标包被板2的一端设有四个挂钩，密封板3端头设有拉环4，试剂瓶孔13和离心管孔旁边设有标签14。

实施例六：本发明用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒效果验证试验

选取2014年12月-2017年12月期间在高血压诊疗中心住院的男性患者，并在睡眠监测中心行睡眠呼吸监测的患者86例，入选患者有明确的打鼾病史(本人、家人或同病房患者述有夜间打鼾)、无诱因白天嗜睡、不能解释的唇舌紫绀、小颌畸形、血压不易控制达标的肥胖，所有患者均按照标准方法测量体重、身高、腹围、颈围和血压值，计算体重指数＝体重(Kg)/身高(m)²，并进行肺功能、肺容积及脉冲震荡检测测定。

诊断标准：阻塞性睡眠呼吸暂停是指口鼻气流消失，胸腹式呼吸仍然存在。系因上气道阻塞而出现呼吸暂停，但是中枢神经系统呼吸驱动功能正常，继续发出呼吸运动指令兴奋呼吸肌，因此胸腹式呼吸运动仍存在。

睡眠呼吸暂停：睡眠过程中口鼻呼吸气流消失或明显减弱(较基线幅度下降>90％)，持续时间≥10S。低通气：睡眠过程中口鼻气流较基线水平降低>30％并伴SaO₂下降≥4％，持续时间≥10S；或者是口鼻气流较基线水平降低>50％并伴SaO₂下降≥3％，持续时间≥10S。未达到呼吸暂停或低通气标准，时间 ≥10S的异常呼吸努力并伴有相关微觉醒也记为低通气事件。根据呼吸暂停低通气指数分为轻度(5次/分≤AHI<15次/分)、中度(15次/分≤AHI<30次/分)、重度(AHI≥30次/分)OSAS。

所有入选患者均进行胸围、腹围、体重、身高等测量，胸围测量是指软皮尺绕乳房最丰满处一周所显示的长度，腹围测量是指软皮尺绕脐一周所显示的长度，在体重、身高测量时嘱患者脱掉鞋袜并着单衣进行。血压测量标准：操作者先检查仪器是否完好处于备用状态，核对患者姓名。进行血压测量前应先排空膀胱并休息至少20分钟以上，尽量着单衣取坐位。首先嘱患者安静保持正确体位，并充分暴露整个右臂，打开水银柱血压计开关，将袖带绑与患者肘关节以上两横指，松紧以袖带与皮肤之间能放下1手指为标准，此时操作者戴好听诊器，触诊肘窝动脉搏动最明显处将听诊器体件覆盖其上，关闭听诊器充气皮球的阀门后开始充气，眼睛直视听诊器刻度，待听诊动脉搏动音消失后继续充气使水银柱上升。挤压皮球前关闭充气皮球的阀门后再进行充气，至动脉搏动消失为止，继续加25-30mm Hg左右，打开听诊器气阀缓慢均匀放气的同时注意动脉搏动音，当动脉波动第一次出现时即为收缩压，动脉最后一次搏动或明显减弱时为舒张压，测量结束后将袖带取下排空气体，血压计倾斜一定角度关闭水银柱开关。重复按上述方法测量血压3次，取平均值。

生化指标测定由医院检验中心完成，所有纳入对象常规禁食12小时，在次日早晨患者取坐位抽取肘正中静脉血3-5ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)3ml做抗凝处理，用于特殊及常规生化指标的测定。常规生化指标检测(胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、电解质、糖化血红蛋白、高敏C反应蛋白等水平)，采用日立7600型全自动生化分析仪测定。

利用本发明实施例五的用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒和实施例四的方法进行测定采集血清中SP-A，SP-B，SP-C和SP-D浓度。

参数	非OSA组	OSA组	p
				年龄(岁)	45.22±6.17	45.23±5.55	0.781
体重指数(kg/m²)	28.17±3.02	28.09±2.89	0.049
				SP-A(ng/ml)	158.17±32.22	141.45±32.44	0.242
SP-B(ng/ml)	47.81±5.14	39.56±5.42	<0.001
				SP-C(ng/ml)	35.01±4.76	34.19±5.21	0.572
SP-D(ng/ml)	19.24±3.76	17.69±3.47	0.147

从上述数据可以看出，单从SP-A，SP-B，SP-C和SP-D中的一种或者两种判断受测试误差的影响和患者本身机能的影响不能准确判定是否存在OSA情况，但是如果有一种测试盒能够同时进行四种检测，就能准确快速的判断患者是否患有OSA，从平行试验的86例试验对象来看，本申请检测时间缩短到一天内，甚至能做到早晨采集血液下午获得检测结果，大大缩短了检测时间，加快了治疗进程，而且上述86例无一例误诊或者漏诊，诊断准确性达到了100％。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims

1.一种用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，其特征在于，所述用于OSA的肺表面活性蛋白包括SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。

2.如权利要求1所述的用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，其特征在于，所述SP-A和SP-D从血清中检测、SP-B和SP-C从肺灌洗液中提取检测。

3.如权利要求1所述的用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，其特征在于，所述SP-A、SP-D、SP-B和SP-C从血清中检测。

4.如权利要求1所述的用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒有四个隔室，第一隔室存放待检测SP-A和SP-D的检测血清，第二隔室存放待检测SP-B和SP-C的血清或者肺灌洗液，第三隔室容纳用于检测肺表面活性剂的试剂，所述第四隔室容纳用于促进第三分区中的试剂检测的试剂。

5.如权利要求4所述的用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，其特征在于，所述用于检测肺表面活性剂的试剂为乙二胺四乙酸、酶标试剂与SP-A、SP-D、SP-B和SP-C标准品稀释液。

6.如权利要求4所述的用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，其特征在于，所述用于促进第三分区中的试剂检测的试剂为蒸馏水、底物TMB。

7.如权利要求5或者6所述的用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中检测方法包括如下步骤：

（1）血标本用乙二胺四乙酸3ml抗凝，经过抗凝处理的血标本或者肺灌洗液离心处理以去除沉淀颗粒获得血清或者澄清肺灌洗液，然后分装样品，封存入-80℃冰箱储存；

（2）测试前从冰箱取出室温下放置1h解冻血清或者澄清肺灌洗液，解冻后放入离心机以300转/分的转速离心20分钟，收集上清液用纯化的相应指标抗体包被微孔板，制成固相抗体；

（3）往包被单抗的微孔中依次加入相应指标SP-A、SP-B、SP-C和SP-D再与HRP标记的相应指标抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；

（4）经过彻底洗涤后加底物TMB显色；

（5）用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，通过标准曲线计算样品中SP-A，SP-B，SP-C和SP-D浓度。

8.如权利要求7所述的用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体和酶标包被板，盒体一侧底部设有两组酶标包被板。

9.如权利要求8所述的用于OSA的肺表面活性蛋白试剂盒，其特征在于，所述盒体设有第一隔室、第二隔室、第三隔室和第四隔室，第一隔室和第二隔室底部分别设有一组酶标包被板，酶标包被板上面设有密封板，第一隔室和第二隔室上部均设有离心管孔、移液管孔和密封板高度调节杆，离心管孔中设有离心管，移液管孔中设有移液管，第三隔室和第四隔室上部设有试剂瓶孔和移液管孔，第四隔室设有洗瓶，第三隔室上部设有洗耳球，盒体与酶标包被板相邻的两侧设有把手，盒体远离酶标包被板的一端设有四个挂钩，密封板端头设有拉环。

10.如权利要求1所述的利用血清或者肺灌洗液中SP-A，SP-B，SP-C和SP-D浓度诊断的试剂盒在OSA诊疗装置中的应用。