DE69530261T2

DE69530261T2 - Durch Zelldichte stimulierte Protein-Tyrosin-Phosphatasen

Info

Publication number: DE69530261T2
Application number: DE69530261T
Authority: DE
Inventors: Nicholas K. Tonks; Arnie ÖSTMAN
Original assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Current assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Priority date: 1994-05-03
Filing date: 1995-05-03
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2015-05-04
Also published as: EP1331265A2; DK0708831T4; DK0708831T3; ATE236983T1; JP2007312793A; JPH09500794A; US7195762B2; WO1995030008A1; US20070190581A1; DE69530261D1; US6552169B1; US20030148491A1; US6114140A; EP0708831B1; DE69530261T3; EP1331265A3; EP0708831A1; EP0708831B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein gereinigte und isolierte Proteintyrosinphosphatase-Enzyme (PTPs) und für diese kodierende Polynukleotide. Erfindungsgemäße PTPs sind charakterisiert durch eine hochregulierte mRNA-Transkription und/oder -Translation oder post-translationale Modifikationen, die zu einer erhöhten Gesamtzell-Enzymaktivität als Funktion erhöhten Zellkontakts mit Nachbarzellen führen. Solche Dichte-stimulierten PTPs werden nachfolgend als DEPTPs bezeichnet. Ein illustratives Beispiel, die menschliche Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase wird als huDEP-1 bezeichnet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Protein-Tyrosinphosphorlierung ist ein unverzichtbares Element in Signaltransduktionswegen, die fundamentale zelluläre Prozesse einschließlich Wachstum und Differenzierung, Zellzyklus-Progression und Cytoskelettfunktionen steuern. Kurz gesagt löst das Binden von Wachstumsfaktoren oder anderen Liganden an eine zugehörige Rezeptorprotein-Tyrosinkinase (PTK) die Autophosphorylierung von Tyrosinresten des Rezeptors selbst und die Phosphorylierung von Tyrosinresten in den Zielsubstraten des Enzyms aus. Innerhalb der Zelle ist die Tyrosinphosphorylierung ein reversibler Prozess; der Phosphorylierungszustand eines jeweiligen Tyrosinrestes in einem Zielsubstrat wird bestimmt durch die koordinierte Wirkung sowohl der PTKs, die die Phosphorylierung katalysieren, und der Proteintyrosinphosphatasen (PTPs), die die Dephosphorylierung katalysieren.
Die PTPs sind eine große und diverse Enzymfamilie, die ubiquitär in Eurkarionten gefunden wird (Charbonneau und Tonks, Ann. Rev. Cell Biol. 8: 463-493 (1993)]. Die strukturelle Diversität innerhalb der PTP-Familie entsteht hautpsächlich aus Variationen in nicht-katalytischen (möglicherweise regulatorischen) Sequenzen, die mit einer oder mehreren hochkonservierten katalytischen Domänen verbunden sind. Im allgemeinen werden lösliche cytoplasmatische PTP-Formen Nicht-Rezeptor-PTPs und solche mit zumindest einer nicht-katalytischen Region, die durch die Zellmembran reicht, rezeptorartige PTPs (RPTPs) genannt.
Es ist eine Anzahl Nicht-Rezeptor-PTPs identifiziert worden, die charakteristischer Weise eine einzige katalytische Domäne, flankiert von nicht-katalytischen Sequenzen, besitzen. Solche nicht-katalytischen Sequenzen umfassen nachweislich, unter anderem, Sequenzen, die homolog zu Cytoskelett-assoziierten Proteinen sind [Yang und Tonks, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 5949–5953 (1991)] oder zu Lipid bindenden Proteinen [Gu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 2980–2984 (1992)] und/oder Sequenzen, die die Assoziation des Enzyms mit spezifischen intrazellulären Membranen regulieren [Frangioni et al., Cell 68: 545–560 (1992)], was darauf hinweist, dass die subzelluläre Lokalisierung eine wesentliche Rolle in der Regulation der PTP-Aktivität spielen kann.
Die Analyse von Sequenzen nicht-katalytischer Domänen von RPTPs deutet auf deren Beteiligung an Signaltransduktionsmechanismen hin. Das Binden spezifischer Liganden an die extrazellulären Segmente von RPTPs konnte jedoch nur in wenigen Fällen charakterisiert werden. Beispielsweise wurde das homophile Binden von PTPμ-Molekülen [Brady-Kalnay et al.., J. Cell. Biol. 122: 961–972 (1993)] nachgewiesen, d. h. der Ligand eines an der Zelloberfläche exprimierten PTPμ ist ein anderes PTPμ-Molekül auf der Oberfläche einer angrenzenden Zelle. Darüber hinaus ist wenig bekannt über Liganden, die spezifisch an die Mehrzahl von RPTPs binden und deren Aktivität regeln.
Viele rezeptorartige PTPs umfassen ein intrazelluläres Carboxylsegement mit zwei katalytischen Domänen, eine einzelnen Transmembran-Domäne und ein extrazelluläres aminoterminales Segment [Krueger et al.., EMBO J. 9: 3241–3252 (1990)]. RPTP-Unterklassen sind voneinander auf Basis von Kategorien oder „Typen" extrazellulärer Domänen unterschieden [Fischer et al.., Science 253: 401–406 (1991)]. Typ I-RPTPs haben eine große extrazelluläre Domäne mit mehreren Glycosilierungsstellen und einer konservierten Cystein-reichen Region. CD45 ist ein typisches Typ I-RPTP. Die Typ 11-RPTPs umfassen zumindest eine aminoterminale Immunglobolin (Ig)-artige Domäne, die an mehrere Tandem-Fibronectin-Typ III (FNIII)-artige Repeats angrenzt. Ähnliche wiederholte FNIII-Domänen, von denen angenommen wird, dass sie an Protein:Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind, sind in Rezepto- ren für IL2, IL4, IL6, GM-CSF, Prolactin, Erythropoietin und Wachstumshormon nachgewiesen worden [Patthy, Cell 61: 13–14 (1992)]. Das als LAR bekannte, auf das allgemeine Leukozyten-Antigen bezogene PTP, ist beispielhaft für eine Typ II-RPTP-Struktur [Streuli et al.., J. Exp. Med. 168: 1523–1530 (1988)] und umfasst, wie andere Typ II-RPTPs, eine extrazelluläre Region, die an die NCAM-Klasse zellulärer Adhäsionsmoleküle erinnert [Edelmann und Crossin, Ann. Rev. Biochem. 60: 155-190 (1991)]. Die Typ 111-RPTPs wie beispielsweise HPTPβ [Krueger et al.., EMBO J. 9: 3241–3252 (1990)], umfassen nur mehrere Tandem-FNIII-Repeats in der extrazellulären Domäne. Die Typ IV-RPTPs, beispielsweise RPTPa [Krueger et al.. (1990) supra], haben relativ kurze extrazelluläre Sequenzen ohne Cysteinreste aber mit mehreren Glycosilierungsstellen. Ein fünfter RPTP-Typ, beispielhaft verkörpert durch PTPy [Barnes et al.., Mol. Cell. Biol. 13: 1497–1506 (1993)] und PTPζ [Krueger und Saito, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 7417–7421 (1992)], ist gekennzeichnet durch eine extrazelluläre Domäne mit einem 280 Aminosäuren langen Segment, das homolog zur Kohlenanhydrase (carbonic anhydrase, CAH), dem aber essentielle Histidinreste fehlen, die zur reversiblen Hydration von Kohlendioxid notwendig sind.
FNIII-Sequenzen, die in charakteristischer Weise in den extrazellulären Domänen von Typ II- und Typ 111-RPTPs gefunden werden, umfassen etwa 90 Aminosäurereste mit einem Faltungsmuster ähnlich dem, das bei Ig-artigen Domänen beobachtet wird [Bork und Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 8990–8994 (1992)]. Hochkonservierte FNIII-Sequenzen wurden in mehr als fünfzig verschiedenen eukariotischen und prokariotischen Proteinen identifiziert [Bork und Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 8990–8994 (1992)], für diese Domäne konnte jedoch keine verallgemeinerte Funktion nachgewiesen werden. Fibronectin selbst umfasst fünfzehn bis siebzehn FNIII-Domänensequenzen, und es konnte gezeigt werden, dass die zweite FNIII-Domäne (FNIII₂) eine Bindungsstelle für Heparinsulfat-Proteoglycan enthält [Schwarzbauer, Curr. Opin. Cell Biol. 3: 786–791 (1991)] und das FNIII₁₃ und FNIII₁₄ verantwortlich sind für die Heparinbindung durch ionische Wechselwirkungen [Schwarzbauer, Curr. Opin. Cell Biol. 3: 786–791 (1991)]. Die vielleicht best charakterisierte Wechselwirkung einer Fibronectin-FNIII-Domäne betrifft FNIII₁₀, die Hauptstelle der Zelladhäsion [Edelman und Crossin, Ann. Rev. Biochem. 60: 155–190 (1991); Leahy et al.., Science 258: 987–991 (1992); Main et al.., Cell 71: 671–678 (1992)]. FNIII₁₀ umfasst die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp (RGD), die an der Förderung der Zelladhäsion durch Binden an bestimmte Mitglieder von Proteinen der Integrin-Superfamilie beteiligt ist.
Eigenschaften, die den löslichen PTPs und den RPTPs gemeinsam sind, umfassen: Eine absolute Spezifität für Phosphortyrosinreste, eine hohe Affinität für Substratproteine, und eine spezifische Aktivität, die ein bis drei Größenordnungen höher ist als die von PTKs in vitro [Fischer et al.., Science 253: 401–406 (1991); Tonks, Curr. Opin. Cell. Biol. 2: 1114–1124 (1990)]. Die letztgenannte Eigenschaft deutet darauf hin, dass die PTP-Aktivität in vivo einen antagonistischen Einfluss auf die Wirkung der PTKs ausübt, so dass das Gleichgewicht dieser beiden den Grad intrazellulärer Tyrosin-Phosphorylierung bestimmt. Eine dominante physiologische Rolle der PTP-Aktivität unterstützend ist die Beobachtung, dass bei Behandlung von NRK-1-Zellen mit Vanadat, einem starken Inhibitor der PTP-Aktivität, zu erhöhten Graden an Phosphortyrosin und zur Entwicklung einer transformierten Zellmorphologie führt [Kiarlund; Cell 41: 707–717 (1985)]. Diese Beobachtung impliziert einen möglichen therapeutischen Wert für PTPs und für Wirkstoffe, die die PTP-Aktivität modulieren, beispielsweise indirekte Modifizierer der PTK-Aktivität, und dementsprechend auch den Level an zellulärem Phosphotyrosin beeinflussen.
Jüngste Studien haben Aspekte der physiologischen Bedeutung der PTP-Aktivität hervorgehoben. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Mutationen in dem Gen, das für HCP, einer Nicht-Rezeptor-Tyrosinphosphatase hämatopoietisches Zellprotein, kodiert, zu schweren Immunstörungen führt, die für den motheaten Phänotyp bei Mäusen charakteristisch ist [Schultz et al.., Cell. 73: 1445–1454 (1993)]. Unter normalen Bedingungen kann HCP als ein Supressor PTK-induzierter Signalwege wirken, beispielsweise des CSF-1-Rezeptors [Schultz et al.., Cell. 73: 1445–1454 (1993)]. Einige PTP-Enzyme können die Produkte von Tumorsupressorgenen sein, und ihre Mutation oder Deletion kann zum Erhöhen des zellulären Phosphotyrosins, das mit bestimmten Neoplasien im Zusammenhang steht, beitragen (Braun-Shimer et al.., Cancer Res. 52: 478–482 (1992); Wary et al.., Cancer Res. 53: 1498–1502 (1993)]. Beobachtete Mutationen im Gen für RPTPγ in Mäuse-L-Zellen wären mit dieser Hypothese im Einklang [Wary et al.. Cancer Res. 53: 1498–1502 (1993)]. Die Beobachtung, dass das rezeptorartige PTP CD45 für eine normale T-Zellen-Rezeptorinduzierte Signalisierung benötigt wird [Pingel und Thomas, Cell 58: 1055–1065 (1989)] stellt einen Beweis dar, der die PTP-Aktivität als positiven Mediator zellulärer Signalantworten impliziert.
Normale Zellen zeigen in Kultur eine Kontakthemmung des Wachstums, d. h., wenn aneinandergrenzende Zellen einer konfluenten Einfachschicht einander berühren, wird ihr Wachstum inhibiert [Stoker und Rubin, Nature 215: 171–172 (1967)]. Da PTKs das Zellwachstum fördern, könnte die PTP-Wirkung Mechanismen der Wachstumshemmung zugrunde liegen. In Swiss-Mouse-3T3-Zellen ist eine mit Membranfraktionen assoziierte Phosphatase-Aktivität achtfach erhöht in konfluenten Zellen, die bei hohen Dichten geerntet wurden, verglichen mit Zellen, die aus niedrig- oder mitteldichten Kulturen geerntet wurden [Fallen und Tong, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 6996–7000 (1991)]. Die erhöhte Aktivität wurde nicht in subkonfluenten Zellkulturen beobachtet, die durch Serumentzug in einem Ruhezustand versetzt wurden. Die erhöhte Phosphatase-Aktivität wurde einem 37 kD Protein zugeschrieben, wie durch Gelfiltration bestimmt wurde, sie wurde aber nicht anderweitig charakterisiert. In ähnlicher Weise wurden PTPs direkt verbunden mit dem Dichte-Arrest des Zellwachstums; die Behandlung von NRK-1-Zellen mit Vanadat konnte die dichteabhängige Wachstumsinhibierung überwinden und verankerungsunabhängige Proliferation stimulieren, eine Eigenschaft, die nur in transformierten oder immortalisierten Zellen auftritt [Klarland, Cell 41: 707–717 (1985); Rijksen et al.., J. Cell. Physiol. 154: 343–401 (1993)].
Im Gegensatz zu diesem Beobachtungen offenbart die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/03610 ein Transmembran-PTP, genannt PTP35, dessen RNA-Level im Gleichgewichtszustand in aktiv wachsenden Zellen am größten war. Nur eine geringe oder keine Expression von PTP35-mRNA wurde in konfluenten Zellen beobachtet. Diese Regulationsart wurde auch in Mäuse-3T3-Zellen beobachtet. Demnach scheinen zwei RPTPs im gleichen Zelltyp offenbar aneinander gegensätzlichen Prozessen beteiligt zu sein, wobei eines (PTP35) zum Zellwachstum beiträgt und das andere (das 35 kD-PTP von Pallen und Tongs) zur Zellruhe beiträgt.
Interessanterweise ist gezeigt worden, dass die Transkription von Typ II RPTP-LAR mRNA in Zellkulturen konfluenten Fibroblasten hochreguliert wird [Longo et al.., J. Biol. Chem. 268: 26503–26511 (1993)]. LAR wird proteolytisch verarbeitet, um ein reifes Protein zu erzeugen, das ein Komplex aus zwei nicht-kovalent assoziierten Untereinheiten ist, von denen eine den größten Teil der zelladhäsionsmolekülartigen extrazellulären Domäne enthält [Yu et al.., Oncogene 7: 1051–1057 (1992); Streuli et al.., EMBO J. 11: 897–907 (1992)] und die abgeworfen wird, wenn die Zellen sich der Konfluenz nähern [Streuli et al.., EMBO J. 11: 897–907 (1992)]. Diese Beobachtungen führen zu Spekulationen hinsichtlich der Beteiligung von PTP bei der Regulierung der Cytoskelett-Integrität sowie anderer verwandter Zellphänomene wie Transformation, Tumor-Invasion, Metastasen, Zellanheftung und der Bewegung von Leukozyten entlang und deren Passage durch die Endothel-Zellschicht bei Entzündungen. Erhebliche therapeutische Bedeutung haben Modulatoren der PTP-Aktivität, die beliebige oder alle dieser Zellereignisse regulieren können.
Es besteht deshalb im Stand der Technik ein Bedarf, Mitglieder der PTP-Enzymfamilie zu identifizieren und diese Proteine im Hinblick auf ihre Aminosäureund kodierenden DNA-Sequenzen zu charakterisieren. Solche Informationen könnten die großtechnische Produktion dieser Proteine ermöglichen sowie die Identifizierung von Zellen erlauben, die die Phosphatasen natürlicherweise exprimieren, und die Herstellung von Antikörpern ermöglichen, die spezifisch auf die Phosphatasen reagieren. Darüber hinaus würde das Aufklären der Substrate, Regulationsmechanismen und der subzellulären Lokalisation dieser PTPs zum Verständnis normalen Zellwachstums beitragen und unverzichtbare Informationen liefern für das Entwickeln therapeutischer Wirkstoffe zur Bekämpfung abnormalen und/oder malignen Zellwachstums.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Nachfolgend wird mit Bezug auf eine Proteintyrosinphosphatase der Ausdruck „Dichte-stimuliert" verwendet mit der Bedeutung einer hochregulierten zellulären mRNA-Transkription oder -Translation und/oder Gesamtzellaktivität als Funktion des erhöhten Kontakts mit Nachbarzellen.
Erfindungsgemäß wird ein isoliertes, Dichte-stimulierte Typ 111-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid der SEQ ID NO. 2 oder eine Variante davon bereitgestellt, wobei die Variante ausgewählt ist aus:

(a) einer menschlichen Allel-Variante oder einer Variante einer heterologen Spezies;
(b) einem Fragment davon, wobei:
(1) das Fragment von einem Antikörper erkannt werden kann, der für eine Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase spezifisch ist, oder
(2) wenigstens eine biologische Aktivität einer Dichte-stimulierten Typ IIIrezeptorartigen Phosphatase beinhaltet oder verstärkt ist; wobei die biologische Aktivität ausgewählt ist aus
(i) Bindung an ein Substrat, Ligand oder Gegenrezeptor einer Dichtestimulierten Typ III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase,
(ii) enzymatische Aktivität einer Dichte-stimulierten Typ III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase, oder
(iii) Signaltransduktionaktivität einer Dichte-stimulierten Typ IIIrezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase;
c) einer Variante davon, bei der eine Aminosäure ersetzt ist; und wobei
(1) die Variante von einem Antikörper erkannt werden kann, der für eine Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase spezifisch ist, oder
(2) wenigstens eine biologische Aktivität einer Dichte-stimulierten Typ IIIrezeptorartigen Phosphatase beinhaltet oder verstärkt ist; wobei die biologische Aktivität ausgewählt ist aus
(i) Bindung an ein Substrat, Ligand oder Gegenrezeptor einer Dichtestimulierten Typ III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase,
(ii) enzymatische Aktivität einer Dichte-stimulierten Typ III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase, oder
(iii) Signaltransduktionaktivität einer Dichte-stimulierten Typ IIIrezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase; oder
(3) eine spezifische Ligand/Rezeptor-Bindung oder Signalfunktion außer Kraft gesetzt ist; oder
(d) eine Mutante davon, bei der ein Cysteinrest in der katalytischen Domäne gegen einen Serinrest ausgetauscht ist.

Gemäß einem anderen Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung aufgereinigte und isolierte Polynukleotide (z. B. DNA und RNA-Transkripte, sowohl Sense- als auch Antisense-Stränge), kodierend für eine Enzymaktivität einer Dichte-stimulierten Typ III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase, ein Beispiel einer solchen ist die menschliche Phosphatase huDEP-1 und deren Varianten, einschließlich Fragmente (d. h. Fragmente und Deletions-, Additions- oder Substitutions-Analoga), die Bindungs- und/oder immunologische Eigenschaften der Dichte-stimulierten Typ III-Phosphatasen besitzen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Polynukleotid bereitgestellt, das für ein Dichte-stimulierte-Typ 111-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid oder eine erfindungsgemäße Variante kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße DNA-Moleküle umfassen cDNA, genomische DNA und ganz oder teilweise chemisch synthetisierte DNA-Moleküle. Ein gegenwärtig bevorzugtes Polynukleotid ist die DNA gemäß SEQ ID NO. 1, die das menschliche DEP-1-Polypeptid der SEQ ID NO. 2 kodiert. Ebenfalls bereitsgestellt werden rekombinante Plasmid- und virale DNA-Konstrukte (Expressionskonstrukte), die Sequenzen enthalten, die für ein Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid oder eine erfindungsgemäße Variante kodieren, insbesondere solche Konstrukte, bei denen die für die Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase kodierende Sequenz in Wirkverbindung stehend gekoppelt ist an ein homologes oder heterologes Transkriptionsregulationselement oder mehrere solcher Elemente.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird auch ein gereinigtes und isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1, und (b) einem cDNA-Molekül, das unter stringenten Bedingungen an den proteinkodierenden Abschnitt der DNA gemäß (a) hybridisiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden prokariotische oder eukariotische Wirtszellen bereitgestellt, die transformiert oder transfiziert sind mit erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, die ein Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid oder dessen Varianten exprimieren. Erfindungsgemäße Wirtszellen sind besonders nützlich zur großtechnischen Herstellung von Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptiden, die entweder aus den Wirtszellen selbst oder dem Medium isoliert werden können, in dem die Wirtszelle herangezogen wird. Wirtszellen, die Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptide auf der extrazellulären Membran exprimieren, sind ebenfalls als Immunogene bei der Herstellung von Anti-Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Antikörpern nützlich.
Ebenfalls offenbart werden gereinigte und isolierte Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptide, einschließlich deren Fragmenten und Varianten. Ein bevorzugtes, Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptid wird in SEQ ID NO. 2 angegeben. Neue Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptide und variante Polypeptide können aus natürlichen Quellen isoliert werden, sie werden aber bevorzugt in rekombinanten Verfahren mittels erfindungsgemäßer Wirtszellen produziert. Vollständig glycosilierte, teilweise glycosilierte und nicht-glycosilierte Formen des Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptids können erzeugt werden durch Variieren der Wirtszelle, die für die rekombinante Produktion und/oder Prozessierung nach der Aufreinigung ausgewählt ist. Variante erfindungsgemäße Dichtestimulierte Typ III-Phosphatasen-Polypeptide können wasserlösliche und unlösliche Polypeptide umfassen einschließlich deren Analoge, wobei eine oder mehrere Aminosäuren deletiert oder ersetzt sind (1) ohne Verlust, und vorzugsweise unter Verstärkung einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten oder immunologischer Eigenschaften, die spezifisch sind für Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatasen; oder (2) unter spezifischem Verlust einer bestimmten Ligand/Rezeptor-Bindungs- oder – Signalfunktion.
Ebenfalls offenbart werden Peptide, Polypeptide und andere Nicht-Peptid-Moleküle, die spezifisch an erfindungsgemäße, Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatasen binden. Bevorzugte Bindungsmoleküle umfassen Antikörper (beispielsweise monoklonale und polyklonale Antikörper, einzelkettige Antikörper, chimerische Antikörper, Anti-Idiotyp-Antikörper, CDR-grafted Antikörper und dergleichen), Gegenrezeptoren (beispielsweise Membran-assoziierte und lösliche Formen) und ändere Liganden (beispielweise natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle), einschließlich derer, die kompetitiv an Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatasen in Gegenwart von Anti-Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-monoklonalen Antikörpern und/oder spezifischen Gegenrezeptoren binden. Bindungsmoleküle sind nützlich zum Aufreinigen von erfindungsgemäßen Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptiden und zum Identifizieren von Zelltypen, die das Polypeptid exprimieren. Bindungsmoleküle sind auch nützlich zum Modulieren (d. h. Inhibieren, Blockieren oder Stimulieren) des in vivo Bindens und/oder der Signal-Transduktions-Aktivitäten von Dichtestimulierten Typ III-Phosphatasen.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt, der in der Lage ist, spezifisch an ein Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid oder eine erfindungsgemäße Variante zu binden. Ebenfalls werden Hybridoma-Zelllinien bereitgestellt, die Antikörper herstellen, die spezifisch sind für Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteine an Resin-Phosphatase-Polypeptiden oder deren erfindungsgemäße Varianten binden. Verfahren zum Herstellen von Hybridomen, die monoklonale Antikörper absondern, sind im Stand der Technik gut bekannt. Hybridoma-Zelllinien können hergestellt werden nach dem Immunisieren eines Tieres mit gereinigter Dichte-stimulierter Typ III-Phosphatase oder deren Varianten oder Zellen, die eine Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase oder deren Variante auf der extrazellulären Membranoberfläche exprimieren. Immunogene Zelltypen umfassen Zellen, die Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase in vivo exprimieren, oder transfizierte oder transformierte prokariotische oder eukariotische Wirtzellen, die normalerweise das Protein nicht in vivo exprimieren.
Der Wert der Information, die durch die Offenbarung der DNA- und Aminosäure-Sequenzen von menschlichem DEP-1 beigesteuert wird, ist mit Händen zu greifen. In einer Beispielsserie macht es cDNA-Sequenz menschlichen DEP-1 möglich, ge nomische DNA-Sequenzen des menschlichen DEP-1 zu isolieren, einschließlich der Transkriptions-Kontrollelemente. Erfindungsgemäß umfassen Kontrollelemente beispielsweise Promotor-Elemente und Verstärker-Elemente sowie Elemente, die zur Repression oder Herabregulierung der mRNA-Transkription beitragen. Kontrollelemente dieser Art können 5'-DNA-Sequenzen oder 3'-DNA-Sequenzen bezogen auf die Protein-kodierenden Strukturgen-Sequenzen und/oder in Introns angeordnete DNA-Sequenzen sein. Die 5'- und/oder 3'-Kontrollelemente können proximal und/oder distal zu den Protein-kodierenden Sequenzen des Strukturgens angeordnet sein. Das Identifizieren von DNA-Sequenzen, die die mRNA-Transkription modulieren, erlaubt wiederum das Identifizieren von Wirkstoffen, die einen Einfluss auf die Transkriptions-Modulation ausüben können.
Unter einen weiteren Aspekt fällt das Identifizieren von Polynukleotiden, die für andere Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatasen, huDEP-1 Allel-Varianten und DNAs , heterologer Spezies (z. B. Ratte oder Maus) kodieren. Das Isolieren der huDEP-1-genomischen DNA und von DNAs heterologer Spezies kann erreicht werden durch Standard-Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren unter geeignet stringenten Bedingungen, wobei die gesamte oder ein Teil der DEP-1 DNA- oder RNA-Sequenz als Sonde zum Durchsuchen einer geeigneten Bibliothek verwendet wird. Alternativ dazu kann eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung . von Oligonukleotid-Primern, die spezifisch entworfen sind und auf den bekannten Nukleotid-Sequenzen beruhen, verwendet werden, um andere cDNA und genomische DNA-Sequenzen zu vervielfältigen und zu identifizieren. Synthetische DNAs, die Dichtestimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptide, einschließlich deren Fragmente und anderen Varianten kodieren, können mit herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenzinformation ermöglicht auch die Entwicklung von Nagetieren durch homologe Rekombinations- oder „knock-out"-Strategien (siehe z. B. Capecchi, Science 244: 1288–1292 (1989)], die kein wirksames Dichtestimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptid exprimieren oder die ein variantes Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptid exprimieren. Solche Nagetiere sind nützlich als Modelle zum Studieren der Aktivitäten von Dichte-stimulierten Typ III-Phosphatasen und deren Modulatoren in vivo.
Die erfindungsgemäßen DNA- und Aminosäure-Sequenzen ermöglichen auch die Analyse von Abschnitten Dichte-stimulierter Typ III-Phosphatasen, die aktiv beteiligt sind am Gegenrezeptor-Binden, sowie von Sequenzen, die auf andere Weise als durch aktives Teilnehmen am Binden regulierend wirken. Das Identifizieren von Motiven, die an der Transmembran-Signaltransduktion beteiligt sind, unterfällt dem ebenfalls.
Ebenfalls umfasst es das Identifizieren von Motiven, die die subzelluläre Lokalisation der unreifen und reifen Dichte-stimulierten Typ III-Phosphatase-Proteine bestimmen.
Die erfindungsgemäße DNA ist auch nützlich zum Detektieren von Zelltypen, die Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptide exprimieren. Das Identifizieren solcher Zelltypen kann signifikante Auswirkungen auf die Entwicklung therapeutischer und prophylaktischer Wirkstoffe haben. Übliche Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von beispielsweise huDEP-1-DNA zum Detektieren korrespondierender RNAs können verwendet werden, um den konstitutiven Level an Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Transkription innerhalb einer Zelle sowie die Veränderungen im Level der Transkription in Abhängigkeit zu inneren oder äußeren Wirkstoffen zu bestimmen. Das Identifizieren von Wirkstoffen, die die Transkription, Translation und/oder Aktivität von Dichte-stimulierten Typ III-Phosphatasen modifizieren kann wiederum im Hinblick auf deren therapeutischen oder prophylaktischen Wert hin untersucht werden. Die erfindungsgemäße DNA ermöglicht auch in situ-Hybridisierungen von beispielsweise huDEP-1-DNA an zelluläre RNA, um die zelluläre Lokalisation von für Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase spezifische mRNA (Messages) innerhalb komplexer Zellpopulationen und Geweben zu bestimmen.
Erfindungsgemäße Polynukleotide können auch ein Verfahren ermöglichen zum Identifizieren von Substraten oder anderen Molekülen, die mit Dichte-stimulierten Typ III-Phosphatasen wechselwirken. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Isolieren eines Polynukleotids, das für ein Polypeptid kodiert, das an ein Dichte-stimulierte Typ 111-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid oder einer erfindungsgemäßen Variante bindet, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen mit einem DNA-Konstrukt, umfassend ein Reportergen unter der Kontrolle eines Promotors, reguliert durch einen Transkriptionsfaktor mit einer DNA-Bindungsdomäne und einer Aktivierungsdomäne;(b) Exprimieren einer ersten Hybrid-DNA-Sequenz, die für eine erste Fusion eines Teils oder eines ganzen Dichtestimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptids oder einer erfindungsgemäßen Variante und entweder der DNA-Bindungsdomäne oder der Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors kodiert, in den Wirtszellen; (c) Exprimieren einer Bibliothek von zweiten Hybrid-DNA-Sequenzen, die für zweite Fusionen eines Teils oder ganzer mutmaßlicher Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Bindungspolypeptide und entweder der Aktivierungsdomäne oder der DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors kodieren, die nicht in die erste Fusion eingebaut ist, in den Wirtszellen; (d) Transformieren oder Transfizieren der Wirtszellen mit dem DNA-Konstrukt, umfassend ein Proteintyrosinkinasegen; (e) Nachweisen der Bindung des (der) Dichte-stimulierte Typ IIIrezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Bindungspolypeptids (Polypeptide) an das Phosphatase-Polypeptid in der Wirtszelle durch Nachweis der Produktion des Reportergenprodukts in der (den) Wirtszelle(n); und (f) Isolieren der zweiten Hybrid-DNA-Sequenzen, die für das Phosphatase-Bindungspolypeptid oder die Variante kodieren, aus der (den) Wirtzelle(n).
Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren zum Identifizieren wechselwirkender Moleküle umfasst die Schritte: a) Transformieren oder Transfizieren geeigneter Wirtszellen mit einem DNA-Konstrukt, umfassend ein Reportergen unter der Kontrolle eines Promotors, reguliert durch einen Transkriptionsfaktor mit einer DNA-Bindungsdomäne und einer Aktivierungsdomäne; b) als optionaler Schritt Co-Transformieren oder Co-Transfizieren der gleichen Wirtszellen mit einer Proteintyrosinkinase (z. B. v-src, c-src oder dergleichen) zum Phosphorylieren möglicher wechselwirkender Komponenten und/oder Substrate, die in (d) unten eingeführt werden; c) Exprimieren einer ersten Hybrid-DNA-Sequenz in den Wirtszellen, die für eine Fusion eines Teils oder eines Ganzen z. B. einer huDEP-1-Isoform und entweder der DNA-Bindungsdomäne oder der Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors kodiert; d) in den Wirtszellen Exprimieren einer Bibliothek von zweiten Hybrid-DNA-Sequenzen, die für zweite Fusionen eines Teils oder ganzer mutmaßlicher DEP-1-Isoform-bindendender Proteine und entweder der Aktivierungsdomäne oder der DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors kodieren, die nicht in die erste Fusion eingebaut ist; e) Nachweisen der Bindung des DEP-1-Isoform-bindenden Proteins an die DEP-1-Isoform in einer bestimmten Wirtszelle durch Nachweis der Produktion des Reportergenprodukts in der Wirtszelle; und f) Isolieren zweiter Hybrid-DNA-Sequenzen, die für das DEP-1-Isoform-bindende Protein der Wirtszelle kodieren. Erfindungsgemäß werden auch Variationen des Verfahrens in Betracht gezogen, bei denen die Reihenfolge geändert wird, beispielsweise werden die hu-DEP-1-Isoformen und mutmaßlichen huDEP-1-Isoform-bindenden Proteine an die Transkriptionsfaktor-Domänen fusioniert, und zwar entweder an das aminoterminale oder carboxyterminale Ende der Transkriptionsfaktor-Domänen. In einem bevorzugten Verfahren ist der Promotor der ADHI-Promotor, die DNA-Bindungsdomäne ist die IexA-DNA-Bindungsdomäne, die Aktivierungsdomäne ist die GAL4-Transaktivierungsdomäne, das Reportergen ist das IacZ-Gen und die Wirtszelle ist eine Hefe-Wirtszelle. Besonders bevorzugt ist der Promotor der beta-Galactosidase-Promotor, die DNA-Bindungsdomäne ist die IexA-DNA-Bindungsdomäne, die Aktivierungsdomäne ist die GAL4-Transaktivierungsdomäne, das Reportergen ist das lacZ-Gen und die Wirtszellen sind Hefe-Wirtszellen. Der Fachmann wird erkennen, dass eine Vielzahl anderer Reportergene und Wirtszellen diesem Verfahren zugänglich sind. Ebenfalls verwendbar in diesem Verfahren sind beliebige einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren mit unterschiedlichen DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen, wobei entweder sowohl die DNA-Bindungs- als auch die Aktiverungsdomänen vom gleichen Transkriptionsfaktor abgeleitet sind, oder von unterschiedlichen, aber miteinander kompatiblen Transkriptionsfaktoren. Als eine weitere Abwandlung des Verfahrens können mutierte DEP-1-Polypeptide eingesetzt werden, bei denen ein Cysteinrest in der katalytischen Domäne gegen einen Serinrest ausgetauscht ist. Es ist gezeigt worden, dass Mutationen dieser Art bei anderen Phosphatasen Substrate erkennen und binden lassen, aber die Dephosphorylierung verhindern, da die Phosphatase als Ergebnis der Mutation inaktiv ist.
Ein erfindungsgemäß in Betracht gezogenes alternatives Identifizierungsverfahren zum Nachweisen von Proteinen, die an eine erfindungsgemäße Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid-Isoform binden, umfasst die Schritte a) Tranformieren oder Transfizieren geeigneter Wirtszellen mit einer Hybrid-DNA-Sequenz, die für eine Fusion zwischen einem mutmaßlichen Phosphatase-Bindungsprotein und einem Liganden kodiert, der in der Lage ist, an einen spezifischen Gegenrezeptor mit hoher Affinität zu binden; b) Exprimieren der Hybrid-DNA-Sequenz in den Wirtzellen unter geeigneten Bedingungen; c) Immobilisieren des Fusionsproteins aus den Wirtszellen durch Aussetzen des Fusionsproteins gegenüber dem spezifischen Gegenrezeptor in immobilisierter Form; d) in Kontaktbringen der Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Isoform mit dem immobilisierten Fusionsprotein; und e) Nachweisen der Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Isoform, die an das Fusionsprotein gebunden ist, mit einem für die Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Isoform spezifischen Reagenz. Gegenwärtig bevorzugte Ligand-Gegenrezeptor-Kombinationen zum Ausführen des Verfahrens sind Glutathion-S-Transferase/Glutathion, Hemagglutinin/Hemagglutinin-spezifische Antikörper, Polyhistidin/Nickel und Maltose-bindendes Protein/Amylose.
Ebenfalls in Betracht gezogen werden zusätzliche Verfahren zum Identifizieren von Proteinen, die spezifisch wechselwirken mit Dichte-stimulierter Typ III-Phosphatase (d. h. Substrate, Liganden, Modulatoren usw.). In einem Beispiel kann gereinigtes und isoliertes Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptid (z. B. huDEP-1-Polypeptid) kovalent verbunden werden mit einem immobilisierten Träger (d. h. Säulenharze, Perlen usw.) und inkubiert werden mit Zelllysaten, um Protein/Protein-Wechselwirkungen zu ermöglichen. Proteine, die mit dem immobilisierten DEP-1-Polypeptid wechselwirken, können dann vom Träger durch Gradient-Waschverfahren eluiert werden, wie sie im Stand der Technik üblich sind.
Als weiteres Beispiel können Protein-Overlay-Verfahren eingesetzt werden. DNA von Zellen, die entweder beispielsweise huDEP-1 oder Polypeptide exprimieren, die huDEP-1 modulieren oder binden können, können isoliert und mit Standardverfahren in eine Bibliothek überführt werden. Diese Bibliothek kann dann in einer heterologen Zelllinie exprimiert werden, und die daraus hervorgehenden Kolonien können auf einen immobilisierenden Träger überführt werden. Exprimierte Proteine aus diesen Kolonien werden dann in Kontakt gebracht mit DEP-1 und unter geeigneten Bedingungen inkubiert, um DEP-1/Protein-Wechselwirkungen zu ermöglichen. Die entstehenden Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase/Protein-Komplexe können durch Inkubation mit einem spezifischen Antikörper gegen Dichte-stimulierte Typ III-Phosphatase nachgewiesen werden. Kolonien, die mit dem spezifischen Antikörper wechselwirken, enthalten DNA, die für ein Protein kodiert, das mit der Dichtestimulierten Typ III-Phosphatase wechselwirkt. Alternativ können Zell- oder Gewebelysate in diesem Verfahren angewendet werden, wobei Zellen oder Gewebe ver wendet werden, die normalerweise DEP-1 exprimieren, oder solche Zellen verwendet werden, die zuvor mit für DEP-1 kodierender DNA transfiziert oder transformiert wurden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Zahlreiche weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Begutachtung der vorliegenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung offensichtlich, wobei Bezug genommen wird auf die Zeichnung, in der:
1A bis 1B Fotografien von Northernblot-Analyse-Autoradiogrammen sind; und
2 die Dichte-abhängige Expression von DEP-1 zeigen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird anhand der vorliegenden Beispiele illustriert, die sich auf die Isolierung und Charakterisierung von Genen beziehen, die für Dichtestimulierte Typ III-Phosphatase-Polypeptide kodieren. Beispiel 1 bezieht sich auf die Isolierung von cDNA, die für menschliches DEP-1 kodiert. Beispiel 2 diskutiert die Gewebeverteilung von huDEP-1, wie sie durch Northernblot-Analyse bestimmt wurde. Beispiel 3 betrifft die Herstellung von Antikörpern, die spezifisch sind für DEP-1 und dessen Fragmente. Beispiel 4 zeigt die Expression eines huDEP-1-cDNA-Klons in COS-Zellen. Beispiel 5 bezieht sich auf den Nachweis endogener Expression von huDEP-1 in Fibroblastenzellen. Beispiel 6 betrifft die Expression von huDEP-1 als Funktion der Zellkulturdichte. Beispiel 7 betrifft das Identifizieren von huDEP-1-Liganden. Beispiel 8 diskutiert die Identifizierung von Modulatoren und Substraten der huDEP-1-Aktivität. Beispiel 9 führt Details der Charakterisierung der genomischen huDEP-1-DNA näher aus.
Beispiel 1:
Isolierung und Charakterisierung von huDEP-1-cDNA In ersten Anstrengungen, cDNA kodierend für eine neue menschliche Phosphatase zu isolieren, die durch einen Zelldichte-abhängigen Mechanismus reguliert wird, wurden PCR-Primer synthetisiert, basierend auf konservierten Aminosäuresequenzen, die vielen zuvor identifizierten Phosphatasen gemeinsam sind. Diese Primer wurden dann verwendet, um Polynukleotide aus einer cDNA-Bibliothek zu vervielfältigen, die resultierenden Vervielfältigungsprodukte wurden sequenziert und diese Sequenzen wurden mit zuvor gefundenen DNA-Sequenzen verglichen.
Es wurden degenerierte Primer synthetisiert, die zu konservierten PTP-Animosäuresequenzen wie in SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 4 dargestellt korrespondieren, und zum Primen einer PCR mit einer HeLa-Zell-cDNA-Bibliothek als Templat verwendet.
KCAQYWP SEQ ID NO. 3
HCSAGIG SEQ ID NO. 4
Die in der PCR verwendeten entsprechenden Primen sind in SEQ ID NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 6 dargestellt, wobei die Nukleotidsymbole von 37 U.S.C. §1.882 entsprechen.
Das Sequenzieren von siebenundsiebzig unabhängigen Subklonen offenbarte sieben verschiedene Sequenzen, von denen 6 PTPs betrafen, deren DNA-Sequenzen zuvor publiziert worden waren, und die einschlossen: PTP 1B [Tonks et al.., J. Biol. Chem. 263: 6722–6730 (1988)], TCPTP [Cool et al.., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 5257–5261 (1989)], RPTPa [Krueger et al.., EMBO J. 9: 3241–3252 (1990)], LAR [Streuli et al.., J. Exp. Med. 168: 1523–1530 (1988)], PTPH1 [Yang und Tonks , Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 5949–5953 (1991)] und PTPμ [Gebbink et al.., FEBS Lett. 290: 123–130 (1991)]. Zum siebten Klon wurde herausgefunden, dass er ein einzigartiges 300 bp PCR-Fragment enthält, und er wurde verwendet, um eine Oligo-dTgeprimte HeLa-Zell-cDNA-Bibliothek (Strategene, La Jolla, CA) zu durchsuchen, um eine korrespondierende vollständige cDNA zu isolieren. Etwa 1,8 x 10⁶ Phagen-Plaques wurden wie zuvor beschrieben untersucht [Yang und Tonks, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 5949–5953 (1991)] und vierundzwanzig positive Klone wurden identifiziert. Das größte Insert, eine 5,1 kb cDNA, wurde in pUC119 kloniert, mit dem Dideoxy-Kettenabbruchsverfahren sequenziert, und es wurde ein offener Leserahmen von 4011 Nukleotiden gefunden, die für ein neues rezeptorartiges PTP von 1337 Aminosäuren Länge kodiert. Die DNA-Sequenz des 5,1 kb-Inserts ist in SEQ ID NO. 1 dargestellt, die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO. 2 dargestellt. Dieses menschliche Dichte-stimulierte PTP (human density enhanced PTP) wurde als huDEP-1 bezeichnet.
Das vorgeschlagene ATG-Start-Codon des huDEP-1-Gens wird durch ein Purin (G) an der -3'-Position flankiert und steht somit in Übereinstimmung mit den Kozak-Regeln für die Initiierung [Kozak, J. Cell. Biol. 198: 229–241 (1989)]. Es gibt ein zum Leseraster passendes Stop-Codon etwa 290 bp stromaufwärts der vorhergesagten Startstelle, und das Start-ATG wird gefolgt durch eine hydrophobe Region, die als Signalsequenz dienen kann. Ausgehend von der statistischen Analse bekannter Spaltungsstellen für die Signalpeptidase [von Heijne, Nuc. Acids Res. 14: 4683–4690 (1986)) wurde das Amino-Ende des reifen huDEP-1-Polypeptids mit Gly³ ⁷' bestimmt. Eine zweite hydrophobe Region befindet sich zwischen den Aminosäuren 977 und 996 und wird von einem Abschnitt hauptsächlicher basischer Reste gefolgt, was charakteristisch ist für eine Stop-Transfer-Sequenz. Dementsprechend wird eine extrazelluläre Region von 940 Aminosäuren Länge und ein intrazellulärer Abschnitt von 341 Aminosäuren Länge für das reife huDEP-1-Protein vorhergesagt. Die extrazelluläre Domäne umfasst acht FNIII-Domänen, und dreiunddreißig mögliche Stellen für eine N-verbundene Glykosylierung werden vorhergesagt. Demnach stimmt hu-DEP-1 mit der RPTP Typ III-Topographie gemäß der Nomenklatur von Fischer et al.., siehe oben, überein. Anders als die meisten RPTPs, die ein Tandem-Repeat katalytischer Domänen besitzen, umfasst die cytoplasmische Region eine einzelne katalytische Domäne, die von den Aminosäureresten 1060 bis 1296 reicht. Menschliches DEP-1 ist deshalb ein Beispiel einer sich vergrößernden Gruppe von RPTPs mit einer einzelnen katalytischen Domäne, die umfasst: PTPβ [Krueger et al.., EMBO J. 9: 3241–3252 (1990)), DPTPIOD aus Drosophila [Tian et al.., Cell 76: 675–685 (1991); Yang et al.., Cell 67: 661–673 (1991)], DPTP4E aus Drosophila [Oon et al.., J. Biol. Chem. 268: 23964–23971 (1993)) und das kürzlich beschriebene Enzym SAP-1 [Matozaki et al.., J. Biol. Chem. 269: 2075–2081 (1994)]. Ein Aminosäure-Sequenzvergleich der katalytischen Domäne von huDEP-1 mit anderen PTP-Domänen ergab, dass huDEP-1 am nächsten verwandt ist mit PTPβ und SAP-1. Die Sequenz enthält mehrere Ser-Pro-Motive sowie mögliche Phosphorylierungsstellen für Caseinkinase II.
Beispiel 2:
Northern-Analyse der huDEP-1-Gewebeverteilung Da zuvor gezeigt worden ist, dass die Expression von PTPs in Eukarioten ubiquitär ist, wurden verschiedene menschliche Gewebe analysiert, um den relativen Grad der huDEP-1-mRNA-Expression zu bestimmen.
RNA-Multi-Tissue-Northerblot-Filter (Clontech, Palo Alto, CA), die immobilisierte RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben enthalten, wurden beprobt mit einem 1,6 kb Hindlll/EcoRl-Fragment der huDEP-1-cDNA, die zuvor auf eine spezifische Aktivität von 1,5 x 10⁶ cpm/ng mit einem Megaprime DNA-Markierungskit (Amersham, Arlington Heighst, IL) radiomarkiert worden war. Diese Sonde repräsentierte die gesamte Länge der isolierten huDEP-1-cDNA. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden bei 65°C durchgeführt in einem Hybridisierungspuffer, der 0,5 M Na₂HPO₄, 7% SDS, 1 mM EDTA, und markierte Sonde in einer Konzentration von 10⁶ cpm/ml enthielt. Die Filter wurden dann fünfmal gewaschen bei 45 °C in 40 mM Na₂HPO₄, 1% SDS, und 1 mM EDTA. Die Membran wurde dann autoradiografiert. Die Ergebnisse sind in den 1A und 1 B dargestellt, wobei die menschliche Gewebequelle immobilisierter RNA folgende ist: In 1A ist die RNA in Spur 2 aus Herz, in Spur 3 aus Hirn, in Spur 4 aus Placenta, in Spur 5 aus Lunge, in Spur 6 aus Leber, in Spur 7 aus Skelettmuskel, in Spur 8 aus Niere und in Spur 9 aus Bauchspeicheldrüse. In 1 B ist die RNA in Spur 2 aus Milz, in Spur 3 aus Thymus, in Spur 4 aus Prostata, in Spur 5 aus Hoden, in Spur 6 aus Eierstock, in Spur 7 aus Dünndarm, in Spur 8 aus Dickdarm und in Spur 9 aus Leukozyten peripheren Bluts.
Die Northern-Analyse ergab, dass huDEP-1 in den meisten analysierten Geweben exprimiert wird, wobei besonders hohe mRNA-Werte in Placenta, Niere, Milz und Leukozyten peripheren Bluts detektiert wurden.
Beispiel 3:
Herstellen von huDEP-1-Polyklonalen Antikörpern Zwei für huDEP-1 einzigartige und zu den Aminosäureresten 1297 bis 1315 und den Resten 1321 bis 1334 aus SEQ ID NO. 1 (stromabwärts der katalytischen Region) korrespondierenden Peptide wurden mit einem zusätzlichen aminoterminalen Cycteinrest synthetisiert und mit Kaninchenserum-Albumin (RSA) mit m-Maleimidobenzoesäure-N-Hydroxysuccinimid-Ester (MBS) (Pierce, Rockford, IL) konjugiert. Die Immonisierungen mit diesem Peptiden wurden durch Cocalico Biological (Reamstown, PA) durchgeführt. Vor der Immunisierung wurden die Kaninchen zunächst vorgeblutet. Die erste Immunisierung umfasste Freund's vollständiges Adjuvans und 500 μg konjugierten Peptids oder 100 μg gereinigtes Peptid. Alle nachfolgenden Immunisierungen, die vier Wochen nach der vorherigen Injektion durchgeführt wurden, enthielten Freund's unvollständiges Adjuvans bei gleicher Proteinmenge. Blut wurde sieben bis zehn Tage nach den Immunisierungen entnommen.
Zum Affinitätsreinigen der Antikörper wurden huDEP-1-Peptide, konjugiert an RSA mit MBS, an CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gekoppelt. Das Antiserum wurde 10-fach verdunnt in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, und über Nacht mit der Affinitätsmatrix inkubiert. Nach dem Waschen wurden gebundene Antikörper vom Harz eluiert mit 100 mM Glycin, pH 2,5.
Der hergestellte Antikörper gegen die konjugierten Aminosäurereste 1297 bis 1315 wurde anti-CSH-241 genannt, und der Antikörper, der gegen das zu den Aminosäureresten 1321 bis 1334 korrespondierende konjugierte Peptid erzeugt wurde, wurde anti-CSH-243 genannt.
Beispiel 4:
Expression von huDEP-1 durch transfizierte Wirtszellen
Um das Proteinprodukt der huDEP-1-cDNA zu untersuchen, wurde das 5,1 kb Eco-RI-Insert in den Expressionsvektor pMT2 kloniert (Sambrook et al.., Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press (1989), Seiten 16.17 bis 16.22] und in COS-Zellen transfiziert, die in mit 10% FCS angereichertem DMEM herangezogen worden waren. Transfektionen wurden mit Hilfe des Calciumphosphat-Verfahrens durchgeführt [Sambrook et al.. (1989), Seiten 16.32 bis 16.40, siehe oben], und Zelllysate wurden 48 Stunden nach der Transfektion von transfizierten und untransfizierten COS-Zellen hergestellt. Die Lysate wurden durch Immunoblotting analysiert mit Hilfe des anti-CSH-243-Antikörpers und PTP-Assays von Immunkomplexen wie unten beschrieben.
In Immunoblot-Experimenten wurden Zelllysate hergestellt und Elektrophoresen durchgeführt. Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe von BioRad-Proteinassay-Lösungen bestimmt. Nach halbtrockenem elektrophoretischem Transfer auf Nitrozellulose wurden die Membranen geblockt mit 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 0,05% Tween-20 (TTBS) mit 5% Trockenmilch. Nach dem Waschen in TTBS und einer Inkubation mit sekundären Antikörpern (Amersham) wurden verbesserte Chemiluminescence-Verfahren (ECL) (Amersham) wie vom Hersteller beschrieben durchgeführt, um den Nachweis zu erleichtern.
Für Immunkomplex-PTP-Assays wurden 60 μg Zelllysate immunopräzipitiert mit 20 μl anti-CSH-243-Antiseren oder Vorimmun-Kaninchenserum, das an 25 μl Protein-A-Sepharose (Pharmacia) gebunden war. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4 °C wurden die Immunkomplexe dreimal in Waschpuffer (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,5, 5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leupeptin, 1 mM Benzamidin und 1 mM DTT) und einmal in Assay-Puffer (25 mM Imidazol, pH 7,2, 0,5 mg/ml BSA und 2 mM DTT) gewaschen. Die Protein-A-Sepharose-Immunkomplexe wurden dann resuspendiert in 150 μl Assay-Puffer und in Triplikaten auf PTP-Aktivität untersucht. Die Assays wurden 6 Minuten lang bei 30°C in einem Gesamtvolumen von 60 μl mit 3 μM [³²P-Tyr]-reduziertem carboxymethyliertem (RCM)-Lysozym als Substrat durchgeführt [Flint et al.., EMBO J. 12: 1937–1946(1993)].
Affinitätsgereinigte anti-CSH-243-Antikörper detektierten spezifisch ein Protein mit einem Molekulargewicht von 180 kD in Lysaten transfizierter Zellen. Wenn darüber hinaus Immunkomplexe auf PTP-Aktivität untersucht wurden, wurde eine fast 10-fach höhere Aktivität in anti-CSH-243-Immunkomplexen von transfizierten Zellen im Vergleich zu den untransfizierten Zellen nachgewiesen. Diese PTP-Aktivität trat im Wesentlichen nicht in Immunkomplexen auf, die aus Immunopräzipitationen mit blo ckiertem Antiserum oder Vorimmunisierungsserum gewonnen waren. Es wurde beschlossen, dass die huDEP-1-cDNA für ein 180 kD Protein mit intrinsischer PTP-Aktivität kodiert.
Beispiel 5:
Endogene Expression von huDEP-1 Um endogen exprimiertes huDEP-1 zu charakterisieren wurden Lysate verschiedener Zelllinien einschließlich CEM (ATCC CCL 119), HeLA (ATCC CCL 2), 293 (ATCC CRL 1573), Jurkat (ATCC TIB 152), K562 (ATCC CCL 243), HL60 (ATCC CCL 240), W138 (ATCC CCL 75) und AG 1518 (Coriell Cell Repositories, Camden, NJ) durch Immunoblot analysiert mit dem Antikörper Anti-CSH-243 wie in Beispiel 4 beschrieben.
W138-Zellen, eine diploide fötale-Lungen-fibrolastenartige Zelllinie mit begrenzter Lebensdauer, zeigte die höchste Expression. Ähnliche Expressionsgrade wurden auch in AG 1518 Vorhautfibroblastenzellen nachgewiesen.
Um ferner die Expression von huDEP-1 zu untersuchen wurden Lysate von metabolisch markierten Zellen durch Immunopräzipitation und SDS-Gel-elektrophorese analysiert. Konfluente Kulturen von W138- und AG 1518-Zellen wurden vier Stunden lang metabolisch markiert in Methionin-freiem DMEM, angereichert mit 1 mg/ml Rinderserum-Albumin (BSA) und 0,15 mCi/ml Translabel (ICN, Costa Mesa, CA). Zellen wurden lysiert in 0,5% DOC, 0,5% Triton X-100, 150 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,5, 5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leupeptin, 1 mM Benzamidin, 1 mM DTT (Lysepuffer), und die Lysate wurden 15 Minuten lang bei 15000 x g zentrifugiert. Lysate, die etwa 2 x 10⁶ Zellen entsprachen, wurden dann mit 20 μl anti-CSH-243 oder anti-CSH-243 inkubiert. Nach vierstündiger Inkubation bei 4°C wurden 50 μl einer 1 : 1 Protein-A-Sepharose-Aufschlämmung zugegeben, um die Protein/Antikörper-Komplexe zu binden, und die Inkubation dauerte weitere 60 Minuten. Immunkomplexe, die an die Protein-A-Sepharose adsorbiert waren, wurden durch Zentrifugation gesammelt und dreimal in 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,5, 5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leupeptin, 1 mM Benzamidin, 1 mM DTT (Waschpuffer) und einmal in 20 mM Tris, pH 7,5, gewaschen. Proben wurden vom Harz eluiert durch dreiminütige Inkubation bei 95°C in reduzierendem SDS-Probenpuffer und durch SDS-Gelelektrophorese auf 7%-Gelen analysiert, gefolgt von Fluorografie.
Sowohl in W138- als auch in AG 1518-Zellen wurde ein 180 kD Protein spezifisch in den ungeblockten Antiseren erkannt. Immunopräzipitation von anti-CSH-243-Antiseren mit W138-Zelllysaten ergaben auch signifikant höhere Werte (etwa 10- bis 20-fach höher) an Aktivität als Präzipitationen mit Vorimmunisierungs-Serum oder Antiserum, das zuvor mit 200 mg/ml Peptid-Konjugat inkubiert worden war.
Es scheint, dass huDEP-1 ein Phosphorprotein in vivo ist, da der anti-CSH-243-Antikörper ein 180 kD [³²P]-markiertes Protein aus einem Zelllysat von W138-Zellen immunopräzipitieren konnte, das metabolisch mit [³²P]-anorganischem Phosphat markiert worden war.
Beispiel 6:
Zelldichte-abhängige Expression und Aktivität von huDEP-1
W138-Zelllysate aus dünnen (weniger als 7000 Zellen/cm²) und dichten (mehr als 25000 Zellen/cm2) Kulturen wurden im Hinblick auf die Level an exprimiertem hu-DEP-1-Protein durch Immunoblotten mit anti-CSH-243-Antikörpern wie in Beispiel 4 beschrieben verglichen. Ein dramatischer 10- bis 20-facher Anstieg an huDEP-1-Expression wurde in dichten Zellkulturen nachgewiesen, wie in 2 dargestellt. Da 3 μg eines Gesamtzelllysats aus mehr konfluenter Kultur ein vergleichsweise starkes Signal ergaben und 15 μg an Lysaten aus dünnen Kulturen unterhalb der Nachweisgrenze lagen, wurde geschätzt, dass zumindest eine 10-fach höhere Menge an huDEP-1 in Zellen aus dichten Kulturen vorliegt. Ähnliche Ergebnisse wurden mit anti-CSH-241 erhalten. Wenn die Mengen an PTP1 B in Zelllysaten aus dünnen und dichten Zellen mit einem anti-PTP1 B-monoklonalen Antikörper FG6 (Oncogene Science, Uniondale, NY) verglichen wurden, wurden keine Unterschiede beobachtet. Die beobachteten Effekte auf die huDEP-1-Expression sind nicht auf W138-Zellen beschränkt, da ähnliche Ergebnisse auch mit AG 1518-Zellen erhalten wurden.
Um zu bestimmen, ob auch die Enzymaktivität durch einen dichteabhängigen Mechanismus reguliert wurde, wurden huDEP-1- und PTP1 B-Immunkomplexe und Gesamtzelllysate von dünnen und dichten W138- und AG 1518-Zellkulturen auf Phosphataseaktivität mit dem PTP-Assay analysiert. Für die Immunkomplex-PTP-Assays wurden 60 μg Zelllysat immunopräzipitiert mit 20 μl anti-CSH-243-Antiserum (mit oder ohne Vorbehandlung mit Antigen) oder mit Vorimmunisierungs-Serum, das an 25 μl Protein-A-Sepharose gebunden war. Nach einer über Nacht-Inkubation bei 4°C wurden die Immunkomplexe dreimal in Waschpuffer und einmal in 25 mM Imidazol, pH 7,2, 0,5 mg/ml BSA, 1 mM DTT (Assaypuffer) gewaschen. Protein-A-Sepharose-Immunkomplexe wurden dann in 150 μl Assaypuffer suspendiert und auf PTP-Aktivität in Triplikaten untersucht. Die Assays dauerten 6 Minuten bei 30°C in einem Gesamtvolumen von 60 μl mit 3 μM [³²P-Tyr] RCM-Lysozym als Substrat [Flint et al.., siehe oben].
Übereinstimmend mit der erhöhten huDEP-1-Proteinexpression, die in den Immunoblot-Experimenten gezeigt wurde, stieg auch die huDEP-1-Enzymaktivität in den dichten Zellkulturen. Der beobachtete Aktivitätsanstieg in huDEP-1/CSH-243-Immunopräzipitaten aus dichten Kulturen (etwa 2- bis 3-fach) war nicht so groß wie der beobachtete Anstieg an Proteinexpression in dichten Kulturen, was höchstwahrscheinlich auf unvollständige Präzipitation der Gesamt-PTP mit anti-CSH-243-Antiseren zurückzuführen ist. Es wurde kein Aktivitätsunterschied beobachtet bei PTP1 B/FG6-Immunopräzipitaten oder Gesamtzelllysaten aus dünnen und dichten Zellkulturen.
Schließlich wurden zum Untersuchen der Kinetik der dichte-abhängigen Hochregulierung der huDEP-1-Expression Lysate aus W138- und AG 1518-Zellen bei mittleren Zelldichten in die Immunoblot-Analyse aufgenommen. Die höchste Expression wurde in Zellen bei Sättigungsdichte gefunden, aber bei mittleren Dichten war ein Expressionsanstieg im Vergleich zu dünnen Zellkulturen beobachtbar. Es scheint also, dass die Hochregulierung der huDEP-1-Expression vor der Sättigungsdichte ausgelöst wird und nicht das Ergebnis des Wachstumsarrestes ist.
Während der genaue Mechanismus, durch den die huDEP-1-Expression induziert wird, unklar bleibt, legt der Nachweis, dass die Expression in zwei unterschiedlichen Zelllinien induziert wird, wenn die Zellen sich der Konfluenz nähern, eine Beteiligung von huDEP-1 beim Fördern der Netto-Dephosphorylierung von Proteinen nahe, wodurch den wachstumsfördernden Effekten. der PTK-Aktivität gegengesteuert wird. Diese Möglichkeit legt in Kombination mit der breiten Verteilung der huDEP-1-Expression nahe, dass huDEP-1 in einem allgemeinen Mechanismus der Zellwachstums-Kontaktinhibierung beteiligt ist.
Beispiel 7:
Identifizieren von DEP-1-Liganden
Die Möglichkeit, dass DEP-1 als Adhäsionsmolekül wirkt, wird mit dem Sf9-Zellsystem überprüft werden [Brady-Kalnay et al.., J. Cell Biol. 122: 961–972 (1993)] nach Transfektion mit DEP-1-cDNA. Zusätzlich werden nach Studien mit transienter Expression stabile Zelllinien, die DEP-1 überexprimieren, hergestellt.
Wenn DEP-1 als ein Adhäsionsmolekül wirkt, dann werden der oder die extrazelluläre(n) Gegenrezeptoren) gefunden. Eine Möglichkeit ist, dass, ähnlich wie bei PTPμ, die DEP-1-Bindung homophil ist, so dass ein DEP-1-Molekül ein anderes DEP-1-Molekül auf einer angrenzenden Zelle bindet. Alternativ dazu erkennt DEP-1 spezifisch ein Nicht-DEP-1-Molekül in einem heterophilen Bindungsmechanismus.
Zusätzlich werden eine Anzahl bekannter deletions- und zielgerichteter Mutageneseverfahren angewendet werden, um die wichtigen Segmente im Protein zu identifizieren, die die Bindungsspezifität bewirken. Die Analyse von 2D-Gelen von Proteinen, die mit Anti-Phosphortyrosin-Antikörpern reagieren, beispielsweise mit dem monoklonalen Antikörper 4G10 (UBI, Lake Placid, NY), werden verwendet werden, um Studien hinsichtlich der Auswirkungen der Beteiligung des extrazellulären PTP-Segments in entweder homophilen Bindungs-Wechselwirkungen oder Antikörper-Bindungen durchzuführen.
Die „Epitope"-Bibliotheks-Technologie [Scott und Smith, Science 249: 386–390 (1990)] wird verwendet werden, um Peptidsequenzen zu identifizieren, die mit DEP-1 wechselwirken. Dieser Ansatz wird sich als besonders wertvoll erweisen bei der Suche nach DEP-1-Liganden, dessen extrazelluläres Segment, umfassend mehrere FNIII-Repeats, Faktoren mit niedrigem M_r binden kann.
Protein:Protein-Wechselwirkungen wurden zuvor für FNIII-Sequenzen und spezifisch bindende Proteine berichtet, und diese Information wird in mehreren Ansätzen verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die spezifisch mit der extrazellulären Domäne von DEP-1 wechselwirken. Insbesondere werden Protein:Protein-Wechselwirkungen untersucht werden in Zell-„Panning"-Experimenten [Seed und Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 3365–3369 (1987)], Gel-Overlay-Assays [Hirsch et al.., J. Biol. Chem. 267: 2131–2134 (1992); Carr und Scott, Trends in Biochemical Sci. 17: 246–249 (1992)], Band-Shift-Analysen [Carr et al.., J. Biol. Chem. 267: 13376–13382 (1992)], Affinitätschromatografie, Durchsuchen von Expressionsbibliotheken [Young und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80: 1194–1198 (1983)] usw.
Beispiel 8:
Identifizieren von Modulatoren/Substraten von DEP-1 Mögliche Substrate mit vorhergesagter physiologischer Relevanz werden auf ihre Aktivität gegen die katalytische Domäne in vitro getestet.
Zusätzlich werden Hefe-Screening-Systeme [Fields und Song, Nature 340: 245–246 (1989); Yang et al.., Science 257: 681–682 (1992)]; Vojtek et al.., Cell 74: 205–214 (1993)] eingesetzt werden, insbesondere mit Bezug auf Co-Expression mit einer Proteintyrosinkinase, beispielsweise v-src oder c-src, um Proteine zu isolieren, die die DEP-1-Aktivität regulieren können.
In einem weiteren Ansatz zum Identifizieren von DEP-1-Substraten wird eine mutierte Form, bei der die Cysteinylreste des aktiven Zentrums durch ein Serin ersetzt wurde, exprimiert werden. Jüngste Studien legen nahe, dass Substrate an die inaktive Phosphatase binden und komplexiert bleiben. Die mutierte PTP kann Substratmoleküle binden, aber fängt sie in einem „Sackgassen"-Komplex, der durch übliche Immunopräzipitationsverfahren isoliert werden kann [Sun et al.., Cell. 75: 487–493 (1993)]. Mögliche Substrate können mit der mutierten PTP aus ³⁵S-markierten Zellen co-immunopräzipitiert werden. Alternativ dazu kann das Wildtyp- oder native DEP-1-Enzym in diesem Verfahren verwendet werden. Erste Studien in dieser Hinsicht verwenden chimere Moleküle, für die Antikörper gegen den extrazelluläre Wachstumsfaktoren bindenden Abschnitt kommerziell verfügbar sind, während Antikörper gegen die bona fide DEP-1-Sequenzen erzeugt werden.
Beispiel 9:
Charakterisierung des genomischen DEP-1-Gens
Die Isolierung der DEP-1-cDNA-Sequenzen wird das Isolieren und Reinigen der zugehörigen genomischen DEP-1-Sequenzen erlauben. In einer vorläufigen Arbeit wurde gezeigt, dass huDEP-1 auf dem menschlichen Chromosom 11p, Band 11.2 oder der Grenze von 11.2 und 11.3 liegt. Das Isolieren dieser genomischen DEP-1-Sequenzen wird das Identifizieren mutmaßlicher regulatorischer Sequenzen der DEP-1-Transkription ermöglichen, und wahrscheinlich auch das Identifizieren von trans-wirkenden Transkriptionsmodulatoren der DEP-1-Expression. Zusätzlich wird das Identifizieren und Reinigen des menschlichen genomischen Klons das Durchsuchen von Bibliotheken anderer Spezies erlauben, um zu bestimmen, ob homologe Gegenstücke in den Spezies existieren. Das Identifizieren eines homologen Gegenstücks in Mäusen wird von besonderer Bedeutung sein wegen der Möglichkeit, einen „knockout"-Stamm zu erzeugen. Mäusestämme, die ein bestimmtes Protein nicht exprimieren, sind von erheblicher Bedeutung, da sie es erlauben, Krankheitsbilder zu bestimmen, die mit dem Fehlen des Proteins in einem lebenden Tier zusammenhängen.
Sequenzprotokoll

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Tonks, Nicholas K. und Östman, Arne
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Dichte-stimulierte Proteintyrosinphosphatase
(iii) ANZAHL SEQUENZEN: 6
(iv) ANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Borun
(B) STRAβE: 233 South Wacker Drive, Suite 6300
(C) STADT: Chicago
(D) STAAT: Illinois
(E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
(F) POSTLEITZAHL: 60606
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUM-ART: Floppy Disk
(H) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIN Release #1.0, Version #1.25
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(viii) ANWALT/AGENT:
(A) NAME: Borun, Michael F.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 25,447
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 27866/31954
(ix) TELEKOMMUNIKATIONS-ANGABEN:
(A) TELEFON: 312–474–6300
(B) TELEFAX: 312–474–0448
(2 ), ANGABEN ZU SEQ ID N0.1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5117 BASENPAARE
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 350..4364 ,
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0.2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 1337 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.2:

)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO.3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO.4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO.4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0.5:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0.6_:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA
(ix) MERKMAL:
(D) ANDERE ANGABE: /Hinweis="Base N an Position 6 ist Inosin."
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.6:

Claims

Isoliertes, Dichte-stimulierte Typ-III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid der SEQ ID NO. 2 oder eine Variante davon, wobei die Variante ausgewählt ist aus: a) einer menschlichen Allel-Variante oder einer Variante einer heterologen Spezies; b) einem Fragment davon, wobei: (1) das Fragment von einem Antikörper erkannt werden kann, der für eine Dichte-stimulierte Typ-III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase spezifisch ist, oder (2) wenigstens eine biologische Aktivität einer Dichte-stimulierten Typ-IIIrezeptorartigen Phosphatase beinhaltet oder verstärkt ist; wobei die biologische Aktivität ausgewählt ist aus (i) Bindung an ein Substrat, Ligand oder Gegenrezeptor einer Dichtestimulierten Typ-III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphastase, (ii) enzymatischer Aktivität einer Dichte-stimulierten Typ-III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase, oder (iii) Signaltransduktionsaktivität einer Dichte-stimulierten Typ-III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase; c) einer Variante davon, bei der eine Aminosäure ersetzt ist, und wobei (1) die Variante von einem Antikörper erkannt werden kann, der für eine Dichte-stimulierte Typ-III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase spezifisch ist, oder (2) wenigstens eine biologische Aktivität einer Dichte-stimulierten Typ-IIIrezeptorartigen Phosphatase beinhaltet oder verstärkt ist; wobei die biologische Aktivität ausgewählt ist aus (i) Bindung an ein Substrat, Ligand oder Gegenrezeptor einer Dichtestimulierten Typ-III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase, (ii) enzymatischer Aktivität einer Dichte-stimulierten Typ III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase, oder (iii) Signaltransduktionsaktivität einer Dichte-stimulierten Typ III-rezeptorartigen Proteintyrosinphosphatase; oder (3) eine spezifische Ligand/Rezeptor-Bindung oder Signalfunktion außer Kraft gesetzt ist; oder d) eine Mutante davon, bei der ein Cysteinrest in der katalytischen Domäne gegen einen Serinrest ausgetauscht ist:
Dichte-stimulierte Typ-III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid oder Variante nach Anspruch 1 in vollständig glykosylierter, teilweise glykosylierter oder nicht-glykosylierter Form.
Isoliertes Polynukleotid, das für ein Dichte-stimulierte Typ-III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid oder Variante nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 3, das eine DNA ist.
DNA nach Anspruch 4, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus cDNA, genomischer DNA, teilweise chemisch synthetisierter DNA und vollständig chemisch synthetisierter DNA.
DNA nach Anspruch 4, umfassend eine huDEP-1-Protein-kodierende Sequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO. 1. 7: DNA nach Anspruch 4, ferner umfassend regulatorische DNA-Sequenzen, die die Transkription der DNA steuern.
Aufgereinigtes und isoliertes Polynukleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO. 1 dargestellt ist, und (b) einem DNA-Molekül, das unter stringenten Bedingungen an den Proteinkodierenden Teil der DNA von (a) hybridisiert.
DNA-Expressionskonstrukt, umfassend die DNA nach Anspruch 7.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit der DNA nach Anspruch 4.
Verfahren zum Herstellen eines Dichte-stimulierte Typ-III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptids oder einer Variante davon, umfassend die Schritte: Wachsenlassen der Wirtszelle nach Anspruch 10 in einem geeigneten Medium und Isolieren des Polypeptids oder der Variante aus der Wirtszelle oder ihrem Wachstumsmedium.
Isolierter Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch an ein Dichte-stimulierte Typ-III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid oder eine Variante nach Anspruch 1 oder 2 zu binden.
Antikörper nach Anspruch 12, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Anti-Idiotyp-Antikörper, der für den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 13 spezifisch ist.
Hybridom-Zelllinie, die den Antikörper nach Anspruch 13 oder 14 erzeugt.
Verfahren zum Isolieren eines Polynukleotids, das für ein Polypeptid kodiert, das an ein Dichte-stimulierte Typ-III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase- Polypeptid oder eine Variante nach Anspruch 1 oder 2 bindet, umfassend die Schritte: (a) Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen mit einem DNA-Konstrukt umfassend ein Reportergen unter der Kontrolle eines Promotors, reguliert durch einen Transkriptionsfaktor mit einer DNA-Bindungsdomäne und einer Aktivierungsdomäne; (b) Exprimieren einer ersten Hybrid-DNA-Sequenz, die für eine erste Fusion eines Teils oder eines . ganzen Dichte-stimulierte Typ 111-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptids oder einer Variante nach Anspruch 1 oder 2 und entweder der DNA-Bindungsdomäne oder der Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors kodiert, in den Wirtszellen; (c) Exprimieren einer Bibliothek von zweiten Hybrid-DNA-Sequenzen, die für zweite Fusionen eines Teils oder ganzer mutmaßlicher Dichte-stimulierte Typ IIIrezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Bindungspolypeptide und entweder der Aktivierungsdomäne oder der DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors kodieren, die nicht in die erste Fusion eingebaut ist, in den Wirtszellen; (d) Transformieren oder Transfizieren der Wirtszellen mit einem DNA-Konstrukt, umfassend ein Proteintyrosinkinasegen; (e) Nachweisen der Bindung des (der) Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Bindungspolypeptids (-polypeptide) an das Phosphatase-Polypeptid in der Wirtszelle durch Nachweis der Produktion des Reportergenprodukts in der (den) Wirtszelle(n); und (f) Isolieren der zweiten Hybrid-DNA-Sequenzen, die für das Phosphatase-Bindungspolypeptid oder die Variante kodieren, aus der (den) Wirtzelle(n).
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Promotor der beta-Galactosidase-Promotor ist, die DNA-Bindungsdomäne die IexA-DNA-Bindungsdomäne ist, die Aktivierungsdomäne die GAL4-Transaktivierungsdomäne ist, das Reportergen das IacZ-Gen ist, und die Wirtszellen Hefe-Wirtzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Dichte-stimulierte Typ-III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase eine katalytisch inaktive Variante von huDEP-1 ist, die in der Lage ist, huDEP-1-Substrat zu binden.
Verfahren zum Nachweis von Proteinen, die an eine Dichte-stimulierte Typ-IIIrezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid-Isoform nach Anspruch 1 oder 2 binden, umfassend die Schritte: a) Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen mit einer Hybrid-DNA-Sequenz, die für eine Fusion zwischen einem mutmaßlichen Phosphatase-Bindungsprotein und einem Liganden kodiert, der in der Lage ist, an einen spezifischen Gegenrezeptor mit hoher Affinität zu binden; b) Exprimieren der Hybrid-DNA-Sequenz in den Wirtzellen unter geeigneten Bedingungen; c) Immobilisieren des Fusionsproteins aus den Wirtszellen durch Aussetzen des Fusionsproteins gegenüber dem spezifischen Gegenrezeptor in immobilisierter Form; d) In-Kontakt-Bringen des Dichte-stimulierte Typ III-rezeptorartige Proteintyrosinphosphatase-Polypeptids mit dem immobilisierten Fusionsprotein; und e) Nachweisen des an das Fusionsprotein gebundenen Phosphatase-Polypeptids unter Verwendung eines Reagens, das für das Phosphatase-Polypeptid spezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Ligand Glutathion-S-Transferase ist, und der Gegenrezeptor Glutathion ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Ligand Hämagglutinin ist und der Gegenrezeptor ein Hämagglutinin-spezifischer Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Ligand ein Polyhistidin ist und der Gegenrezeptor Nickel ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Ligand Maltose-Bindungsprotein ist und der Gegenrezeptor Amylose ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Verwendung als ein therapeutisches oder prophylaktisches Mittel.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zum Herstellen eines Medikaments zur Behandlung malignen Zellwachstums.