JPH10503182A - 金属複合体及びオリゴヌクレオチドから作られた接合体、該接合体を含む薬剤、放射線診断におけるそれらの使用並びにそれらの製造のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、オリゴヌクレオチドに接続している構成物により結合された複合剤又は複合体を含む化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド接合体に関する。この場合において、オリゴヌクレオチドは、天然のヌクレアーゼによるデグラデーションを防ぐ又は少くとも大きく阻害する様に改良される。オリゴヌクレオチドラジカルは標的構造に特異的かつ高結合アフィニティーで結合することができ、これにより、結合複合剤又は複合体による特定の治療又は診断効果を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】 金属複合体及びオリゴヌクレオチドから作られた接合体、該接合体を含む薬剤、 放射線診断におけるそれらの使用並びにそれらの製造のための方法 本発明は、請求の範囲、例えば複合薬剤又は複合体を含むオリゴヌクレオチド 接合体を特徴とする対象に関する。これらの接合体は、診断及び治療の分野に用 いられる。像形成診断は、過去数十年の大きな進歩をとげ、続けて更に発展して いる。それは、主要な介入なしに生きている体の脈管系、ほとんどの器官及び多 くの組織を目で見ることを可能にする。病気は、それらが体内の解剖学的構造の 形状、大きさ、及び位置の明らかな変化を導くため、多くの場合、診断される。 体の内側からのこのような解剖学的データは、Ｘ線技術、超音波診断及び磁気共 鳴断層撮影法により得られうる。この言及された技術の各々の効果は、結果の像 における組織及び体液の自然なコントラストの増強のための医薬剤の使用により 改良され得る。問題の医薬剤は、腔又は管のコントラストを変える目的で体腔内 に導入されるか又は血管内に注入される。更に、それらは生物内の血流により広 がり、器官及び組織の可視性を変化させ得る。例外的な場合において、このよう な物質は体内における特定の構造に結合し、及び／又は後者により輸送及び／又 は排出される。この方法において、機能は個々の場合において目で見えるように して、病気を診断するのにも用いられ得る。 これに対して、核の診断は、それ自体が可視化され得る物質を基礎とする。こ の場合、広範囲の放射線を発する放射性同位体が体内に導入される。生物内での これらの物質の広がりは、適切な検出器 により追跡され得る。核の医療方法の利点は、放射性医薬剤として設計されたシ グナル伝達性放射性物質の低い投与量での高い効果である。 組織に影響を与えるα−もしくはβ−放射線又は他の毒性分解産物を放出する 同位体が用いられるなら、放射性医薬剤は、治療目的のため、例えば腫瘍の破壊 のためにも用いられ得る。有害でない同位体又は物質が体内に導入され、例えば 中性子もしくはＸ線放射線、超音波又は放射性波によりそこでのみ医薬として有 効な形態に転化することにおいても同じ結果が達成され得る。 一般的な問題は、問題の器官及び組織の形状、構造及び循環の明らかな変化が 利用できない場合の病理学的変化の診断及び限局化である。このような診断及び 追跡調査は、例えば、転移のための調査を含む腫瘍病の場合、器官への組織の不 十分な供給の評価、並びに特定の感染及び代謝病の場合において、決定的な重要 なものである。 新しい利用できる治療及び像形成診断法は、さもなければ検出不能な病理学的 変化の部位において蓄積する医薬調整物の有効性にかなり依存する。 この場合における市販のコントラスト媒体は、全く支配的にいわゆる非特異的 な調製物である。それらは、例えば注入によりそれらが導入される空間において 受動的に広がる。 過去に、検出され得、生きている生物内に広がる点で特異性を有することが予 想され得る多くの物質及び物質クラスが同定されている。これの例は、抗体に加 えて、レクチン、全ての型のレセプター結合物質、細胞、膜及び膜構成物、核酸 、天然の代謝物及びそれらの誘導体、並びに無数の医薬物質である。ペプチドは 、特別の関心と共に研究されている。 米国特許第4,707,352は、放射性同位体との標識複合分子に特別の過程を与え るが、金属イオンの結合のための十分に適した複合剤は記載されていない。 EP−Ａ−0 285 057は、生体内診断剤又は治療剤として用いるための、用いら れるヌクレオチドの生体内不安定性のため適切でないヌクレオチド複合剤接合体 を記載し、これは、適合性及び薬物速度論の他の要求にほとんど合致しない。 例えば米国特許第4,707,440のような多くの米国特許は、検出可能な化学基を 含む修飾ポリマーを与える。このポリマーは、ポリヌクレオチド及びオリゴヌク レオチドであり得るが、それらは、天然のヌクレアーゼによるデグラデーション に対して安定でないばかりでなく、それらが標的構造に高結合アフィニティーで 特異的に結合するように特定の方法により選択されない。これらの検出可能分子 の特定の実例形態は、米国特許第4,843,122号及び第4,943,523号に言及される。 この方法において改良された個々のヌクレオチドは、米国特許第4,952,685号に クレームされる。像形成過程におけるこれらの薬剤の使用は、米国特許第4,849, 208号に開示される。 本発明の目的は、標的構造の検出のための特異的結合診断剤の調製である。こ れにより、例えば試験管内及び生体内の器官、組織及びそれらの病理学的変化の 視覚化が可能となる。 この目的は、オリゴヌクレオチドラジカルに加えて、直接的結合又は接続する 構成物により結合された複合物を示し、それらのオリゴヌクレオチドラジカルが 、天然のヌクレアーゼによるデグラデーションが防がれ、又は少くとも大きく阻 害されるように修飾されるように修飾されているオリゴヌクレオチド接合体によ り達成される。 本発明の対象は、次の通りである： １．オリゴヌクレオチドラジカルＮ及びｎ置換基（Ｂ−Ｋ）（ここで、Ｂは、 オリゴヌクレオチドラジカルへの直接の結合又はそれに接続する構成物を表し、 Ｋは、 外からの放射線により放射性同位体に転化され、 外からの放射線を異なる質、異なるエネルギー含量、及び／又は異なる波長の 放射線に転化する 原子番号５，21〜29，31，39，42〜44，49，57〜83又は85の要素の放射性金属 同位体の複合剤もしくは複合体、又は安定な同位体を意味する）からなるオリゴ ヌクレオチド接合体であって、オリゴヌクレオチドラジカルＮが、天然のヌクレ アーゼによるデグラデーションを防ぐ又は少くとも重大に阻害する改良がなされ ていることを特徴とするオリゴヌクレオチド接合体。 ２．好ましい実施形態において一般式（Ｉ） Ｎ−（Ｂ−Ｋ）_n （Ｉ） （ここで、Ｎは他の標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合するオリゴ ヌクレオチドであり、天然のヌクレアーゼによるデグラデーションを重大に削減 する改良がなされており、 ＢはＮとＫとの間の接続を形成する化学結合又は接続構成物であり、 Ｋはシグナル伝達性又は治療的に活性な要素を示し得る複合リガンドであり、 そして ｎは１〜10の間の数である） に表される本発明のオリゴヌクレオチド接合体。 ３．Ｎが５〜200ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである請求項１又は２に 記載の化合物であって、 ａ）その糖ユニットの２’位置が、互いに独立して、次の基： 基−OR（ここで、Ｒは２までの水酸基を任意に含み、１〜５の酸 素原子により任意に割り込まれている１〜20の炭素原子のアルキル基である）、 水素原子、 水酸基、 フッ素原子、 アミン基、 アミノ基、 及び互いに独立して基Ｒと任意にエーテル化された末端位置３’及び５’に存 在する水酸基により占有されており、及び／又は ｂ）ヌクレオチド間結合として任意に用いられるホスホジエステルが、互いに 独立して、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又はアルキルホスホネー ト、好ましくはメチルホスフェートであり、及び／又は ｃ）３’−及び５’−位置における末端基がｂ）に記載されるヌクレオチド間 結合により互いに分子内様式で結合され、及び／又は ｄ）それが３’−３’−又は５’−５’−位置に結合するｂ）に記載のヌクレ オチド間結合を含み、及び／又は ｅ）それが、３−位置においてＣ₂〜Ｃ₂₀ヒドロキシアルキル基により各々エ ステル様に２つのチミジンに結合し、又は２’−又は３’−又は５’−位置にお いて他の糖の水酸基と共に、エステル様に、類似置換されたチミジン基に結合す るｂ）に記載のホスホジエステル結合を含み、及び／又は ｆ）３’−及び５’−位置における末端基がｂ）に記載のように任意に改良さ れたヌクレオチド間結合を含む ことを特徴とする１又は２に記載の化合物。 ４．オリゴヌクレオチドＮが15〜100ヌクレオチドを含むことを特徴とする３ に記載の化合物。 ５．Ｎが、他の標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合し、ランダム な配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物が前記標的構造と一緒にされ、ここで 特定のオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの混合物に比較して前記標的構 造に対する増加されたアフィニティーを示し、後者が前記オリゴヌクレオチド混 合物の残りから分離され、その後前記標的構造に対して増加されたアフィニティ ーを有するオリゴヌクレオチドが、前記標的構造に結合するオリゴヌクレオチド の増加された部分を示すオリゴヌクレオチドの混合物を得るために増幅されるこ とにおいて得られうるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする１〜４のいず れか一に記載の化合物。 ６．Ｎが、他の標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合し、 ａ）最初に、DNA鎖が、その３’末端上において、該DNA鎖がRNAポリメラーゼ のためのプロモーターに相補的であり、同時にポリメラーゼ鎖反応(PCR)のプラ イマーに相補的である規定された配列を示すように、そして前記DNA鎖がポリメ ラーゼ鎖反応のためのプライマー配列に相補的である５’末端上の規定された配 列を示し、前記規定された配列間の配列がランダム配列を含むように化学合成に より作製されること、及び ｂ）前記DNA鎖がRNAポリメラーゼにより相補的RNA鎖に転写され、リボース単 位の２’−位置において改良されたヌクレオチドが前記ポリメラーゼに供される こと、及び ｃ）この様に製造されたRNAオリゴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドが特 異的に結合すべき前記標的構造と一緒にされること、及び ｄ）前記標的構造に結合されたこれらのオリゴヌクレオチドが結合していない オリゴヌクレオチドからの標的構造と最初に一緒にさ れ、次に結合したオリゴヌクレオチドが前記標的構造から再び分離されること、 及び ｅ）これらの標的構造特異的RNAオリゴヌクレオチドが相補的DNA鎖において逆 転写酵素により転写されること、及び ｆ）これらのDNA鎖がポリメラーゼ鎖反応と共に規定されたプライマー配列を 用いて増幅されること、及び ｇ）その後、この様にして増幅されたDNAオリゴヌクレオチドがRNAポリメラー ゼにより、RNAオリゴヌクレオチドにおける改良されたヌクレオチドで再び転写 されること、及び ｈ）先に記載の選択ステップｃ）〜ｇ）が、前記標的構造に対する高結合アフ ィニティーを特徴とするオリゴヌクレオチドが十分に選択されるまで任意にしば しば繰り返され、その後これにより得られたオリゴヌクレオチドの配列が任意に 決定され得ることにおいて得られうるオリゴヌクレオチドであることを特徴とす る１〜５のいずれか一に記載の化合物。 ７．前記標的構造が高分子、動物もしくはヒトのような高等生物の組織構造、 動物もしくはヒトの器官もしくは器官の一部、細胞、腫瘍細胞又は腫瘍から選択 されることを特徴とする６に記載の化合物。 ８．接続構成物Ｂが、 ａ）CH₂−OH基により４’−位置において還元されたオリゴヌクレオチドラジ カルＮの４’端に、及び／又は ｂ）水素原子により３’−位置において還元されたオリゴヌクレオチドラジカ ルＮの３’端に、及び／又は ｃ）２つのヌクレオチド各々の間のOH基により還元されたホスホジエステルブ リッジに、及び／又は ｄ）５−，８−位置において各々水素原子により、及び／又は２ −，４−及び６−位置においてアミノ基により還元された１〜10のヌクレオベー スに 結合されていることを特徴とする１〜７のいずれか一に記載の化合物。 ９．Ｂが、前記複合剤又は複合物にＸ側において、オリゴヌクレオチドにＺ側 において接続された一般式：Ｘ−Ｙ−Ｚ¹ 〔ここで、Ｘは直接の結合、−NH又は−Ｓ基であり、 Ｙは、１〜２シクロヘキシレン、１〜５イミノ、１〜３フェニレン、１〜３フ ェニレンイミノ、１〜３フェニレノキシ、１〜３ヒドロキシフェニレン、１〜５ アミド、１〜２ヒドラジド、１〜５カルボニル、１〜５エチレノキシ、ウレイド 、チオウレイド、１〜２カルボキシアルキルイミノ、１〜２エステル基、Arの１ 〜３基（ここでArは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜２ヘテロ原子及び ／又は１〜２カルボニル基を任意に含む飽和もしくは不飽和５もしくは６員環を 表す）、１〜10酸素、１〜５窒素及び／又は１〜５硫黄原子を任意に含み、及び ／又は１〜５ヒドロキシ、１〜２メルカプト、１〜５オキソ、１〜５チオキソ、 １〜３カルボキシ、１〜５カルボキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜５エステル、 １〜３アミノ、１〜３ヒドロキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜３ Ｃ₁〜Ｃ₇−ア ルコキシ基により任意に置換された直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキレン基であり、 Ｚ¹は、−CONH−CH₂−４’，−NH−CO−４’，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ¹−NH−CH₂− ４’，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ¹−Ｏ−CH₂−４’，Ｏ−Ｐ（Ｓ）Ｒ¹−Ｏ−３’又は− Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−Ｏ−３’（ここで、４’又は３’は末端の糖ユニットとの結 合を示し、Ｒ¹はＯ^-，Ｓ^-，Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル又はＲ²及びＲ³が水素もしくはＣ₁ 〜Ｃ₄アルキル基を意味するNR²R³基である）である〕 を有することを特徴とする８ａ）又は８ｂ）に記載の化合物。 環状構造（Ar）として、特にＮ，Ｓ又はＯのようなヘテロ原子を任意に含む３ 〜６、特に５又は６のＣ原子を有する環状飽和もしくは不飽和アルキレンが適切 である。例として、シクロペンチレン、ピロリレン、フラニレン、チオフェニレ ン、イミダゾリレン、オキサゾリリデン、チアゾリレン、ピラゾリレン、ピロリ ジレン、ピリジレン、ピリミジレン、マレインイシジレン及びフタルイミジレン 基が言及され得る。 10．Ｂが、前記複合剤又は複合物にＸ側において、オリゴヌクレオチドにＺ側 において接続された一般式：Ｘ−Ｙ−Ｚ² 〔ここで、Ｚ²は、２つの隣接する糖ユニット： を結合するブリッジにおいて、基−NR²−，−Ｏ−又は−Ｓ−を表し、Ｘ，Ｙ、 及びＲ²は９に示される意味を有する〕 を有することを特徴とする８ｃ）に記載の化合物。 接続構成物（９に従う）Ｚ¹−Ｙ−Ｘ又は（10に従う）Ｚ²−Ｙ−Ｘのラジカル Ｙとしては、例として、ラジカル が挙げられ得る。 11．Ｂが、一般式：Ｘ−Ｙ−Ｚ³ 〔ここでＺ³は−NH基又は前記ヌクレオベースへの直接の結合を表し、Ｘ及び Ｙは９に示される意味を有する〕を有することを特徴とする８ｄ）に記載の化合 物。 例としては、ラジカル−CH₂−CO−NH−CH₂−CH(OH)−CH₂−，−NH−CO−CH₂− CO−NH−CH₂−CH(OH)−CH₂−，−CO−NH−CH₂−CH₂−NH−，−CH₂−Ｓ−CH₂−CH₂ −NH−，−CH₂−Ｓ−CH₂−CH₂−，−(CH₂)₄−Ｓ−CH₂−CH₂−NH−，−CO−CH₂ −Ｓ−CH₂−CH₂−NH−，−CO−CH₂−Ｓ−(CH₂)₆−NH−，−CH＝CH−CO−NH−CH₂ −CH₂−NH−，−CH＝CH−CH₂−NH−，−Ｃ≡Ｃ−CH₂−NH−又は−CO−CH₂−CH₂ −NH−CH₂−CH₂−NH−． が挙げられ得る。 プリン塩基の場合における結合部位として、特に８−位置が適切であり、ピリ ミジン塩基の場合、５−位置が適切である。純粋に形式的には、この場合、各々 の塩基の水素原子がラジカルＢ−Ｋにより置換される。しかし、結合は２−，４ −又は６−位置に任意に含 まれるアミノ基によってもおこり得、これにより例えば、グアニンにおける２− アミノ基により、アデニンにおける６−アミノ基により、又はシトシンにおける ４−アミノ基によっておこる。この場合、各々のアミノ基の水素原子は各々ラジ カルＢ−Ｋにより置換される。 12．前記金属複合物が、像形成要素として、要素銅、ビスマス、テクネチウム 、レニウム又はインジウムから選択される放射性同位体を含むことを特徴とする 先のいずれか一に記載の化合物。 13．本発明は、標的構造を検出するための方法であって、先のいずれか一に記 載の化合物の一以上が、生体内又は試験管内においてシグナルを基にして研究さ れるべきサンプルと一緒にされ、オリゴヌクレオチドＮが特異的かつ高結合アフ ィニティーで結合する標的構造が前記サンプル内に存在するか否かを検出するこ とを特徴とする方法も含む。 14．病気の非侵襲性の診断のための方法であって、１〜12のいずれか一に記載 の化合物の１以上が、生体内でシグナルを基にして研究されるべき標的構造と一 緒にされ、オリゴヌクレオチドＮが特異的に結合する標的構造が研究されるべき 生物内に存在するか否かを検出することを特徴とする方法。 15．本発明の対象は、放射線診断及び／又は、放射線治療における１〜12のい ずれか一に記載の化合物の使用でもある。 16．標的構造の生体内及び／又は試験管内検出のための診断キットであって、 該診断キットが、少くとも１つの１〜12のいずれか一に記載の化合物を含むこと を特徴とする診断キット。 17．１〜４のいずれか一に記載の化合物であって、Ｎが、標的分子に対する特 定の結合アフィニティーを有する非天然のオリゴヌクレオチドリガンドであり、 前記標的分子が、ワトソン／クリック塩 基対形成又は三重らせん結合に主に依存する機構により前記オリゴヌクレオチド リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、前記オリゴ ヌクレオチドリガンドが前記標的分子により結合される周知の生理学的機能を有 する核酸でないことを特徴とする化合物。 本発明に従う接合体が診断剤として用いられるなら、複合剤は原子番号21，26 〜27，29，31，43又は49、好ましくは43又は49の要素の像形成放射性同位体を含 む。本発明に従う接合体が治療剤として用いられるなら、先に記載されるものの 他、更に原子番号５，22〜25，28，42，44，57〜83及び85の要素の同位体も適切 である。先に記載される要素の放射性同位体の他に、特に ａ）外からの放射線により放射性同位体に転化され、 ｂ）外かの放射線を異なる質、異なるエネルギー含量及び／又は異なる波長の 放射線に転化する安定な同位体も処理の範囲において適切である。 オリゴヌクレオチドラジカルに結合した像形成又は治療に有効な置換基Ｂ−Ｋ の数は、一方でオリゴヌクレオチドの値により限定されるが、10より大きくない 。本発明に従うと、１又は２の置換基Ｂ−Ｋが好ましい。 主要なオリゴヌクレオチドラジカルＮの値は限定されない。本発明のために、 ５〜200ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが実用的であり、特に15〜100ヌクレ オチドのオリゴヌクレオチドが好ましい。 本発明に従って用いることができるオリゴヌクレオチドは、生体内で発生する ヌクレアーゼによるデグラデーションに対して安定である。 改良されていないオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドはエ ンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼにより生体内で切断される。RNA類に おけるデグラデーション反応は、２’−水酸基の活性化と共に始まる。他の異化 酵素は、例えばRNSのホスホジエステル結合を切断するリボザイムである(Scienc e 26)，709(1993)を参照）。RNS誘導体の生体内安定性は、他の置換基による２ ’−水酸基の部分的又は完全な置換により増加され得る。このような置換基は、 例えば、アルコキシ基、特にメトキシ基（例えばChem．Pharm．Bull．13，1273( 1965)，Biochemistry 10，2581，(1971)を参照のこと）、水素原子、フッ素原子 （例えばCan．J．Chem．46，1131（1968）を参照のこと）又はアミノ基（例えば J．Org．Chem．42，714(1977)を参照のこと）である。これらの置換体のいくつ か及び他のものも1994年６月に出願された米国出願通し番号08/264,029号に開示 される方法を用いてその２’−位置において誘導される。ヌクレオチド内結合を 安定化するための他の可能性は、ホスホロチオエート(Trends Biochem．Sci．14 ，97(1989))又はホスホロジチオエート(J．Chem．Soc.，Chem．Commun．591（19 83）及びNucleic Acids Res．12，9095(1984))を形成する間のホスホジエステル ブリッジにおける１又は２の酸素原子の置換、並びにホスホジエステルの代わり のアルキルホスホネートの使用（Ann．Rep．N．Y．Acad．Sci. 507，220(1988) ）である。 安定化は、リボースユニットの２’−位置における水酸基が、互いに独立して 修飾されることで達成され得る。このような改良は、OR基、ハロゲン原子、特に フッ素原子、水素原子又はアミン基により、特にアミノ基によるこの水酸基の置 換により達成され得る。アルコキシ基のラジカルＲは、この場合、１〜２水酸基 を任意に含み、１〜５の酸素原子により介在される、メチル、エチル、プロピル 、イソプロピル、ブチル、tert−ブチル、ペンチル又はヘキシルの ような１〜20のＣ原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基又はシクロペン チルもしくはシクロヘキシルのような４〜20のＣ原子を有する環状の未置換又は 置換されたアルキル基を表す。安定化は、この３’−及び５’−位置における水 酸基が任意にエーテル化されるために増加もされる。 ポリヌクレオチドの他の安定化は、ヌクレオチド間結合として用いられるホス ホジエステルが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又はアルキルホス ホネートにより、特に好ましくは例えばメチルホスホネートのような低級アルキ ルホスホネートにより部分的又は完全に、互いに独立して置換されることにおい ておこる。これらのヌクレオチド間結合は、３’及び５’−位置における末端基 に結合され得、又は３’−３’−又は５’−５’−位置に接続もされる。ホスホ ジエステル結合は、ヌクレオベースの窒素又は炭素原子上に存在するヒドロキシ アルキル基による更なる結合を可能にし、これにより、例えば２つのチミジンが ３−位置に存在するヒドロキシアルキル鎖により結合され得、又は８−位置に存 在する基により２つのプリン塩基が結合され得る。結合は、２’−又は３’−又 は５’−位置における水酸基にもおこる。 改良されたヌクレオチド間結合は、好ましくはポリヌクレオチドの端において 任意におこり得、それらは特に好ましくはチミジンに結合される。 本発明に従って、用いられるオリゴヌクレオチドラジカルＮは、特定のオリゴ ヌクレオチド配列に限定されない。しかし、核酸を除く標的構造に高結合アフィ ニティーで特異的に結合するこれらのオリゴヌクレオチドが好ましい。 本発明に従う接合体のための開始物質として必要とされる適切なオリゴヌクレ オチドを同定するための方法は、米国特許第5,270,1 63に記載される。SELEXと呼ばれるこの方法は、いずれかの要求される標的分子 に対する核酸リガンドを作るのに用いられ得る。 SELEX法は、結合アフィニティー及び選択性の実質的にいずれかの要求される 判定基準を用いる、候補のオリゴヌクレオチドの混合物からの選択、並びに結合 、分配及び増幅の段階をおっての繰返しを含む。好ましくはランダムにされた配 列のセグメントを含む核酸の混合物から開始して、SELEX法は、結合のための好 ましい条件下において標的に前記混合物を接触させるステップと、標的分子に特 異的に結合した核酸から未結合の核酸を分けるステップと、前記核酸−標的複合 体を解離するステップと、核酸−標的複合体から解離された核酸を増幅して核酸 のリガンド−リッチな混合物を作るステップと、その後標的分子に対する高度に 特異的な高アフィニティー核酸リガンドを作るのに必要とされるだけのサイクル を通して結合、分配、解離及び増幅のステップを再び繰り返すステップと、を含 む。 基本的なSELEX法は、いくつかの特定の目的を達成するように改良されている 。例えば、1992年10月14日に出願された米国特許出願通し番号07/960,093は、曲 がったDNAのような特定の構造的特徴を有する核酸分子を選択するためにゲル電 気泳動と組み合わせたSELEXの使用を記載する。1993年９月17日に出願された米 国特許出願通し番号第08/123,935号は、標的分子に結合する及び／又は光架橋す る及び／又は光不活性化することができる光反応基を含む核酸リガンドを選択す るためのSELEXを基礎とする方法を記載する。1993年10月７日に出願された米国 特許出願通し番号第08/134,028号は、密接に関連した分子間を識別することがで きる高度に特異的な核酸リガンドを同定するための方法を記載し、これはCounte r-SELEXと呼ばれる。1993年10月25日に出願された米国特許出願通し番号08/143 ,564号は、標的分子に対して高い及び低いアフィニティーを有するオリゴヌクレ オチド間を極めて効果的に分けることを達成するSELEXを基礎とした方法を記載 する。1992年10月21日に出願された米国特許出願通し番号第07/964,624号は、SE LEXが行われた後、改良された核酸リガンドを得るための方法を記載する。1995 年３月８日に出願された米国特許出願通し番号08/400,440号は、その標的にリガ ンドを共有結合させるための方法を記載する。 SELEX法は、生体内安定性の改良又は送出・特徴の改良のようなリガンドに改 良された特徴を与える改良されたヌクレオチドを含む高アフィニティー核酸リガ ンドの同定を含む。このような改良の例は、リボース及び／又はホスフェートに おける化学的置換及び／又は塩基置換を含む。改良された核酸を含むSELEXで同 定された核酸リガンドは、ピリミジンの５−及び２’−位置において化学的に修 飾された核酸誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する1993年９月８日に出願 された米国特許出願通し番号08/117,991号に記載される。米国特許出願通し番号 第08/134,028（前掲）は、２’−アミノ(２’−NH₂)、２’−フルオロ（２’− Ｆ）、及び／又は２’−Ｏ−メチル(２’−OMe)で修飾された１以上のヌクレオ チドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載する。1994年６月22日に出願され た米国特許出願通し番号第08/264,029号は、種々の２’−修飾ピリミジンを含む オリゴヌクレオチドを記載する。 SELEX法は、1994年８月２日に出願された米国特許出願通し番号08/284,063及 び1994年８月28日に出願された通し番号08/234,997に記載されるような他の選択 されたオリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチド機能単位と選択されたオリ ゴヌクレオチドを組み合わせることを含む。これらの出願は、他の分子の要求さ れる特性を有するオリゴヌクレオチドの広範囲の形状及び他の特性、並びに効果 的な増幅及び複製特性の組合せを許容する。 その最も基本的な形態において、SELEX法は、次の一連のステップにより規定 され得る。 １）異なる配列の核酸の候補の混合物を調製する。この候補の混合物は、固定 された配列の領域（即ち、候補の混合物のメンバーの各々は同じ位置に同じ配列 を含む）及びランダムな配列を含む。固定された配列領域は、（ａ）以下に記載 される増幅ステップを助けるため、（ｂ）標的に結合することが知られている配 列をまねるため、又は（ｃ）候補の混合物において核酸の与えられた構造配置の 濃縮を増強するためのいずれかで選択される。ランダムな配列は、全体的にラン ダムにされる（即ちいずれの位置において塩基を見い出す可能性も４のうち１つ ）又は部分的にランダムにされる（例えばいずれの位置における塩基を見い出す 可能性も０〜100％の間のいずれかのレベルで選択され得る）。 ２）候補の混合物を、標的と候補の混合物との間の結合のために好ましい条件 下において選択された標的と接触させる。これらの環境下で候補の混合物の標的 と核酸との間の相互作用は、標的と標的のための最も強いアフィニティーを有す る核酸との間の核酸−標的対を形成するとして考慮し得る。 ３）標的のための最も高いアフィニティーを有する核酸を標的に対するより低 いアフィニティーを有する核酸から分ける。最も高いアフィニティーの核酸に相 当する極めて少量の配列（及び核酸の可能なだけの分子）のみが候補の混合物内 に存在するので、候補混合物中の核酸の重大な量（約５〜50％）が分配の間に保 持されるように分配の判定基準をセットすることが一般に要求される。 ４）標的に対して比較的高いアフィニティーを有するように分配する間に選択 された核酸を、標的に対して比較的高いアフィニティ ーを有する核酸において豊富である新しい候補の混合物を作るように、その後増 幅される。 ５）先の分配及び増幅ステップを繰り返すことにより、新しく形成された候補 の混合物はより少い特有の配列を含み、標的に対する核酸のアフィニティーの平 均の程度は一般的に増加する。その極限までにするために、SELEX法は、標的分 子に対する最も高いアフィニティーを有するもとの候補の混合物から、これらの 核酸を表す１又は少数の特有の核酸を含む候補の混合物を作り出すだろう。 SELEX特許及び出願は、極めて詳細にこの方法を記載する。この過程：候補混 合物内の核酸を分けるための方法；及びリッチな候補混合物を作るために分けら れた核酸を増幅するための方法に用いられ得る標的が含まれる。SELEX特許及び 出願は、蛋白質が核酸結合蛋白質である及びそうでない蛋白質標的の両方を含む いくつかの標的種に対して得られたリガンドも記載する。従って、SELEX法は標 的分子の高アフィニティーリガンドを供するために用いられ得る。 標的分子は好ましくは蛋白質であるが、他の炭水化物、ペプチドグリカン及び 種々の小分子も含み得る。慣用的な蛋白質の抗体と一緒に核酸抗体（オリゴヌク レオチドリガンド）が、生物の構造の一体的部分である分子との特定の相互作用 を通して細胞表面又はウィルスのような標的生物の構造に用いられ得る。オリゴ ヌクレオチドリガンドは、それらが慣用的抗体のように自己寛容により限定され ない点で有利である。また、SELEXは全体的に試験管内過程であるので、核酸抗 体は、合成又は産生のために動物又は細胞培養を必要としない。公知であるよう に、核酸は相補的核酸配列と結合することができる。核酸のこの特性は、核酸分 子の検出、定量及び単離のために広く利用される。これにより、本発明の方法は 、核酸間の公知の結合能力を含むことを意図しない。特に、核酸抗体の使用に関 連する本発明の方法は、核酸分子間の周知の結合アフィニティーを含むことを意 図しない。 いくつかの蛋白質は、核酸オペレーター配列に結合する調節蛋白質のような核 酸配列に結合することにより機能することが知られている。それらの天然の部位 に結合するための、特定の核酸結合蛋白質の周知の能力が、このような蛋白質の 検出、定量、単離及び精製において用いられている。オリゴヌクレオチドリガン ドの使用に関連する本発明の方法は、核酸結合性蛋白質とそれらが結合すること が知られている核酸配列との間の周知の結合アフィニティーを含むことを意図し ない。しかしながら、同じ核酸結合性蛋白質に結合する新規の非天然の配列は、 SELEXを用いて開発され得る。特に、本発明のオリゴヌクレオチドリガンドは、 ワトソン／クリック塩基対形成又は三重らせん結合に主に依存する機構を通して 前記オリゴヌクレオチドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造を含 む標的分子に結合する。ここで、前記オリゴヌクレオチドリガンドは標的分子に より結合される周知の生理学的機能を有する核酸ではない。 SELEXが蛋白質に結合するであろう核酸配列の極めて迅速な決定を許容し、こ れにより未知のオペレーター及び本明細書に記載される出願のために後に用いら れ得る結合部位配列の構造を決定するのに直ちに用いられ得る。これにより、SE LEXは核酸に結合することが知られていない蛋白質の検出、定量、単離及び精製 のための核酸分子の使用のための一般的方法である。更に、SELEXにより単離さ れ得る特定の核酸抗体は、その機能に影響を及ぼす、例えば特定の標的分子又は 構造の機能を阻害、増強又は活性化するのにも用いられ得る。 本発明に従う接合体に用いられるオリゴヌクレオチドは、以下に 記載の方法に従う好ましい実施形態において得られる。 これにより、適切なオリゴヌクレオチドは、ランダムな配列を含むオリゴヌク レオチドの混合物が標的構造と一緒にされ、ここで特定のオリゴヌクレオチドは オリゴヌクレオチドの混合物と比較して標的構造に対して増加されたアフィニテ ィーを示し、後者はオリゴヌクレオチド混合物の残りから分離され、その後標的 構造に対して増加されたアフィニティーを有するオリゴヌクレオチドが、標的構 造に結合するオリゴヌクレオチドの増加された部分を示すオリゴヌクレオチドの 混合物を得るために増幅されることにおいて得られうる。本方法において、最初 に、DNA鎖が化学合成による好ましい方法で製造される。３’末端において、こ のDNA鎖は、RNAポリメラーゼのためのプロモーターとして用いられ、同時にポリ メラーゼ鎖反応(PCR)のためのプライマー配列に相補的である周知の配列を有す る、この場合における特に好ましい実施形態において、T7 RNAポリメラーゼのた めのプロモーターが含まれる。その後、ランダム配列がプロモーター上に合成さ れる。ランダム配列は、適切な４つの塩基を同じ比率で合成機に与えることにお いて得られうる。これにより、完全にランダムなDNA配列が生ずる。好ましい実 施形態において、ランダム配列の長さは約15〜100ヌクレオチドである。ポリメ ラーゼ鎖反応(PCR)に用いられ得る他のDNA配列は、ランダム配列でこのDNA断片 上に合成される。 このDNA鎖の合成の後、後者はRNAポリメラーゼの助けで補助的RNA鎖において 転写される。好ましい実施形態において、T7 RNAポリメラーゼがこの場合に用い られる。転写において、改良されたヌクレオチドがRNAポリメラーゼに供される 。特に好ましい実施形態において、リボースは２’−位置において修飾される。 この場合、アルコキシ基、好ましくはメトキシ、アミノ又はフッ素による水素 原子又は水酸基の置換が含まれ得る。この様に製造されたRNAオリゴヌクレオチ ドは、その後、選択過程に導入される。 選択過程において、RNAオリゴヌクレオチドは標的構造と一緒にされる。標的 構造はオリゴヌクレオチドが特異的に高アフィニティーで結合する構造を意味す ると理解される。 このような構造は、例えば高分子、動物もしくはヒトのような高等生物の組織 構造、器官もしくは器官の一部、細胞、特に腫瘍細胞もしくは腫瘍である。 この結合において、標的構造は絶対的に純粋な形態である必要はなく、それは 器官上又は細胞表面上にも存在し得る。ストリンジェンシーは、ポリアミノ（tR NA、ヘパリン）、プラズマ又は完全な血液をSELEX反応に加えることにより選択 過程に適用され得る。 単離された蛋白質がこれに含まれるなら、後者は固相例えばフィルターに結合 され得る。選択において、RNA混合物に比して過剰の標的構造が用いられる。イ ンキュベーションにおいて、特定のオリゴヌクレオチド分子が標的構造に結合し 、一方結合していないオリゴヌクレオチドは例えば洗浄により混合物から分離さ れる。 その後、オリゴヌクレオチド分子は標的分子から分離されるか、又は適切な緩 衝液もしくは溶媒で洗浄することにより除去される。 逆転写酵素により、見い出されたRNAオリゴヌクレオチドは相補的DNA鎖に転写 される。 得られたDNA鎖は両端においてプライマー配列（又はプロモーター配列）を示 すので、見い出されたDNA配列の増幅は、ポリメラーゼ鎖反応により簡単に行わ れ得る。 この様に増幅されたDNAオリゴヌクレオチドは、その後再びRNAオリゴヌクレオ チドにRNAポリメラーゼにより転写され、これにより得られたRNAオリゴヌクレオ チドは、（先に記載の）更なる選択 ステップに用いられ得る。 第２の選択ステップにおいて標的分子から得られた結合性RNAオリゴヌクレオ チドを分離した後、逆転写酵素により再びDNAに転写し、これにより得られた相 補的DNAオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ鎖反応により増幅し、その後RNAポリ メラーゼによりRNAオリゴヌクレオチドに再び転写する。これは更なる選択ステ ップに利用できる。 選択ステップが数回繰り返されるなら、要求される高特異性及び高結合アフィ ニティーが得られうることがわかっている。まれに、１又は２の選択ステップの 後程度早くに要求されるオリゴヌクレオチド配列が得られるだろう。標的構造と オリゴヌクレオチドとの間の要求される特異性及び結合アフィニティーが得られ るとすぐに、オリゴヌクレオチドは配列決定され得、結果として特異的に結合す るオリゴヌクレオチドの配列が決定され得る。 この方法における特別の利点は、この方法が適切な蛋白質ばかりでなく生体内 でも用いられ得ることである。しかし先に記載の選択方法は精製された標的構造 においても行われ得る。しかし、生きている環境における標的構造にオリゴヌク レオチドの特異性を供することは、特に生体内診断に本質的である。それゆえ、 選択過程は細胞もしくは細胞培養物において、組織もしくは組織セクションにお いて、灌流された器官において、並びに生きている生物においてでさえも行われ 得る。 この場合において、改良されたオリゴヌクレオチドがほとんどの遍在するRNA によるデグラデーションに耐えることができることが有利である。結果として要 求されるオリゴヌクレオチド配列は、対応する天然のオリゴヌクレオチドがRNA により分解されるであろうので、生きている生物に選択方法において蓄積された それ自体であ る。 オリゴヌクレオチドラジカルＮは、互いに独立して選択され得る１以上の構成 物Ｂ、又は置換基Ｂ−Ｋを示し得る。要求されるのは、１〜10の同一の又は２〜 10の異なる接続構成物Ｂである。特に好ましいのは、１又は２の接続構成物Ｂと のオリゴヌクレオチド接合体である。 接続構成物Ｂは、複合剤又は複合体ＫでオリゴヌクレオチドラジカルＮに接続 する。 有利には、Ｏ，Ｓ及びＮを有する多歯状(polydentate)、開いた鎖の又は環状 の複合リガンドがドナー原子として用いられ得る。 複合剤ラジカルＫの例としては、水素原子、水酸基及び／又は酢酸基により還 元されたポリアミノポリカルボン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレン トリアミンペンタ酢酸、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミンテトラ酢酸 、１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンテトラ酢酸、１，４，７−トリア ザシクロノナントリ酢酸、１，４，８，11−テトラアザテトラデカンテトラ酢酸 、１，５，９−トリアザシクロドデカントリ酢酸、１，４，７，10−テトラアザ シクロドデカントリ酢酸、及び３，６，９，15−テトラアザビシクロー〔９，３ ，１〕−ペンタデカ−１（15），11，13−トリエントリ酢酸があり得る。 適切な複合剤は、例えばEP 0 485 045，EP 0 071564及びEP 0 588 229に、DE 43 10 999及びDE 43 11 023に、並びにUS 4,965,392に記載される。 本発明に従う複合剤Ｋのための種々の可能性を示すために、いくらかの有利な 構造が集められている図１〜３が参照される。これらの図は、選択として意味さ れ、示される複合剤にいずれの様式においても本発明を限定しない。 複合剤Ｋは、それらの金属イオンの形態における診断及び治療目的のための核 医学において通常用いられる全ての放射性同位体を含む。診断又は治療用放射線 を発するための外の放射線により発せられる安定な同位体、又は放射性同位体に 外からの放射線により転化される同位体も用いられ得る。 本発明に従う適切な同位体は、原子番号５，21〜29，31，39，42〜44，49，57 〜83又は85の要素から選択される。 放射線医薬剤としての本発明に従う化合物の使用のために、複合剤は放射性要 素を含む。生体内又は試験管内で有効な治療又は診断を達成することができる全 ての放射性要素がこの目的に適する。要素銅、ビスマス、テクネチウム、レニウ ム及びインジウムの放射性同位体が好ましい。特に好ましいのは^99mTc−複合体 である。 本発明に従う一般式Ｉの化合物が、例えばSc−43，Sc−44，Fe−52，Co-55，G a-68又はCu-61のような陽電子放射性同位体を含むなら、これは陽電子放出断層 撮影法(PET)において用いられ得る。 本発明に従う一般式Ｉの化合物が例えばTc−99ｍ又はIn−111のようなγ−放 射線放射性同位体を含むなら、それらは単一光子放出断層撮影法において用いら れ得る。 本発明に従う化合物は、例えばIr−192のような放射性同位体とのそれらの複 合体において放射線療法においても用いられ得る。 本発明に従う化合物は、放射線免疫療法又は放射線療法においても用いられ得 る。後者は、用いられる同位体の量及び型によってのみ対応する診断から区別さ れる。この場合において、目的は、最も小さい可能な範囲での高エネルギー軟波 放射線による腫瘍の破壊である。適切なβ−放射性イオンは、例えばSc−46，Sc −47，Sc−48，Ga−72，Ga−73，Ｙ−90，Re−186又はRe−188である。小さい半 減期を示す適切なα−放射性イオンは、例えばAt−209，At−21 1，Bi−211，Bi−212，Bi−213及びBi−214であり、Bi−212が好ましい。適切な 光子−及び電子−放射性イオンは、中性子捕獲により¹⁵⁷Gdから得られ得る¹⁵⁸Gd である。 本発明に従う薬剤がR．L．Mills et al.（Nature 336，787(1988)）により提 唱される放射線の変種における使用を意図するなら、中心のイオンは、例えば⁵⁷ Fe又は¹⁵¹Euのようなメスバウアー同位体から得られなければならない。 原子番号21〜29，31，39，42〜44，49，57〜83又は85の要素の金属イオンを複 合するために必要とされないこれらのカルボン酸基は、アルカリもしくはアルカ リ土類金属水酸化物及び炭酸塩、特にナトリウム及びカリウム水酸化物、又はア ンモニア及びアルキルアミン、のような無機もしくは有機塩基の塩、又はアミノ 酸として、又はアミドのエステルとして任意に存在し得る。 更に、粒子及び／又は放射線を発するように中性子により励起された化合物が 用いられ得る、この場合に特に有効なのはガドリニウムである。有利には、これ らの化合物は同位体ホウ素−10を含むものも用いられる。このように場合に、Ｋ は次の構造： （ここでＸは１〜10の全ての数字を表す）を有する。 本発明は、本発明に従う接合体の製造のための方法に更に関する。 これにより、接続構成物Ｂがオリゴヌクレオチドの５’末端に結合している接 合体は、ホスホルアミジト誘導体(Tetrahedron 49 1925〜1963(1993))とのオリ ゴヌクレオチドの反応により得られうる。この端のために、オリゴヌクレオチド の５’−水酸基は一般式 PR'（NR₂''）OR'''のホスホルアミジトと反応される。この場合、Ｒ’は任意に 置換され得る、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、メト キシ、エトキシ、プロピロキシ、ブチロキシ、ベンジロキシ又はフェニレトキシ のような１〜20のＣ原子を含むＮ，NO₂，Si又はSO₂を任意に含むアルキル、アル コキシ又はアリールアルコキシ基を表す。置換基として、特に、シアノ及びニト ロ基が用いられる。有利には、例えば、メトキシ、β−シアノエトキシ又はニト ロフェニルエトキシ基が用いられ得る。特に好ましいのは、β−シアノエトキシ 基である。Ｒ''はＣ₁〜Ｃ₄アルキル基であり、エチル及びプロピル基が特に適す る。好ましいのは、イソプロピル基である。Ｒ'''は、１〜20のＣ原子を有する 、Ｓ，Ｏ，Ｎ，CN，NO₂又はハロゲンを任意に含むアルキル又はアリールアルキ ル基である。好ましくは、保護されたアミノ及びチオアルキル基並びに保護され たアミノ及びチオオキサアルキル基が用いられる。特に好ましいのは、６−アミ ノ−ヘキシル、６−チオヘキシル、３，６，９−トリオキサ−11−アミノ−ウン デシル及び３，６−ジオキサ−８−アミノ−オクタニル基である。保護基として は、一般的に通常のＮ−又はＳ−保護基が用いられる。例えば、トリフルオロア セチル、フタルイミド及びモノメトキシトリチル基が適切である。 本発明の特に好ましい実施形態において、β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソ プロピルアミノ−６−（トリフルオロアセトアミド）−１−ヘキシル−ホスホル アミジトがホスホルアミジト誘導体として用いられる。 本発明の他の好ましい実施形態において、β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソ プロピルアミノ−（３，６，９−トリオキサ−１１−フタルイミド−１−ウンデ シル）−ホスホルアミジトがホスホルアミ ジト誘導体として用いられる。 本発明の他の実施形態において、接続構成物Ｂは、リン酸含有基により先に記 載されるものに類似した様式においてオリゴヌクレオチドＮの３’末端に結合さ れる。 オリゴヌクレオチドとホスホルアミジトとの間の先に記載の反応は、固相反応 としておこり得、オリゴヌクレオチドは自動合成機のカラム上になお存在する。 要求される配列のオリゴヌクレオチドが得られてオリゴヌクレオチドの５’−水 酸基の露出が例えばトリクロロ酢酸でおこった後、それはホスホルアミジトと反 応され、この反応産物が酸化され、遊離する。その後、これにより得られたオリ ゴヌクレオチド誘導体は末端アミノ又はチオール基上で任意に他のリンカー基に より複合剤又は複合物Ｋに結合される。その後、オリゴヌクレオチド上のリン酸 含有基による最初のステップにおけるラジカル結合が、任意に存在する付加的リ ンカー基、接続構成物Ｂと共に形成される。 オリゴヌクレオチドと複合剤との間の結合は、オリゴヌクレオチドの５’−水 酸基が、末端に結合可能なリン酸ラジカルを有する複合剤又は複合体と反応され るようにもおこり得る。このようなものは、次式： ａ） （ここで、Ｒ^aはβ−位置にシアノ基を任意に有するＣ₁〜Ｃ₆アルキル基を表 し、 Ｒ^bは第２アミノ基を表し、そして Ｋ及びＢは先に示される意味を有する）、又は次式： ｂ） （ここで、Ｒ^cはトリアルキルアンモニウムカチオンであり、Ｋ及びＢは先に 記載される意味を有する）又は次式： ｃ） （ここで、Ｒ^dは、１以上のハロゲン原子及び／又は１以上のニトロ基で任意 に置換されたアリール基、又はβ−位置においてシアノ基で任意に置換されたＣ₁ 〜Ｃ₆アルキル基を表し、Ｋ，Ｂ及びＲ^cは先に記載の意味を有する）により表 され得、式ａ）のラジカルを用いる場合、カップリング反応の完了後にホスフェ ートへの酸化ステップがおこる。両方の場合において、ラジカル−OR^a又は−OR^c は加水分解において任意に切断され得る。 複合剤又は複合体Ｋとのリンカーによるオリゴヌクレオチド誘導体の結合は、 自動合成機のカラム上の固相反応としてもおこり得る。本発明に従う化合物は、 その後脱離により固体ビヒクルから単離され得る。 オリゴヌクレオチドのリンカーとの結合は、末端ヌクレオチドの糖の５’−OH 基ばかりでなく例えばアミノ又はカルボキシ基のような５’−OH基から生じ得る 他の官能基によってもおこり得る。このようなアミノ又はカルボキシ基を有する ヌクレオチドは周知であり、容易に作られ得る。５’−デオキシ−５’−アミノ −ウリジンの合成は、J．Med．Chem．22，1273（1979）及びChem．Lett．6，601 （1976）に記載される。４’−カルボキシ−５’−デオキシウリジ ンは、J．Med．Chem．21，1141（1978）、又はNucleic Acids Symp．Ser.９，95 （1981）に記載されるように利用できる。 その後複合剤との結合は、当業者に公知であるカルボン酸又はアミノ基を有す るリンカーによりおこる。その後、リンカーは、−NH−CH₂−４’又は−CO−４ ’基と共に接続構成物Ｂを形成する。 本発明に従う接合体のヌクレオチドラジカル、接続構成物並びに複合剤もしく は複合体への分配は、純粋に形式的に、これにより実際の合成構造と独立してお こることが示され得る。これにより、例えば先に記載の場合において、基−NH− CH₂−４’又は−CO-４’は接続構成物Ｂに属するとして考慮され、一方、CH₂−O H基により４’−位置において還元されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレ オチドラジカルＮとしてデザインされる。 OHにより還元されたホスホジエステル又はホスホロチオエートブリッジへの接 合構成物が生ずる接合体の製造方法は、最初に２つの糖ユニットがジヌクレオチ ドに結合することにある（例えばChem．Lett．1305（1993）を参照のこと）。こ の場合、最初に式： （ここで、Ｕは対応するアルキレン残基を表し、Ｖは保護されたアミノ又は硫 黄基を表す）のトリエステルを生ずる。例えばアミノ保護基の切断の後、複合剤 は、例えばアミド結合の形態において、アミノ基とのリンカーにより当業者に周 知である方法において任意に結合され得る。その後、リンカーは基Ｏ−Ｕ−Ｖ’ （ここでＶ’は基−NHを表す）と共に接続構成物Ｂを形成する。 代わりの方法は、（例えば１，５−ジアミノペンタンとの反応により）介在的 に通過するホスホジエステルがアミノリシスされるこ とにある（Biochemistry 27，7237（1988）又はJ．Am．Chem．Soc．110, 4470( 1988)。 これにより得られる式： の化合物は、任意にリンカーにより、複合剤に先に記載のように結合され得る。 結合目的のために、ジヌクレオシド−ホスフェート−モノチオトリエステルも 適する（J．Am．Chem．Soc．111, 9117(1983)及びNucl．Acids Res．20，5205（ 1992）を参照のこと）。 ヌクレオベースは、ヌクレオチドに複合剤を結合させるために特に大きなバラ エティーを供する。プリンの２−位置における、及びピリミジンの４−位置にお けるアミノ基による結合は直接的におこり得る。しかし、プリン及びピリミジン を最初に改良して、これらの誘導された塩基を複合剤に（任意に付加的リンカー により）結合させることがしばしば上り有利である。適切に誘導されたヌクレオ ベースは、例えばBiochemie〔Biochemistry〕71，319．(1989)．Nucl．Acids Re s．16，4937（1988）又はNucleosides Nucleotides 10，633(1991)に記載される 。 ヌクレオベースによる結合のための代わりの方法は、官能基化された基との臭 素又はヨウ素のパラジウムで触媒されるカップリングにある(Biogenic and Medi cal Chemistry Letter V．361(1994))。これらの官能基化された基により、複合 剤はその後、周知の方法に従い、他のリンカーによりヌクレオベースと任意に結 合され得る。ピリミジンの５−位置における、及びプリンの８−位置における官 能基化され基として、アクリルエステル又はアリルアミンが例と して挙げられる（Nucl．Acids Res．14 6115(1986)及びNucl．Acids Res．16，4 077（1988）を参照のこと）。５−位置で改良されたピリミジンを調製するため 、特に５−位置においてカルボニル、アルケニル又はアリール基のような官能基 を導入するための他の代わりの方法、並びにピリミジンの５−位置において修飾 基をカップリングすることができる改良されたパラジウム触媒は、1993年６月14 日に出願された米国特許出願通し番号08/076,735に記載される。前駆体として用 いられるハロゲン誘導体は、例えばBiophys．J．44，201(1983)，J．Am．Chem． Soc．86，1242（1964）又はChem．Commun．17（1967）に記載されるように得ら れうる。 金属無含有オリゴヌクレオチド接合体からの本発明に従う金属複合体の製造は 、DE 34 01 052に記載されるように行われる。ここでは、要求される金属同位体 の金属酸化物又は金属塩（例えばニトレート、アセテート、カルボネート、クロ ライド又はスルフェート）を、水及び／又は（メタノール、エタノール又はイソ プロパノールのような）低級アルコール中に溶解又は懸濁し、複合剤を含む等量 のオリゴヌクレオチド接合体の溶液又は懸濁液と反応させ、その後、必要に応じ て、存在する酸性ハロゲン原子が無機及び／又は有機塩基又はアミノ酸又は遊離 カルボン酸基のカチオンにより置換され、アミノ酸アミドに転化されることによ る。 なお存在する可能性のある遊離酸基の中和は、例えばナトリウム、カリウム、 リチウム、マグネシウム又はカルシウムの無機塩基（例えばヒドロキシド、カル ボネート又はビカルボネート）、及び／又は例えばエタノールアミン、モルホリ ン、グルカミン、Ｎ−メチル−及びＮ，Ｎ−ジメチル−グルカミンのような第１ 、第２及び第３アミン等のような有機塩基、並びに例えばリシン、アルギニン及 びオルニチンのような塩基性アミノ酸の、又はもとの中性もしくは 酸性アミノ酸のアミドの助けによりおこる。 本発明に従う医薬剤の製造は、任意に、生薬に用いられる添加物を加え、水性 媒体中に懸濁又は溶解した後、懸濁液又は溶液を任意に滅菌する又はろ過により 滅菌することにより当該技術において周知である方法においても行われる。適切 な添加物は、例えば（例えばトロメタアミンのような）生理学的に無毒な緩衝液 、（例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸のような）複合剤の添加物又は必要 に応じて例えば塩化ナトリウムのような電解質、又は必要に応じて例えばアスコ ルビン酸のような酸化防止剤、又は特に経口形態の投与のための、マンニトール もしくは他の浸透性活性物質を含む。 水又は生理食塩水中の本発明に従う薬剤の懸濁液又は溶液が腸の投与又は他の 目的のために必要とされるなら、それらは生薬（例えばメチルセルロース、ラク トース、マンニトール）及び／又は界面活性剤（例えばレシチン、Tween^TR，Myr j^TR）に用いられる１以上の補助剤と混合される。 本発明に従う医薬剤は、好ましくは、本発明に従うオリゴヌクレオチド接合体 0.1μmol/ｌ〜３mmol／ｌを含み、一般的に、0.01nmol／kg〜60μmol/kgの量で 投与される。それらは、腸内及び非経口投与を意図される。 生体内の使用における核医療において、標識された化合物が、一般的に体重の 10^-10/kgより少い量で投与され、正確な量は研究される体の領域の関数として、 特に研究の各々の選択された方法の関数としても極めて多様であり得る。70kgの 平均体重から始めると、診断的使用のための放射能の量は40〜1100MBq、好まし くは200〜800MBq、の間であり、治療的使用のためには、投与当り１〜500MBq、 好ましくは10〜100MBqである。投与は、静脈内、動脈内、間隙、腹膜又は腫瘍内 に通常、行われ、静脈内投与が好ましい一般に、問題 の薬剤の0.1〜20mlが研究当りに投与される。 本発明は、標的構造を検出するための方法に更に関する。この場合、一以上の 先に記載の化合物が生体内又は試験管内で研究されるべきサンプルと一緒にされ る。この場合、オリゴヌクレオチドラジカルＮは検出されるべき標的構造に対し て特異的が高結合アフィニティーで結合する。 標的構造がサンプル中に存在するなら、それはシグナルを基にしてそこで検出 され得る。本方法は、特に病気の非侵襲性の診断に適する。この場合、１以上の 先に記載の化合物が生体内に投与され、オリゴヌクレオチドラジカルＮが特異的 かつ高アフィニティーで結合する標的構造が研究されるべき生物内に存在するか 否かがシグナルにより検出され得る。 しかし、研究されるべきサンプル内の標的構造の単なる検出に加えて、それは 特異的に破壊もされ得る。この点において、本発明の化合物は特に放射線療法、 例えば癌療法に適する。 本発明の他の実施形態は、１以上の、先に記載の化合物を含む標的構造の生体 内検出のための診断キットを含む。 本発明に従う接合体及び薬剤は、放射線療法及び診断のための医薬剤に基づい て作られるべきであるという多くの要求がある。それらは、問題の標的構造に比 して高いアフィニティー又は特異性により、特に区別される。周知のオリゴヌク レオチド接合体に比して、本発明の接合体は生体内安定性が特に高い。これは、 ２’−水酸基の置換、及びヌクレオチドの末端水酸基上の改良されたチミジン配 列の組込みにより達成された。驚くことに、オリゴヌクレオチドの特異性は、こ の改良又は複合剤とのカップリングのいずれによっても大きく害されない。他の 利点は、制御可能な薬物速度及び必要な適合性である。 図面の簡単な説明 本発明の種々の他の目的、特徴及び付随する利点は、添付の図面と組み合わせ て考える時により十分に理解されるのと同様により十分に歓迎されるだろう。 図１は、本発明のために有利に用いられ得る環状複合剤Ｋの選択を示す。“ｂ ”は接続構成物Ｂへの結合部位を示す。 図２及び３は、本発明のために有利に用いられ得る開いた鎖の複合剤Ｋの選択 を示す。 以下の実施例はより詳細にこれらの発明を示すはずである。 本実施例に記載されるポリヌクレオチドは改良された化合物を含む。 それらは以下の意味を有する： Ａ，Ｕ，Ｃ，Ｇ ２’−OCH₃基を含むヌクレオチド ＊： ヌクレオチド間結合がメチルホスホネートで ある。 **： ヌクレオチド間結合がチオホスホネートであ る。 ***： ヌクレオチド間結合がジチオホスホネートで ある。 更なる研究なしに、当業者は、先の記載を用いて本発明をその十分な程度まで 利用すると確信される。それゆえ、以下の好ましい特定の実施形態は、単に示す だけのものとして作られ、いずれの方法においても開示の残りを限定するもので はない。 先の及び以下の実施例において、全ての温度はセルシウム温度で間違いなく記 載され、示さなければ、全ての部及び百分率は重量による。1994年７月14日に出 願されたDE 44 24 922 5を含む先及び以下に言及される全ての出版物、特許、及 び出願の全体の開示は引用 により本明細書に組み込まれる。 実施例 実施例１ ａ）35mer−オリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−ヘキシル−リン酸エステル） 上流におかれた配列T*T*T*T*T-3’の改良と共にSELEX法に従って同定された30 mer−オリゴヌクレオチド5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’をPharmacla companyの自動合成機において普通の方法で作製し(Oligonucleotides and Anal ogues，A Practical Approach，Ed．F．Eckstein，Oxford University Press，O xford，New York，Tokyo，1991)、このオリゴヌクレオチドを固定化ビヒクルの カラム上にも存在させる。ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応によ り、５’−水酸基を開放させる。カラムの充填は35mer−オリゴヌクレオチド約1 0mgである。リンカーに結合させるために、カラムを、テトラゾリンの存在下で( Nucl．Acids．Res 16，2659〜2669（1988）に従って作られた)β−シアノエチル −Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−６−（トリフルオロアセトアミド）−１−ヘ キシル−ホスホルアミジトと反応させる。形成されたホスフェートの完全に保護 されたホスホトリエステルへの酸化を、テトラヒドロフラン中のヨウ素と共に行 う。その後、カラムをメタノール及び水の連続液中で洗浄する。固体ビヒクルか ら改良されたオリゴヌクレオチドを除去するため、カラムの成分をマルチバイア ルに移し、30％アンモニア溶液５mlと混合して、この容器を密閉して55℃で一晩 振とうする。その後０℃に冷やして遠心し、このビヒクルを５mlの水で洗浄して 、組み合わされた水性相を凍結乾燥させる。 精製のために、この固体材料を２mlの水にとり、0.5Ｍ酢酸アンモニウム溶液 ２mlと混合して10mlエタノールと混合して、−20℃で一晩遠心し、残りを１mlの エタノール（−20℃）で洗浄し、最後に室温で真空中で乾燥させる。無色の粉体 としてタイトルの化合物８mgを得る。 ｂ）10−〔５−（２−カルボキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ− ４−アザ−ペンチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７ ，10−テトラアザシクロドデカン １，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシク ロドデカン（DO3A）50ｇ(144.3mmol)を250mlの水に溶解して、そのpHを５Ｎ水酸 化ナトリウム溶液で13に調節する。その後、100mlのジオキサン中のＮ−（２， ３−エポキシプロピル）−フタルイミド38.12ｇ(187.6mmol)の溶液を１時間内に 準備し、50℃で24時間、撹拌して、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えて13に維持 する。この溶液を10％塩酸でpH２に調整し、真空中で乾燥するまでエバポレート する。残ったものを少量の水に溶解し、イオン交換カラム（Reiley^(R)＝ポリ− （４−ビニル）−ピリジン、水で溶出する）で精製する。主な画分を真空内での エバポレーションにより濃縮し、残りをRP−18（LiChroPrep^(R)／テトラヒドロ フラン／メタノール／水の移動溶媒：勾配）上のクロマトグラフィーによる最終 精製にかける。主要画分のエバポレーションによる濃縮の後、アモルファス固体 63.57ｇ（理論値の71％）を得る。 水成分：8.5％ （無水物に関する）元素分析 Cld ： Ｃ 52.90 Ｈ 6.57 Ｎ 12.34 Fnd ： Ｃ 52.65 Ｈ 6.68 Ｎ 12.15 ｃ）10−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−プロピル）−１，４， ７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン 実施例１ｂのタイトル化合物50ｇ（88.1mmol）を24時間、濃塩酸300ml中に還 流する。それを乾燥するまでエバポレートし、残ったものを少量の水に溶かして イオン交換カラム（Reiley^(R)＝ポリ−（４−ビニル）−ピリジン（水で溶出す る））上で精製する。主要画分を乾燥するまでエバポレートする、 収率：ガラス質の固体39ｇ（理論値の95％） 水成分：10.3％ （無水物に関する）元素分析： Cld ： Ｃ 48.68 Ｈ 7.93 Ｎ 16.70 Fnd ： Ｃ 48.47 Ｈ 8.09 Ｎ 16.55 ｄ）10−（７−（４−ニトロフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７− （カルボキシメチル）−４−アザ−ヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキ シメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン ３−（４−ニトロフェニル）−無水グルタル酸（J．Org．Chem．26，3856(196 1)）9.84ｇ（41.8mmol）をジメチルホルムアミド２00ml／トリエチルアミン20ml の200ml中の実施例１ｃ）のタイトル化合物14.62ｇ(34.86mmol)に加え、室温で 一晩撹拌する。それを乾燥するまで真空中でエバポレートする。残ったものをイ ソプロパノール／酢酸95：５から再結晶化する。 収率：黄色様固体21.68ｇ（理論値の95％） 水成分：0.9％ （無水物に関する）元素分析： Cld ： Ｃ 51.37 Ｈ 6.47 Ｎ 12.84 Fnd ： Ｃ 51.18 Ｈ 6.58 Ｎ 12.67 ｅ）10−〔７−（４−アミノフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７− （カルボキシメチル）−４−アザ−ヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキ シメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン 実施例１ｄ）のタイトル化合物21.0ｇ(32.07mmol)をメタノール250ml中に溶か し、５ｇのパラジウム触媒（Ｃ上10％Pd）を加える。それを一晩室温で水素化す る。触媒をろ過して除き、ろ液を乾燥するまで真空中でエバポレートする。 収率：クリーム色の固体19.63ｇ（理論値の98％） 水成分：0.8％ （無水物に関する）元素分析： Cld ： Ｃ 53.84 Ｈ 6.35 Ｎ 12.60 Fnd ： Ｃ 53.73 Ｈ 6.45 Ｎ 12.51 ｆ）10−〔７−（４−イソチオシアナトフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オ キソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザ−ヘプチル〕−１，４，７−トリス （カルボキシ−メチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン 実施例１ｅ）のタイトル化合物12.4ｇ(19.27mmol)を200mlの水中に溶解して50 mlのクロロホルム中6.64ｇ（57.8mmol）のチオホスジーンを加える。それを50℃ で１時間、撹拌する。それを室温まで冷却して、有機相を分離して水相をクロロ ホルム100mlで２回、振とうする。水相を乾燥するまでエバポレートして、残っ たものを室温で100mlのイソプロパノールで吸収的に沈殿させる。この固体をろ 過しておとし、エーテルで洗浄する。真空中で一晩、乾燥させた後（40℃）、ク リーム色の固体12.74ｇ（理論値の97％）を得る。 水成分：3.1％ （無水物に関する）元素分析： Cld ： Ｃ 52.24 Ｈ 6.35 Ｎ 12.60 Ｓ 4.81 Fnd ： Ｃ 52.37 Ｈ 6.44 Ｎ 12.48 Ｓ 4.83 ｇ）35merオリゴヌクレオチド の５−（６−アミノ−ヘキシル−リン酸エステル）及び10−〔７−（４−イソチ オシアナト−フェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチ ル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４ ，７，10−テトラアザシクロドデカンの接合体 実施例１ａ）で得られたオリゴヌクレオチド８mgを2.5mlのNaHCO₃／Na₂CO₃緩 衝液(pH8.0)に溶かして、１mgの10−（７−（４−イソチオシアナトフェニル） −２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザ−ヘプチ ル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザ シクロドデカン（実施例１ｆ）のタイトル化合物）と混合する。それを室温で５ 時間、撹拌して0.01Ｍ塩酸を加えることによりそのpHを7.2に調節し、この溶液 を排除限界3,000の膜（Amicon YM3）を通して限外ろ過し、次に凍結乾燥する。 要求される接合体７mgを得る。 ｈ）35merオリゴヌクレオチド の５−（６−アミノ−ヘキシル−リン酸エステル）及び10−〔７−（４−イソチ オシアナトフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル ）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４， ７，10−テトラアザシクロドデカンのチオウレア接合体の¹¹¹インジウム複合体 （２Ｍ酢酸ナトリウム溶液中¹¹¹インジウム（III）クロライドから、pHを0.1 Ｍ塩酸で4.0に調節して作られる）¹¹¹インジウム（ III）アセテート溶液(350μCi)15μｌを、MES緩衝液、pH6.2（MES＝２−（Ｍ− モルホリノ）エチルスルホン酸中実施例１ｇ）のタイトル化合物１mgの溶液135 μｌに加える。0.01Ｍ塩酸を加えることによりpHを4.2にする。それを２Ｍ酢酸 ナトリウム溶液でpH６にして、0.1Ｍ EDTA＝エチレンジアミン−テトラ酢酸ジナ トリウム塩を複合体過剰¹¹¹インジウムに加える。これにより得られた標識され た接合体（２ｈ）の最終精製を、HPLC（排除クロマトグラフィー：TSK−400／ME S−緩衝液）により行う。標識接合体を含む画分を生理食塩水で希釈し、0.01Ｍ 水酸化ナトリウム溶液でpH7.21に調節してろ過する。その後、これにより作られ た溶液は放射線診断のための適した調製物となる。 実施例２ ａ）35merオリゴヌクレオチド の５’（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及びＮ−〔２−アミノ− ３−（４−イソチオシアナトフェニル）−プロピル〕−トランス−シクロ−ヘキ サン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’−Ｎ’，Ｎ''，Ｎ'''−ペンタ酢酸の接合体 実施例１ａ）で得られたオリゴヌクレオチド８mgを2.5mlのNaHCO₃／Na₂CO₃緩 衝液(pH8.0)中に溶解し、１mgのＮ−〔２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナ トフェニル）プロピル〕−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ， Ｎ''，Ｎ’，Ｎ''，Ｎ'''−ペンタ酢酸を加える（Bioconjugate Chem.１，59（1 990）に従って作られる）。それを室温で５時間、撹拌した後、0.1Ｍ塩酸でpH7. 2に調節し、この溶液を排除限界3,000（Amicon YM3）の膜を通して限外ろ過する 。凍結乾燥させた後、チオウレア接合体２ａ）の６mgを得る。 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及びＮ−（２−アミノ− ３−（４−イソチオシアナトフェニル）−プロピル〕−トランス−シクロヘキサ ン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ''，Ｎ'''−ペンタ酢酸の接合体の ビスマス−212複合体 0.1Ｍの塩酸中の²¹²ビスマス−テトラヨウ化物溶液を２Ｍ酢酸でpH４にする。 約３ｍCiの活性のこの溶液のアリコートを実施例２ａ）のタイトル化合物１mgに 加え、0.02Ｍ MES−緩衝液0.5ml中に溶かして、0.15Ｍ塩化ナトリウム溶液0.5ml を加える。それを室温で20分間、撹拌する。それを２Ｍ酢酸ナトリウム溶液でpH ６にして0.01Ｍ Na₂EDTA溶液20μｌを加える。それを20分間、撹拌する。複合体 の精製をHPLC（排除クロマトグラフィー：TSK−400／MES−緩衝液）により行う 。放射性接合体画分を組み合わせて、生理食塩水で希釈し、0.01Ｍ水酸化ナトリ ウムでpH7.2に調節する。ろ過の後、放射線療法に適した調製物が得られる。 実施例３ ａ）35merオリゴヌクレオチド の５’（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及びＮ−〔２−アミノ− ３−（４−イソチオシアナトフェニル）−プロピル〕−トランス−シクロ−ヘキ サン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’−Ｎ’，Ｎ''，Ｎ'''−ペエンタ酢酸の接合 体のインジウム−111複合体 （２Ｍ酢酸ナトリウム溶液中¹¹¹インジウム(III)クロライドから、0.1Ｍ塩酸 でpHを4.0に調節して作られた）¹¹¹インジウム(III)アセテート溶液(350μCi)15 μｌの15mlをMES−緩衝液、pH6.2（MES＝２−（Ｎ−モルホリノ）エチルスルホ ン酸）中１mgの実施 例２ａ）のタイトル化合物の溶液の0.5mlに加える。0.01Ｍ塩酸を加えることに よりpHを5.0にする。それをpH5.0で37℃で１時間、撹拌する。それを２Ｍ酢酸ナ トリウム溶液でpH６にして、10μｌの0.1Ｍ Na₂EDTA＝エチレンジアミン−テト ラ酢酸ジナトリウム塩を、複合過剰¹¹¹インジウムに加える。これにより得られ る標識接合体（１ｈ）の最終精製をHPLC（排除クロマトグラフィー：TSK−400／ MES−緩衝液）により行う。標識された接合体を含む画分を生理食塩水で希釈し て0.01Ｍ水酸化ナトリウム溶液でpH7.2に調節し、ろ過する。これにより作られ る溶液は、その後放射線診断のために適する調製物である。 実施例４ ａ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び２−（４−イソチ オシアナト−ベンジル）−ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ''，Ｎ''− ペンタ酢酸の接合体 実施例１ａ）で得られたオリゴヌクレオチド８mgを2.5mlのNaHCO₃／Na₂CO₃緩 衝液(pH8.0)中に溶かして、１mgの２−（４−イソチオシアナト−ベンジル）− ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ''，Ｎ''−ペンタ酢酸を加える（Bi oconjugate Chem.２，187(1990)に従って作られたもの）。それを室温で５時間 、撹拌した後、0.01Ｍ塩酸でpH7.2に調節して、この溶液を排除限界3,000の膜（ Amicon YM3）を通して限外ろ過する。凍結乾燥した後、チオウレア接合体６mgを 得る。 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び２− （４−イソチオシアナト−ベンジル）−ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’， Ｎ''，Ｎ''−ペンタ酢酸の接合体のイットリウム−90複合体 0.05Ｍ酢酸アンモニウム溶液（約380ｍCi）中に溶かされた⁹⁰イットリウムの 溶液をpH６の0.05Ｍ酢酸アンモニウム溶液中１mgの実施例４ａ）のチオウレア誘 導体に加え、３Ｍ酢酸でpH5.2に調整し、室温で１時間、撹拌する。それを0.01 Ｍ水酸化ナトリウム溶液でpH7.0に調節してこの接合体をHPLC(TSK−400／MES− 緩衝液)により精製する。主要画分を組み合わせ、生理食塩水で希釈して0.01Ｍ 水酸化ナトリウム溶液でpH7.2にする。ろ過の後、放射線療法に適した調製物が 得られる。 実施例５ ａ）35mer−オリゴヌクレオチド （セリンプロテアーゼのための改良されたリガンド）の５’−（６−メルカプト −１−ヘキシル−リン酸エステル） 糖ユニットにおいて５チミジンの５’−結合配列により修飾されたSELEX法に 従って同定された30mer−オリゴヌクレオチド （米国特許第5,270,163号の配列番号：13）をPharmacia companyの自動合成機に おいて通常の方法で作り（Oligonucleotides and Analogues，A Practical Appr oach，Ed．F．Eckstein，Oxford University Press，Oxford New York，Tokyo， 1991）、このオリゴヌクレオチドも固体ビヒクルのカラム上に存在させる。ジク ロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５’−ヒドロキシル基を開 く。カラムの充填は約10mgの35mer−オリゴヌクレオチドである。リンカーと結 合させるために、カラムを、テトラゾリンの存在下 でアセトニトリル中の50μmolのβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルア ミノ−Ｓ−トリチル−６−メルカプト−ホスホルアミジトの溶液と反応させる。 形成されたホスファイトの完全に保護されたホスホトリエステルへの酸化をテト ラヒドロフラン中のイオジンで行う。その後、カラムをメタノール及び水で連続 的に洗浄する。固体ビヒクルから改良されたオリゴヌクレオチドを除去するため に、カラムの成分をマルチバイアルに移し、30％アンモニア溶液５mlと混合し、 この容器を密閉して55℃で一晩振とうする。それをその後０℃まで冷却し、遠心 してビヒクルを５mlの水で洗浄し、組み合わされた水相を凍結乾燥させる。 精製のために、固体材料を２mlの水にとり、0.5Ｍ酢酸アンモニウム溶液２ml と混合して10mlエタノールと混合し、それを−20℃で一晩安置して遠心し、残っ たものを１mlのエタノールで洗浄し（20℃）、最後に室温で真空中で乾燥させる 。 ９mgのＳ−トリチル化タイトル化合物を得る。トリチル保護基を切断するため に、産物を0.5mlの水に溶かして、0.1mlの１Ｍ硝酸銀溶液と混合し、室温で１時 間、撹拌する。その後、それを0.1mlの１Ｍジチオトレイトール溶液と混合する 。15分後、それを遠心し、その上清の溶液を酢酸エチルで数回抽出する。凍結乾 燥した後、要求されるタイトル化合物８mgを水溶液から得る。 ｂ） ４−ベンジロキシ−Ｎ−メタンスルホニル−フェニルアラニン−メチル エステル メタンスルホン酸クロライド19.58ｇを０℃において300mlのピリジン中50ｇの ４−ベンジロキシ−フェニルアラニン−メチル−エステル−ヒドロクロライド中 に入れ、０℃で３時間、撹拌する。それを乾燥するまで真空中でエバポレートし て、残ったものをジクロロメタン500ml中に溶かす。それを各々５Ｎ塩酸で２回 、振とうし て出し、硫酸マグネシウム上で乾燥させて真空中でのエバポレーションにより濃 縮する。残ったものを150mlのメタノールから再結晶化する。 収率：無色結晶性粉体53.64ｇ ｃ）２−（４−ベンジロキシベンジル）−１−メタンスルホニル−１，４，７ −トリアザ−ヘプタン−３−オン ４−ベンジロキシ−Ｎ−メタンスルホニル−フェニルアラニン−メチルエステ ル37.2ｇ及び１，２−ジアミノエタン1.2ｌを80℃で３時間、撹拌する。残った ものを乾燥するまでエバポレートして、200mlの水で吸収的に沈殿させ、この沈 殿物を吸い出げて出し、水で中性に洗浄し、60℃で一晩乾燥させる。 収率：クリーム色のアモルファス粉体37.68ｇ ｄ）２−（４−ベンジロキシベンジル）−１−メタンスルホニル−７−（tert −ブチロキシカルボニル）−１，４，７−トリアザヘプタン−３−オン 200mlクロロホルム中２−（４−ベンジロキシベンジル）−１−メタンスルホ ニル−１，４，７−トリアザヘプタン−３−オン16.23ｇ及びトリエチルアミン4 .76ｇの溶液を０℃で50mlクロロホルム中10.27ｇのジ−tert−ブチル−ジカルボ ネートの溶液と混合する。それを室温で５時間、撹拌して５％炭酸ナトリウム溶 液及び水と共に振とうして、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空におけるエバ ポレーションにより濃縮する。この残ったものをメタノール100mlから再結晶化 する。 収率：泡状固体20.19ｇ ｅ）２−（４−ヒドロキシベンジル）−１−メタンスルホニル−７−（tert− ブチロキシカルボニル）−１，４，７−トリアザヘプタン−３−オン ジクロロメタン300ml中に溶かされた20ｇの２−（４−ヒドロキシベンジル） −１−メタンスルホニル−７−（tert−ブチロキシカルボニル）−１，４，７− トリアザヘプタン−３−オンを水素雰囲気下で一晩、パラジウム−炭素（１0％ ）４ｇと共に撹拌する。それをろ過してその溶液を真空におけるエバポレーショ ンにより濃縮する。 収率：数分後に硬化するガラス質の泡16.17ｇ ｆ）２−〔４−（３−オキサプロピオン酸−ベンジルエステル）−ベンジル〕 −１−メタンスルホニル−７−（tert−ブチロキシカルボニル）−１，４，７− トリアザヘプタン−３−オン 15ｇの２−（４−ヒドロキシベンジル）−１−メタンスルホニル−７−（tert −ブチロキシカルボニル）−１，４，７−トリアザヘプタン−３−オン、8.56ｇ のブロモ酢酸−ベンジルエステル及び１3.18ｇの炭酸カリウムを24時間、300ml のアセトニトリル中で還流させる。それをろ過して乾燥するまで真空中でエバポ レートする。この残りのものをジクロロメタン200ml中に溶かして、各々50mlの 水と共に２回振とうする。この有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空中の エバポレーションにより濃縮する。この残ったものを溶離液としてジクロロメタ ン−ヘキサン−アセトン（20／10／１）でクロマトグラフィーを行う。 収率：泡状固体10.06ｇ ｇ）２−〔４−（３−オキサプロピオン酸−ベンジルエステル）−ベンジル〕 −１−メタンスルホニル−１，４，７−トリアザヘプタン−３−オン 10ｇの２−〔４−（３−オキサプロピオン酸−ベンジルエステル）−ベンジル 〕１ｌ−メタンスルホニル−７−（tert−ブチロキシカルボニル）−１，４，７ −トリアザヘプタン−３−オンを100ml のトリフルオロ酢酸と共に室温で１時間、撹拌する。それを乾燥するまで真空中 でエバポレートする。 収率：放置の間に硬化するガラス様泡9.2ｇ ｈ）９−クロロ−１−メタンスルホニル−２−〔４−（３−オキサプロピオン 酸−ベンジルエステル）−ベンジル〕−１，４，７−トリアザ−３，８−ジオン ９ｇの２−〔４−（３−オキサプロピオン酸−ベンジルエステル）−ベンジル 〕−１−メタンスルホニル−１，４，７−トリアザヘプタン−３−オン及び1.78 ｇのトリエチルアミンを200mlのクロロホルム中に溶かす。０℃において、20ml のクロロホルム中に溶かされたクロロアセチルクロライド1.98ｇを30分収内に充 填し、その後０℃で２時間、撹拌する。それを５％塩酸100mlで、各々水50mlで ２回、洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、乾燥するまで真空中でエバポレ ートする。残ったものを溶離液としてジクロロメタン−エチルアセテート（20／ １）を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーを行う。 収率：ろう状固体6.97ｇ ｉ）９−クロロ−１−メタンスルホニル−２−〔４−（３−オキサプロピオン 酸−ベンジルエステル）−ベンジル〕−１，４，７−トリアザ−３，８−ジオン 150mlのジクロロメタン中に溶かされた6.5ｇの９−クロロ−１−メタンスルホ ニル−２−〔４−（３−オキサプロピオン酸−ベンジルエステル）−ベンジル〕 −１，４，７−トリアザ−３，８−ジオンを水素雰囲気下で２ｇのパラジウム− 炭素（10％）と共に一晩撹拌する。それをろ過して、この溶液を真空におけるエ バポレーションにより濃縮する。 収率：ガラス状固体5.33ｇ ｊ）10−アセチル−２−〔４−（３−オキサプロピオン酸）−ベンジル〕−１ −（メタンスルホニル）−10−チア−１，４，７−トリアザデカン−３，８−ジ オン 80mlのクロロホルム中に溶解された５ｇの９−クロロ−１−メタンスルホニル −２−〔４−（３−オキサプロピオン酸−ベンジルエステル）−ベンジル〕−１ ，４，７−トリアザ−３，８−ジオンを10分間、1.98ｇのトリエチルアミン及び 0.74ｇのチオ酢酸で還流させる。この溶液を200mlの氷冷５％塩酸に注ぎ、有機 相を分離して硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空におけるエバポレーションに より濃縮する。ヘキサン−酢酸エチル（３／１）でのシリカゲル上でのクロマト グラフィーの後、要求される化合物4.64ｇをガラス様固体として得る。 ｋ）10−アセチル−２−〔４−（３−オキサプロピオン酸）−（２，５−ジオ キソピロリジン−１−イル）−エステル）−ベンジル〕−１−（メタンスルホニ ル）−10−チア−１，４，７−トリアザデカン−３，８−ジオン ４ｇの10−アセチル−２−〔４−（３−オキサプロピオン酸）−ベンジル〕− １−（メタンスルホニル）−10−チア−１，４，７−トリアザデカン−３，８− ジオン、1.91ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド、４ｇのＮ−ヒドロキシスク シニミド及び30mgの４−ジメチルアミノピリジンを室温で20mlのクロロホルム中 で24時間、撹拌する。その後、それを20mlのジエチルエーテルと混合し、ろ過し て、残ったものを真空でのエバポレーションにより濃縮する。残ったものを溶離 液としてジクロロメタン−ジオキサン（10／１）を用いてシリカゲル上でクロマ トグラフィーを行う。 収率：クリーム色固体3.47ｇ 元素分析： Cld ： Ｃ 46.15 Ｈ 4.93 Ｎ 9.78 Ｓ 11.20 Fnd ： Ｃ 46.03 Ｈ 4.83 Ｎ 9.64 Ｓ 11.05 １）10−アセチル−２−｛４−〔３−オキサプロピオン酸−（６−マレイミド −ヘキサノイル）−ヒドラジド〕−ベンジル｝−１−メタンスルホニル−10−チ ア−１，４，７−トリアザデカン−３，８−ジオン ３ｇの10−アセチル−２−〔４−（３−オキサプロピオン酸−（２，５−ジオ キソ−ピロリジン−１−イル）−エステル）−ベンジル〕−１−（メタンスルホ ニル）−10−チア−１，４，７−トリアザデカン−３，８−ジエン及び1.17ｇの ６−マレイミドカプロン酸ヒドラジド(Science 261, 212(1993))を60℃で５時間 、40mlのジメチルホルムアミド中で撹拌する。激しく撹拌しながら、100mlの水 を充填して、沈殿した沈殿物からろ過して出す。それを真空中で乾燥させて、残 ったものを溶離液としてジクロロメタン／ジオキサン（10／１）を用いるシリカ ゲルカラム上でのFLASHクロマトグラフィーにより精製する。2.8ｇのタイトル化 合物を白色固体として得る。 （無水物に関する）元素分析： Cld ： Ｃ 49.25 Ｈ 5.61 Ｎ 12.30 Ｓ 9.39 Fnd ： Ｃ 49.33 Ｈ 5.95 Ｎ 12.43 Ｓ 9.11 ｍ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び10−アセチル −２−｛４−〔３−オキサプロピオン酸−（６−マレイミド）−ヘキサノイル） −ヒドラジド〕−ベンジル｝−１−メタンスルホニル−10−チア−１，４，７− トリアザデカン−３，８−ジオン 実施例５ａ）に従って作られたチオール含有オリゴヌクレオチド５mgを0.2ml のジメチルホルムアミド中に溶解された実施例５１）に従って作られたマレイミ ド誘導体１mgと２mlのリン酸緩衝液(pH7.4)中で混合する。それを２時間、室温 で放置し、その溶液を排除限界3,000（Amicon YM3）の膜を通す限外ろ過を行っ た後、凍結乾燥させる。５mgの要求される接合体を得る。 ｎ）35mer−オリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び10−アセチル −２−｛４−〔３−オキサプロピオン酸−（６−マレイミド）−ヘキサノイル） −ヒドラジド〕−ベンジル｝−１−メタンスルホニル−10−チア−１，４，７− トリアザデカン−３，８−ジオンの接合体のテクネチウム−99ｍ複合体 0.2Ｍ NaHCO₃中Ｄ−グルカル酸カリウム（12mg／ml）及び塩化スズ(II)（100 μｇ／ml）の１mlをバイアル内で凍結乾燥させ、その後Mo−99／Tc−99ｍジェネ レーターからの〔Tc−99ｍ〕−ナトリウムペルテクネテート溶液（１ml，１ｍCi ）と混合する。室温で15分おいた後、アリコートを取り除き、0.2Ｍ NaHCO₃溶液 中に溶かされた実施例５ｍ）の接合体（１mg／ml）の同量と混合する。15分後、 薄層クロマトグラフィー及びHPLCは、98％超の放射能が接合体により取り込まれ ていることを示した。 実施例６ ａ）35mer−オリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及びＳ−ベンゾイルMA G₃−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルの接合体 0.2mlのジメチルホルムアミドに溶解された（US 4,965,392に従って作られた ）３mgのＳ−ベンゾイルMAG₃−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステ ルを0.5mlの0.1Ｍリン酸緩衝液（pH７）に溶かされた実施例１ａ）のタイトル化 合物８mgに加え、室温で３時間、撹拌する。それを水で希釈してその溶液を限外 ろ過（Amicon YM3、排除限外3,000）にかける。凍結乾燥後、５mgの接合体６ａ ）を得る。 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及びＳ−ベンゾイルMA G₃−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルの接合体の^99mテクネチ ウム複合体 実施例６ａ）のタイトル化合物１mgを200μｌの水に溶かし、pH8.5の0.1Ｍリ ン酸緩衝液１mlと混合する。^99mテクネチウム−（Ｖ）−グルカネート溶液200μ ｌ（約15ｍCi）をこの混合物に加えて室温で15分間おく。（HPLCにより測定され た）残ったものの収率は約95％である。 実施例７ ａ）35mer−オリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び２，３，５，６− テトラフルオロフェニル−４，５−ビス（メルカプトアセタミド）−ペンタン酸 エステルの^99mテクネチウム複合体の接合体 0.6mlのリン酸緩衝液に溶解された実施例１ａ）のタイトル化合物３mgを、２m lのリン酸緩衝液pH7.2に溶解された（J．Nucl．Med．32，1445（1991）に従って 作られた）２，３，５，６−テトラフ ルオロフェニル−４，５−ビス（メルカプトアセタミド）−ペンタン酸エステル 約100ｍCiに加える。それを1.0Ｍ炭酸カリウム緩衝液でpH10に調節して室温で20 分間、撹拌する。最終的な精製のために、この溶液をSephadex colum(Pharmacia )に加え、塩化ナトリウム溶液75mmolで溶出する。主要画分を組み合わせて、生 理食塩水で希釈してろ過する。これにより得られた溶液は、放射線診断の研究の ために用いられ得る。 実施例８ ａ）35mer−オリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び５’（Ｎ−マ レイミド）−３−オキサペンチル−｛２−〔３−カルボキシベンゾイル）−チオ 〕−アセチル｝−グリシルグリシルグリシネートの接合体 ５mgの実施例５ａ）に従って作られたチオ含有オリゴヌクレオチドを、Ｎ₂下 で、２mlのリン酸緩衝液(pH7.4)中で、0.2mlのジメチルホルムアミド中に溶解さ れた（Bioconj．Chem.１，431(1990)に従って作られた）１mgの５−（Ｎ−マレ イミド）−３−オキサペンチル−｛２−〔３−カルボキシ−ベンゾイル）−チオ 〕−アセチル｝−グリシル−グリシルグリシネートと混合する。それを膜（Amic on YM3）を通して限外ろ過し、その後凍結乾燥する。5.5mgの要求される接合体 が得られる。 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び５’（Ｎ−マ レイミド）−３−オキサペンチル−｛２−〔３−カルボキシベンゾイル）−チオ 〕−アセチル｝−グリシルグリシルグリ シネートのテクネチウム−99ｍ複合体 0.2Ｍ NaHCO₃中Ｄ−グルカル酸カリウム（12mg／ml）及び塩化スズ(II)（100 μｇ／ml）の溶液１mlをバイアル内で凍結乾燥させて、その後Mo−99／Tc−99ｍ ジェネレーターからの〔Tc−99ｍ〕−ナトリウムペルテクネテート溶液（１ml， １ｍCi）と混合する。室温で15分おいた後、アリコートを取り出し、0.2Ｍ NaHC O₃溶液に溶解された実施例８ａ）の接合体（１mg／ml）の同量と混合する。凍結 乾燥により物質を単離することができる。HPLCにより測定された残ったものの収 率は96％超である。 実施例９ ａ）35mer−オリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び１−〔６−（ ２−ビニル−６−ヘキシロキシメチル）−ピリジン〕−１，４，８，11−テトラ アザシクロテトラデカンの接合体 リン酸緩衝液(pH7.4)２ml中の実施例５ａ）に従って作られたチオ含有オリゴ ヌクレオチド４mgの溶液を、Ｎ₂下において、0.5mlのジメチルホルムアミドに溶 かされた（EP 0 588 229に従って作られた）１mgの１−〔６−（２−ビニル−６ −ヘキシル−オキシメチル）−ピリジン〕−１，４，８，11−テトラアザシクロ テトラデカンと混合する。それを35℃で４時間、撹拌し、10mlのエタノールと混 合し、その産物を遠心により単離する。50mmolトリエチルアンモニウムアセテー ト（pH７）アセトニトリル勾配を用いる１×25cmカラムでの逆相クロマトグラフ ィーにより精製を行う。組み合わされた画分を凍結乾燥し、１mlの水に溶かして Sephadex G-10カラムで脱塩する。タイトル化合物（約４mg）を凍結乾燥により 単離する。 ｂ）35mer−オリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び１−〔６−（ ２−ビニル−６−ヘキシロキシメチル）−ピリジン〕−１，４，８，11−テトラ アザシクロテトラデカンの接合体のTc−99ｍ複合体 実施例８ｂ）に記載されるような手順を行う。HPLCによる残ったものの収率は 92％である。 実施例10 ａ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−リン酸エステル）及びＮ−〔４−ヒ ドロキシ−３−（１，４，８，１１−テトラアザ−シクロテトラデク−５−イル ）−ベンジル〕−２−（６−ビニル−ピリジン−２−イルメトキシ）−アセタミ ドの接合体 リン酸緩衝液(pH8.0)２ml中の実施例５ａ）に従って作られたチオール含有オ リゴヌクレオチドの6.5mgの溶液を、0.1mlのジメチルホルムアミドに溶かされた （J．Chem．Soc.，Chem．Commun．156（1988）に従って作られた）Ｎ−〔４−ヒ ドロキシ−３−（１，４，８，11−テトラアザ−シクロテトラデク−５−イル〕 −ベンジル−２−（６−ビニル−ピリジン−２−イルメトキシ）−アセタミド1. 2mgと混合する。それを35℃で窒素下で４時間、撹拌して10mlのエタノールと混 合し、その産物を遠心により単離する。50mmolトリエチルアンモニウムアセテー ト（pH７）／アセトニトリル勾配を用いる１×25cmカラムでの逆相クロマトグラ フィーにより精製を行う。組み合わされた画分をSephadex-G-10カラムで脱塩す る。凍結乾燥することにより、５mgのタイトル化合物を白色粉体として得る。 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−ホスホン酸エステル）及びＮ−〔４ −ヒドロキシ−３−（１，４，８，11−テトラアザ−シクロテトラデク−５−イ ル）−ベンジル〕−２−（６−ビニル−ピリジン−２−イルメトキシ）−アセタ ミドの接合体の銅−64複合体 10ａ）に従って得られた接合体１mgを⁶⁴CuCl₂10，２ｍCi）を含む１mlのリン 酸緩衝液中でインキュベートする。HPLCにより１時間後に測定された残ったもの の収率は98％超である。その産物を凍結乾燥により単離する。 実施例11 ａ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び１，４，７， 10−テトラアザシクロドデカン−２−〔（５−アザ−８−マレイミド−６−オキ ソ）−オクタン〕−１，４，７，10−テトラ酢酸の接合体 （J．Chem．Soc.，Chem．Commun．796，(1989)に従って作られた）１，４，７ ，10−テトラアザシクロドデカン−２−〔（５−アザ−８−マレイミド−６−オ キソ）−オクタン〕−１，４，７，10−テトラ酢酸１mgをＮ₂下において２mlの リン酸緩衝液（pH８）中で実施例５ａ）に従って作られたチオール含有オリゴヌ クレオチド５mgの溶液に加える。それを35℃で３時間、撹拌してイソプロピルア ルコール10mlと混合してその産物を遠心により単離する。25mmolトリエチルアン モニウムアセテート（pH７）／アセトニトリル勾配を用いる１×25cmカラムでの 逆相クロマトグラフィーにより精製を行う。組み合わされた画分を真空でのエバ ポレーションによりゆっく りと濃縮し、少量の水に溶かしてSephadex-G-10カラムで脱塩する。凍結乾燥す ることにより、４mgのタイトル化合物を白色粉体として得る。 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−ホスホン酸エステル）及び１，４， ７，10−テトラアザシクロドデカン−２−〔（５−アザ−８−マレイミド−６− オキソ）−オクタン〕−１，４，７，10−テトラ酢酸の接合体のイットリウム− 90複合体 １mlの0.05Ｍ酢酸アンモニウム溶液に溶解された⁹⁰Ｙ−アセテート（１ｍCi） を１mgの実施例11ａ）に従って作られた接合体と混合し、１時間、85℃に加熱す る。HPLCにより測定された残ったものの収率は95％超である。この産物を凍結乾 燥により単離する。 実施例12 ａ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−ホスホン酸エステル）及び１，４， ７−トリアザシクロノナン−２−〔（５−アザ−８−マレイミド−６−オキソ） −オクタン〕−１，４，７−トリ酢酸の接合体 （J．Chem．Soc.，Chem．Commun．794，(1989)に従って作られた）１，４，７ ，10−トリアザシクロノナン−２−〔（５−アザ−８−マレイミド−６−オキソ ）−オクタン〕−１，４，７−トリ酢酸をＮ₂下において、２mlのリン酸緩衝液 （pH８）中の実施例５ａ）に従って作られたチオール含有オリゴヌクレオチド５ mgの溶液に加える。それを35℃で６時間、撹拌し、10mlのイソプロパノールの10 mlに混合し、その産物を遠心により単離する。25mmolのトリエチル アンモニウムアセテート（pH７）／アセトニトリル勾配を用いる１×25cmカラム での逆相クロマトグラフィーにより精製を行う。組み合わせた画分を真空でのエ バポレーションによりゆっくりと濃縮し、少量の水に溶かして、Sephadex-G-10 カラムにより脱塩する。凍結乾燥することにより、３mgのタイトル化合物を白色 粉体として得る。 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−メルカプト−１−ヘキシル−ホスホン酸エステル）及び１，４， ７−トリアザシクロノナン−２−〔（５−アザ−８−マレイミド−６−オキソ） −オクタン〕−１，４，７−トリ酢酸の接合体のガリウム−67複合体 実施例12ａ）に従って作られた接合体20mgをpH4.5の0.1Ｍクエン酸緩衝液0.5m lに溶かして、0.1mlのガリウム−67−クエン酸溶液(0.2ｍCi)と混合する。室温 に２時間放置し、この産物をSephadex-G-10カラムで脱塩する。凍結乾燥した後 、17mgのタイトル化合物を白色粉体として得る。 実施例13 ａ）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−（プロプ−２−エン− １−オン）−２’−デオキシウリジンのホスファイト化 50mgの４−ジメチルアミノピリジン、３mlのジイソプロピルエチルアミン及び 962μｌ（4.31mmol）の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホス ホルアミジトを、50mlのテトラヒドロフラン中の（Nucleosides & Nucleotides 13 ，939〜944,（1994）に従って作られた）2.1ｇ（3.59mmol）の５’−Ｏ−（４ ，４’−ジメトキシトリチル）−５−（プロップ−２−エン−１−オン）−２ ’−デオキシウリジンの撹拌溶液に連続的に加える。約30分後に、白色沈殿を形 成する。それをろ過し、その溶液を真空におけるエバポレーションにより濃縮し 、その残りをジクロロメタンと５％重炭酸ナトリウムとの間に広げる。ジクロロ メタン相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空におけるエバポレーションによ り濃縮する。残ったものをジクロロメタン／ヘキサン／ジイソプロピルエチルア ミン（80：18：２）で溶出する。1.8ｇの要求される化合物を白色泡として得る 。 原素分析： Cld ： Ｃ 64.28 Ｈ 6.29 Ｎ 7.14 Ｐ 3.95 Fnd ： Ｃ 64.02 Ｈ 6.60 Ｎ 7.21 Ｐ 4.09 ｂ）36merオリゴヌクレオチド 及び10−（４−アザ−２−ヒドロキシ−５−イミノ−８−メルカプト−オクタン ）−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザ シクロドデカンの接合体 Ｕ^*：５−（プロプ−２−エン−１−オン）−２’−デオキシウリジン SELEX法に従って同定された30mer−オリゴヌクレオチドをPharmacia company の自動合成機における通常の方法において５’−結合配列5'-T*T*T*T*Tの修飾に より作り（Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach，Ed．F．E ckstein，Oxford University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991を参照の こと）、このオリゴヌクレオチドを固体ビヒクルのカラム上に存在させる。ジク ロロメタン内のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５’−ヒドロキシ基を開い た。カラムの充填は10mgの35mer−オリゴヌクレオチドである。５’−水酸基を テトラゾリンの存在下で実施例13ａ） に従って得られるホスホルアミジトと反応させる。その後、ホスファイトをヨウ 素溶液での処理によりホスホトリエステルに転化し末端のDMT基をジクロロメタ ン中でのトリクロロ酢酸溶液との反応により切断する。末端の２’−デオキシウ リジン上に存在するα，β−不飽和カルボニル系ヘチオール基を加えるため、そ れをテトラヒドロフラン中の10−（４−アザ−２−ヒドロキシ−５−イミノ−８ −メルカプト−オクタン）−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル）−１， ４，７，10−テトラアザシクロドデカン^*）と反応させ、メタノール及び水の連 続液で洗浄する。固体ビヒクルから修飾されたオリゴヌクレオチドを除去するた め、カラムの成分をマルチバイアルに移し、５mlの30％アンモニア溶液と混合し 、この容器を密閉して55℃で一晩振とうする。その後、それを０℃に冷やして遠 心し、ビヒクルを５mlの水で洗浄して、組み合わされた水相を凍結乾燥させる。 精製のために、固体材料を２mlの水に取り、２mlの0.5Ｍアンモニウムアセテ ート溶液と混合して10mlのエタノールと混合し、それを−20℃で一晩おいて、遠 心し、残ったものを１mlのエタノール（−20℃）で洗浄し、最後に室温で真空中 で乾燥させる。 ６mgのタイトル化合物を無色の粉体として得る。 ＊）10−（４−アザ−２−ヒドロキシ−５−イミノ−８−メルカプト−オクタ ン）−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラア ザシクロドデカンは以下に記載のように得られる： 15.7mlの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液及び480mg（3.49mmol）の２−イミノテト ラヒドロチオフェンヒドロクロライドを50mlの水及び50mlのメタノールの混合物 中の1.46ｇ（3.49mmol）の10−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−プロピル）−１ ，４，７−トリス−（カル ボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン（実施例１ｃを参 照のこと）の溶液に加えて、室温で３時間、撹拌して開始容量の約１／４まで真 空におけるエバポレーションにより濃縮し、pHが11となるまでアニオン交換体(I RA 410)で撹拌する。この溶液をろ過して、小さな部分で撹拌しながらpHが3.5と なるまで十分なカチオン交換体と混合する。ろ過した後、この溶液を凍結乾燥す る。1.39ｇの要求される物質を水成分4.9％で白い粉体として得る。 （無水物に関する）元素分析： Cld ： Ｃ 48.45 Ｈ 7.74 Ｎ 16.14 Ｓ 6.16 Fnd ： Ｃ 48.30 Ｈ 7.98 Ｎ 16.05 Ｓ 6.44 ｃ）36merオリゴヌクレオチド 及び10−（４−アザ−２−ヒドロキシ−５−イミノ−８−メルカプト−オクタン ）−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザ シクロドデカンの接合体のイットリウム−90複合体 Ｕ^*：５−（プロプ−２−エン−１−オン）−２’−デオキシウリジン 0.05Ｍ酢酸アンモニウム溶液（約380ｍCi）中に溶解された⁹⁰イットリウムの 溶液をpH６の0.05Ｍ酢酸アンモニウム溶液0.5ml中の１mgの実施例13ｂ）のチオ 誘導体に加え、３Ｍ酢酸でpH5.2に調節して室温で１時間、撹拌する。それを0.0 1Ｍ水酸化ナトリウム溶液でpH7.0に調節し、この接合体をHPLC(TSK−400／−MES −緩衝液)により精製する。主要画分を組み合わせて、生理食塩水で希釈して、0 .01Ｍ水酸化ナトリウム溶液でpH7.2にする。ろ過の後、放射線療法に適した調製 物を得る。 実施例14 ａ）Ｓ−（トリフェニルメチル−メルカプトアセチル）−グリシル−グリシンメ チルエステル 3.34ｇ（10mmol）のＳ−トリフェニルメチルメルカプト酢酸及び1.83ｇ（10mm ol）のグリシルグリシンメチルエステルヒドロクロライドを250mlの無水ジクロ ロメタンに懸濁する。1.01ｇの（10mmol）のトリエチルアミンを加えた後、50ml の無水ジクロロメタン中に溶解された2.06ｇ（10mmol）のジシクロヘキシルカル ボジイミドを氷冷しながら入れる。それを０℃で１時間、室温で18時間、撹拌す る。それをろ過して、エバポレーションにより濃縮し、シリカゲル上でクロマト グラフィーを行う（溶離液CH₂Cl₂／MeOH：10％〜30％） 収率：3.56ｇ（理論値の77.0％），白色粉体 元素分析： Cld ：Ｃ 67.51 Ｈ 5.67 Ｎ 6.06 Ｏ 13.84 Ｓ 11.20 Fnd ：Ｃ 67.37 Ｈ 6.02 Ｎ 5.91 Ｓ 6.73 ｂ）〔Ｓ−（トリフェニルメチル−メルカプトアセチル）−グリシル−グリシン アミジル〕−６−ヘキサノール 実施例14ａ）下で作られたＳ−（トリフェニル−メチル−メルカプトアセチル ）−グリシル−グリシンメチルエステル4.63ｇ（10mmol）をアルゴン雰囲気下で ２時間、６−アミノ−ヘキサノール11.72ｇ（100mmol）／１，４−ジオキサン50 ml中で100℃に加熱する。その後、反応バッチを100mlのジクロロメタン及び100m lの水の混合物上に注ぐ。撹拌及び氷冷しながら10Ｍ塩酸でpHを６に調節し、有 機相を分離して硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒のエバポレーションの後、 その粗産物をシリカゲル（溶離液：CH₂Cl／MeOH：10％〜50％）で精製する。 収率：2.97ｇ（理論値の54.2％），白白粉体 元素分析： Cld ：Ｃ 67.98 Ｈ 6.81 Ｎ 7.67 Ｏ 11.68 Ｓ 5.85 Fnd ：Ｃ 67.72 Ｈ 6.93 Ｎ 7.93 Ｓ 5.64 ｃ）Ｏ−｛〔Ｓ−（トリフェニルメチル−メルカプトアセチル）−グリシル−グ リシン−アミジル〕−６−ヘキシ−１−イル｝−ジイソプロピルアミド−Ｏ’− メチル−亜リン酸ジエステル 実施例14ｂ）下で作られた5.48ｇ（10mmol）の〔Ｓ−（トリフェニルメチル− メルカプトアセチル）−グリシル−グリシンアミジル〕−６−ヘキサノールを10 0mlの無水ジクロロメタンに溶かす。5.17ｇ（40mmol）のジイソプロピルエチル アミンをアルゴン雰囲気下で加え、50mlの無水ジクロロメタンに溶解された3.95 ｇ（20mmol）の亜リン酸モノメチルエステルジイソプロピルアミドクロライドを ０℃で入れる。それを０℃で0.5時間、その後室温で２時間、撹拌する。作用さ せるために、それを氷冷下で320mg（10mmol）の無水メタノールと混合し、濃縮 後、シリカゲル（溶離液：CH₂Cl₂／MeOH：95％：５／５％トリエチルアミン）で クロマトグラフィーを行う。 収率：1.98ｇ（理論値の27.9％），無色の油 ｄ）35merオリゴヌクレオチド の５’−〔（メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−アミジル）−６−ヘキ シ−１−イル〕−亜リン酸エステル ５’結合配列5'-T*T*T*T*Tの修飾を有するSELEX法に従って同定された30mer− オリゴヌクレオチドをPharmacia companyの自動合成機により作り(Oligonucleot ides and Analogues，A Practical Approach，Ed．F．Eckstein，Oxford Univer sity Press，Oxford ，New York，Tokyo，1991)、この保護された形態におけるオリゴヌクレオチドも 固体ビヒクルのカラム上におく。カラムの充填は約15mgの35mer−オリゴヌクレ オチドである。５’−DMT−保護基の切断（トリクロロ酢酸／ジクロロメタン） 後、それを実施例14ｃ）下に記載されるホスホルアミジトと標準的な方法に従い 結合させる。テトラヒドロフラン中でのヨウ素での酸化の後、接合体とビヒクル から切断する。この場合、材料を30％アンモニア溶液10mlと混合し、その容器を 密閉して55℃で一晩、振とうする。それを０℃に冷却して遠心し、このビヒクル を10mlの水で洗浄して、組み合わされた水相を凍結乾燥させる。 精製のために、その材料を５mlの水にとり、４mlの0.5Ｍ酢酸アンモニウム溶 液４mlと混合して20mlのエタノールと混合する。沈殿させるために、それを一晩 冷却し（−20℃）、遠心して残ったものを１mlのエタノール（−20℃）で洗浄し 、真空中で乾燥させる。９mgの白色粉体を得る。 Ｓ−トリチル保護基の切断のために、その材料を５mlの50mmolトリエチルアン モニウムアセテート溶液(pH7.0)にとり、500μｌの0.1Ｍ硝酸銀溶液と共に30分 間、インキュベートする。その後、500μｌの0.14Ｍジチオトレイトール溶液を 加えて更に30分間、インキュベートする。遠心の後、透明な上清をSephadex G-1 0で脱塩する。産物を含む画分を凍結乾燥させる。４mgの接合体を白色粉体とし て得る。 ｅ）35merオリゴヌクレオチド の接合体５’−〔（メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−アミジル）−６ −ヘキシ−１−イル〕−リン酸エステルのテクネチウム−99ｍ複合体 １mgの接合体14ｄ）を0.1Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液(pH＝9.5)１mlに溶 かす。10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後、それをナトリウムペルテクネテー ト溶液（１ｍCi）と混合して、その後10mlの塩化スズ（II）溶液（５mgのSnCl₂ ／１mlの0.01Ｍ HCl）に混合する。残ったものの収率（約93％）をHPLCにより測 定する。 実施例15 ａ）Ｏ−｛〔Ｓ−（トリフェニルメチル−メルカプトアセチル）−グリシル−グ リシン−アミジル〕−６−ヘキシ−１−イル｝−トルエンスルホン酸エステル 実施例14ｂ）下で作られた5.48ｇ（10mmol）の〔Ｓ−（トリフェニルメチル− メルカプトアセチル）−グリシル−グリシンアミジル〕−６−ヘキサノールを10 0mlの無水ジクロロメタンに溶かす。1.01ｇ（10mmol）のトリエチルアミン及び1 .91ｇ（10mmol）のｐ−トルエンスルホン酸クロライドを加えて室温で24時間撹 拌する。その後、それを遠心してシリカゲル（溶離液：CH₂Cl₂／MeOH：95：５） でクロマトグラフィーを行う。 収率：4.32ｇ（理論値の61.5％），無色の油 元素分析： Cld ：Ｃ 65.03 Ｈ 6.18 Ｎ 5.99 Ｏ 13.68 Ｓ 9.14 Fnd ：Ｃ 64.93 Ｈ 6.32 Ｎ 5.78 Ｓ 8.87 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’−〔（メルカプトアセチル−グリシル−グリシルアミジル）−６−ヘキシ −１−イル〕−リン酸エステル ５’結合配列5'-T*T*T*T*Tの修飾を有するSELEX法に従って同定された30mer− オリゴヌクレオチドをPharmacia companyの自動合成機により作り（Oligonucleo tides and Analogues，A Practica l Approach，Ed．F．Eckstein，Oxford University Press，Oxford，New York， Tokyo，1991を参照のこと）、この保護された形態のオリゴヌクレオチドを固体 ビヒクルのカラムにかける。カラムの充填は35mer−オリゴヌクレオチド約15mg である。５’−DMT−保護基の切断（トリクロロ酢酸／ジクロロメタン）の後、 それをＳ−トリチル−６−メルカプト−ヘキシル−ホスホルアミジトと標準的な 方法に従って結合させる。テトラヒドロフラン中でのヨウ素での酸化の後、この トリチル保護化合物をビヒクルから切断して単離し精製する（実施例14ｄを参照 ） Ｓ−トリチル保護基の切断、SH基を有するオリゴヌクレオチドの単離、及び精 製を実施例14ｄ）下に記載されるように行う（６mg）。 結合のために、0.1Ｍ炭酸ナトリウム溶液500μｌ中のSH基を有する35mer−オ リゴヌクレオチド（６mg）をアルゴン雰囲気下で、500μｌのジメチルホルムア ミドに溶解されたトルエンスルホン酸エステル15ａ）と混合する。30分後、それ を中和して、５mlの容量まで水で希釈する。遠心の後、透明な上清を凍結乾燥さ せる。 Ｓ−トリチル基の切断のために、14ｄ）下に記載されるような方法を行う。精 製の後、４mgの接合体を得る。 ｃ）35merオリゴヌクレオチド の接合体５’−〔（メルカプトアセチル−グリシル−グリシンアミジル）−６− ヘキシ−１−イル〕−リン酸エステルのトリチウム−99ｍ複合体 実施例15ｂ）下に記載される接合体１mgを１mlの0.1Ｍリン酸水素二ナトリウ ム、緩衝液(pH＝9.5)に溶かす。10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後、それを ナトリウムペルテクネテート溶液（１ｍ Ci）と混合し、その後10μｌの塩化スズ（II）溶液（５mgのSnCl₂／１mlの0.01 Ｍ HCl）と混合する。残ったものの収率（約95％）をHPLCにより決定する。 実施例16 ａ）Ｎ−〔３−チア−５−（トリフェニルメチルメルカプト）−１−オキソ−ペ ンチ−１−イル〕−Ｓ−トリフェニルメチル−システインメチルエステル 2.69ｇ（10mmol）のＮ−〔３−チア−５−（トリフェニルメチルメルカプト） −１−オキソ−ペンチ−１−イル〕−Ｓ−トリフェニルメチル−システインメチ ルエステル（DE 43 10 999に従う製造）を、100mlの無水ジクロロメタン中に、5 .58ｇ（20mmol）のトリフェニルメチルクロライドと共に溶解する。2.02ｇ（20m mol）のトリエチルアミンを加えた後、それを室温でアルゴン雰囲気下で一晩撹 拌する。作用させるために、その有機相を３回、各々１％クエン酸溶液、飽和重 炭酸ナトリウム溶液及び水で洗浄する。硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、それ をエバポレーションにより濃縮してシリカゲル（溶離液：CH₂Cl₂／MeOH:95：５ ）で精製する。 収率：無色の油の4.53ｇ（理論値の60.1％） 元素分析： Cld ：Ｃ 73.27 Ｈ 5.75 Ｎ 1.86 Ｏ 6.37 Ｓ 12.76 Fnd ：Ｃ 73.31 Ｈ 5.48 Ｎ 1.63 Ｓ 12.49 ｂ）Ｎ−〔３−チア−５−（トリフェニルメチルメルカプト）−１−オキソ−ペ ンチ−１−イル〕−Ｓ−トリフェニルメチル−Ｎ’−（６−ヒドロキシ−ヘキシ −１−イル）システインアミド 実施例16ａ）下に記載されるＮ−〔３−チア−５−（トリフェニルメチルメル カプト）−１−オキソ−ペンチ−１−イル〕−Ｓ−システインメチルエステルを 、２時間、アルゴン雰囲気下で11.72ｇ (100mmol)の６−アミノヘキサノール／50mlの１，４−ジオキサン中で100℃に加 熱する。その後、反応バッチを100mlのジクロロメタン及び100mlの水の混合物上 に注ぐ。撹拌及び氷冷しながら、それを10Ｍ塩酸でpH６に調節し、その有機相を 分離して硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒のエバポレーションの後、粗産物 をシリカゲル（溶離液：CH₂Cl₂／MeOH：５％〜50％）で精製する。 元素分析： Cld ：Ｃ 72.99 Ｈ 6.49 Ｎ 3.34 Ｏ 5.72 Ｓ 11.46 Fnd ：Ｃ 72.73 Ｈ 6.62 Ｎ 3.11 Ｓ 11.17 ｃ）Ｏ−｛｛〔Ｎ−〔３−チア−５−（トリフェニルメルチメルカプト）−１− オキソ−ペンチ−１−イル〕−Ｓ−トリフェニルメチル−システニル｝−２−ア ミノ−エチ−１−イル｝−ジイソプロピルアミド−Ｏ’−メチル亜リン酸ジエス テル 実施例16ｂ）下で作られたＮ−〔３−チア−５−（トリフェニルメチルメルカ プト）−１−オキソ−ペンチ−１−イル〕−Ｓ−トリフェニルメチル〕−Ｎ’− （６−ヒドロキシ−ヘキシ−１−イル）システインアミドを200mlの無水ジクロ ロメタン中に溶かす。5.17ｇ（40mmol）のジイソプロピルエチルアミンをアルゴ ン雰囲気下で加え、50mlの無水ジクロロメタンに溶解された3.95ｇ（20mmol）の 亜リン酸モノメチルエステル−ジイソプロピルアミド−クロライドを０℃におい て入れる。それを０℃で0.5時間、撹拌した後、1.5時間、室温で撹拌する。作用 させるために、氷冷しながら、無水メタノール320mg（10mmol）と混合し、濃縮 した後、シリカゲル上でクロマトグラフィーを行う（溶離液：CH₂Cl／MeOH：95 ：５／５％（トリエチルアミン）） 収率：黄色状油の5.37ｇ（理論値の53.7％） ｄ）35merオリゴヌクレオチド の５’−〔Ｎ−（３−チア−５−メルカプト−１−オキソ−ペンチ−１−イル〕 −システイン−Ｎ’−〔６−ヒドロキシ−ヘキシ−１−イル）−アミド〕−リン 酸エステル SELEX法に従って同定された30mer−オリゴヌクレオチドをPharmacia company の自動合成機により、上流に位置する配列T*T*T*T*T-3’の修飾で作り（Oligonu cleotides and Analogues，A Practical Approach，Editor F．Eckstein，Oxfor d University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991を参照のこと）、保護形 態におけるオリゴヌクレオチドも固体ビヒクルのカラム上におく。カラムの充填 は35mer−オリゴヌクレオチド約15mgである。５’−DMT−保護基（トリクロロ酢 酸／ジクロロメタン）の切断の後、それを標準的な方法に従ってホスホルアミジ ト（16ｃ）とカップリングし、その後酸化する。 塩基保護基のビヒクルからの切断及びビス−Ｓ−トリチル−保護接合体の精製 を14ｄ）下に記載されるように行う（約12mg）。 Ｓ−トリチル保護基の切断のために、その材料を５mlの50mmolのトリエチルア ンモニウムアセテート溶液(pH＝7.0)中にとり、30分間、500μｌの0.1Ｍ窒化銀 溶液と共にインキュベートする。その後、500μｌの0.14Ｍジチオトレイトール 溶液を加え、更に30分間、インキュベートする。遠心後、透明な上清をSephadex G-10で脱塩する。この産物を含む画分を凍結乾燥させる。５mgの白色粉体を得 る。 ｅ）35merオリゴヌクレオチド の接合体５’−〔Ｎ−（３−チア−５−メルカプト−１−オキソ−ヘンチ−１− イル〕−システイン−Ｎ’−（６−ヒドロキシ−ヘキ シ−１−イル）−アミド〕−リン酸エステルのテクネチウム−99ｍ複合体 実施例16ｄ下に記載される接合体１mgを１mlの0.1Ｍリン酸水素二ナトリウム 緩衝液(pH＝9.5)中に溶かす。10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後、それをナ トリウムペルテクネテート溶液（１ｍCi）と混合し、その後10μｌの塩化スズ（ II）溶液（５mgのSnCl₂／１mlの0.01Ｍ HCl）と混合する。残ったものの収率（ 約96％）をHPLCにより決定する。 実施例17 ａ）Ｏ−｛Ｎ−（３−チア−５−（トリフェニルメチルメルカプト）−１−オキ ソ−ペンチ−１−イル〕−Ｓ−トリフェニルメチル−Ｎ’−（６−ヒドロキシ− ヘキシ−１−イル）システイン−イミジル｝−ｐ−トルエンスルホン酸エステル 実施例16ｂ下で作られたＮ−｛３−チア−５−（トリフェニル−メチルメルカ プト）−１−オキソ−ペンチ−１−イル｝−Ｓ−トリフェニルメチル−Ｎ’−（ ６−ヒドロキシ−ヘキシ−１−イル）システインアミドを200mlの無水ジクロロ メタン中に溶かす。1.01ｇ（10mmol）のトリエチルアミン、1.91ｇ（10mmol）の ｐ−トルエンスルホン酸クロライドを加え、室温で20時間、撹拌する。その後、 それを濃縮してシリカゲル上でクロマトグラフィーを行う（溶離液：CH₂Cl₂／Me OH：97：３） 収率：6.44ｇ（理論値の67.0％）の黄色状油 元素分析： Cld ：Ｃ 72.47 Ｈ 6.29 Ｎ 2.91 Ｏ 8.32 Ｓ 10.01 Fnd ：Ｃ 72.19 Ｈ 6.47 Ｎ 2.68 Ｓ 9.83 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’−〔（メルカプトアセチル−グリシル−グリシン−アミジル）−13−トリ デク−７−チオ−１−イル〕−リン酸エステル SELEX法に従って同定される30mer−オリゴヌクレオチドを、Pharmacia compan yの自動合成機により、上流に位置した配列T*T*T*T*T-3’の修飾と共に作り（Ol igonucleotides and Analogues，A Practical Approach，Editor F．Eckstein， Oxford University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991）、この保護された 形態におけるオリゴヌクレオチドも固体ビヒクルのカラム上におく。カラムの充 填は約15mgの35mer−オリゴヌクレオチドである。５’−DMT保護基（トリクロロ 酢酸／ジクロロメタン）の切断の後、それを標準的な方法に従ってＳ−トリチル −６−メルカプトヘキシル−ホスホルアミジトとカップリングする。 テトラヒドロフラン中でのヨウ素での酸化の後、トリチル保護化合物をビヒク ルから切断し、単離して、精製する（実施例14ｄを参照のこと）。 Ｓ−トリチル保護基の切断のために、SH−基含有オリゴヌクレオチドの単離及 び精製を、実施例14ｄ）下に記載されるように行う。 カップリングのために、0.1Ｍ炭酸ナトリウム溶液550μｌ中のSH−基含有30me r−オリゴヌクレオチド（７mg）をアルゴン雰囲気下で180mgのトルエンスルホン 酸エステル17ａ）と混合し、500μｌのジメチルホルムアミド中に溶解させる。3 0分後、それを中和して水で５mlの容量に希釈する。遠心の後、その透明な上清 を凍結乾燥させる。Ｓ−トリチル基の切断のために、手順を14ｄ）下に記載され るように行う。精製後、4.3ｇの接合体を得る。 ｃ）35merオリゴヌクレオチド の接合体５’−〔（メルカプトアセチル−グリシル−グリシン−ア ミジル）−13−トリデカ−７−チオ−１−イル〕−リン酸エステル 実施例17ｂ）下に記載される接合体１mgを１mlの0.1Ｍリン酸水素二ナトリウ ム緩衝液(pH＝9.5)に溶かす。10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後、それをナ トリウムペルテクネテート溶液（１ｍCi）と混合し、その後10μｌの塩化スズ（ II）（５mgのSnCl₂／１mlの0.01Ｍ HCl）と混合する。残ったものの収率（約93 ％）をHPLCにより決定する。 実施例18 ａ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及びＮ−（テトラヒド ロ−２−オキソ−チオフェン−３−イル）−チオジグリコール酸モノアミドの接 合体 SELEX法に従って同定された30mer−オリゴヌクレオチドをPharmacia company の自動合成機により上流に位置した配列T*T*T*T*T-3’の修飾と共に作り（Oligo nucleotides and Analogues，A Practical Approach，Editor F．Eckstein，Oxf ord University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991）、その保護形態にお けるオリゴヌクレオチドを固体ビヒクルのカラム上にものせる。カラムの充填は 、約15mgの35mer−オリゴヌクレオチドである。５’−DMT−保護基の切断（トリ クロロ酢酸／ジクロロメタン）の後、それを標準的方法に従ってＮ−トリフルオ ロアセチルアミノヘキシルホスホルアミジトとカップリングする。 テトラヒドロフラン中でのヨウ素での酸化の後、アミノ基含有オリゴヌクレオ チドをビヒクルから切断し、１ｂ）下に記載されるように精製する(9.3mg)。 Ｎ−（テトラヒドロ−２−オキソ−チオフェン−３−イル）−チ オジグリコール酸モノアミド（DE 43 11 023）とのカップリングのために、５mg のアミノ基含有オリゴヌクレオチドを１mlの２Ｍ炭酸ナトリウム溶液に溶かす。 100mgのチオラクトン誘導体を加えた後、それを室温で４時間、インキュベート する。その後、それを中和して3,000の排除限界の膜（Amicon YM3）を通す限外 ろ過により脱塩する。凍結乾燥後、それを凍結乾燥させる。6.3mgの要求される 接合体を得る。 ｂ）35merオリゴヌクレオチド 及びＮ−（テトラヒドロ−２−オキソ−チオフェン−３−イル）−チオジグリコ ール酸モノアミドの接合体５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル ）のテクネチウム−99ｍ複合体 実施例18ａ）下に記載されるSH−基含有接合体１mgを１mlの0.1Ｍリン酸水素 二ナトリウム緩衝液(pH＝9.5)に溶かす。10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後 、それをナトリウムペルテクネテート溶液（１ｍCi）と混合し、その後10μｌの 塩化スズ（II）溶液（５mgのSnCl₂／１mlの0.01Ｍ HCl）と混合する。その残っ たものの収率（94％）をHPLCにより決定する。 実施例19 ａ）32mer−オリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル） ビヒクル上に５’−位置に結合した上流に位置したチミジン配列-T³'^-3'T-5' の修飾を有するSELEX法に従って同定された30mer−オリゴヌクレオチド5'-CUCAU GGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’をPharmacia companyの自動合成機において通常 の方法により作り（Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach， Editor F ．Eckstein，Oxford University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991）、そ のオリゴヌクレオチドを固体ビヒクルのカラム上にもおく。ジクロロメタン中ト リクロロ酢酸との反応により、５’−水酸基を開く。カラムの充填は、その32me r−オリゴヌクレオチド約10mgである。リンカーと結合させるために、カラムを テトラゾリンの存在下で（NuCl．Acids．Res．16，2659〜2669（１988）に従っ て作られた）50μmolのβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−６ −（トリフルオロアセトアミド）−１−ヘキシル−ホスホルアミジトのアセトニ トリル溶液と反応させる。完全に保護されたホスホトリエステルへの形成された ホスファイトの酸化をテトラヒドロフラン中のヨウ素で行う。その後、カラムを メタノール及び水の連続液で洗浄する。固体ビヒクルから修飾されたオリゴヌク レオチドを除去するために、カラムの成分をマルチバイアル内に移し、５mlの30 ％アンモニア溶液と混合し、この容器を密閉して55℃で一晩振とうする。その後 、それを０℃に冷却し、遠心してビヒクルを５mlの水で洗浄して、組み合わされ た水性相を凍結乾燥させる。 精製のために、その固体材料を２mlの水中にとり、２mlの0.5Ｍ酢酸アンモニ ウムと混合し、10mlのエタノールと混合し、それを−20℃で一晩おき、遠心して 、その残りを１mlのエタノール（−20℃）で洗浄し、最後に室温で真空中で乾燥 させる。 ８mgのタイトル化合物を無色の粉体として得る。 ｂ）32merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び10−〔７−（４− イソチオシアナトフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシ メチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル）− １，４，７，10−テトラア ザシクロドデカンの接合体 実施例19ａ）において得られたオリゴヌクレオチド８mgを2.5mlのNaHCO₃／Na₂ CO₃緩衝液(pH8.0)中に溶かし、１mgの10−〔７−（４−イソチオシアナトフェニ ル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザ−ヘ プチル〕−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テト ラアザシクロドデカン（実施例１ｆのタイトル化合物）と混合する。それを室温 で５時間、撹拌し、0.01Ｍ塩酸を加えることによりそのpHを7.2に調節し、その 溶液を排除限界3,000の膜（Amicon YM3）を通して限外ろ過し、その後、凍結乾 燥する。７mgの要求される接合体を得る。 ｃ）32merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び10−〔７−（４− イソチオシアナトフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシ メチル）−４−アザ−ヘプチル〕−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル） −１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンの接合体の¹¹¹インジウム複合体 （２Ｍ酢酸ナトリウム溶液中の¹¹¹インジウム（III）クロライドから、0.1Ｍ 塩酸でpHを4.0に調節して作られた15μｌの¹¹¹インジウム（III）アセテート溶 液を、MES緩衝液、pH6.2（MES＝２−（Ｎ−モルホリノ）エチルスルホン酸）中 の１mgの実施例19ｂ）のタイトル化合物の溶液135μｌに加える。そのpHを0.01 Ｍ塩酸を加えることにより4.2にする。それをpH4.2で37℃において１時間、撹拌 する。それを２Ｍ酢酸ナトリウム溶液でpH６にして10μｌの0.1Ｍ Na₂EDTA溶液 （Na₂EDTA＝エチレンジアミン−テトラ酢酸二ナトリウム塩）10μｌを複合体過 剰¹¹¹インジウムに加える。これによ り得られた標識された接合体（１ｈ）の最終精製をHPLC（排除クロマトグラフィ ー：TSK−400／MES−緩衝液）により行う。標識された接合体を含む画分を生理 食塩水で希釈して0.01Ｍ水酸化ナトリウム溶液でpH7.2に調節してろ過する。そ の後、これにより作られた溶液は放射線診断のための適切な調製物となる。 実施例20 35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル） SELEX法に従って同定された30mer−オリゴヌクレオチド5'-TAGGAGGAGGAGGGAGA GCGCAAAUGAGAUU-3'（米国特許第5,270,163号の配列番号：13）をPharmacia comp anyの自動合成機において通常の方法において作り（Oligonucleotides and Anal ogues，A Practical Approach，Ed．F．Eckstein，Oxford University Press，O xford，New York，Tokyo，1991を参照のこと）、そのオリゴヌクレオチドを固体 ビヒクルのカラムにもおく。その４つの最終的チミジンを“Oligonucleotides a nd Analogues，”pp.109〜135においてG．Blaton et alにより記載される技術に 従って５’−末端上に存在するチミジンに、ホスホロジチオエートにより結合さ せる。この目的のために、最初に５’−水酸基をトリクロロ酢酸での処理により 開く。その後、５’−DMTO−チミジンの３’−水酸基をジアミジト中のトリス− ピロリジノホスファイン及びテトラゾールで転化し、２，４−ジクロロベンジル メルカプタンを加えることによりホスホロチオアミジトに転化する。この化合物 をテトラゾールで活性化し、オリゴヌクレオチドの５’−水酸基と反応させてチ オホスフェートトリエステルにする。ホスホロジチオエートへの酸化をカーボン ジスルフィド、ピリジン、トリエチルアミン95：95：10の溶液中の硫黄 元素で行う。ベンジル基はまだ除去されていない。同様に、３の更なるチミジン も結合させる。カラムの充填は約10mgの35mer−オリゴヌクレオチドである。そ の後、５’−水酸基を再び開く。 リンカーと結合するために、カラムをテトラゾリンの存在下で50μmolの実施 例における２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノ−６−（トリフ ルオロアセトアミド）−１−ヘキシルホスホルアミジト（litのアセトリトリル 溶液と反応させる。形成されたホスファイトのホスホトリエステルへの酸化をテ トラヒドロフラン中のヨウ素で行う。その後、カラムをメタノール及び水で連続 的に洗う。その後、ジチオネート結合の保護基をチオフェノール／トリエチルア ミン／ジオキサン１：２：２の溶液に２時間おいて除去する。その後、カラムを メタノールでその容量で各々３回、洗浄し、その後エステルで洗浄して乾燥させ る。固体ビヒクルから修飾されたオリゴヌクレオチドを除去するために、カラム の成分をマルチバイアル内に移し、５mlの30％アンモニア溶液と混合し、容器を 密閉して、55℃で一晩、振とうする。その後、それを０℃に冷やして、遠心し、 ビヒクルを５mlの水で洗浄し、その組み合わされた水相を凍結乾燥させる。 精製するために、固体材料を２mlの水にとり、２mlの0.5Ｍ酢酸アンモニウム 溶液と混合し、10mlのエタノールと混合し、それを−20℃で一晩おき、遠心し、 残ったものを１mlのエタノール（−20℃）で洗浄し、最後に室温で真空中で乾燥 させる。 ８mgのタイトル化合物を無色の粉体として得る。 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び10−〔７−（４− イソチオシアナト−フェニル）−２−ヒドロキシ−５ −オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザ−ヘプチル〕−１，４，７−ト リス−（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンの接 合体 実施例20ａ）において得られたオリゴヌクレオチド８mgを2.5mlのNaHCO₃／Na₂ CO₃緩衝液(pH8.0)に溶かして、１mgの10−〔７−（４−イソチオシアナトフェニ ル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザ−ヘ プチル〕−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テト ラアザシクロドデカン（実施例１ｆのタイトル化合物）中に溶かす。それを室温 で５時間、撹拌し、そのpHを0.01Ｍ塩酸を加えることにより7.2に調節し、その 溶液を排除限界3,000の膜（Amicon YM3）を通して限外ろ過し、その後凍結乾燥 する。 ７mgの要求される接合体を得る。 ｃ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び10−〔７−（４− イソチオシアナトフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシ メチル）−４−アザ−ヘプチル〕−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル） −１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンの接合体の¹¹¹インジウム複合体 （２Ｍ酢酸ナトリウム溶液中の¹¹¹インジウム（III）クロライドから、0.1Ｍ 塩酸でpHを4.0に調節して作られた）¹¹¹インジウム（III）アセテート溶液(350 μCi)15μｌをMES緩衝液、pH6.2（MES＝２−（Ｎ−モルホリノ）−エチルスルホ ン酸）中の実施例20ｂ）のタイトル化合物１mgの溶液135μｌに加える。そのpH を0.01Ｍ塩酸を加えることにより4.2にする。それをpH4.2において37℃で１時間 、撹拌する。それを２Ｍ酢酸ナトリウム溶液でpH６にし、10μ ｌの0.1Ｍ Na₂EDTA＝エチレンジアミン−テトラ酢酸二ナトリウム塩を複合過剰^{1 11} インジウムに加える。これにより得られた接合体（１ｈ）の最終精製をHPLC（ 排除クロマトグラフィー：TSK−400／MES−緩衝液）により行う。標識された接 合体を含む画分を生理食塩水で希釈し、0.01Ｍ水酸化ナトリウム溶液でpH7.2に 調節し、ろ過する。これにより作られた溶液は、その後、放射線診断のための適 切な調製物となる。 実施例21 ａ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル） 上流に位置した配列T**T**T**T**T-3’の修飾を有するSELEX法に従って同定さ れた30mer−オリゴヌクレオチド5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’を、シ アノエチルホスフェート基を３’によりビヒクル上に作ることにより接続された ５のチミジンの配列により最初に得る。この化合物のアセトニトリル中のテトラ エチルチウラムの0.5Ｍ溶液との反応により、ホスホノチオエートへのスルホン 化を15分以内に行い、その後、遊離５’−水酸基を35merオリゴヌクレオチドリ ウムのための開始材料とする。全体の合成をPharmacia companyの自動合成機に おいて通常の方法で行い（Oligonucleotides and Analogues，A Practical Appr oach，Editor F．Eckstein，Oxford University Press，Oxford，New York，Tok yo，1991）、そのオリゴヌクレオチドを固体ビヒクルのカラム上にもおく。ジク ロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５’−水酸基を開く。カラ ムの充填は約10mgの35mer−オリゴヌクレオチドである。リンカーと結合させる ため、カラムをテトラゾールの存在下で（NuCl．Acids．Res．16，2659〜2669（ 1988）に従って作られ た）50μmolのβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−６−（トリ フルオロアセトアミド）−１−ヘキシル−ホスホルアミジトのアセトニトリル溶 液と反応させる。このような方法で形成されたホスファイトの完全に保護された ホスホトリエステルへの酸化を、テトラヒドロフラン中のヨウ素で行う。その後 、カラムをメタノール及び水で連続的に洗浄する。固体ビヒクルから修飾された オリゴヌクレオチドを除去し、シアノエチル基を除去するため、カラムの成分を マルチバイアルに移し、５mlの30％アンモニア溶液と混合し、その容器を密閉し て55℃で一晩振とうする。その後、それを０℃に冷やし、遠心し、そのビヒクル を５mlの水で洗浄し、その組み合わされた水相を凍結乾燥させる。 精製のために、その固体材料を２mlの水にとり、２mlの酢酸アンモニウム溶液 と混合し、10mlのエタノールと混合し、それを−20℃で一晩おき、遠心して、残 ったものを１mlのエタノール（−20℃）で洗浄して最後に室温で真空中で乾燥さ せる。 ８mgのタイトル化合物を無色の粉体として得る。 ｂ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び〔７−（４−イソ チオシアナトフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシ−メ チル）−４−アザ−ヘプチル〕−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル）− １，４，７，10−テトラアザシクロドデカンの接合体 実施例20ａ）において得られた８mgのオリゴヌクレオチドを2.5mlのNaHCO₃／N a₂CO₃緩衝液(pH8.0)に溶かし、１mgの10−〔７−（４−イソチオシアナトフェニ ル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザ−ヘ プチル〕−１，４，７− トリス−（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン（ 実施例１ｆのタイトル化合物）と混合する。それを室温で５時間、撹拌し、その pHを0.01Ｍ塩酸を加えることにより7.2に調節し、その溶液を排除限界3,000の膜 （Amicon YM3）を通して限外ろ過し、その後凍結乾燥する。 ７mgの要求される接合体を得る。 ｃ）35merオリゴヌクレオチド の５’−（６−アミノ−１−ヘキシル−リン酸エステル）及び10−〔７−（４− イソチオシアナトフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシ −メチル）−４−アザ−ヘプチル〕−１，４，７−トリス−（カルボキシメチル ）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンの接合体の¹¹¹インジウム複合 体 （２Ｍ酢酸ナトリウム中の¹¹¹インジウム（III）クロライドから、0.1Ｍ塩酸 でpHを4.0に調節して作られた）15μｌの¹¹¹インジウム（III）アセテート溶液( 350μCi)をMES緩衝液、pH6.2（MES＝２−（Ｎ−モルホリノ）−エチルスルホン 酸）中の１mgの実施例21ｂ）のタイトル化合物の135μｌの溶液に加える。そのp Hを0.01Ｍ塩酸を加えることによりpHを4.2にする。それをpH4.2において37℃で １時間、撹拌する。それを２Ｍ酢酸ナトリウム溶液でpH６にし、10μｌの0.1Ｍ Na₂EDTA＝エチレンジアミン−テトラ酢酸二ナトリウム塩を複合過剰¹¹¹インジウ ムに加える。これにより得られた接合体（１ｈ）の最終精製をHPLC（排除クロマ トグラフィー：TSK−400／MES−緩衝液）により行う。標識された接合体を含む 画分を生理食塩水で希釈して、0.01Ｍ水酸化ナトリウム溶液でpH7.2に調節し、 ろ過する。その後、これにより作られた溶液は放射線診断のための適切な調製物 を示す。 実施例22 ａ）Ｎ−（５−メルカプト−３−チア−１−オキソ−ペンチ−１−イル）−グリ シンメチルエステル 12.56ｇ（0.1mol）のグリシンメチルエステルヒドロクロライド、13.42ｇ（0. 1mol）の２，５−ジチア−シクロヘキサノン及び10.12ｇ（0.1mol）のトリエチ ルアミンをアルゴン雰囲気下で500mlの無水ジクロロメタン中に溶かす。それを 室温で24時間、撹拌し、その後、そのバッチを５％クエン酸水溶液250ml上に注 ぐ。それを十分に撹拌し、その有機相を分離して硫酸ナトリウム上で乾燥させる 。真空内での溶媒のエバポレーションの後、油状の残物をシリカゲル上でクロマ トグラフィーを行う（移動溶媒：ジクロロメタン／メタノール、メタノール０〜 10％） 収率：18.9ｇ（84.6％）、無色の油 元素分析： Cld ：Ｃ 37.65 Ｈ 5.87 Ｎ 6.27 Ｏ 21.49 Ｓ 28.71 Fnd ：Ｃ 37.43 Ｈ 6.02 Ｎ 6.12 Ｓ 28.48 ｂ）Ｎ−〔５−（トリフェニルメチルメルカプト）−３−チア−１−オキソ−ペ ンチ−１−イル〕−グリシンメチルエステル 11.17ｇ（50mmol）のＮ−（５−メルカプト−３−チア−１−オキソ−ペンチ −１−イル）−グリシンメチルエステル（実施例22ａ）、13.94ｇ（50mmol）の トリフェニルメチルクロライド及び5.06ｇ（50mmol）のトリエチルアミンをアル ゴン雰囲気下で500mlの無水ジクロロメタンに溶かす。それを室温で16時間、撹 拌し、そのバッチを150mlの５％クエン酸水溶液上に注ぐ。それを十分に撹拌し て、その有機相を分離して硫酸ナトリウム上で乾燥させる。真空内での溶媒のエ バポレーションの後、油状の残物をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかける （移動溶媒：ジクロロメタン／メタノー ル、95：５）。 収率：15.7ｇ（67.4％）、無色の油 元素分析： Cld ：Ｃ 67.07 Ｈ 5.85 Ｎ 3.01 Ｏ 10.31 Ｓ 13.77 Fnd ：Ｃ 67.01 Ｈ 6.11 Ｎ 2.93 Ｓ 13.49 ｃ）Ｎ−〔５−（トリフェニルメチルメルカプト）−３−チア−１−オキソ−ペ ンチ−１−イル〕−グリシン−Ｎ’−（６−ヒドロキシヘキシル）−アミド 11.64ｇ（25mmol）のＮ−〔５−トリフェニルメチルメルカプト）−３−チア −１−オキソ−ペンチ−１−イル〕−グリシンメチルエステル（実施例22ｂ）及 び29.3ｇ(250mmol)の６−アミノヘキサノールをアルゴン雰囲気下で100℃で16時 間、一緒にとかす。その反応バッチを冷やした後、それを500mlのジクロロメタ ンにとり、250mlの５％クエン酸水溶液上に注ぐ。氷冷及び撹拌下において、そ れを濃縮塩酸で6.5のpHに調節する。その有機相を分離して硫酸ナトリウム上で 乾燥させ、真空中での溶媒のエバポレーションの後、油状残物をシリカゲルでの クロマトグラフィーにかける（移動溶媒：ジクロロメタン／メタノール、０〜10 ％メタノール）。 収率：7.7ｇ（56.0％）、無色の油 元素分析： Cld ：Ｃ 67.60 Ｈ 6.96 Ｎ 5.09 Ｏ 8.72 Ｓ 11.64 Fnd ：Ｃ 67.48 Ｈ 7.03 Ｎ 4.92 Ｓ 11.43 ｄ）Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−シアノエチル−Ｏ’−〔７，10−ジアザ−８，11 −ジオキソ−13−チア−15−（トリフェニルメチル−メルカプト）−ペンタデシ −１−イル〕−亜リン酸アミド 5.51ｇ（10mmol）のＮ−〔５−（トリフェニルメチルメルカプト）−３−チア −１−オキソ−ペンチ−１−イル〕−グリシン−Ｎ’ −（６−ヒドロキシヘキシル）−アミド（実施例22ｃ）を50mlの無水ジクロロメ タン及び50mlの無水ピリジンに溶かす。50mlの無水ジクロロメタンに溶かされた 4.73ｇ（20mmol）のジイソプロピルアミノ−Ｏ−シアノエチル−亜リン酸クロラ イドを室温でそのバッチに入れる。４時間後、それを250mlの飽和重炭酸ナトリ ウム水溶液上に注ぎ、撹拌して、その有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させる 。その溶媒のエバポレーションの後、油状残物をシリカゲルでクロマトグラフィ ーにかける（ジクロロメタン／メタノール／トリエチルアミン98：１：１）。 収率：4.32ｇ（57.5％）、無色泡状油 元素分析： Cld ：Ｃ63.97 Ｈ7.38 Ｎ7.46 Ｏ8.52 Ｐ4.12 Ｓ8.54 Fnd ：Ｃ63.81 Ｈ7.41 Ｎ7.22 Ｐ3.97 Ｓ8.31 の５’−〔Ｎ−（３’−アザ−８’−メルカプト−１’，４’−ジオキソ−６’ −チア−オクチ−１’−イル）−６−アミノヘキシル−リン酸エステル〕 上流に位置した配列T*T*T*T*T*-3'の修飾を有するSELEX法に従って同定された 30merオリゴヌクレオチド5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’をPharmacia companyの自動合成機により作り(Oligonucleotides and Analogues，A Practica l Approach，Ed．F．Eckstein，Oxford University Press，Oxford，New York， Tokyo，1931)、その保護された形態におけるオリゴヌクレオチドを固体ビヒクル のカラム上にもおく。カラムの充填は約15mgの35mer−オリゴヌクレオチドであ る。５’−DMT−保護基の切断の後、それを標準的な方法に従って実施例22ｄ下 に記載されるホスホルアミジトとカップリングする。テトラヒドロフラン中のヨ ウ素での酸化の後、 その接合体をビヒクルから切断する。この目的のために、その材料を10mlの30％ アンモニア溶液と混合し、55℃で一晩振とうする。それを０℃に冷やして、遠心 し、そのビヒクルを10mlの水で洗浄し、その組み合わされた水相を凍結乾燥させ る。精製のために、その材料を５mlの水中で振とうし、４mlの0.5mol酢酸アンモ ニウムを加えて20mlのエタノールと混合する。沈殿の完了のために、それを一晩 冷却（−20℃）し、遠心して、残物を１mlのエタノール（−20℃）で洗浄し、真 空で乾燥させる。9.5mgの白色粉体を得る。Ｓ−トリチル保護基の切断のために 、その材料を５mlの50mmolトリエチルアンモニウムアセテート溶液（pH＝７）に とり、500μｌの0.1Ｍ硝酸銀溶液と共に30分間、インキュベートする。その後、 500μｌの0.14Ｍジチオトレイトール溶液を加えて更に30分間、インキュベート する。遠心後、その透明な上清をSephadex G-10で脱塩する。その産物を含む画 分を凍結乾燥する。3.5mgの白色粉体を得る。 の５’−〔Ｎ−（３’−アザ−８’−メルカプト−１’，４’−ジオキソ−６’ −チア−オクチ−１’−イル）−６−アミノヘキシル−リン酸エステル〕のTc− 99ｍ複合体 実施例22ｅ）下に記載される１mgの接合体を１mlの１Ｍリン酸水素二ナトリウ ム溶液(pH＝8.5)に溶かす。約10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後、それをナ トリウムペルテクネテート溶液（１ｍCi）と混合し、その後10μｌの塩化スズ（ II）（0.01Ｍ HClの５mg／１ml）と混合する。その収率（約95％）をHPLCにより 決定する。 実施例23 の５’−〔Ｎ−（６’−アザ−７’−ヒドロキシカルボキシ−９’−メルカプト −１’，５’−ジオキソ−３’チア−ノニ−１’−イ ル）−６−アミノヘキシルリン酸エステル〕 最初に、500μｌの無水DMF中のＮ−（２−オキソ−テトラヒドロチオフェン− ３−イル）−チオジグリコール酸モノアミドのＮ−ヒドロキシスクシニイミドエ ステル（DE 43 11 023）の溶液を作る。この目的のために、24.9mg(0.1mmol)の Ｎ−（２−オキソ−テトラヒドロチオフェン−３−イル）−チオジグリコール酸 モノアミド及び11.5mg(0.1mmol)のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを500μｌの無 水DMF中に溶かす。０℃において、19.2mg(0.1mmol)のEDCをバッチに加える。そ れを０℃で30分間、撹拌する。 実施例１下で作られた5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3’の ５’−（６−アミノ−ヘキシル−リン酸エステル）10mgを１mlの重炭酸ナトリウ ム／炭酸ナトリウム緩衝液(pH＝8.0)に溶かす。先に調製されたNHSエステルのDM F溶液を加え、アルゴン雰囲気下で室温で16時間、インキュベートする。その後 、それを遠心し、500μｌの容量に濃縮してSephadex G-25でクロマトグラフィー を行う。凍結乾燥後、２mgの接合体を白色粉体として得る。 の５’−〔Ｎ−（６’−アザ−７’−ヒドロキシ−９’−メルカプト−１’，５ ’−ジオキソ−３’−チア−ノニ−１’−イル）−６−アミノヘキシル−リン酸 エステル〕のTc−99ｍ複合体 実施例23ａ）下に記載される１mgの接合体を１mlの0.1Ｍリン酸水素二ナトリ ウム緩衝液に溶かす。10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後、それをナトリウム ペルテクネテート溶液（１ｍCi）と混合し、その後塩化スズ（II）溶液10μｌ（ 0.01Ｍ HClの５mg／１ml）と混合する。残った物の収率はHPLCにより決定される （約92％）。 実施例24 の５’−〔Ｎ−（メルカプトアセチル）−６−アミノヘキシルリン酸エステル〕 実施例１下で作られた5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3'の５ ’−（６−アミノ−ヘキシル−リン酸エステル）10mgを１mlの重炭酸ナトリウム ／炭酸ナトリウム緩衝液(pH＝8.0)に溶かす。その後、500μｌの無水DMFに溶か された23.1mg（0.1mmol）のＳ−アセチルメルカプト酢酸−NHSエステルをそのバ ッチに加え、アルゴン雰囲気下で室温で17時間、インキュベートする。その後、 それを遠心し、500μｌの容量まで濃縮してSephadex G-25でクロマトグラフィー を行う。凍結乾燥後、３mgの接合体を白色粉体として得る。 の５’−〔Ｎ−（メルカプトアセチル）−６−アミノ−ヘキシル−リン酸エステ ル〕のTc−99ｍ複合体 実施例24ａ）下に記載される接合体１mgを１mlの0.1Ｍリン酸水素二ナトリウ ム緩衝液(pH＝8.5)に溶かす。10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後、それをナ トリウムペルテクネテート溶液（１ｍCi）、その後10μｌの塩化スズ（II）溶液 （0.01Ｍ HClの５mg／１ml）と混合する。残物の収率（約97％）をHPLCにより決 定する。 実施例25 ａ）Ｎ−〔２−（トリフェニルメチルメルカプト）−エチ−１−イル〕−チオジ グリコール酸モノアミド 31.9ｇ（0.1mol）の２−（トリフェニルメチルメルカプト）−エチルアミン及 び10.1ｇ（0.1mol）のトリエチルアミンを500mlの無水ジクロロメタン内に導入 する。０℃において、13.2ｇ（0.1mol）のチオジグリコール酸無水物の溶液を入 れ、０℃で１時間、撹拌して、室温で16時間、撹拌する。その後、それを250ml の５％クエン 酸水溶液上に注ぎ、十分に撹拌して、その有機相を分離し、硫酸ナトリウム上で 乾燥させる。真空内での溶媒のエバポレーションの後、その残物をシリカゲルで のクロマトグラフィーにかける（移動溶媒：ジクロロメタン／メタノール、０〜 20％メタノール）。 収率：20.32ｇ（45.0％），無色の油 元素分析： Cld ：Ｃ 66.49 Ｈ 5.58 Ｎ 3.10 Ｏ 10.63 Ｓ 14.20 Fnd ：Ｃ 66.21 Ｈ 5.73 Ｎ 2.98 Ｓ 14.02 の５’−〔Ｎ−（１’，５’−ジオキソ−６’−アザ−３’−チア−８’−メル カプト−オクチ−１−イル）−アミノヘキシルリン酸エステル 最初に、Ｎ−（２−（トリフェニルメチルメルカプト）−エチ−１−イル〕− チオジグリコール酸モノアミド（実施例25ａ）を作る。この目的のために、45.2 mg(0.1mmol)の先に記載される酸を500μｌの無水DMF（0.1mmol）に溶かし、11.5 mg(0.1mmol)のNHSと混合する。０℃に冷やした後、19.2mg(0.1mmol)のEDCを加え 、０℃で30分間、インキュベートする。 実施例１下に記載される重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液(pH=8.0)１ ml中の5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3’を先に作られたNHS− エステル溶液500μｌと混合する。それを室温で16時間、インキュベートする。 その後、それをエバポレーションにより500μｌに濃縮し、Sephadex G-25でクロ マトグラフィーを行う。６mgのＳ−トリチル−保護化合物を得る。Ｓ−トリチル 保護基の切断、SH基を有するオリゴヌクレオチドの単離及び精製を実施例22ｅ下 に記載されるように行う。４mgの白色凍結乾燥物を得る。 の５’−〔Ｎ−（１’，５’−ジオキソ−６’−アザ−３’−チア−８’−メル カプト−オクチ−１−イル）−アミノヘキシルリン酸エステル〕 実施例25ｂ下で作られた接合体１mgを１mlの0.1Ｍリン酸水素二ナトリウム緩 衝液(pH＝8.0)に溶かす。10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後、それをナトリ ウムペルテクネテート溶液（１ｍCi）、後に塩化スズ（II）溶液10μｌ（0.01Ｍ HClの５mg／１ml）と混合する。その残物の収率をHPLCにより決定する（91％） 実施例26 ａ）Ｎ，Ｎ’−ビス−〔２−（トリフェニルメチルメルカプト）−１−オキソ− エチ−１−イル〕−３，４−ジアミノ安息香酸エステル 3.32ｇ（20mmol）の３，４−ジアミノ安息香酸メチルエステル及び13.38ｇ（4 0mmol）のＳ−トリフェニルメチル−メルカプト酢酸を200mlの無水ジクロロメタ ンに溶かす。０℃において、100mlの無水ジクロロメタン中に溶かされたジシク ロヘキシルカルボジイミド8.25ｇ（40mmol）をそのバッチ中に入れる。それを０ ℃において１時間超、撹拌して最後に室温で16時間超、撹拌する。それをろ過し て、１％クエン酸水溶液に対して振とうし、その有機相を硫酸ナトリウム上で乾 燥させ、その溶媒を真空内でエバポレートする。その残物をシリカゲルでのクロ マトグラフィーにかける（移動溶媒：ジクロロメタン／メタノール、０〜10％メ タノール）。 収率：10.2ｇ（63.8％），無色の油 元素分析： Cld ：Ｃ 75.16 Ｈ 5.30 Ｎ 3.51 Ｏ 8.01 Ｓ 8.02 Fnd ：Ｃ 75.01 Ｈ 5.58 Ｎ 3.30 Ｓ 7.89 ｂ）Ｎ，Ｎ’−ビス−〔２−（トリフェニルメチルメルカプト）−１−オキソ− エチ−１−イル〕−３，４−ジアミノ安息香酸 7.99ｇ（10mmol）のＮ，Ｎ’−ビス−〔２−トリフェニルメチルメルカプト） −１−オキソ−エチ−１−イル〕−３，４−ジアミノ安息香酸メチルエステル（ 実施例26ａ）を200mlのジオキサン、20mlの水及び20mlのメタノール中で４ｇ(10 0mmol)の水酸化ナトリウムと混合する。それを室温で５時間、撹拌し、そのバッ チを300mlの５％クエン酸水溶液上に注ぐ。それを排他的にジクロロメタンで抽 出し、その有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒のエバポレーションの 後、その残物をシリカゲルでのクロマトグラフィーにかける（移動溶媒：ジクロ ロメタン／メタノール、メタノール０〜40％）。 収率：3.56ｇ（45.4％），無色の油 元素分析： Cld ：Ｃ 74.97 Ｈ 5.14 Ｎ 3.57 Ｏ 8.15 Ｓ 8.17 Fnd ：Ｃ 74.71 Ｈ 5.32 Ｎ 3.31 Ｓ 7.88 の５’−〔Ｎ−（３’，４’−ビス（２''−メルカプトアセチルアミノ）−ベン ゾイル〕−６−アミノヘキシルリン酸エステル｝ 最初に、Ｎ，Ｎ’−ビス−〔２−（トリフェニル−メチルメルカプト）−１− オキソ−エチ−１−イル〕−３，４−ジアミノ安息香酸（実施例26ｂ）を作る。 この目的のために、その酸78.5mg(0.1mmol)を500μｌの無水DMFに溶かし、11.5m g(0.1mmol)のNHSと混合する。０℃に冷やした後、19.2mg(0.1mmol)のEDCを加え て０℃において30分間、インキュベートする。実施例１下に記載される重炭酸ナ トリウム／炭酸ナトリウム緩衝液(pH＝8.0)１ml中の5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUA GCUACAUAT*T*T*T*T*-3’の５’−（６−アミ ノヘキシル−リン酸エステル）10mgの溶液を先に作られたNHS−エステル溶液500 μｌと混合する。それを室温で17時間、インキュベートする。その後、それをエ バポレーションにより500μｌに濃縮し、Sephadex G-25でクロマトグラフィーを 行う。７mgのＳ−トリチル−保護化合物を得る。 Ｓ−トリチル保護基の切断、SH基を有するオリゴヌクレオチドの単離及び精製 を実施例22ｅ下に記載されるように行う。３mgの白色凍結乾燥物を得る。 の５’−｛Ｎ−（３’，４’−ビス−（２''−メルカプト−アセチルアミノ）− ベンゾイル〕−６−アミノヘキシル亜リン酸エステル｝ 実施例26ｃ）下に記載される接合体１mlを１mlの0.1Ｍリン酸水素二ナトリウ ム緩衝液(pH＝9.5)に溶かす。10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後、それをナ トリウムペルテクネテート溶液（１ｍCi）と混合し、次に塩化スズ（II）溶液（ 0.01Ｍ HClの５mg／１ml）10μｌと混合する。残物の収率（約91％）をHPLCによ り得た。 実施例27 ａ）Ｎ−〔Ｏ−アセチル−ヒドロキシアセチル〕−グリシル−グリシル−グリシ ン−tert−ブチルエステル 24.5ｇ（0.1mol）のグリシル−グリシル−グリシン−tert−ブチルエステル及 び11.8ｇ（0.1mol）のＯ−アセチル−グリコール酸を500mlの無水ジメチルホル ムアミドに０℃において一緒に加える。500mlの無水ジメチルホルムアミド中の2 0.6（0.1mol）の溶液をそのバッチ内に入れ、０℃において１時間、撹拌して最 後に室温で一晩、撹拌する。それをろ過してそのろ液を油ポンプ上のエバポレー ションにより濃縮する。それを酢酸エチル／ｎ−ペンタンから繰り 返し結晶化する。 収率：12.5ｇ（36.2％），白色粉体 元素分析： Cld ： Ｃ 48.69 Ｈ 6.71 Ｎ 12.17 Ｏ 32.43 Fnd ： Ｃ 48.43 Ｈ 7.01 Ｎ 11.93 ｂ）Ｎ−〔Ｏ−アセチル−ヒドロキシアセチル〕−グリシル−グリシル−グリシ ン 3.45ｇ（10mmol）のＮ−（Ｏ−アセチル−ヒドロキシアセチル〕−グリシル− グリシル−グリシン−tert−ブチルエステルを15分間、50mlのトリフルオロ酢酸 中で撹拌する。その後、それを500mlの無水ジエチルエステル上に注ぎ、その産 物をろ過して除く。それを酢酸エチル／ｎ−ペンタンから繰り返し再結晶化する 。 収率：1.23ｇ（42.5％），白色粉体 元素分析： Cld ： Ｃ 41.53 Ｈ 5.23 Ｎ 14.53 Ｏ 38.72 Fnd ： Ｃ 41.31 Ｈ 5.51 Ｎ 14.32 の５’−｛Ｎ−〔Ｎ’−（ヒドロキシアセチル）−グリシル−グリシル−グリシ ル〕−６−アミノヘキシルリン酸エステル｝ 最初に、Ｎ−（Ｏ−アセチルヒドロキシアセチル）−グリシル−グリシル−グ リシン（実施例27ｂ）を作る。この目的のために、28.9mg(0.1mmol)のその酸を5 00μｌの無水DMFに溶かし、11.5mg(0.1mmol)のNHSと混合する。０℃に冷やした 後、19.2mg(0.1mmol)のEDCを加え、０℃において30分間、インキュベートする。 実施例１下に記載される１Ｍ炭酸ナトリウム溶液１ml中の5'-CUCAUGGAGCGCAAGAC GAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3'の（６’−アミノヘキシル−リン酸エステル）10mg の溶液を先に作られたNHS−エステル溶液500 μｌと混合する。それを室温において18時間、インキュベートする。その後、そ れをエバポレーションにより500μｌに濃縮し、Sephadex G-25でクロマトグラフ ィーを行う。凍結乾燥後、３mgのタイトル化合物を得る。 の５−｛Ｎ−（Ｎ’−（ヒドロキシアセチル）−グリシル−グリシル−グリシル 〕−６−アミノヘキシルリン酸エステル｝ 実施例27ｃ下に記載される接合体１mgを0.1Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液 （pH＝10.5）１mlに溶かす。10mgの酒石酸二ナトリウムを加えた後、それをナト リウムペルテクネテート溶液（１ｍCi）、次に10μｌの塩化スズ（II）溶液（0. 01Ｍ HClの５mg／１ml）と混合する。その残物の収率はHPLCにより決定する（95 ％）。 先の実施例は、一般的又は特定して記載された反応物を置換する及び／又は先 の実施例に用いられるもののための本発明の条件を操作することにより同様の成 功を繰り返し得る。 先の記載から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確かめることができ、そ の要旨及び、範囲から離れることなく、それを種々の使用及び条件に適合させる ために本発明の種々の変換及び改良を行うことができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年８月１９日 【補正内容】 請求の範囲 １．オリゴヌクレオチドラジカルＮ及びｎ置換基（Ｂ−Ｋ）（ここで、Ｂは、 オリゴヌクレオチドラジカルへの直接の結合又はそれに接続する構成物を表し、 Ｋは、 外からの放射線により放射性同位体に転化され、 外からの放射線を異なる質、異なるエネルギー含量、及び／又は異なる波長の 放射線に転化する 原子番号５，21〜29，31，39，42〜44，49，57〜83又は85の要素の放射性金属 同位体の複合剤もしくは複合体、又は安定な同位体を意味する）からなるオリゴ ヌクレオチド接合体であって、オリゴヌクレオチドラジカルＮが、天然のヌクレ アーゼによるデグラデーションを防ぐ又は少くとも重大に阻害する改良がなされ ており、オリゴヌクレオチドが標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合 することを特徴とするオリゴヌクレオチド接合体。 ２．一般式（Ｉ） Ｎ−（Ｂ−Ｋ）_n （Ｉ） （ここで、Ｎは他の標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合するオリゴ ヌクレオチドであり、天然のヌクレアーゼによるデグラデーションを重大に削減 する改良がなされており、 ＢはＮとＫとの間の接続を形成する化学結合又は接続構成物であり、 Ｋはシグナル伝達性又は治療的に活性な要素を示し得る複合リガンドであり、 そして ｎは１〜10の間の数である） に表される化合物である請求項１に記載の化合物。 ３．Ｎが５〜200ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである請求 項１又は２に記載の化合物であって、 ａ）その糖ユニットの２′位置が、互いに独立して、次の基： 基−OR（ここで、Ｒは２までの水酸基を任意に含み、１〜５の酸素原子により 任意に割り込まれている１〜20の炭素原子のアルキル基である）、 水素原子、 水酸基、 フッ素原子、 アミン基、 アミノ基、 及び互いに独立して基Ｒと任意にエーテル化された末端位置３′及び５′に存 在する水酸基により占有されており、及び／又は ｂ）ヌクレオチド間結合として任意に用いられるホスホジエステルが、互いに 独立して、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又はアルキルホスホネー ト、好ましくはメチルホスフェートであり、及び／又は ｃ）３′−及び５′−位置における末端基がｂ）に記載されるヌクレオチド間 結合により互いに分子内様式で結合され、及び／又は ｄ）それが３′−３′−又は５′−５′−位置に結合するｂ）に記載のヌクレ オチド間結合を含み、及び／又は ｅ）それが、３−位置においてＣ₂〜Ｃ₁₀ヒドロキシアルキル基により各々エ ステル様に２つのチミジンに結合し、又は２′−又は３′−又は５′−位置にお いて他の糖の水酸基と共に、エステル様に、類似置換されたチミジン基に結合す るｂ）に記載のホスホジエステル結合を含み、及び／又は ｆ）３′−及び５′−位置における末端基がｂ）に記載のように任意に改良さ れたヌクレオチド間結合を含む ことを特徴とする請求項１又は２に記載の化合物。 ４．オリゴヌクレオチドＮが15〜100ヌクレオチドを含むことを特徴とする請 求項３に記載の化合物。 ５．Ｎが、他の標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合し、ランダム な配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物が前記標的構造と一緒にされ、ここで 特定のオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの混合物に比較して前記標的構 造に対する増加されたアフィニティーを示し、後者が前記オリゴヌクレオチド混 合物の残りから分離され、その後前記標的構造に対して増加されたアフィニティ ーを有するオリゴヌクレオチドが、前記標的構造に結合するオリゴヌクレオチド の増加された部分を示すオリゴヌクレオチドの混合物を得るために増幅されるこ とにおいて得られうるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜４ のいずれか一に記載の化合物。 ６．Ｎが、他の標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合し、 ａ）最初に、DNA鎖が、該DNA鎖がRNAポリメラーゼのためのプロモーターに相 補的であり、同時にポリメラーゼ鎖反応(PCR)のプライマーに相補的である３′ 末端上の規定された配列を示すように、そして前記DNA鎖がポリメラーゼ鎖反応 のためのプライマー配列に相補的である５′末端上の規定されたDNA配列を示し 、前記規定された配列間の配列がランダム配列を含むように化学合成により作製 されること、及び ｂ）前記DNA鎖がRNAポリメラーゼにより相補的RNA鎖に転写され、リボース単 位の２′−位置において改良されたヌクレオチドが前記ポリメラーゼに供される こと、及び ｃ）この様に製造されたRNAオリゴヌクレオチドが該オリゴヌク レオチドが特異的に結合すべき前記標的構造と一緒にされること、及び ｄ）前記標的構造に結合されたこれらのオリゴヌクレオチドが結合していない オリゴヌクレオチドからの標的構造と最初に一緒にされ、次に結合したオリゴヌ クレオチドが前記標的構造から再び分離されること、及び ｅ）これらの標的構造特異的RNAオリゴヌクレオチドが相補的DNA鎖において逆 転写酵素により転写されること、及び ｆ）これらのDNA鎖がポリメラーゼ鎖反応と共に規定されたプライマー配列を 用いて増幅されること、及び ｇ）その後、この様にして増幅されたDNAオリゴヌクレオチドがRNAポリメラー ゼにより、RNAオリゴヌクレオチドにおける改良されたヌクレオチドで再び転写 されること、及び ｈ）先に記載の選択ステップｃ）〜ｇ）が、前記標的構造に対する高結合アフ ィニティーを特徴とするオリゴヌクレオチドが十分に選択されるまで任意にしば しば繰り返され、その後これにより得られたオリゴヌクレオチドの配列が任意に 決定され得ること において得られうるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜５ のいずれか一に記載の化合物。 ７．前記標的構造が高分子、動物もしくはヒトのような高等生物の組織構造、 動物もしくはヒトの器官もしくは器官の一部、細胞、腫瘍細胞又は腫瘍から選択 されることを特徴とする請求項６に記載の化合物。 ８．接続構成物Ｂが、 ａ）CH₂−OH基により４′−位置において還元されたオリゴヌクレオチドラジ カルＮの４′端に、及び／又は ｂ）水素原子により３′−位置において還元されたオリゴヌクレ オチドラジカルＮの３′端に、及び／又は ｃ）２つのヌクレオチド各々の間のOH基により還元されたホスホジエステルブ リッジに、及び／又は ｄ）５−，８−位置において各々水素原子により、及び／又は２−，４−及び ６−位置においてアミノ基により還元された１〜10のヌクレオベースに 結合されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一に記載の化合物。 ９．Ｂが、前記複合剤又は複合物にＸ側において、オリゴヌクレオチドにＺ側 において接続された一般式：Ｘ−Ｙ−Ｚ¹ 〔ここで、Ｘは直接の結合、−NH又は−Ｓ基であり、 Ｙは、１〜２シクロヘキシレン、１〜５イミノ、１〜３フェニレン、１〜３フ ェニレンイミノ、１〜３フェニレノキシ、１〜３ヒドロキシフェニレン、１〜５ アミド、１〜２ヒドラジド、１〜５カルボニル、１〜５エチレノキシ、ウレイド 、チオウレイド、１〜２カルボキシアルキルイミノ、１〜２エステル基、Arの１ 〜３基（ここでArは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜２ヘテロ原子及び ／又は１〜２カルボニル基を任意に含む飽和もしくは不飽和５もしくは６員環を 表す）、１〜10酸素、１〜５窒素及び／又は１〜５硫黄原子を任意に含み、及び ／又は１〜５ヒドロキシ、１〜２メルカプト、１〜５オキソ、１〜５チオキソ、 １〜３カルボキシ、１〜５カルボキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜５エステル、 １〜３アミノ、１〜３ヒドロキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜３Ｃ₁〜Ｃ₇−アル コキシ基により任意に置換された直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和のＣ₁ 〜Ｃ₂₀アルキレン基であり、 Ｚ¹は、−CONH−CH₂−４′，−NH−CO−４′，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ¹−NH−CH₂− ４′，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ¹−Ｏ−CH₂−４′，− Ｏ−Ｐ（Ｓ）Ｒ¹−Ｏ−３′又は−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ′−Ｏ−３′（ここで、４′ 又は３′は末端の糖ユニットとの結合を示し、Ｒ¹はＯ^-，Ｓ^-，Ｃ₁〜Ｃ₄アルキ ル又はＲ²及びＲ³が水素もしくはＣ₁〜Ｃ₄アルキル基を意味するNR²R³基である ）である〕 を有することを特徴とする請求項８のハラグラフａ）又はｂ）に記載の化合物 。 10．Ｂが、前記複合剤又は複合物にＸ側において、オリゴヌクレオチドにＺ側 において接続された一般式：Ｘ−Ｙ−Ｚ² 〔ここで、Ｚ²は、２つの隣接する糖ユニット： を結合するブリッジにおいて、基−NR²−，−Ｏ−又は−Ｓ−であり、 Ｘは直接の結合、−NH又は−Ｓ基であり、 Ｙは、１〜２シクロヘキシレン、１〜５イミノ、１〜３フェニレン、１〜３フ ェニレンイミノ、１〜３フェニレノキシ、１〜３ヒドロキシフェニレン、１〜５ アミド、１〜２ヒドラジド、１〜５カルボニル、１〜５エチレノキシ、ウレイド 、チオウレイド、１〜２カルボキシアルキルイミノ、１〜２エステル基、Arの１ 〜３基（ここでArは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜２ヘテロ原子及び ／又は１〜２カルボニル基を任意に含む飽和もしくは不飽和５もしくは６員環を 表す）、１〜10酸素、１〜５窒素及び／又は１〜５硫黄原子を任意に含み、及び ／又は１〜５ヒドロキシ、１〜２メルカプト、１〜５オキソ、１〜５チオキソ、 １〜３カルボキシ、１〜５カルボキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜５エステル、 １〜３アミ ノ、１〜３ヒドロキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜３Ｃ₁〜Ｃ₇−アルコキシ基に より任意に置換された直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和のＣ₁〜Ｃ₂₀ア ルキレン基であり、 Ｒ²は水素又はＣ₁〜Ｃ₄アルキル基である〕 を有することを特徴とする請求項８、パラグラフｃ）に記載の化合物。 11．Ｂが、一般式：Ｘ−Ｙ−Ｚ³ 〔ここでＺ³は−NH基又は前記ヌクレオベースへの直接の結合を表し、 Ｘは直接の結合、−NH又は−Ｓ基であり、 Ｙは、１〜２シクロヘキシレン、１〜５イミノ、１〜３フェニレン、１〜３フ ェニレンイミノ、１〜３フェニレノキシ、１〜３ヒドロキシフェニレン、１〜５ アミド、１〜２ヒドラジド、１〜５カルボニル、１〜５エチレノキシ、ウレイド 、チオウレイド、１〜２カルボキシアルキルイミノ、１〜２エステル基、Arの１ 〜３基（ここでArは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜２ヘテロ原子及び ／又は１〜２カルボニル基を任意に含む飽和もしくは不飽和５もしくは６員環を 表す）、１〜10酸素、１〜５窒素及び／又は１〜５硫黄原子を任意に含み、及び ／又は１〜５ヒドロキシ、１〜２メルカプト、１〜５オキソ、１〜５チオキソ、 １〜３カルボキシ、１〜５カルボキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜５エステル、 １〜３アミノ、１〜３ヒドロキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜３Ｃ₁〜Ｃ₇−アル コキシ基により任意に置換された直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和のＣ₁ 〜Ｃ₂₀アルキレン基である〕 を有することを特徴とする請求項８、パラグラフｄ）に記載の化合物。 12．前記金属複合物が、像形成要素として、要素銅、ビスマス、 テクネチウム、レニウム又はインジウムから選択される放射性同位体を含むこと を特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の化合物。 13．標的構造を検出するための方法であって、先の請求項のいずれか一に記載 の化合物の一以上が、生体内又は試験管内においてシグナルを基にして研究され るべきサンプルと一緒にされ、オリゴヌクレオチドＮが特異的かつ高結合アフィ ニティーで結合する標的構造が前記サンプル内に存在するか否かを検出すること を特徴とする方法。 14．病気の非侵襲性の診断のための方法であって、請求項１〜12のいずれか一 に記載の化合物の１以上が、生体内でシグナルを基にして研究されるべき標的構 造と一緒にされ、オリゴヌクレオチドＮが特異的に結合する標的構造が研究され るべき生物内に存在するか否かを検出することを特徴とする方法。 15．放射線診断及び／又は放射線治療における請求項１〜12のいずれか一に記 載の化合物の使用。 16．標的構造の生体内及び／又は試験管内検出のための診断キットであって、 該診断キットが、少くとも１つの請求項１〜12のいずれか一に記載の化合物を含 むことを特徴とする診断キット。 17．請求項１〜４のいずれか一に記載の化合物であって、Ｎが、標的分子に対 する特定の結合アフィニティーを有する非天然のオリゴヌクレオチドリガンドで あり、前記標的分子が、ワトソン／クリック塩基対形成又は三重らせん結合に主 に依存する機構により前記オリゴヌクレオチドリガンドに結合するポリヌクレオ チド以外の三次元化学構造であり、前記オリゴヌクレオチドリガンドが前記標的 分子により結合される周知の生理学的機能を有する核酸でないことを特徴とする 化合物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，Ｂ Ｒ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ， ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者 ヒルガー，クリストフ−シュテファン ドイツ連邦共和国，デー−13353 ベルリ ン，オステンダー シュトラーセ ３アー (72)発明者 ニエトバラ，ウルリッヒ ドイツ連邦共和国，デー−14195 ベルリ ン，ゴスラーシュトラーセ 28アー (72)発明者 プラツェク，ヨハネス ドイツ連邦共和国，デー−14195 ベルリ ン，クレイアレ 64 (72)発明者 ラディヘル，ベルント ドイツ連邦共和国，デー−13465 ベルリ ン，ゴランツシュトラーセ 132 (72)発明者 スペック，ウルリッヒ ドイツ連邦共和国，デー−13465 ベルリ ン，フィルシュタンダム 20 (72)発明者 ゴールド，ラリー アメリカ合衆国，コロラド 80302，ボー ルダー，フィフス 1033 (72)発明者 ピーケン，ボルフガンク アメリカ合衆国，コロラド 80503，ロン グモント，マウント ミークス ロード 7308

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．オリゴヌクレオチドラジカルＮ及びｎ置換基（Ｂ−Ｋ）（ここで、Ｂは、 オリゴヌクレオチドラジカルへの直接の結合又はそれに接続する構成物を表し、 Ｋは、 外からの放射線により放射性同位体に転化され、 外からの放射線を異なる質、異なるエネルギー含量、及び／又は異なる波長の 放射線に転化する 原子番号５，21〜29，31，39，42〜44，49，57〜83又は85の要素の放射性金属 同位体の複合剤もしくは複合体、又は安定な同位体を意味する）からなるオリゴ ヌクレオチド接合体であって、オリゴヌクレオチドラジカルＮが、天然のヌクレ アーゼによるデグラデーションを防ぐ又は少くとも重大に阻害する改良がなされ ていることを特徴とするオリゴヌクレオチド接合体。 ２．一般式（Ｉ） Ｎ−（Ｂ−Ｋ）_n （Ｉ） （ここで、Ｎは他の標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合するオリゴ ヌクレオチドであり、天然のヌクレアーゼによるデグラデーションを重大に削減 する改良がなされており、 ＢはＮとＫとの間の接続を形成する化学結合又は接続構成物であり、 Ｋはシグナル伝達性又は治療的に活性な要素を示し得る複合リガンドであり、 そして ｎは１〜10の間の数である） に表される化合物である請求項１に記載の化合物。 ３．Ｎが５〜200ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである請求項１又は２に 記載の化合物であって、 ａ）その糖ユニットの２’位置が、互いに独立して、次の基： 基−OR（ここで、Ｒは２までの水酸基を任意に含み、１〜５の酸素原子により 任意に割り込まれている１〜20の炭素原子のアルキル基である）、 水素原子、 水酸基、 フッ素原子、 アミン基、 アミノ基、 及び互いに独立して基Ｒと任意にエーテル化された末端位置３’及び５’に存 在する水酸基により占有されており、及び／又は ｂ）ヌクレオチド間結合として任意に用いられるホスホジエステルが、互いに 独立して、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又はアルキルホスホネー ト、好ましくはメチルホスフェートであり、及び／又は ｃ）３’−及び５’−位置における末端基がｂ）に記載されるヌクレオチド間 結合により互いに分子内様式で結合され、及び／又は ｄ）それが３’−３’−又は５’−５’一位置に結合するｂ）に記載のヌクレ オチド間結合を含み、及び／又は ｅ）それが、３−位置においてＣ₂〜Ｃ₁₀ヒドロキシアルキル基により各々エ ステル様に２つのチミジンに結合し、又は２’−又は３’−又は５’−位置にお いて他の糖の水酸基と共に、エステル様に、類似置換されたチミジン基に結合す るｂ）に記載のホスホジエステル結合を含み、及び／又は ｆ）３’−及び５’−位置における末端基がｂ）に記載のように任意に改良さ れたヌクレオチド間結合を含む ことを特徴とする請求項１又は２に記載の化合物。 ４．オリゴヌクレオチドＮが15〜100ヌクレオチドを含むことを特徴とする請 求項３に記載の化合物。 ５．Ｎが、他の標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合し、ランダム な配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物が前記標的構造と一緒にされ、ここで 特定のオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの混合物に比較して前記標的構 造に対する増加されたアフィニティーを示し、後者が前記オリゴヌクレオチド混 合物の残りから分離され、その後前記標的構造に対して増加されたアフィニティ ーを有するオリゴヌクレオチドが、前記標的構造に結合するオリゴヌクレオチド の増加された部分を示すオリゴヌクレオチドの混合物を得るために増幅されるこ とにおいて得られうるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜４ のいずれか一に記載の化合物。 ６．Ｎが、他の標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合し、 ａ）最初に、DNA鎖が、該DNA鎖がRNAポリメラーゼのためのプロモーターに相 補的であり、同時にポリメラーゼ鎖反応(PCR)のプライマーに相補的である３’ 末端上の規定された配列を示すように、そして前記DNA鎖がポリメラーゼ鎖反応 のためのプライマー配列に相補的である５’末端上の規定されたDNA配列を示し 、前記規定された配列間の配列がランダム配列を含むように化学合成により作製 されること、及び ｂ）前記DNA鎖がRNAポリメラーゼにより相補的RNA鎖に転写され、リボース単 位の２’−位置において改良されたヌクレオチドが前記ポリメラーゼに供される こと、及び ｃ）この様に製造されたRNAオリゴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドが特 異的に結合すべき前記標的構造と一緒にされること、 及び ｄ）前記標的構造に結合されたこれらのオリゴヌクレオチドが結合していない オリゴヌクレオチドからの標的構造と最初に一緒にされ、次に結合したオリゴヌ クレオチドが前記標的構造から再び分離されること、及び ｅ）これらの標的構造特異的RNAオリゴヌクレオチドが相補的DNA鎖において逆 転写酵素により転写されること、及び ｆ）これらのDNA鎖がポリメラーゼ鎖反応と共に規定されたプライマー配列を 用いて増幅されること、及び ｇ）その後、この様にして増幅されたDNAオリゴヌクレオチドがRNAポリメラー ゼにより、RNAオリゴヌクレオチドにおける改良されたヌクレオチドで再び転写 されること、及び ｈ）先に記載の選択ステップｃ）〜ｇ）が、前記標的構造に対する高結合アフ ィニティーを特徴とするオリゴヌクレオチドが十分に選択されるまで任意にしば しば繰り返され、その後これにより得られたオリゴヌクレオチドの配列が任意に 決定され得ること において得られうるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜５ のいずれか一に記載の化合物。 ７．前記標的構造が高分子、動物もしくはヒトのような高等生物の組織構造、 動物もしくはヒトの器官もしくは器官の一部、細胞、腫瘍細胞又は腫瘍から選択 されることを特徴とする請求項６に記載の化合物。 ８．接続構成物Ｂが、 ａ）CH₂−OH基により４’−位置において還元されたオリゴヌクレオチドラジ カルＮの４’端に、及び／又は ｂ）水素原子により３’−位置において還元されたオリゴヌクレオチドラジカ ルＮの３’端に、及び／又は ｃ）２つのヌクレオチド各々の間のOH基により還元されたホスホジエステルブ リッジに、及び／又は ｄ）５−，８−位置において各々水素原子により、及び／又は２−，４−及び ６−位置においてアミノ基により還元された１〜10のヌクレオベースに 結合されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一に記載の化合物。 ９．Ｂが、前記複合剤又は複合物にＸ側において、オリゴヌクレオチドにＺ側 において接続された一般式：Ｘ−Ｙ−Ｚ¹ 〔ここで、Ｘは直接の結合、−NH又は−Ｓ基であり、 Ｙは、１〜２シクロヘキシレン、１〜５イミノ、１〜３フェニレン、１〜３フ ェニレンイミノ、１〜３フェニレノキシ、１〜３ヒドロキシフェニレン、１〜５ アミド、１〜２ヒドラジド、１〜５カルボニル、１〜５エチレノキシ、ウレイド 、チオウレイド、１〜２カルボキシアルキルイミノ、１〜２エステル基、Arの１ 〜３基（ここでArは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜２ヘテロ原子及び ／又は１〜２カルボニル基を任意に含む飽和もしくは不飽和５もしくは６員環を 表す）、１〜10酸素、１〜５窒素及び／又は１〜５硫黄原子を任意に含み、及び ／又は１〜５ヒドロキシ、１〜２メルカプト、１〜５オキソ、１〜５チオキソ、 １〜３カルボキシ、１〜５カルボキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜５エステル、 １〜３アミノ、１〜３ヒドロキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜３ Ｃ₁〜Ｃ₇−ア ルコキシ基により任意に置換された直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキレン基であり、 Ｚ¹は、−CONH−CH₂−４’，−NH−CO-４’，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ¹−NH−CH₂− ４’，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ¹−Ｏ−CH₂−４’，−Ｏ−Ｐ（Ｓ）Ｒ¹−Ｏ−３’又は −Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−Ｏ−３’（ ここで、４’又は３’は末端の糖ユニットとの結合を示し、Ｒ¹はＯ^-，Ｓ^-，Ｃ₁ 〜Ｃ₄アルキル又はＲ²及びＲ³が水素もしくはＣ₁〜Ｃ₄アルキル基を意味するNR² R³基である）である〕 を有することを特徴とする請求項８のハラグラフａ）又はｂ）に記載の化合物 。 10．Ｂが、前記複合剤又は複合物にＸ側において、オリゴヌクレオチドにＺ側 において接続された一般式：Ｘ−Ｙ−Ｚ² 〔ここで、Ｚ²は、２つの隣接する糖ユニット： を結合するブリッジにおいて、基−NR²−，−Ｏ−又は−Ｓ−であり、 Ｘは直接の結合、−NH又は−Ｓ基であり、 Ｙは、１〜２シクロヘキシレン、１〜５イミノ、１〜３フェニレン、１〜３フ ェニレンイミノ、１〜３フェニレノキシ、１〜３ヒドロキシフェニレン、１〜５ アミド、１〜２ヒドラジド、１〜５カルボニル、１〜５エチレノキシ、ウレイド 、チオウレイド、１〜２カルボキシアルキルイミノ、１〜２エステル基、Arの１ 〜３基（ここでArは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜２ヘテロ原子及び ／又は１〜２カルボニル基を任意に含む飽和もしくは不飽和５もしくは６員環を 表す）、１〜10酸素、１〜５窒素及び／又は１〜５硫黄原子を任意に含み、及び ／又は１〜５ヒドロキシ、１〜２メルカプト、１〜５オキソ、１〜５チオキソ、 １〜３カルボキシ、１〜５カルボキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜５エステル、 １〜３アミノ、１〜３ヒドロキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜３ Ｃ₁〜Ｃ₇ −アルコキシ基により任意に置換された直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不 飽和のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキレン基であり、 Ｒ²は水素又はＣ₁〜Ｃ₄アルキル基である〕 を有することを特徴とする請求項８、パラグラフｃ）に記載の化合物。 11．Ｂが、一般式：Ｘ−Ｙ−Ｚ³ 〔ここでＺ³は−NH基又は前記ヌクレオベースへの直接の結合を表し、 Ｘは直接の結合、−NH又は−Ｓ基であり、 Ｙは、１〜２シクロヘキシレン、１〜５イミノ、１〜３フェニレン、１〜３フ ェニレンイミノ、１〜３フェニレノキシ、１〜３ヒドロキシフェニレン、１〜５ アミド、１〜２ヒドラジド、１〜５カルボニル、１〜５エチレノキシ、ウレイド 、チオウレイド、１〜２カルボキシアルキルイミノ、１〜２エステル基、Arの１ 〜３基（ここでArは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜２ヘテロ原子及び ／又は１〜２カルボニル基を任意に含む飽和もしくは不飽和５もしくは６員環を 表す）、１〜10酸素、１〜５窒素及び／又は１〜５硫黄原子を任意に含み、及び ／又は１〜５ヒドロキシ、１〜２メルカプト、１〜５オキソ、１〜５チオキソ、 １〜３カルボキシ、１〜５カルボキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜５エステル、 １〜３アミノ、１〜３ヒドロキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、１〜３ Ｃ₁〜Ｃ₇−ア ルコキシ基により任意に置換された直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキレン基である〕 を有することを特徴とする請求項８、パラグラフｄ）に記載の化合物。 12．前記金属複合物が、像形成要素として、要素銅、ビスマス、テクネチウム 、レニウム又はインジウムから選択される放射性同位 体を含むことを特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の化合物。 13．標的構造を検出するための方法であって、先の請求項のいずれか一に記載 の化合物の一以上が、生体内又は試験管内においてシグナルを基にして研究され るべきサンプルと一緒にされ、オリゴヌクレオチドＮが特異的かつ高結合アフィ ニティーで結合する標的構造が前記サンプル内に存在するか否かを検出すること を特徴とする方法。 14．病気の非侵襲性の診断のための方法であって、請求項１〜12のいずれか一 に記載の化合物の１以上が、生体内でシグナルを基にして研究されるべき標的構 造と一緒にされ、オリゴヌクレオチドＮが特異的に結合する標的構造が研究され るべき生物内に存在するか否かを検出することを特徴とする方法。 15．放射線診断及び／又は放射線治療における請求項１〜12のいずれか一に記 載の化合物の使用。 16．標的構造の生体内及び／又は試験管内検出のための診断キットであって、 該診断キットが、少くとも１つの請求項１〜12のいずれか一にに記載の化合物を 含むことを特徴とする診断キット。 17．請求項１〜４のいずれか一にに記載の化合物であって、Ｎが、標的分子に 対する特定の結合アフィニティーを有する非天然のオリゴヌクレオチドリガンド であり、前記標的分子が、ワトソン／クリック塩基対形成又は三重らせん結合に 主に依存する機構により前記オリゴヌクレオチドリガンドに結合するポリヌクレ オチド以外の三次元化学構造であり、前記オリゴヌクレオチドリガンドが前記標 的分子により結合される周知の生理学的機能を有する核酸でないことを特徴とす る化合物。