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DE4438838C1 - DNA-Sequenzen für Matrix-Metallproteasen, ihre Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

DNA-Sequenzen für Matrix-Metallproteasen, ihre Herstellung und ihre Verwendung

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DE4438838C1
DE4438838C1 DE4438838A DE4438838A DE4438838C1 DE 4438838 C1 DE4438838 C1 DE 4438838C1 DE 4438838 A DE4438838 A DE 4438838A DE 4438838 A DE4438838 A DE 4438838A DE 4438838 C1 DE4438838 C1 DE 4438838C1
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mmpm1a
mmpm2
mmpm1b
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DE4438838A
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Horst Prof Dr Will
Bernd Dr Hinzmann
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Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
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Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
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Priority to EP95915743A priority patent/EP0750672B1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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Description

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen für menschliche Matrix-Metalloproteasen sowie davon abgeleitete und homologe Sequenzen. Sie betrifft ferner die durch die DNA-Sequenzen kodierten Proteine und Proteinvarianten, ihre Expression, Gewinnung und Nutzung. Anwendungsgebiete sind die molekularbiologische, medizinische und pharmazeutische Forschung, die medizinische Diagnostik und Therapie, die pharmazeutische und die biotechnologische Industrie.
Matrix-Metalloproteasen hydrolysieren Proteine der extrazellulären Matrix. Sie verändern die Matrixstruktur und beeinflussen Zell-Matrix-Wechselwirkungen. Zu den Matrix-Me­ talloproteasen gehören Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysine und Metalloelastasen /1/. Die Enzyme sind u. a. an folgenden physiologischen Prozessen beteiligt: Ovulation /2 /, Embryoimplantation in den Uterus /3/, Zellmigrationen und Gewebeumlagerungen während der Embryogenese /4/, Involution von Brustdrüse /5/ und Uterus /6/, Angiogenese /7/. Matrix-Metalloproteasen spielen eine wichtige Rolle in der Wundheilung und Narbenbildung /8/, bei der Metastasierung von Tumorzellen /9, 10/, bei rheumatischer Arthritis und bei Osteoarthritis /11, 12/, bei periodontalen Erkrankungen /13/.
Alle Matrix-Metalloproteasen enthalten im aktiven Zentrum ein Zn2+-Ion. Die Aktivierung der in Form inaktiver Proenzyme synthetisierten Matrix-Metalloproteasen erfordert die Lösung einer Bindung zwischen dem Zn2+-Ion im aktiven Zentrum und einem Cys-Rest im N-terminalen Propeptid von Matrix-Metalloproteasen (Cystein-Schalter) /14/. Matrix-Me­ talloproteasen bestehen aus mehreren Proteindomänen, die Homologie zueinander aufweisen /1, 14/. Während die Protease Matrilysin nur aus einem Propeptid und der Aminosäuresequenz der katalytischen Domäne besteht, enthalten andere Matrix-Metallo­ proteasen darüberhinaus eine hämopexin-ähnliche Sequenz von ca. 200 Aminosäuren. Die Gelatinasen A und B enthalten zusätzliche Aminosäurefolgen. Bekannte Matrix-Me­ talloproteasen des Menschen, ihre Molekulargewichte und ihre bevorzugten Substrate sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die verschiedenen Matrix-Metalloproteasen zeichnen sich nicht nur durch charakteristische makromolekulare Spezifität für Matrixproteine aus. Ihre Aktivität wird auf verschiedenen molekularen und zellulären Ebenen kontrolliert:
  • 1. Regulation der Synthese von Matrix-Metalloproteasen durch Wachstumsfaktoren, Cytokine, Polypeptidhormone, Prostaglandine, Glukocorticoide, Estrogen, Progesteron und andere Effektoren /1, 14/.
  • 2. Bindung von Matrix-Metalloproteasen an Membranrezeptoren /15/.
  • 3. Aktivierung inaktiver Proenzyme durch spezifische Hydrolyse der jeweiligen Propeptide /16/ oder durch Oxydation /17/.
  • 4. Hemmung von Matrix-Metalloproteasen durch spezifische Proteininhibitoren wie TIMP-1, TIMP-2 und TIMP-3 (TIMP = Tissue Inhibitor of Matrix-Metalloproteases) /16/.
  • 5. Proteolytischer Abbau von Matrix-Metalloproteasen.
Matrix-Metalloproteasen werden auf Grund ihrer wichtigen physiologischen Funktionen und ihrer Rolle in der Pathogenese von Krankheiten intensiv untersucht. Es besteht Interesse an der Auffindung und Charakterisierung weiterer Matrix-Metalloproteasen.
Die vorliegende Erfindung hat das Ziel, neuartige und bisher nicht bekannte Matrix-Me­ talloproteasen des Menschen für die medizinische Forschung, Diagnostik und Therapie zu erschließen. Die Aufgabe besteht darin, DNA-Sequenzen für Matrix-Metalloproteasen zu identifizieren und zu isolieren, sowie die durch die DNA-Sequenzen kodierten Proteine zu charakterisieren.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1-13 realisiert.
Neuartige Matrix-Metalloproteasen werden durch folgendes Verfahren ermittelt:
In Sequenzen bekannter Matrix-Metalloproteasen werden konservierte Aminosäurefolgen ausgewählt. Zwei geeignete Folgen sind Aminosäuren um einen konservierten Cys-Rest im Propeptid (Cystein-Schalter) und Aminosäuren, die an der Zn2+-Bindung im aktiven Zentrum der Enzyme beteiligt sind. Für die ausgewählten Peptide werden degenerierte Oligonukleotide synthetisiert. Mit den Oligonukleotiden und cDNA, welche durch reverse Transkription von mRNA aus Zellen und Geweben erhältlich ist, werden Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR) durchgeführt. Synthetisierte DNA-Fragmente werden kloniert und sequenziert. Die ermittelten Sequenzen werden mit Sequenzen in Gendatenbanken verglichen. PCR-Produkte mit neuartigen, bisher nicht bekannten Nukleotidfolgen und Homologie zu DNA-Sequenzen von Matrix-Metalloproteasen werden als Sonden zur Bestimmung der Genexpression und zur Gewinnung vollständiger cDNA-Sequenzen aus cDNA-Banken genutzt. Die Nukleotidfolgen vollständiger cDNA werden ermittelt. Die Aminosäuresequenzen der zugehörigen Proteine werden durch Translation der kodierenden Nukleotidregionen abgeleitet und nach bekannten Verfahren analysiert.
Folgende cDNA-Sequenzen wurden ermittelt:
  • 1. cDNA-Sequenz mmpm1a bestehend aus
  • - 5′-nichttranslatierter Region: Basenpaare 1 bis 141
  • - kodierender Region: Basenpaare 142 bis 1881
  • - 3′-nichttranslatierter Region: Basenpaare 1882 bis 3456 (siehe Anlage 1)
  • 2. cDNA-Sequenz mmpm1b bestehend aus
  • - 5′-nichttranslatierter Region: Basenpaare 1 bis 113
  • - kodierender Region: Basenpaare 114 bis 1862
  • - 3′-nichtranslatierter Region: Basenpaare 1863 bis 3437 (siehe Anlage 2)
  • 3. cDNA-Sequenz mmpm2 bestehend aus
  • - 5′-nichttranslatierter Region: Basenpaare 1 bis 48
  • - kodierender Region: Basenpaare 49 bis 2058
  • - 3′-nichttranslatierende Region: Basenpaare 2059 bis 3530 (siehe Anlage 3)
Die Erfindung umfaßt auch Varianten dieser Sequenzen sowie homologe DNA-Sequenzen des Menschen und anderer Säugerspezies, die durch Kreuzhybridisierung mit diesen Sequenzen aufgefunden werden. Zur Erfindung gehören ebenfalls Konstrukte, die aus einem Vektor für den Gentransfer in prokaryotische oder eukaryotische Zellen und einer der erfindungsgemäßen Sequenzen bestehen.
Mit Hilfe der Sequenzen mmpm1a, mmpm1b und mmpm2 können verschiedene Aspekte der Biosynthese kodierter Matrix-Metalloproteasen untersucht werden. Es können die Strukturgene einschließlich flankierender Sequenzen ermittelt werden. cDNA-Sequenzen können als molekulare Sonden zur Analyse der Genexpression in Zellen und Geweben verwendet werden.
Die cDNA-Sequenzen mmpm1a, mmpm1b und mmpm2 kodieren folgende Aminosäuresequenzen:
MMPm1a
MMPm1b
MMPm2
Die Erfindung umfaßt auch Varianten dieser Proteine, die durch posttranslationale Proteinmodifizierung, durch proteinchemische Modifikationen oder durch in vitro Mutagenese und Expression von Nukleotidfolgen erhalten werden sowie homologe Proteine des Menschen und anderer Säugerspezies, die durch immunologische Kreuzreaktivität oder vergleichbare Enzymaktivität identifiziert werden. Zur Erfindung gehören ebenfalls Komplexe dieser Proteine mit einem oder mehreren Liganden.
MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Die Proteine können auch durch Gentransfer und Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen synthetisiert und aus den rekombinanten Zellen gewonnen werden. Die Verfügbarkeit der Proteine MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 ermöglicht Untersuchungen ihrer Struktur und Funktion. Es können Methoden der Bestimmung der enzymatischen Aktivität und Spezifität ausgearbeitet werden. Ausgehend von der Primärstruktur der Proteine MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 können monoklonale und polyklonale Antikörper hergestellt werden. Die Antikörper können zur diagnostischen Analytik von MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 eingesetzt werden. MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 können als Teststrukturen für die Auffindung natürlicher und synthetischer Aktivatoren und Inhibitoren von Matrix-Metalloproteasen verwendet werden.
Zur Charakterisierung von mmpm1a, mmpm1b und mmpm2 sowie MMPm1a, MMPM1b und MMPm2 werden folgende weitere Angaben gemacht:
Die DNA-Sequenzen mmpm1a und mmpm1b unterscheiden sich nur in ihren 5′-nichttrans­ latierten Regionen und in den unmittelbar darauffolgenden Teilen ihrer kodierenden Regionen. Beginnend mit den Nukleotiden 363 (mmpm1a) bzw. 344 (mmpm1b) sind beide Sequenzen identisch. In der Sequenz mmpm1a ist ein offener Leserahmen von 580 Codons enthalten. Der Leserahmen beginnt mit den Nukleotiden A₁₄₂TG. Die Umgebung dieser Nukleotide ist für eine effektive Translation jedoch ungünstig. Dagegen befinden sich die im Leserahmen darauffolgenden Nukleotide A₁₅₄TG in einer für einen Translationsstart favorisierten Umgebung. Es ist möglich, daß die Translation von mmpm1a erst bei dem zweiten ATG beginnt. Die Sequenz mmp1b weist beginnend mit A₁₁₄TG einen offenen Leserahmen von 583 Codons aus. Das Startcodon befindet sich innerhalb der Nukleotidfolge ACCATGT, die eine effektive Translation begünstigt.
Der Translationsstart von mmpm2 befindet sich bei A₄₉TG. Der offene Leserahmen von mmpm2 enthält 670 Codons.
Die Proteine MMPm1a, MMPm1b und MMPm2, die sich aus den cDNA-Sequenzen mmpm1a, mmpm1b und mmpm2 ableiten, haben berechnete Molekulargewichte von 65 591, 65 900 und 75 813. Die Primärsequenzen von MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 sind homolog zu Sequenzen bekannter Matrix-Metalloproteasen. Die drei neuartigen Enzyme enthalten je ein Signalpeptid, eine Prosequenz mit der Cystein-Schalter-Region PRCGVPD und eine Consensus-Sequenz RRKRYA. Es folgen Sequenzen katalytischer Domänen mit der spezifischen Anordnung von drei Histidinresten HELGHALGLEH und hämopexin-homologe Sequenzen. Im Unterschied zu bekannten Matrix-Metalloproteasen enthalten MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 darüberhinaus C-terminale Sequenzen mit charakteristischen Folgen hydrophober Aminosäurereste. MMPm1a und MMPm1b weisen die hydrophobe Aminosäurefolge AAAVVLPVLLLLLVLAVGLAV (Aminosäurepositionen 536-556 in MMPm1a, Aminosäurepositionen 539-559 in MMPm1b) auf. Eine analoge Sequenz in MMPm2 ist VVMVLVPLLLLLCVLGLTY (Aminosäurereste 626-645). Die hydrophoben Sequenzen, die noch über die angegebenen Positionen hinausgehen, werden von geladenen Aminosäureresten flankiert. N-terminal überwiegen negativ geladene Glutamin- und Aspartatreste, C-terminal positiv geladenen Arginin- und Lysinreste.
Die Anwesenheit der hydrophoben Sequenzen in MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 erlaubt die Schlußfolgerung, daß MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 - im Unterschied zu bekannten löslichen Matrix-Metalloproteasen (Tabelle 2) - membran-assoziierte Enzyme sind. Aus den Primärsequenzen folgt, daß Propeptide, katalytische Domänen und hämopexin-homologe Domänen der Proteasen extrazellulär lokalisiert sind. Die äußersten C-Termini der Proteine sollten sich dagegen im Zytosol MMPm1a-, MMPm1b- bzw. MMPm2-expremierender Zellen befinden.
MMPm2 enthält in Unterschied zu MMPm1a und MMPm1b einen potentiellen Glykosylierungsort bei N₁₄₀YT.
MMPm1a und MMPm1b unterscheiden sich nur in ihren Signal und Prosequenzen. Die unterschiedliche Struktur der Prosequenzen impliziert unterschiedliche Aktivierungs­ mechanismen von MMPm1a und MMPm1b. Da die Prosequenzen im Laufe der Aktivierung von Matrix-Metalloproteasen durch Hydrolyse abgetrennt werden, sollte die Aktivierung von MMPm1a und MMPm1b zu einem identischen aktiven Enzym führen.
Northern-Blot-Analysen von mRNA menschlicher Gewebe belegen eine unterschiedliche Expression von MMPm1 und MMPm2. Matrix-Metalloproteasen vom Typ MMPm1 werden vor allem in Lungen-, Plazenta- Nieren-, Ovar-, Prostata-, Dünndarm-, Milz-, Thymus-, und Testisgewebe expremiert. Ihre Expression ist in Herz- und Pankreasgewebe deutlich geringer, in Hirn, Leber und Skelettmuskulatur kaum nachweisbar. MMPm2 wird in Plazenta, Herz, Leber, Skelettmuskel, Niere, Pankreas, Lunge, Testis, Colon und Dünndarm expremiert.
Zusammenfassend wird festgestellt, daß die Erfindung neuartige, bisher nicht bekannte Matrix-Me­ talloproteasen des Menschen zur Verfügung stellt. Die Kenntnis von cDNA und Proteinsequenzen der Matrix-Metalloproteasen gestattet die weitere Untersuchung von Biosynthese, Struktur und Funktion der Enzyme. Durch Analyse der Gensequenzen können vererbte und erworbene Mutationen aufgefunden werden. Die Bestimmung von Konzentration und Aktivität der Matrix-Metalloproteasen in Zellen, Geweben und Körperausscheidungen ermöglicht diagnostische Aussagen. Die Enzyme können vorteilhaft als Teststrukturen zur Auffindung neuer Pharmaka, darunter Aktivatoren und Inhibitoren von Matrix-Metalloproteasen verwendet werden.
Die Erfindung wird durch folgende Anwendungsbeispiele weiter erläutert:
1. Identifizierung neuartiger DNA-Sequenzen für Matrix-Metalloproteasen
Zur Auffindung von cDNA-Sequenzen, die für Matrix-Metalloproteasen kodieren, wurde mRNA aus menschlichen Zellen und Tumorgeweben, darunter Neuroblastomzellen, Nierenkarzinom- und Osteosarkomgeweben, isoliert. Die mRNA wurde mit reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben.
In den Proteinsequenzen bekannter Matrix-Metalloproteasen wurden zwei konservierte Aminosäurefolgen ausgewählt.
  • 1. Eine Sequenz um einen charakteristischen Cys-Rest in Propeptiden von Matrix-Metalloproteasen (Cystein-Schalter):
    P - R - C - G - V/N - P - D
  • 2. Eine Sequenz mit drei His-Resten in der katalytischen Proteindomäne von Matrix-Metalloproteasen (Zn2+-Bindungsregion):
    H - E - L/I/F - G - H - S/V/A - L/M - G
Entsprechend den Aminosäurefolgen wurden degenerierte Oligonukleotid-Primer, die sowohl die Variation der Aminosäuren in den beiden konservierten Sequenzen, als auch die Degeneration des genetischen Codes berücksichtigen, synthetisiert:
1. Propeptid-Primer
2. Zn-Bindungsregion-Primer
Beide Primer enthalten je vier Deoxyinosinnukleotide sowie zusätzliche Nukleotide für Erkennungsorte der Restriktionsendonukleasen XbaI (Propeptid-Primer) und BamHI (Zn2+-Bindungsregion-Primer).
Die degenerierten Primer wurden zusammen mit cDNA in der PCR eingesetzt.
Das Reaktionsgemisch enthielt:
100 ng cDNA
1 µg Propeptid-Primer
1 µg Zn2+-Bindungsregion-Primer
2,5 E/100 µl DNA Polymerase AmpliTaq
100 µM dNTP
0,01% Gelatine
50 mM KCl
1,5 mM MgCl₂
10 mM Tris-HCl, pH 8,3
Es wurden 30 Reaktionszyklen der Folge 50 sec 94°, 1 min 56°, 2 min 72° durchgeführt. Die amplifizierte DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und anschließend mit den Restriktionsenzymen XbaI und BamHI gespalten. DNA-Fragmente der Größe 350-500 Basenpaare wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese isoliert (Abb. 1) und in dem Plasmid pBluescript SK (Stratagene) kloniert. Einzelne Klone wurden mit T3- und T7-Primern und Sequenase 2.0 (USB/Amersham Life Science) sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit DNA-Sequenzen in den Datenbanken Genbank und EMBL verglichen. Der Sequenzvergleich erfolgte mit dem Programm FASTA des Programmpaketes HUSAR (GCG Package, Copyright Genetics Computer Group, Inc.). Ausgehend von Nierenkarzinom-cDNA wurden z. B. mehrere hundert Klone mit amplifizierter DNA erhalten, von denen 50 sequenziert wurden. Die Auswertung ergab sowohl bekannte als auch neuartige DNA-Sequenzen. Unter den ersteren waren Sequenzen für menschliche interstitielle Kollagenase und für Matrilysin. Unter den letzteren waren zwei Sequenzen mit Homologie zu menschlichen Matrix-Metalloproteasen. Die zwei neuartigen Sequenzen, die PCRmmpm1 und PCRmmpm2 bezeichnet wurden, enthielten folgende Nukleotide:
PCRmmpm1
PCRmmpm2
2. Northern-Blot-Analyse
Die Expression von Matrix-Metalloproteasen in menschlichen Geweben wurde mit Hilfe der Fragmente PCRmmpm1 und PCRmmpm2 untersucht. Die Fragmente wurden radioaktiv markiert (Multiprime DNA-Labeling Kit, Amersham Life Science) und mit mRNA auf Nylon (Multiple Tissue Blot, Clontech) hybridisiert. Die Hybridisierungen und anschließenden Waschungen erfolgten unter Standardbedingungen /18/.
Sowohl PCRmmpm1 als auch PCRmmpm2 hybridisieren mit RNA von ca. 3,6 kb. Die Experimente belegten jedoch eine unterschiedliche Expression der mit PCRmmpm1 und PCRmmpm2 hybridisierenden mRNA (Abb. 2). Spezifische Transkripte, die mit PCRmmpm1 hybridisieren, sind insbesondere in Lungen-, Plazenta-, Nieren- und Nierenkarzinomgewebe (nicht dargestellt) enthalten. Sie sind in Pankreas- und Herzgewebe in deutlich geringer Menge, in Leber, Skelettmuskulatur und Hirn kaum vertreten.
Messenger RNA, die mit PCRmmpm2 hybridisiert, wird insbesondere in Plazentagewebe synthetisiert. Ihre Expression in Herz, Leber, Skelettmuskel, Niere, Pankreas und Lunge ist jedoch vergleichbar. Sie ist in Hirngewebe deutlich geringer.
3. Isolierung und Sequenzierung von cDNA mmpm1 und mmpm2
Eine Lungen-cDNA-Bank im Vektor λgt 11 (Clontech) wurde mittels Phagentransfer auf Nylon und Hybridisierung mit den radioaktiv markierten Sonden PCRmmpm1 und PCRmmpm2 analysiert /18/. Die Hybridisierungen wurden 16 h bei 40° in 50% Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardt, 0,5% SDS, 50 µg/ml denaturierte Heringssperma-DNA durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter bei Raumtemperatur und bei 65° in 2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen und anschließend in einem Bio-Imaging-Analyzer (BAS 2000, Fuji Photo Film Co, LTD) ausgewertet. Phagenklone, die mit PCRmmpm1 und PCRmmpm2 hybridisierten, wurden anhand spezifisch gebundener Radioaktivität identifiziert. Die aufgefundenen Phagen wurden durch Ausverdünnen schrittweise vereinzelt. Die DNA vereinzelter Phagen wurde isoliert (Quiagen Lambda Kit, Diagen GmbH) und enthaltene cDNA-Inserte wurden in den Plasmidvektor pBluescript SK (Stratagene) eingefügt. Die Inserte wurden anschließend in Teilfragmente zerlegt (Erase-a-Base-System, Promega) und sequenziert (Sequenase 2.0, USB/Amersham Life Science). Ermittelte DNA-Sequenzen wurden mit Hilfe der Programmpakete DNA-STAR (DNA-STAR. Inc) und HUSAR (GCG Package, Copyright Genetics Computer Group, Inc) analysiert. Die Translation der kodierenden Sequenzen und der Vergleich der erhaltenen Aminosäuresequenzen mit bekannten Matrix-Metalloproteasen belegte, daß die neuartigen Sequenzen zu der Familie der Matrix-Metalloproteasen gehören (Abb. 3).
TABELLEN UND ABBILDUNGEN Tabelle 1
Matrix-Metalloproteasen des Menschen. Die angegebenen Molekulargewichte sind aus den cDNA-Sequenzen der Enzyme berechnet.
Abb. 1:
Agarose-Gel-Elektrophorese von PCR-Produkten, die mit degenerierten Primern für Matrix-Me­ talloproteasen und cDNA der menschlichen Neuroblastomzellinie SK-N-SH (Bahn 1), cDNA von Nierenkarzinomgewebe (Bahn 2) und cDNA von Osteosarkomgewebe (Bahn 3) erhalten wurden.
Abb. 2:
Northern-Blot-Analyse von mRNA für MMPm1 (oben) und MMPm2 (unten)
Abb. 3:
Homologievergleich von MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 mit bekannten Matrix-Metall­ oproteasen des Menschen. Der Vergleich wurde mit dem Programm CLUSTAL durchgeführt. Die Abkürzungen bedeuten: hscollr. pep - Interstitielle Kollagenase, hsclgna.pep - Neutrophile Kollagenase, P08253.swisspro - Gelatinase A, hs4cola.pep - Gelatinase B, hsmmp3a.pep - Stromelysin 1, hsstrom2.pep - Stromelysin 2, hsstro13.pep - Stromelysin 3.
Literatur
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Tabelle 1
Matrix-Metalloproteasen

Claims (16)

1. DNA-Sequenzen mmpm1a, mmpm1b, mmpm2 und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen für menschliche Matrix-Metalloproteasen, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sequenz mmpm1a (Anlage 1) aus
  • - 5′-nichuranslatierter Region: Basenpaare 1 bis 141
  • - kodierender Region für die Matrix-Metalloprotease MMPm1a: Basenpaare 142 bis 1881
  • - 3′-nichttranslatierter Region: Basenpaare 1882 bis 3456
besteht,
die cDNA-Sequenz mmpm1b (Anlage 2) aus
  • - 5′-nichttranslatierter Region: Basenpaare 1 bis 113
  • - kodierender Region für die Matrix-Metalloprotease MMPm1b: Basenpaare 114 bis 1862
  • - 3′-nichttranslatierter Region: Basenpaare 1863 bis 3437
besteht und
die cDNA-Sequenz mmpm2 (Anlage 3) aus
  • - 5′-nichttranslatierter Region: Basenpaare 1 bis 48
  • - kodierender Region für die Matrix-Metalloprotease MMPm2: Basenpaare 49 bis 2058
  • - 3′- nichttranslatierter Region: Basenpaare 2059 bis 3530
besteht, wobei die Anlagen 1, 2 und 3 Bestandteile dieses Anspruchs sind.
2. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese in Genen des Menschen sowie homologen Genen anderer Säugerspezies enthalten sind.
3. Varianten der Sequenzen mmpm1a, mmpm1b und mmpm2, sowie homologe DNA-Sequenzen des Menschen und anderer Säugerspezies, die durch Kreuzhybridisierung mit den in dem Anspruch 1 aufgeführten Sequenzen erhalten werden.
4. Konstrukte, die aus einem Vektor für den Gentransfer in prokaryotische oder eukaryotische Zellen und einer der Nukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 bestehen.
5. Die Matrix-Metalloprotease MMPm1a folgender Primärstruktur:
6. Die Matrix-Metalloprotease MMPm1b folgender Primärstruktur:
7. Die Matrix-Metalloprotease MMPm2 folgender Primärstruktur:
8. Varianten der Proteine MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 gemäß den Ansprüchen 5-7, die durch posttranslationale Proteinmodifizierung, durch proteinchemische Modifikationen oder durch in vitro Mutagenese und Expression von Nukleotidfolgen nach Ansprüchen 1 und 2 erhalten werden, sowie homologe Proteine des Menschen und anderer Säugerspezies, die immunologische Kreuzreaktivität oder vergleichbare Enzymaktivität aufweisen.
9. Proteine nach den Ansprüchen 5-8, dadurch gekennzeichnet, daß diese mit einem oder mehreren Liganden als Komplex vorliegen.
10. Rekombinante prokaryotische und eukaryotische Zellen, die durch Transfer von DNA-Sequenzen gemäß Ansprüchen 1 bis 3 in Zellen erhalten werden und die Proteine gemäß den Ansprüchen 5-8 expremieren.
11. Verfahren der Gewinnung der Proteine MMPm1a, MMPm1b, MMPm2 und von Varianten dieser Proteine aus natürlichen Quellen und aus rekombinanten Zellen gemäß Anspruch 10 bzw. aus Kulturüberständen rekombinanter Zellen gemäß Anspruch 10.
12. Verwendung von Matrix-Metalloproteasen MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 gemäß Ansprüchen 5-8 und von Zellen, die diese Enzyme expremieren, zur Generierung proteolytischer Aktivität.
13. Verwendung von Matrix-Metalloproteasen MMPm1a, MMPm1b, MMPm2 gemäß Ansprüchen 5-8 und von Zellen, die MMPm1a, MMPm1b und MMPm2 expremieren, zum Screening von Protease-Effektoren.
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