JPH10501962A - マトリックス金属プロテアーゼのｄｎａ配列、その調製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト・マトリックス金属プロテアーゼ、ならびにこれから誘導された相同のＤＮＡ配列が開示されている。また、これらのＤＮＡ配列によりコードされている蛋白質及び蛋白質変異型、それらの発現、調製および用途も開示されている。本発明は、分子生物学的、医学的および薬学的研究の分野、医学的な診断および治療の目的で、ならびに医薬品産業およびバイオテクノロジー産業に応用される。

Description

【発明の詳細な説明】 マトリックス金属プロテアーゼのＤＮＡ配列、 その調製および使用 詳細な説明 本発明は、ヒト・マトリックス金属プロテアーゼのＤＮＡ配列ならびにこれか ら誘導された配列および相同の配列に関する。本発明は、更に、ＤＮＡ配列によ ってコード化されたタンパク質、タンパク質変異体、その発現、調製および利用 に関する。応用分野は、分子生物学的、医学的および薬学的研究、医学的診断お よび治療、医薬品産業およびバイオテクノロジー産業である。 マトリックス金属プロテアーゼは、細胞外マトリックスのタンパク質を加水分 解する。マトリックス金属プロテアーゼは、マトリックス構造を変化し、細胞・ マトリックス・交互作用に影響を与える。マトリックス金属プロテアーゼには、 コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシンおよび金属エラスターゼが含まれ る／１／。この酵素は、特に、下記の生理学的プロセスに関与する。排卵／２／ ，子宮の胚着床／３／、胚形成中の細胞移動および組織転位／４／，乳腺／５／ 及び子宮の退行／６／，脈管形成／７／。マトリックス金属プロテアーゼは、傷 の治癒および瘢痕形成／８／，腫瘍細胞の転移／９，１０／，リウマチ性関節炎 および骨関節炎／１１，１２／，歯周疾患／１３／において重要な役割を演ずる 。 すべてのマトリックス金属プロテアーゼは、活性中心に、Ｚｎ²⁺イオンを含む 。不活性なプロ酵素の形に合成されたマトリックス金属プロテアーゼの活性化は 、活性中心のＺｎ²⁺イオンとマトリックス金属プロテアーゼのＮ末端プロペプチ ドのCys 残基との間の結合を解くことを必要とする（システイン・スィッチ）／ １４／。マトリックス金属プロテアーゼは、相互に相同である複数のタンパク質 ドメインからなる／１，１４／。プロテアーゼ・マトリリシンは、１つのプロペ プチドと触媒ドメインのアミノ酸配列だけからなるが、他のマトリックス金属プ ロテアーゼは、更に、約２００のアミノ酸のヘモペクシン類似の配列を含む。ゼ ラチナーゼＡおよびＢは補助アミノ酸系列を含む。公知のヒト・マトリックス金 属プロテアーゼ、その分子量およびその好ましい基質を表１に示した。 各種のマトリックス金属プロテアーゼは、マトリックス・タンパク質に特性的 な巨大分子特異性を特徴とするだけでない。その活性は、各種の分子および細胞 レベルでコントロールされる： １．成長因子、サイトカイン、ポリペプチドホルモン、プロスタグランジン、グ ルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロンおよびその他のエフェクター によるマトリックス金属プロテアーゼの合成の調節／１，１４／ ２．膜受容体へのマトリックス金属プロテアーゼの結合／１５／ ３．当該のプロペプチドの特殊な加水分解(16)又は酸化(17)による不活性プロ酵 素の活性化 ４．特殊なタンパク質阻害剤（例えば、ＴＩＭＰ−１，ＴＩＭＰ−２，ＴＩＭＰ −３によるマトリックス金属プロテアーゼの阻害（ＴＩＭＰ＝マトリックス金属 プロテアーゼの組織阻害剤） ５．マトリックス金属プロテアーゼのタンパク質分解 マトリックス金属プロテアーゼは、その重要な生理学的機能および疾患の発病 におけるその役割にもとづき鋭意研究されている。その他のマトリックス金属プ ロテアーゼの発見および特徴付けに関心が持たれる。 本発明は、医学的研究、診断および治療のためにこれまで知られていない新規 のヒト・マトリックス金属プロテアーゼを開発することを目的する。本発明の課 題は、マトリックス金属プロテアーゼのＤＮＡ配列を同定及び単離し、ＤＮＡ配 列によってコード化したタンパク質を特徴付けることにある。 本発明は、請求項１−１６にもとづき実現される。 新規のマトリックス金属プロテアーゼは、下記の方法によって検出される： 公知のマトリックス金属プロテアーゼの配列の中で、保存されたアミノ酸系列 を選択する。２つの適切な系列は、プロペプチド（システイン・スィッチ）内の 保存Cys 残基のまわりのアミノ酸と、酵素の活性中心ーのＺｎ²⁺結合に関与する アミノ酸とである。選択したペプチドについて、縮退したオリゴヌクレオチドを 合成する。オリゴヌクレオチドと、細胞および組織のｍＲＮＡの逆転写によって 得られるｃＤＮＡを使用して複製連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する。合成したＤＮ Ａ断片をクローン化し、配列する。検出された配列を遺伝子データバンクの配列 と比較する。これまで知られてない新規のヌクレオチド系列及びマトリックス金 属プロテアーゼのＤＮＡ配列との相同性を有するＰＣＲ生成物は、遺伝子発現を 決定しｃＤＮＡバンクから完全なｃＤＮＡ配列を得るためのプローブとして使用 される。完全なｃＤＮＡのヌクレオチド系列を確かめる。当該のタンパク質のア ミノ酸配列をコード化ヌクレオチド領域の翻訳によって誘導し、公知の方法にも とづき分析する。 下記のｃＤＮＡ配列が検出された： １．下記からなるｃＤＮＡ配列ｍｍｐｍ１ａ ・５´-非翻訳領域：塩基対１〜１４１ ・コード化領域：塩基対１４２〜１８８１ ・３´-非翻訳領域：塩基対１８８２〜３４５６ （添付資料１参照） ２．下記からなるｃＤＮＡ配列ｍｍｐｍ１ｂ ・５´-非翻訳領域：塩基対１〜１１３ ・コード化領域：塩基対１１４〜１８６２ ・３´-非翻訳領域：塩基対１８６３〜３４３７ （添付資料２参照） ３．下記からなるｃＤＮＡ配列ｍｍｐｍ２ ・５´-非翻訳領域：塩基対１〜４８ ・コード化領域：塩基対４９〜２０５８ ・３´-非翻訳領域：塩基対２０５９〜３５３０ （添付資料３参照） 本発明は、更に、上記配列の変異型と、上記配列との雑種形成によって得られ るヒトおよびその他の哺乳類の相同ＤＮＡ配列とを含む。本発明には、更に、原 核細胞または真核細胞への遺伝子転移のためのベクターと本発明に係る配列の１ つとからなる構成物も含まれる。 配列ｍｍｐｍ１ａ，ｍｍｐｍ１ｂおよびｍｍｐｍ２によって、コード化マトリ ックス金属プロテアーゼの生合成の種々の側面を研究することができる。フラン キング配列も含めて構造遺伝子を検出することができる。ｃＤＮＡ配列は、細胞 および組織の遺伝子発現を解析するための分子ゾンデとして使用できる。 ｃＤＮＡ配列ｍｍｐｍ１ａ，ｍｍｐｍ１ｂおよびｍｍｐｍ２は、下記のアミノ 酸配列をコード化する。 本発明は、更に、翻訳後タンパク質修飾、タンパク質化学的修飾またはヌクレ オチドの試験管内突然変異誘発および発現によって得られる上記タンパク質の変 異型と、免疫学的交差反応性または同等の酵素活性によって同定されるヒトおよ びその他哺乳類の相同タンパク質とを含む。更に、本発明には、単数または複数 のリガンドを含む上記タンパク質の錯体も含まれる。 ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂ，ＭＭＰｍ２は，自然源から単離できる。タンパ ク質は、原核細胞または真核細胞の遺伝子転移および発現によって合成し、再結 合された細胞からえることもできる。タンパク質ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂ， ＭＭＰｍ２は入手可能であるから、その構造および機能を研究することができる 。酵素活性および特異性の決定方法を確立することができる。タンパク質ＭＭＰ ｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂ，ＭＭＰｍ２の１次構造から出発して、モノクロナール抗 体およびポリクロナール抗体を調製できる。上記抗体は、ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰ ｍ１ｂ，ＭＭＰｍ２の診断解析に使用できる。ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂおよ びＭＭＰｍ２は、マトリックス金属プロテアーゼの天然および合成活性化因子お よび阻害剤を発見するための試験構造として使用できる。 ｍｍｐｍ１ａ，ｍｍｐｍ１ｂおよびｍｍｐｍ２ならびにＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ １ｂおよびＭＭＰｍ２を特徴づけるために、以下に、更に説明する： ＤＮＡ配列ｍｍｐｍ１ａ，ｍｍｐｍ１ｂは、その５´-非翻訳領域およびその コード化領域の上記非翻訳領域に直接続く部分だけが相違する。２つの配列は、 ヌクレオチド３６３（ｍｍｐｍ１ａ）および３４４（ｍｍｐｍ１ｂ）を始め、同 一である。配列ｍｍｐｍ１ａには、５８０のコドンの開放した読み枠が含まれて いる。読み枠は、ヌクレオチドＡ₁₄₂ＴＧから始まる。しかしながら、上記ヌク レオチドの環境は、有効な翻訳には不適である。他方、読み枠内の次のヌクレオ チドＡ₁₅₄ＴＧは、翻訳スタートに好適な環境にある。第２のＡＴＧで始めてｍ ｍｐｍ１ａの翻訳を開始できる。配列ｍｍｐｍ１ｂは、Ａ₁₁₄ＴＧで始めて、５ ８３のコドンの開放した読み枠を有する。出発コドンは、有効な翻訳を促進する ヌクレオチド系列ＡＣＣＡＴＧＴ内にある。 ｍｍｐｍ２の翻訳出発点は、Ａ₄₉ＴＧにある。ｍｍｐｍ２の開放した読み枠は 、６７０のコドンを含む。 ｃＤＮＡ配列ｍｍｐｍ１ａ，ｍｍｐｍ１ｂおよびｍｍｐｍ２から誘導されるタ ンパク質ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂおよびＭＭＰｍ２は、６５５９１，６５９ ００および７５８１３の計算分子量を有する。ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂおよ びＭＭＰｍ２の１次配列は、公知のマトリックス金属プロテアーゼの配列と相同 である。新規の３つの酵素は各々１個のシグナルペプチドと、システイン・スィ ッチ領域ＰＲＣＧＶＰＤを含むプロ配列と、共通配列ＲＲＫＲＹＡとを含む。３ つのヒスチジン残基ＨＥＬＧＨＡＬＧＬＥＮおよびヘモペキシン相同配列の特殊 の配置を含む触媒領域配列が続く。公知のマトリックス金属タロプロテアーゼと は異なり、ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂおよびＭＭＰｍ２は、更に、疎水性アミ ノ酸残基の特徴的な系列を有するＣ末端配列を含む。ＭＭＰｍ１ａおよびＭＭＰ ｍ１ｂは、疎水性アミノ酸系列ＡＡＡＶＶＬＰＶＬＬＬＬＶＬＡＶＧＬＡＶ（Ｍ ＭＰｍ１ａのアミノ酸位置５３６−５５６，ＭＭＰｍ１ｂのアミノ酸位置５３９ −５５９）を有する。ＭＭＰｍ２の同様の配列は、ＶＶＭＶＬＶＰＬＬＬＬＬＣ ＶＬＧＬＴＹ（アミノ酸残基６２６−６４５）である。上述の位置を更に越える 疎水性配列には、荷電アミノ酸残基が両端に隣接する。Ｎ末端は、荷電グルタミ ン残基およびアスパラギン酸残基が、Ｃ末端は、荷電アルギニン残基およびリシ ン残基が優勢である。 ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂおよびＭＭＰｍ２内の疎水性配列の存在から、Ｍ ＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂおよびＭＭＰｍ２は、ー公知の可溶なマトリックス金 属プロテアーゼ（表２）とは異なりー膜会合酵素であると結論づけられる。１次 配列から推論されるところでは、プロペプチド、プロテアーゼの触媒ドメインお よびヘモペキシン相同ドメインは細胞外に限局される。これに対して、タンパク 質の最外側のＣ末端は、ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂまたはＭＭＰｍ２発現細胞 の細胞質ゾル内になければならない。 ＭＭＰｍ２は、ＭＭＰｍ１ａおよびＭＭＰｍ１ｂとは異なり、Ｎ₁₄₀ＹＴに潜 在的なグリコシル化の場所を含む。 ＭＭＰｍ１ａおよびＭＭＰｍ１ｂは、そのシグナルおよびプロ配列が異なるだ けである。プロ配列の異なる構造は、ＭＭＰｍ１ａおよびＭＭＰｍ１ｂの異なる 活性化機構を示唆する。プロ配列は、加水分解によるマトリックス金属プロテア ーゼの活性化の過程で、分離されるので、ＭＭＰｍ１ａおよびＭＭＰｍ１ｂの活 性化は、同一の活性酵素をもたらす。 ヒトの組織のｍＲＮＡのノーザン・ブロッティング分析は、ＭＭＰｍ１ａおよ びＭＭＰｍ１ｂの異なる発現を証明する。ＭＭＰｍ１ａタイプのマトリックス金 属プロテアーゼは、特に、肺臓、胎盤、腎臓、卵巣、前立線、小腸、脾臓、胸線 および睾丸の組織に認められる。その発現は、心臓および膵臓の組織には明らか に少なく、脳、肝臓および骨格筋系統には殆ど検出されない。ＭＭＰｍ２は、胎 盤、心臓、肝臓、骨格筋系統、腎臓、膵臓、肺臓、睾丸、結腸および小腸に認め られる。 要約すれば、本発明は、これまで知られていない新規のヒト・マトリックス金 属プロテアーゼを提供することが確認される。マトリックス金属プロテアーゼの ｃＤＮＡおよびタンパク質配列を知れば、酵素の生合成、構造および機能の詳細 な研究が可能である。遺伝子配列の解析によって、遺伝および獲得突然変異を見 出すことができる。細胞、組織および身体排泄物中のマトリックス金属プロテア ーゼの濃度および活性の決定によって、診断上の言明を行うことができる。この 酵素は、新規の薬剤、特に、マトリックス金属プロテアーゼの賦活剤および阻止 剤を発見するための試験構造として使用することが好ましい。 下記の実施例にもとづき、本発明を詳細に説明する： Ｉ．マトリックス金属プロテアーゼの新規のＤＮＡ配列の同定 マトリックス金属プロテアーゼに対してコード化するｃＤＮＡ配列を見つける ため、ヒトの細胞および腫瘍組織、特に、神経芽細胞腫細胞、腎臓癌組織および 骨肉腫組織からｍＲＮＡを単離した。逆転写酵素によってｍＲＮＡをｃＤＮＡに 転写した。 公知のマトリックス金属プロテアーゼのタンパク質配列において、２つの保存 アミノ酸系列を選択した。 １．マトリックス金属プロテアーゼのプロペプチドの特徴的なCys 残基のまわり の配列（システイン・スィッチ） Ｐ−Ｒ−Ｃ−Ｇ−Ｖ／Ｎ−Ｐ−Ｄ ２．マトリックス金属プロテアーゼの触媒タンパク質ドメインの３つのヒスチジ ン残基を有する配列（Ｚｎ²⁺結合領域） Ｈ−Ｅ−Ｌ／Ｉ／Ｆ−Ｇ−Ｓ／Ｖ／Ａ−Ｌ／Ｍ−Ｇ アミノ酸系列に対応して、２つの保存配列のアミノ酸の変異および遺伝コード の縮重を考慮するオリゴヌクレオチド・プライマーを合成した。 １．プロペプチド・プライマー ２．Ｚｎ結合領域・プライマー 双方のプライマーは、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼ（プロペプチド・プ ライマー）およびＢａｍＨＩ（Ｚｎ²⁺結合領域・プライマー）の識別部位に対し て各々４つのデオキシイノシンヌクレオチドおよび補助ヌクレオチドを含む。 ＰＣＲにおいて縮重プライマーをｃＤＮＡとともに使用した。 反応混合物は、下記を含む： ｃＤＮＡ １００ｎｇ プロペプチド・プライマー １μｇ Ｚｎ²⁺結合領域プライマー １μｇ ポリメラーゼ ＡｍｐｌｉＴａｑ ２,５Ｅ／１００μｌＤＮＡ ｃＮＴＰ １００μＭ ゼラチン ０,０１％ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂１,５ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８,３） １０ｍＭ ５０ｓｅｃ９４°，１ｍｉｎ５６°，２ｍｉｎ７２°の順序３０の反応サイク ルを実施した。増幅したＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、次いで、 制限酵素ＸｂａｌおよびＢａｍＨＩによって分割した。大きさが３５０−５００ 塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し（図１） 、プラスミド ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でク ローン化した。各クローンをＴ３，Ｔ７−プライマーおよびシークエナーゼ２, ０（ＵＳＢ／ＡＬＳ）によって配列した。得られた配列をデータバンク、即ち、 遺伝子バンクおよびＥＭＢＬのＤＮＡ配列と比較した。配列比較は、プログラム パッケージＨＵＳＡＲのプログラムＦＡＳＴＡ（ＧＣＧパッケージ、著作権ジェ ネティクス・コンピュータ・・グループ・インコーポレーション Genetics Comp utor Group，Inc.）によって行った。例えば、腎臓癌腫のｃＤＮＡから出発して 、増幅されたＤＮＡを含む数百のクローンを得た。このうち５０を配列させた。 解析は公知および新規のＤＮＡ配列を明らかにした。前者には、ヒトの間質性コ ラーゲナーゼおよびマトリリシンの配列であった。後者には、ヒト・マトリック ス金属プロテアーゼと相同の２つの配列があった。ＰＣＲｍｍｐｍ１およびＰＣ Ｒｍｍｐｍ２と名づけた２つの新規の配列は、下記のヌクレオチドを含む： ２．ノーザン・ブロッティング分析 フラグメントＰＣＲｍｍｐｍ１およびＰＣＲｍｍｐｍ２を使用して、ヒトの組 織のマトリックス金属プロテアーゼの発現を調べた。フラグメントを放射能でマ ーキングし（マルチプライムＤＮＡ標識キット、アマーシャム・ライフサイエン ス Amersham Life Science）、ナイロン（多重組織点梁、クロンテク Clontech ）上でｍＲＮＡでハイブリッド形成した。ハイブリッド形成および以降の成長は 、標準条件下で実施した／１８／。 ＰＣＲｍｍｐｍ１およびＰＣＲｍｍｐｍ２は、何れも、約３，６ｋｂのＲＮＡ とハイブリッド形成する。しかしながら、実験は、ＰＣＲｍｍｐｍ１およびＰＣ Ｒｍｍｐｍ２とハイブリッド形成するｍＲＮＡの種々の発現を証明した（図２） 。ＰＣＲｍｍｐｍ１とハイブリッド形成する特異的転写は、特に、肺臓、胎盤、 腎臓および腎臓癌腫の組織（図示せず）に含まれている。膵臓および心臓の組織 では著しく少量であり、肝臓、骨格筋系統および脳には殆ど見られない。 ＰＣＲｍｍｐｍ２とハイブリッド形成するメッセンジャーＲＮＡは、特に、胎 盤組織で合成される。しかしながら、心臓、肝臓、骨格筋系統、腎臓、膵臓およ び肺臓での発現は、同等であり、脳組織での発現は僅かである。 ３．ｃＤＮＡｍｍｐｍ１およびｍｍｐｍ２の単離および配列 ベクターλｇｔ１１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の肺臓・ｃＤＮＡ・バンクを、ナ イロン上のファージ転移および放射能でマーキングしたプローブ、ＰＣＲｍｍｐ ｍ１および ＰＣＲｍｍｐｍ２とのハイブリッド形成によって分析した／１８／ 。ハイブリッド形成は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ，５ｘデンハルト， ０,５％ＳＤＳ，変性ニシン精子ＤＮＡ ５０μｇ／ｍｌ中において４０°で１ ６時間実施した。ハイブリッド形成後、室温および６５°以下で２ｘＳＳＣ，０ ,１％ＳＤＳ中でフィルタを洗浄し、次いで、バイオ・イメージング・アナライ ザー（ＢＡＳ ２０００，富士フィルム）で評価した。特異的に結合された放射 能にもとづき、ＰＣＲｍｍｐｍ１およびＰＣＲｍｍｐｍ２とハイブリッド形成す るファージクローンを同定した。発見したファージを希釈によって段階的に分離 した。分離されたファージのＤＮＡを分離し（キアゲン・ラムダ・キット、ディ アゲン社 Diagen GmbH）、含まれるｃＤＮＡ挿入断片をプラスミドベクターｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔ−ａｇｅｎｅ）に加えた。次いで、イン サートを部分セグメントに分割し（エラーゼａベース・システム、プロメガ Pro mega）、配列した（ＵＳＢ／ＡＬＳ）。確かめたＤＮＡ配列をプログラムパッケ ージＤＮＡ−ＳＴＡＲ（ＤＮＡ−ＳＴＡＲ社）およびＨＵＳＡＲ（ＧＣＧパッケ ージ、著作権ジェネティク・コンピュータ・グループ社）によって分析した。コ ード化配列の翻訳および得られたアミノ酸配列と公知のマトリックス金属プロテ アーゼとの比較は、新規の配列がマトリックス金属プロテアーゼのファミリーに 属することを証明した（図３）。 表および図面 表１ ヒト・マトリックス金属プロテアーゼ。記載の分子量は、酵素のｃＤＮＡ配列 から計算した。 図１ マトリックス金属プロテアーゼおよびヒトの神経芽細胞腫細胞系ＳＫ−Ｎ−Ｓ Ｈ（レーン１）、腎臓癌組織のｃＤＮＡ（レーン２）および骨肉腫組織のｃＤＮ Ａ（レーン３）の縮重プライマーによって得られたＰＣＲ生成物のアガロースゲ ル電気泳動 図２ ＭＭＰｍ１（上）およびＭＭＰｍ２（下）のｍＲＮＡのノーザン・ブロッティ ング分析 図３ ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂおよびＭＭＰｍ２とヒトの公知のマトリックス金 属プロテアーゼとの相同性比較。比較は、プログラムＣＬＵＳＴＡＬによって実 施した。略号は次の意味である。ｈｓｃｏｌｌｒ．ｐｅｐ−間質コラゲナーゼ、 ｈｓｃｉｇｎａ．ｐｅｐ−好中性コラゲナーゼ、Ｐ０５２５３．ｓｗｉｓｓｐｒ ｏ−ゼラチナーゼＡ，ｈｓ４ｃｏｌａ．ｐｅｐ−ゼラチナーゼＢ，ｈｓｍｍｐ３ ａ．ｐｅｐ−ストローメリシンＬ，ｈｓｓｔｒｏｍ２．ｐｅｐ−ストローメリシ ン２，ｈｓｓｔｒｏｍ３．ｐｅｐ−ストローメリシン３。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．マトリックス金属プロテアーゼのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列。 ２．ヒト・マトリックス金属プロテアーゼＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂおよびＭ ＭＰｍ２に対してコード化するｃＤＮＡ配列ｍｍｐｍ１ａ，ｍｍｐｍ１ｂおよび ｍｍｐｍ２ならびにｍｍｐｍ１ａ，ｍｍｐｍ１ｂおよびｍｍｐｍ２を含むヒト遺 伝子およびその他の哺乳類の相同遺伝子。 ３．下記からなるｃＤＮＡ配列ｍｍｐｍ１ａ ー ５´-非翻訳領域：塩基対１〜１４１、 ー コード化領域：塩基対１４２〜１８８１、 ー ３´-非翻訳領域：塩基対１８８２〜３４５６ （添付資料１(Anlage)1 参照） ４．下記からなるｃＤＮＡ配列ｍｍｐｍ１ｂ ー ５´-非翻訳領域：塩基対１〜１１３ ー コード化領域：塩基対１１４〜１８６２ ー ３´-非翻訳領域：塩基対１８６３〜３４３７ （添付資料２(Anlage 2)参照） ５．下記からなるｃＤＮＡ配列ｍｍｐｍ２ ー ５´-非翻訳領域：塩基対１〜４８ ー コード化領域：塩基対４９〜２０５８ ー ３´-非翻訳領域：塩基対２０５９〜３５３０ （添付資料３(Anlage 3)参照） ６．配列ｍｍｐｍ１ａ，ｍｍｐｍ１ｂおよびｍｍｐｍ２の変異型、ならびに請求 項１−５に記載の配列とのクロスハイブリッド形成によって得られるヒトおよび その他の哺乳類の相同ＤＮＡ配列。 ７．原核または真核細胞への遺伝子転移のためのベクターと、請求項ム１ないし ６に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つとからなる構成体。 ８．下記の１次構造のマトリックス金属プロテアーゼＭＭＰｍ１ａ： ９．下記の１次構造のマトリックス金属プロテアーゼＭＭＰｍ１ｂ： １０．下記の１次構造のマトリックス金属プロテアーゼＭＭＰｍ２： １１．翻訳後タンパク質修飾、タンパク質化学的修飾または請求項１ないし６に 記載のヌクレオチッドの試験管内の突然変異誘発および発現によって得られる請 求項８ないし１０に記載のタンパク質ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂおよびｍｍｐ ｍ２の変異型、ならびに免疫学的交差反応性または同等の酵素活性を有するヒト およびその他の哺乳類の相同タンパク質。 １２．単数または複数のリガンドを含む請求項８ないし１１に記載のタンパク質 の錯体。 １３．細胞への請求項１ないし６に記載のＤＮＡ配列の転移によって得られ且つ 請求項８ないし１１に記載のタンパク質を発現する再結合原核および真核細胞。 １４．天然源および請求項１３に記載の再結合細胞または請求項１３に記載の再 結合細胞の培養上澄液からタンパク質ＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂ、ＭＭＰｍ２ および上記タンパク質の変異型を得る方法。 １５．タンパク質分解活性を生じさせるための、請求項８ないし１１に記載のマ トリックス金属プロテアーゼＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂ、ＭＭＰｍ２および上 記酵素を発現する細胞の使用。 １６．プロテアーゼ・エフェクターのスクリーニングための、請求項８ないし１ １に記載のマトリックス金属プロテアーゼＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂ、ＭＭＰ ｍ２およびＭＭＰｍ１ａ，ＭＭＰｍ１ｂ、ＭＭＰｍ２を発現する細胞の使用。