JPH10500113A - 改良された修飾ｂｒｓｖ生ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一回投与後に感染からの免疫を有利に与える改良されたＢＲＳＶワクチン組成物を提供する。この組成物は、修飾生ＢＲＳウイルスおよびアジュバントからなり、共同して、一回投与後にＢＲＳＶ感染からの免疫を与え、かつ、ＢＲＳＶに特異的で、細胞性免疫および局所（分泌型ＩｇＡ）免疫を含む免疫応答を誘起する。好ましい具体例では、ＢＲＳウイルスは３７５株であり、アジュバントは不飽和テルペン炭化水素（好ましくは、スクアレンまたはスクアラン）およびポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマー（最も好ましくは、コポリマーが平均分子量約３２５０〜４０００のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）成分を有し、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）成分が全分子の約１０〜２０％を構成するもの）からなる。アジュバントは、所望により、界面活性剤（好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンオレエート）を含有していてもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 改良された修飾ＢＲＳＶ生ワクチン 発明の分野 本発明は、特に受容動物に一回量で投与するのに適した修飾生ワクチンを採用 して、ウシ呼吸器シンシチア（ＲＳ）ウイルス（ＢＲＳＶ）に対する防御免疫を 誘発する改良された方法に関する。 発明の背景 現在、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）は、ウシ呼吸器疾患症候群（ＢＲＤＣ） の重要な病因因子であると認識されている。この疾患は、急速な呼吸、咳、食欲 の減退、眼や鼻の分泌物、および高い体温によって特徴づけられる。急性発生の 場合、徴候の発現から４８時間以内に死に至りうる。 ＢＲＳＶは、乳児期の子ウシを含めて、あらゆる年齢のウシに感染する。ＢＲ ＳＶは、子ウシの流行性肺炎の最も一般的なウイルス病原体であると考えられ、 新たに離乳した子ウシの肺気腫とも関連している。それゆえ、このウイルスに対 する有効な予防法が子ウシや乳牛において必要とされている。 ＢＲＳＶに対する防御免疫を確立することは問題がある。いくつかの他のウイ ルス性疾患の場合のように、ＢＲＳＶに対する血清抗体のレベルは、疾患に対す る防御と必ずしも相関してしない。この現象は、ＢＲＳＶに向けて局所的に産生 されたＩｇＡに対する役割（キムマン（Kimman）ら、ジャーナル・オブ・クリニ カル・マイクロバイオロジー（J．Clin．Microbiol.）25：1097-1106，1987）お よび／または細胞性免疫がこのウイルスに対する有効な防衛を行う必要条件を反 映しうる。乳児期の子ウシの防御免疫を確立することは、ＢＲＳＶに対する母系 抗体が注入された免疫原を枯渇させ、ワクチンを効果的に中和しうるので、付加 的な障害を与える。最後に、多数回のワクチン接種が不便で経費の掛かることか ら、一回量（single-dose）ワクチンが望まれている。それゆえ、当該分野では 、活力のある多面的な免疫応答を誘起する一回投与（one-dose）ＢＲＳＶワクチ ン 製剤が必要とされている。 従来技術のＢＲＳＶワクチンに対する標準的な投与計画は、二回投与（two do ses）である（ストット（stott）ら、ジャーナル・オブ・ハイジーン・オブ・ケ ンブリッジ（J．Hyg．Camb.）93：251-261，1984；トーマス（Thomas）ら、アグ リ-プラクティス（Agri-Practice）5：1986；およびシブルード（Syvrud）ら、 ヴェテリナリー・メディスン（Vet．Med.）83：429-430，1988；ヴェテリナリー ・ファーマシューティカルズ・アンド・バイオロジカルズ（Veterinary Pharmac euticals & Biologicals），第８版，1993/94年，484，740-741，956-960，982- 983頁）。クセラ（Kucera）ら（アグリープラクティス（Agri-Practice），ヴェ テリナリー・メディスン（Vet．Med.）Vol.78，1983年10月，1599-1604頁，1983 ）に示されているように、一回の実験的なＢＲＳＶワクチン接種はＢＲＳＶに対 して比較的低いレベルの血清中和（ＳＮ）抗体価を誘発したが、ワクチンの二回 投与は１：１０〜１：３２０のＳＮ抗体価を誘起した。さらに、野外試験の間に 明らかにＢＲＳＶに接触した牛群の場合、呼吸器疾患の治療を必要としたのが、 一回量および二回量ワクチンを接種された動物では、それぞれ２７％および２１ ％であったのに比べて、ワクチン接種を受けなかった動物では、約４８％であっ た。しかしながら、野外試験における呼吸器疾患の原因因子がＢＲＳＶであると いう決定的な証明は行われなかった。また、一回量ワクチンが非常に免疫原性で あるわけではないことが注目された。その後の評価によると、良好な防御を得る には、このワクチンを二回投与することが必須であるらしいと結論された（ボー バイン・ベテリナリー・フォーラム（Bovine Vet．Forum）1：No.2，2-16頁，19 86；シブルード（Syvrud）ら、ヴェテリナリー・メディスン（Vet．Med.）429-4 30,1988）。 欧州特許出願第129,923号（1985年２月１日付で公開され、1988年７月９日付 で特許として発行された）には、水中油型の乳剤として処方された１種またはそ れ以上の抗原（特に不活化インフルエンザウイルス）を含有する不活化ワクチン に生ワクチンを溶解することからなるＢＲＳＶ生ワクチンの調製方法が記載され ている。まだ母系免疫を有する若い動物では、血清学的応答が得られた。この出 願には、ＢＲＳＶおよびアジュバントを含有する修飾生製剤も記載されている。 しかしながら、ＢＲＳＶ攻撃に対するＢＲＳＶワクチンの防御効力に関するデー タは全く示されなかった。 本発明のある目的は、ＢＲＳＶに対する有効なワクチンを提供することであり 、かかるワクチンは防御免疫を誘起し、かつ、このウイルスによって引き起こさ れる疾患を予防する。 本発明のさらなる目的は、ＢＲＳＶワクチンに用いるのに適したアジュバント を提供することである。このアジュバントは、かかるワクチンの一回量を投与し た後に防御免疫を誘起するようにウイルスの免疫原性を増強する。 発明の概要 本発明は、ブロックコポリマー（例えば、ポリオキシプロピレン-ポリオキシ エチレン（ＰＯＰ−ＰＯＥ）ブロックコポリマー（好ましくは、プルロニック 成分（例えば、代謝可能な油（例えば、不飽和テルペン（turpin）炭化水素（好 ましくは、スクアラン（２,６,１０,１５,１９,２３-ヘキサメチルテトラコサン ）またはスクアレン））など）からなる、免疫応答を増強する組成物を包含する 。この組成物はまた、非イオン性の洗浄剤または界面活性剤（好ましくは、ポリ オ （２０）ソルビタンモノオレエート））など））を含有してもよい。 この保存アジュバント混合物において、ブロックコポリマー、有機油、および 界面活性剤は、それぞれ約１０〜約４０ｍｌ/Ｌ、約２０〜約８０ｍｌ/Ｌ、およ び約１.５〜約６.５ｍｌ/Ｌの範囲内の量で存在しうる。保存アジュバントの好 ましい具体例では、有機成分は約４０ｍＬ/Ｌの量で存在するスクアランであり 、界面活性剤は約３.２ｍｌ/Ｌの量で存在するポリオキシエチレンソルビタンモ ノ る。なお、ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）成分は分子量が３２５０〜４０００ であり、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）成分は全分子の約１０〜２０％（好まし くは、１０％）を構成する。 別の態様では、本発明は、上記アジュバントおよび医薬上許容される安定剤、 担体または希釈剤と組み合わせた修飾生ＢＲＳウイルスからなる、ウシＲＳウイ ルス（ＢＲＳＶ）による感染に対して動物を免疫する免疫原性組成物を提供する 。アジュバントは、約１〜２５％（ｖ/ｖ）（好ましくは、５％（ｖ/ｖ））の最 終濃度で、このワクチン組成物中に存在する。この組成物はまた、他のウイルス （例えば、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）、ウシウイルス性下痢症（ ＢＶＤＶ）、およびパラインフルエンザ３型（ＰＩ-３Ｖ））を含有してもよく 、筋肉内または皮下経路で投与すればよい。 さらに別の態様では、本発明は、修飾生ＢＲＳＶおよびアジュバントからなる 上記ワクチンの一回量を投与することによって、ウシＲＳウイルスによって引き 起こされる疾患に対して動物を保護する方法を提供する。 発明の詳細な説明 ここで引用するすべての特許、特許出願、および他の文献は、出典を示すこと によって、それらの全体を明細書の一部とする。矛盾が生じる場合には、本開示 が優先する。 ここで用いるように、「修飾生ワクチン」は、疾患を引き起こす能力を弱める ために、典型的には組織培養細胞中に通過させることによって、変性されている が、動物に投与された場合には、疾患または感染に対して防護する能力を保持し ているウイルスからなるワクチンである。 「アジュバント」とは、ワクチン組成物中でＢＲＳＶと組み合わせた場合に、 ＢＲＳＶの免疫原性および効力を増強する１種またはそれ以上の物質からなる組 成物を意味する。 ＢＲＳＶの「感染単位」は、ＴＣＩＤ₅₀、すなわち組織培養細胞の５０％を感 染または死滅させるのに必要なウイルスの量として定義される。 本発明は、一回量での投与に適した、ＢＲＳＶに対するワクチンを提供する。 このワクチンは、修飾生ウイルス品種のものである。これは、ウイルスの病原性 を低減するが、その免疫原性および／または効力は保存するという利点を与える 。 このワクチンは、当該分野で標準的な方法によって、新しく採取されたウイル ス培養物から調製すればよい（以下の実施例１を参照）。すなわち、ウイルスは 、ヒト二倍体繊維芽細胞または好ましくはＭＤＢＫ（マーディン-ダービィ（Mad in-Darby）ウシ腎臓）または他のウシ細胞などの組織培養細胞中で増殖させれば よい。ウイルスの増殖を標準的な技術（細胞変性効果の観察、免疫蛍光または他 の抗体に基づく測定法）によってモニターし、充分に高いウイルス力価が達成さ れたら採取する。保存ウイルスは、ワクチン製剤に配合する前に、従来法によっ て、さらに濃縮または凍結乾燥してもよい。他の方法（例えば、トーマス（Thom as）ら、アグリ-プラクティス（Agri-Practice）V.7 No.5，26-30頁に記載のも の）を採用することができる。 本発明のワクチンは、１種またはそれ以上の医薬上許容される安定剤、担体お よびアジュバントと組み合わせた修飾生ワクチンからなる。使用に適した担体と しては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、最少必須培養液（ＭＥＭ）、また は、ＨＥＰＥＳ緩衝液を添加したＭＥＭが挙げられる。安定剤としては、ショ糖 、ゼラチン、ペプトン、消化タンパク抽出物（例えば、ＮＺ-アミンまたはＮＺ- アミンＡＳなど）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明は、修 飾生ウイルスの免疫原性を増強し、かつ、防御免疫を誘起するための一回投与を 規定するアジュバントを包含する。 適当なアジュバントの非限定的な例としては、スクアランおよびスクアレン（ または動物起源の他の油）；ブロックコポリマー（例えば、プルロニック（Plu リウム（Corynebacterium）由来のアジュバント（例えば、コリネバクテリウム ・パルブム（Corynebacterium parvum）など）；プロピオニバクテリウム（Prop ion ibacterium）由来のアジュバント（例えば、プロピオンバクテリウム・アクネ（ Propionibacterium acne）など）；ウシ型結核菌（カルメットおよびゲラン桿菌 、すなわちＢＣＧ）；インターロイキン（例えば、インターロイキン２およびイ ンターロイキン１２など）；モノカイン（例えば、インターロイキン１など）； 腫瘍壊死因子；インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロンなど）；組 アルミニウムなど）；リポソーム；イスコム（iscom）アジュバント；ミコバク テリア細胞壁抽出物；合成グリコペプチド（例えば、ムラミルジペプチドまたは 他の誘導体など）；アブリジン（Avridine）；脂質Ａ；硫酸デキストラン；ＤＥ ＡＥ-デキストラン、または、リン酸アルミニウムを添加したＤＥＡＥ-デキスト ラン； 米国特許第5,047,238号）など）；ワクシニアまたは動物ポックスウイルスタン パク；サブウイルス粒子アジュバント（例えば、オルビウイルスなど）；コレラ 毒素；ジメチルジオクレデシルアンモニウムブロミド；またはそれらの混合物が 挙げられる。 好ましいアジュバント混合物の処方は、以下の実施例２に記載されている。 本発明のワクチンは、好ましくは筋肉内または皮下経路によって投与すること ができ、また、それほど好ましくはないが、鼻腔内、腹腔内、または経口経路に よって投与することもできる。 一回量で投与する場合、このワクチンは、約１０^3.0〜約１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀/ ｍｌ、好ましくは１０⁴〜１０⁵ＴＣＩＤ₅₀/ｍｌに相当する量のＢＲＳＶを含有 している必要がある。動物１頭あたり、約１〜５ｍｌ、好ましくは２ｍｌを、筋 肉内、皮下、または腹腔内に投与すればよい。１〜１０ｍｌ、好ましくは２〜５ ｍｌを経口または鼻腔内に投与してもよい。 以下の実施例は、本発明を、その範囲を限定することなく、さらに詳しく説明 することを意図するものである。 実施例１：ＢＲＳＶの増殖および採取 Ａ）保存ウイルスの説明： ＢＲＳＶは、多くの容易に入手可能な供給源から 得ることができる。ある具体例では、ＢＲＳＶ３７５株を用いればよい。このＢ ＲＳＶの病原性株は、アイオワ州立大学（エイメス（Ames）、アイオワ）由来で あった。いかなる適当なＢＲＳＶ株も意図しており、本発明の範囲内に包含され る。同様に、ＢＨＶ-１、ＢＶＤＶ、およびＰＩ-３Ｖは、容易に入手可能なウイ ルスである。病原性の形態で得た場合、これらのウイルスは、公知手段によって 弱毒化し、ワクチン用に適した修飾生ウイルスを与えることができる。また、ウ イルスは、従来法によって死菌とし、ワクチン用に適した不活化ウイルスを与え ることもできる。ワクチン用にウイルスを弱毒化または不活化する方法は、公知 である。修飾生および／または死菌ＢＲＳＶ、ＢＨＶ-１、ＢＶＤＶ、およびＰ Ｉ-３Ｖウイルスワクチンは公知であり、市販品を利用することができる。例え ば、トーマス（Thomas）ら、前掲文献、およびヴェテリナリー・ファーマシュー ティカルズ・アンド・バイオロジカルズ（Veterinary Pharmaceuticals & Biolo gicals）、前掲および付録２，A-31-45を参照されたい。 Ｂ）細胞培養： アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから、ＢＶ Ｄを含まないＭＤＢＫ（ＮＢＬ-１）細胞系を購入した。それは、１０％（ｖ/ｖ ）までのウシ血清、０.５％までのラクトアルブミン加水分解物（ジェイ・アー ル・エイチ（ＪＲＨ）、レネクサ（Lenexa）、ＫＳ）、３０ｍｃｇ/ｍｌまでの ポリミキシンＢ（ファイザー（Phizer）、ＮＹ、ＮＹ）およびネオマイシン（ア ップジョン（Upjohn）、カラマズー（Kalamazoo）、ＭＩ）、および２.５ｍｃｇ /ｍｌまでのアンホテリシンＢ（シグマ・ケミカルズ・カンパニー（Sigma Chemi cal Co.）、セントルイス（St．Louis）、ＭＯ）を補足したＯptiＭＥＭ（ギブ コ（Gibco）、グランド・アイランド（Grand Island）、ＮＹ）中で保持した。 また、細胞増殖を維持する必要があるなら、ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナト リウム、グルコース、Ｌ-グルタミンおよび塩化カルシウムを添加してもよい。 ウイルス増殖用には、ＯptiＭＥＭ、イーグル（Eagle）ＭＥＭ、メディウム（ Medium）１９９または等価な培養液を、２％までのウシ血清、０.５％までのウ シ血清アルブミン、０.５％までのラクトアルブミン加水分解物、３０ｍｃｇ/ ｍｌまでのポリミキシンＢおよびネオマイシン、および２.５ｍｃｇ/ｍｌまでの アンホテリシンＢを補足する。また、細胞増殖を維持する必要があるなら、ピル ビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、Ｌ-グルタミンおよび塩化 カルシウムを添加してもよい。 Ｃ）培養物の接種： １：５〜１：５,０００感染単位/細胞の感染多重度を用 いて、ＭＤＢＫ細胞の個々の準密集培養物にＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、ＰＩ-３Ｖ、 またはＢＨＶ-１Ｖを接種した。これら細胞の増殖培養液を捨て、ウイルス増殖 培養液（前記参照）で置き換えた後、種ウイルスを培養容器に直接添加した。ウ イルス感染した培養物を３６℃で保持した。 ウイルス増殖は、細胞変性効果を顕微鏡で調べるか、あるいは、蛍光抗体染色 法によって測定した。ＢＲＳＶの場合、感染細胞は融合細胞および伸長した紡錘 状形細胞の形成を示したが、それらは実質的に完全細胞シートを含むまで進行し た。ＢＨＶ-１Ｖの場合、感染細胞は、細胞質顆粒化を示した後、感染細胞の円 形化および／または風船様拡大を示す。ＢＶＤＶの場合、感染細胞は、細胞内液 胞を形成し、集合し、細胞を欠く区画領域が残る。ＰＩ-３Ｖ-感染細胞における 細胞変性変化は、ＢＨＶ-１Ｖ-感染細胞におけるものと同様である。 Ｄ）ウイルスの採取： 培養液を滅菌容器に採取した。多数回の採取は、５０ ％の細胞シートが特徴的な細胞病理を示したときに始め、１００％の細胞が影響 を受けるまで続ければよい。ウイルス液は、必要に応じて、遠心または濾過によ って清澄化してもよい。ウイルス液は、−５０℃またそれ以下で保存するか、ま たは凍結乾燥して２〜８℃で保存する。 最終ワクチンを調製するためには、保存ウイルスを単独または組み合わせてア ジュバントと混合する。 液体保存ウイルスを用いる場合には、１９部の保存ウイルスを１部のアジュバ ント（好ましくは、実施例２のアジュバント）と混合する。凍結乾燥保存ウイル スを用いる場合には、生理食塩水溶液中の５％（ｖ/ｖ）希釈溶液を調製する（ １部のアジュバントと１９部の生理食塩水とを混合する）。凍結乾燥保存ウイル スを希釈アジュバントで復元（再水和）して、最終ワクチン組成物を形成する。 最 終処方物には、１：１０,０００の最終濃度までチメリゾールを添加してもよい 。 実施例２：好ましい保存アジュバントの処方 本発明で用いるのに好ましいアジュバントは、以下の処方に従って調製した： ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマー スクアラン（例えば、コダック(Kodak)、ロチェスター(Rochester)、ＮＹ） ４０ｍｌ ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート 緩衝塩溶液 （例えば、Ｄ-ＶＰＡＳ溶液、Ｃａ、Ｍｇ無添加） ９３６.８ｍｌ これらの成分を混合し、安定な塊または乳濁液が形成されるまで均質化する。 均質化の前に、これらの成分または混合物をオートクレーブに付すことができる 。乳濁液は、さらに濾過滅菌してもよい。ホルマリンは、０.２％の最終濃度ま で添加してもよい。チメロサールは、１：１０,０００の最終希釈倍率まで添加 してもよい。 実施例３：修飾生ＢＲＳＶワクチンの増強 この実験用として、２種のＢＲＳＶワクチンを調製したが、その一方は実施例 ２に記載のアジュバント混合物を含有しており、他方はそれを含有していなかっ た。アジュバントを欠くワクチンは２ｍｌあたり２.５２ｌｏｇ感染単位のＢＲ ＳＶを含んでいたが、アジュバントを含有するワクチンは２ｍｌあたり２.９６ ｌｏｇ感染単位および５％（ｖ/ｖ）アジュバントを含んでいた。 ２０頭のウシの各々に、アジュバントを欠くワクチンを２ｍｌ量ずつ投与した が、そのうち１０頭には筋肉内投与し、残りの１０頭には皮下投与した。さらに ５頭のウシに、アジュバントを含有するワクチンを２ｍｌ量ずつ投与した。すべ てのワクチン接種を２１日目に繰り返した。血清試料は２回目のワクチン接種後 ６日目に取得し、これを抗ＢＲＳＶ血清中和抗体の存在について試験した。血清 中和抗体アッセイについては、実施例４に記載する。 この実験の結果によると、アジュバント含有ＢＲＳＶワクチンを接種した５頭 の子ウシのうち４頭が抗ＢＲＳＶ抗体の形跡（セロコンバージョン）を示したが 、アジュバントを欠くＢＲＳＶワクチンを接種した２０頭の動物は全く抗体の形 跡を示さなかった。このことは、実施例２に記載のアジュバントが修飾生ＢＲＳ Ｖワクチンの免疫原性を増強する性質を有することを示している。 実施例４：修飾ＢＲＳＶワクチンの一回量投与 以下のワクチン接種および攻撃実験は、アジュバントと処方した単一免疫化修 飾生ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）がウシの防御免疫を誘起するか否かを決定す るために実施した。第二に、この実験は、修飾生ウシ下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ ）、ウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ-１またはＩＢＲＶ）、およびウシパラ インフルエンザウイルス（ＰＩ３）の同時投与がＢＲＳＶに対する防御免疫の誘 起を妨害するか否かを決定するために設計した。 Ａ）実験的ワクチン： マスター種から５継代目の修飾生ウシＲＳウイルス（ ＢＲＳＶ）を、保存マスター細胞２０継代目のマーディン・ダービー（Madin Da rby）ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞上で増殖させた。簡単に説明すると、ＭＤＢＫ 細胞は、５％ウシ血清、０.５％ＬＡＨ、および３０μｇ/ｍＬゲンタマイシンを 含有する最少必須培養液（ＭＥＭ）を入れた回転ボトルあたり３×１０⁷個の細 胞という密度で、８５０ｃｍ²の回転ボトルに移植した。細胞は、ウイルスを感 染させる前に、３７℃で２日間増殖させた。回転ボトルから培養液を傾瀉し、ボ トルあたり１００ｍＬのウイルス増殖培養液（２％ウシ血清、０.５％ＬＡＨ、 および３０μｇ/ｍＬゲンタマイシンを含有するＭＥＭ）中に１：６００の感染 多重度でウイルスを添加した。感染の７日後に、１００％細胞病理学が示され、 上澄み液を採取した。ウイルスを２５％（ｖ/ｖ）ＳＧＧＫ３安定剤で安定化さ せ、凍結乾燥した。ワクチン接種日に、生理食塩水希釈液中に希釈した５％（ｖ /ｖ）アジュバントで凍結乾燥ウイルスを復元した（実施例２を参照）。復元Ｂ ＲＳＶウイルスは、ＰＩ３、ＢＶＤＶ、およびＢＨＶ-１ウイルスと合わせた。 ワ クチンの各成分の力価は、ワクチン接種日の力価測定を繰り返すことによって測 定した。 Ｂ）用いた実験動物： この実験には合計３０頭のウシを用いた。これらのウ シは、試験動物についてはワクチン接種日に、また、対照については攻撃日に、 血清中和（ＳＮ）抗体価が２未満であることによって示されるように、ＢＲＳＶ に対して感受性である。動物は屋外で飼育したが、３方向が囲われ南側が開口し たシェルターに近づけるようにした。対照は、ワクチンウイルスと接触するのを 避けるために、攻撃前にワクチン接種を受けた動物から隔離して飼育した。完全 な食餌を１日１回与え、干し草および水は自由に供給した。 Ｃ）ワクチン接種： ワクチンを接種すべき動物に、２ｍＬ容量の混合型ワク チンを１回投与した。２０頭の動物にワクチン接種を（１０頭は皮下経路で、１ ０頭は筋肉内経路で）行ったが、残りの１０頭の動物は、ワクチン接種を行わず に、攻撃対照として供した。 Ｄ）実験的攻撃： ワクチン接種の１４日後に、動物を病原性ＢＲＳＶウイル スで攻撃した。最少限の１０^5.7ＴＣＩＤ₅₀の病原性ＢＲＳＶウイルスをエアゾ ール攻撃によって３日間連続で各々の子ウシに投与した。 Ｅ）臨床的観察： ウシは、疾患および発熱（直腸体温）の臨床的徴候につい て、攻撃の２日前から１４日後まで毎日観察した。ウシは、鼻や眼の分泌物、結 膜炎、咳、呼吸困難、食欲不振、およびうつ病を含む（これらに限定されない） ＢＲＳＶ感染の徴候について観察した。直腸体温は、観察期間を通して毎日記録 した。 Ｆ）アッセイ： １．血清中和抗体アッセイ（ＳＮ） １００〜５００のＴＣＩＤ₅₀のＢＲＳＶを用いた変動血清・一定ウイルス中和 試験においては、熱不活化血清の系列希釈物を、等量のウイルス懸濁液と混合し た。血清ウイルス混合物は３７℃で１時間インキュベートし、次いで９６穴マイ クロタイタープレート中のＶＥＲＯ細胞に接種した。ＳＮ抗体価の存在は、細胞 変性効果によって検出されるウイルスの不在によって示された。ＳＮ抗体価の測 定に際して、５０％中和終点は、リード（Reed）およびミュンヒ（Muench）の方 法に従って計算した。 ２．ワクチンの最終希釈物中におけるウイルスの力価測定 ワクチンのＢＲＳＶウイルスカ価は、ワクチン接種日の力価測定を繰り返すこ とによって測定した。簡単に説明すると、混合型ワクチンを、適当な中和抗血清 と合わせた。ワクチンおよび抗血清の混合物は、３７℃で４５〜６０分間インキ ュベートした。ワクチンおよび抗血清の系列希釈物を調製し、ＶＥＲＯ細胞に接 種した。ウイルスの存在は、細胞変性効果の存在によって示され、特異的な免疫 蛍光法（ＦＡ）によって確認した。ウイルスカ価は、リード（Reed）およびミュ ンヒ（Muench）の方法によって、各レプリケートについて計算した。ワクチンの ＢＲＳＶ画分の平均的な力価は、１０^3.4ＴＣＩＤ⁵⁰/投与量であった。 ３．攻撃ウイルスの力価測定 投与したＢＲＳＶ攻撃ウイルスの希釈物を系列希釈し、９６穴マイクロタイタ ープレート中のＭＤＢＫ細胞に接種した。ウイルスの存在は、細胞変性効果の存 在によって示され、ウイルス単離について説明したように、特異的免疫蛍光法に よって確認した。 結果を解釈するために、臨床スコアを以下のように割り当てた： 臨床的徴候 スコア/知見 鼻の分泌物 重度の漿液性 ２ 軽度の粘液膿性 ２ 中度の粘液膿性 ３ 重度の粘液膿性 ４ 眼の分泌物 重度の漿液性 １ 軽度の粘液膿性 ２ 中度の粘液膿性 ３ 重度の粘液膿性 ４ 結膜炎 ２ 咳 ２ 呼吸困難 ２ 食欲不振 １ 鼻粘膜の充血および発赤 １ 発熱（基準より少なくとも１°Ｆ高くなければならない） １０３.５〜１０３.９°Ｆ １ １０４.０〜１０４.９°Ｆ ２ １０５.０〜１０５.９°Ｆ ３ ＞１０６.０°Ｆ ４ 屋外で飼育したウシの場合、軽度の漿液性の鼻や眼の分泌物は正常であると見 なした。発熱は、それが基準体温よりも少なくとも１度高い場合のみを有意であ ると見なした。基準体温は、攻撃前日および攻撃当日の各動物の平均体温として 測定した。 各動物の全臨床スコアを総計した。ワクチン接種動物および対照の臨床スコア を、マン・ホイットニー・ランクド・サム・アナリシス（Mann Whitney Ranked Sum Analysis）によって比較した。 疾患の臨床的徴候は、攻撃の５〜１０日後の対照ウシにおいて観察された（表 １）。すべての対照（１００％）は、複数の日に呼吸器系疾患の徴候を有してい ることが観察された。呼吸器系疾患の特異的徴候としては、重度の漿液性鼻分泌 物（実際に鼻孔から垂れる分泌物）、粘液膿性鼻分泌物、眼の分泌物および咳が 挙げられる。対照子ウシについての平均的な臨床スコアは、３.７であった。 比較すると、ワクチン接種を受けた動物では、呼吸器系の徴候がほとんど見ら れなかった。ワクチン接種を受けた動物のうち、何らかの呼吸器系の徴候を示し たのは、わずか４０％であり、複数の日に臨床的徴候を示したのは、わずか２頭 （１０％）であった。ワクチン接種群の平均的な臨床スコアは１.０であった。 マン・ホイットニー・ランクド・サム・アナリシス（Mann Whitney Ranked Sum Analysis）によって対照と比較すると、ワクチン接種を受けた動物には、臨床的 疾患の統計学的に有意な低減が見られた（ｐ＜０.０５）。 これらのデータは、本発明によるアジュバント添加修飾生ＢＲＳＶウイルスワ クチンの一回量投与が病原性ＢＲＳＶの攻撃に対する防御を与えることを示して いる。このワクチンおよび方法は、他のワクチンをＢＲＳＶワクチンと同時投与 した場合にさえ有効である。 それゆえ、本発明は、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）による感染に対して動物 を免疫するためのワクチン組成物を提供する。このワクチンは、修飾生ＢＲＳウ イルス、アジュバント、および医薬上許容される担体からなり、かかる組合せは 一回投与後にＢＲＳＶ感染からの免疫を与え、かつ、ＢＲＳＶに特異的で、細胞 性免疫および局所（分泌型ＩｇＡ）免疫から選択される免疫応答を誘起する。 細胞性免疫としては、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞および遅延型過敏反応Ｔ 細胞の刺激、ならびに、マクロファージ、単球および他のリンホカインやインタ ーフェロン産生の刺激が挙げられる。細胞性免疫の存在は、従来のインビトロお よびインビボ・アッセイで評価し得る。分泌型ＩｇＡなどの局所免疫は、１〜２ またはそれより大きい血清中和抗体価を示す従来のＥＬＩＳＡまたはＩＦＡアッ セイによって評価することができる。本発明によれば、その結果生じる細胞性免 疫または局所免疫は、ＢＲＳＶに特異的であるか、あるいは、それと関連してい る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）による感染に対して動物を免疫するための ワクチン組成物であって、 該組成物が一回投与後にＢＲＳＶ感染からの免疫を与え、かつ、ＢＲＳＶに特 異的で、細胞性免疫および局所（分泌型ＩｇＡ）免疫から選択される免疫応答を 誘起するように、修飾生ＢＲＳウイルス、アジュバント、および医薬上許容され る担体からなるワクチン組成物。 ２．アジュバントがポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポ リマーおよび不飽和テルペン炭化水素からなる請求項１記載の組成物。 ３．不飽和テルペン炭化水素がスクアレンおよびスクアランの一方であり、コ ポリマーが平均分子量約３２５０〜４０００のポリオキシプロピレン成分を有し 、ポリオキシエチレン成分が全分子の約１０〜２０％を構成する請求項２記載の 組成物。 ４．コポリマーが約０.０１〜１％（ｖ/ｖ）の最終濃度で存在し、炭化水素成 分が約０.０２〜２％（ｖ/ｖ）の最終濃度で存在する請求項２記載の組成物。 ５．アジュバントが付加的に界面活性剤を含有する請求項２記載の組成物。 ６．アジュバントがまた約０.００１５〜０.２０％（ｖ/ｖ）の最終濃度で存 在する界面活性剤を含有する請求項４記載の組成物。 ７．界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである請求項 ５または６記載の組成物。 ８．炭化水素がスクアレンおよびスクアランの一方であり、コポリマーが平均 分子量約３２５０〜４０００のポリオキシプロピレン成分を有し、ポリオキシエ チレン成分が全分子の約１０〜２０％を構成する請求項４記載の組成物。 ９．さらにウシ鼻気管炎ウイルス（ＢＨＶ-ＩＶ）、ウシウイルス性下痢症ウ イルス（ＢＶＤＶ）、およびパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ-３Ｖ）を 含有する請求項１〜９のいずれか記載の組成物。 １０．ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）による感染に対して動物を免疫するため のワクチン組成物であって、 該組成物が一回投与後にＢＲＳＶ感染からの免疫を与えるように、修飾生ＢＲ Ｓウイルス、医薬上許容される担体、および、ポリオキシプロピレン-ポリオキ シエチレンブロックコポリマーおよび不飽和テルペン炭化水素からなるアジュバ ントからなるワクチン組成物。 １１．炭化水素がスクアレンおよびスクアランの一方であり、コポリマーが平 均分子量約３２５０〜４０００のポリオキシプロピレン成分を有し、ポリオキシ エチレン成分が全分子の約１０〜２０％を構成する請求項１０記載の組成物。 １２．ブロックコポリマーが約０.０１〜１％（ｖ/ｖ）の最終濃度で存在し、 有機成分が約０.０２〜２％（ｖ/ｖ）の最終濃度で存在する請求項２記載の組成 物。 １３．アジュバントが付加的に約０.００１５〜０.２０％（ｖ/ｖ）の最終濃 度で存在する界面活性剤を含有する請求項１２記載の組成物。 １４．界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである請求 項１３記載の組成物。 １５．さらにウシ鼻気管炎ウイルス（ＢＨＶ-ＩＶ）、ウシウイルス性下痢症 ウイルス（ＢＶＤＶ）、およびパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ-３Ｖ） からなる群から選択される少なくとも１種の修飾生ウイルスを含有する請求項１ ０〜１４のいずれか記載の組成物。 １６．ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）によって引き起こされる疾患に対して動 物を防御する方法であって、 該組成物が一回投与後にＢＲＳＶ感染からの免疫を与え、かつ、ＢＲＳＶに 特異的で、細胞性免疫および局所（分泌型ＩｇＡ）免疫から選択される免疫応答 を誘起するように、修飾生ＢＲＳウイルス、アジュバント、および医薬上許容さ れる担体からなる免疫原性医薬組成物を該動物に投与する工程からなる方法。 １７．前記ウイルスが１ミリリットルあたり約１０³〜約１０⁶感染単位の範囲 内で存在する請求項１６記載の方法。 １８．前記投与工程が、筋肉内、皮下、腹腔内、経口、および鼻腔内投与の１ つからなる請求項１６記載の方法。 １９．アジュバントが最終濃度約０.０１〜１％（ｖ/ｖ）のポリオキシプロピ レン-ポリオキシエチレンブロックコポリマーおよび最終濃度約０.０２〜２％（ ｖ/ｖ）の不飽和テルペン炭化水素からなる請求項１６記載の方法。 ２０．アジュバントが付加的に最終濃度約０.００１５〜０.２０％（ｖ/ｖ） の非イオン性界面活性剤を含有する請求項１９記載の方法。 ２１．炭化水素がスクアレンおよびスクアランの一方であり、界面活性剤がポ リオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり、コポリマーが平均分子量約 ３２５０〜４０００のポリオキシプロピレン成分を有し、ポリオキシエチレン成 分が全分子の約１０〜２０％を構成する請求項２０記載の方法。 ２２．さらにウシ鼻気管炎ウイルス（ＢＨＶ-ＩＶ）、ウシウイルス性下痢症 ウイルス（ＢＶＤＶ）、およびパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ-３Ｖ） の同時投与を包含する請求項１６〜２１のいずれか記載の方法。