ES2287997T3 - Vacuna viva modificada contra el brsv mejorada. - Google Patents
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Abstract
La invención proporciona una composición de vacuna BRSV mejorada, que proporciona ventajosamente inmunidad sobre una infección después de una única administración. La composición comprende un virus BRS vivo modificado y un adyuvante que combinados proporcionan inmunidad sobre una infección de BRSV después de una única administración y provoca una respuesta inmune específica para BRSV, incluyendo inmunidad mediada por células e inmunidad local (secretora de IgA). En realizaciones preferidas, el virus BRS es de la cepa 375 y el adyuvante comprende un hidrocarburo de turpina insaturado, preferiblemente escualeno o escualeno y un copolímero polioxipropileno-polioxietileno de bloque, más preferiblemente uno en el que el copolímero tenga un componente de polioxipropileno (POP) con un peso molecular medio de entre aproximadamente 3250 y 4000 y el componente de polioxietilno (POE) comprende entre 10 y 20% del total de la molécula. El adyuvante puede incluir opcionalmente un tensioactivo, preferiblemente un monooleato de polioxietilenosorbitano.
Description
Vacuna viva modificada contra el BRSV,
mejorada.
La presente invención se refiere a métodos
mejorados para inducir inmunidad protectora frente al virus
sincítico respiratorio bovino (BRSV), específicamente empleando una
vacuna viva modificada, adecuada para administrar a animales
receptores en una sola dosis.
Actualmente el virus sincítico respiratorio
bovino está reconocido como un agente etiológico importante en el
complejo de la enfermedad respiratoria bovina (BRDC). La enfermedad
se caracteriza por respiración rápida, tos, pérdida de apetito,
secreción ocular y nasal, y temperaturas elevadas. En un ataque
agudo, la muerte se puede producir dentro de las 48 horas de la
iniciación de los síntomas.
El BRSV infecta a ganado de todas las edades,
incluidas las terneras lactantes. El BRSV está considerado como el
patógeno vírico más común en la neumonía enzoótica en las terneras,
y también se ha asociado al enfisema pulmonar entre terneras recién
destetadas. Así pues, existe una necesidad de una profilaxis eficaz
contra este virus en el ganado y en las granjas lecheras.
El establecer una inmunidad protectora frente al
BRSV es problemático. Como en algunas otras enfermedades mediadas
por virus, los niveles de anticuerpos en suero contra el BRSV no
están necesariamente correlacionados con una protección frente a la
enfermedad. Este fenómeno puede reflejar un papel para IgA
localmente producidas, dirigidas contra el BRSV (Kimman et
al., J. Clin. Microbiol., 25: 1097-1106, 1987),
y/o un requisito de la inmunidad mediada por células para
establecer una defensa eficaz contra este virus. El establecer una
inmunidad protectora en terneras lactantes presenta obstáculos
adicionales, puesto que los anticuerpos maternos frente al BRSV
pueden debilitar el inmunógeno inyectado y neutralizar eficazmente
la vacuna. Finalmente, la inconveniencia y el gasto de vacunaciones
múltiples hacen que sea deseable una vacuna en una sola dosis. Así
pues, en el estado de la técnica existe una necesidad de
formulaciones de una vacuna contra el BRSV, en una sola dosis, que
produzcan una respuesta inmunitaria enérgica y multifacética.
El régimen de administración estándar para las
vacunas contra el BRSV, del estado de la técnica anterior, es de
dos dosis (Stott et al., J. Hyg. Camb., 93:
251-261, 1984; Thomas et al.,
Agri-Practice, 5: 1986; y Syrvud et
al., Vet. Med., 83: 429-430, 1988;
Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals, 8ª Edición, 1993/94,
págs. 484, 740-741, 956-960,
982-983). Tal como se muestra en Kucera et
al. (Agri-Practice, Vet. Med., Vol. 78, octubre
de 1983, págs. 1599-1604, 1983), una sola vacunación
experimental contra el BRSV inducía niveles relativamente bajos del
título de anticuerpos de neutralización del suero (SN) frente al
BRSV, mientras que dos dosis de la vacuna producían títulos de
anticuerpos SN de 1:10 a 1:320. Además de esto, en los rebaños
aparentemente expuestos al BRSV durante las pruebas de campo,
aproximadamente el 48% de los animales no vacunados requirieron
tratamiento para la enfermedad respiratoria, en comparación con el
27% y el 21% entre los vacunados con una dosis única y con una
dosis doble, respectivamente. Sin embargo, no se demostró
concluyentemente que el agente causante de la enfermedad
respiratoria en las pruebas de campo fuera el BRSV. Asimismo, se
advirtió que una vacuna en una sola dosis no se mostró muy
inmunogénica. Evaluaciones posteriores llevaron a la conclusión de
que serían esenciales dos dosis de esta vacuna para obtener una
buena protección (Bovine Vet. Forum 1, No. 2, págs.
2-16, 1986; Syvrud, et al., Vet. Med.,
429-430, 1988).
Vet. Immunol. Immunopathol., vol, 22, nº 2, 1989
NL, páginas 145-60, Kimman et al describe el
cebado para respuestas de memoria de anticuerpo sistémicas y
locales al virus sincítico respiratorio bovino y el efecto de la
cantidad de virus, replicación del virus, ruta de administración y
anticuerpos maternos. J. Clin. Microbiol. vol. 25, nº 6, 1987,
páginas 1.097-1.106, Kimman et al describe la
respuesta de anticuerpo sistémica y local a la infección y
reinfección por virus sincítico respiratorio bovino en terneras con
y sin anticuerpos maternos. Vet. Q. vol. 13, nº 1, 1991 NL, páginas
47-59, Baker, da a conocer los mecanismos
inmunopatológicos del virus sincítico respiratorio bovino y humano.
Semin. Immunol. vol. 2, nº 5, 1990 USA, páginas
369-374, Allison et al da a conocer
formulaciones de adyuvante y su modo de acción.
La solicitud de patente europea nº 129.923
(publicada el 1 de febrero de 1985 y concedida como patente el 9 de
julio de 1988) describe un método para preparar una nueva vacuna
BRSV viva; dicho método implica disolver la vacuna viva en una
vacuna inactivada que contiene uno o más antígenos (particularmente
virus de la influenza inactivados) formulada en forma de una
emulsión aceite-en-agua. Se obtuvo
una respuesta serológica en animales jóvenes que todavía tenían
inmunidad materna. La solicitud también describe una preparación
viva modificada que incluye el BRSV y un adyuvante. Sin embargo, no
se aportó ningún dato sobre la eficacia protectora de ninguna
vacuna BRSV frente a un reto con BRSV.
Un objeto de la invención es proporcionar una
vacuna eficaz contra el BRSV que cree una inmunidad protectora y
evite la enfermedad causada por este virus.
\newpage
Un objeto más de la invención es proporcionar un
adyuvante adecuado para utilizar en una vacuna BRSV, donde el
adyuvante aumenta la inmunogenicidad del virus de manera que cree
una inmunidad protectora después de una sola dosis de la vacuna.
La invención comprende las utilizaciones tal
como se indica en las reivindicaciones adjuntas a la misma.
La invención se refiere asimismo a una
composición para aumentar la respuesta inmunitaria, que comprende un
copolímero de bloque, tal como un copolímero de bloque de
polioxipropileno/polioxietileno (POP/POE), preferentemente
PLURONIC® L121 (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4.772.466),
y un componente orgánico, tal como un aceite metabolizable como,
por ejemplo, un hidrocarburo terpénico no saturado, preferentemente
el escualano (2,6,10,15,19,23-hexametiltetracosano)
o el escualeno. La composición también puede incluir un detergente
no-iónico o tensioactivo, preferentemente un
monooleato de polioxietilensorbitano tal como un detergente Tween,
más preferentemente el Tween®-80, esto es el monooleato de
polioxietilen(20)sorbitano.
En esta mezcla madre de adyuvantes, el
copolímero de bloque, el aceite orgánico y el tensioactivo pueden
estar presentes en cantidades que oscilan entre alrededor de 10 y
alrededor de 40 ml/l, de alrededor de 20 a alrededor de 80 ml/l y
de alrededor de 1,5 a alrededor de 6,5 ml/l, respectivamente. En una
realización preferida del adyuvante madre, el componente orgánico
es el escualano presente en una cantidad de aproximadamente 40 ml/l,
el tensioactivo es el monooleato de polioxietilensorbitano
(Tween®-80) presente en una cantidad de aproximadamente 3,2 ml/l y
el copolímero de bloque POP/POE es el Pluronic® L121 presente en una
cantidad de aproximadamente 20 ml/l. El Pluronic® L121 es un
copolímero líquido a 15-40ºC, en el que el
componente de polioxipropileno (POP) tiene un pero molecular de
3250 a 4000 y el componente de polioxietileno (POE) comprende
aproximadamente el 10-20%, preferentemente el 10%,
de la molécula total.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere una composición inmunogénica para inmunizar a un animal
frente a la infección por el virus sincítico respiratorio bovino
(BRSV), que comprende un virus BRS vivo modificado combinado con el
adyuvante anterior y un estabilizante, vehículo o diluyente,
farmacéuticamente aceptable. El adyuvante está presente en esta
composición de vacuna a una concentración final de alrededor del
1-25% (v/v), preferentemente al 5% (v/v). La
composición también puede incluir otros virus, tales como el virus
de la rinotraqueítis bovina infecciona (IBRV), de la diarrea vírica
bovina (BVDV) y de la parinfluenza 3 (PI-3V), y se
puede administrar por las vías intramuscular o subcutánea.
En todavía otro aspecto, se describe un método
para proteger a un animal frente a la enfermedad causada por el
virus sincítico respiratorio bovino, administrando una sola dosis de
la vacuna anterior, que comprende BRSV vivo modificado y un
adyuvante.
Tal como se utiliza aquí, una "vacuna viva
modificada" es una vacuna que comprende un virus que ha sido
alterado (típicamente por pases en células de un cultivo de
tejidos), con el fin de atenuar su capacidad de provocar la
enfermedad, pero que mantiene su capacidad de proteger frente a la
enfermedad o la infección, cuando se administra a animales.
"Adyuvante" significa una composición
constituida por una o más substancias que aumenta(n) la
inmunogenicidad y eficacia del BRSV cuando se combina con BRSV en
una composición de vacuna.
Una "unidad infecciosa" de BRSV se define
como una TCID_{50}, o la cantidad de virus requerida para infectar
o matar el 50% de las células de un cultivo de tejidos.
La presente invención se refiere asimismo a
vacunas contra el BRSV que resultan adecuadas para la administración
en forma de una dosis única. Las vacunas son de la variedad de
virus vivo modificado. Ello proporciona la ventaja de preservar la
inmunogenicidad y/o la eficacia del virus al tiempo que reduciendo
su virulencia.
La vacuna se puede preparar a partir de cultivos
víricos recién cosechados, por métodos que son estándar en el
estado de la técnica (véase el Ejemplo 1, más adelante). Esto es, el
virus se puede propagar en células de un cultivo de tejidos, tales
como fibroblastos diploides humanos, o, preferentemente, células
MDBK (riñón bovino Madin-Darby) u otras células
bovinas. El crecimiento del virus se monitoriza por técnicas
estándar (observación del efecto citopático, inmunofluorescencia u
otros ensayos basados en anticuerpos), y se recolecta cuando se ha
conseguido un título vírico lo suficientemente elevado. Las
soluciones madre del virus se pueden concentrar más, o bien
liofilizar por métodos convencionales, antes de la inclusión en la
formulación de la vacuna. Se pueden emplear otros métodos, tales
como los descritos en Thomas et al.,
Agri-Practice, Vol. 7 No. 5, págs.
26-30.
Las vacunas comprenden el virus vivo modificado
combinado con uno o más estabilizantes, vehículos o adyuvantes,
farmacéuticamente aceptables. Vehículos adecuados para utilizar
incluyen solución salina, solución salina tamponada con fosfatos,
medio esencial mínimo (MEM), o MEM con tampón HEPES. Los
estabilizantes incluyen, aunque no se limitan a, sacarosa,
gelatina, peptona, extractos proteínicos digeridos tales como la
NZ-amina o la NZ-amina AS. En
particular, la presente invención se refiere a un adyuvante que
acrecienta la inmunogenicidad del virus vivo modificado y hace que
una sola administración cree una inmunidad protectora.
Los adyuvantes adecuados incluyen el escualano y
el escualeno (u otros aceites de origen animal); copolímeros de
bloque tales como el Pluronic® (L121); saponina; detergentes tales
como el Tween®-80; Quil® A; aceites minerales tales como el
Drakeol® o el Markol®; aceites vegetales tales como el aceite de
cacahuete; adyuvantes derivados del Corynebacterium tales
como el Corynebacterium parvum: adyuvantes derivados del
Propionobacterium tales como el Propionobacterium
acne; el Mycobacterium bovis (bacilo de Calmette y
Guerin, o BCG); interleuquinas tales como la interleuquina 2 y la
interleuquina 12; monoquinas tales como la Interleuquina 1; factor
de la necrosis tumoral; interferones tales como el
gamma-interferón; combinaciones tales como saponina
- hidróxido de aluminio o Quil®-A - hidróxido de aluminio;
liposomas; adyuvante iscom; extracto de la pared celular de
micobacterias; glucopéptidos sintéticos tales como los dipéptidos de
muramilo u otros derivados; Avridina; Lípido A; sulfato de
dextrano; DEAE - dextrano o DEAE - dextrano con fosfato de aluminio;
un carboxipolimetileno, tal como el Carbopol®; EMA y emulsiones de
copolímeros acrílicos tales como el Neocryl® A640 (como se describe
en por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5.047.238); vacunas o
proteínas de poxvirus animales; adyuvantes basados en partículas
subvíricas tales como los orbivirus; toxina del cólera; bromuro de
dimetildiocledecilamonio; o mezclas de los mismos.
La formulación de una mezcla de adyuvantes
preferida se describe en el Ejemplo 2, más adelante.
La vacuna de la presente invención se puede
administrar, preferentemente, por las vías intramuscular o
subcutánea o bien, menos preferentemente, por las vías intranasal,
intraperitoneal u oral.
Para la administración en una dosis única, la
vacuna tendría que contener una cantidad de BRSV correspondiente a
desde alrededor de 10^{3,0} hasta alrededor de 10^{6,0}
TCID_{50}/ml, preferentemente desde 10^{4} hasta 10^{5}
TCID_{50}/ml. Por animal, se pueden administrar alrededor de 1 a 5
ml, preferentemente 2 ml, por vía intramuscular, subcutánea o
intraperitoneal. Por las vías oral o intranasal se pueden
administrar de 1 a 10 ml, preferentemente de 2 a 5 ml.
Los ejemplos que se aportan a continuación
pretenden ilustrar con mayor detalle la invención, sin limitar su
alcance.
A) Descripción de los stocks de virus:
El BRSV se puede obtener a partir de cualquier número de fuentes
fácilmente asequibles. En una realización, se puede utilizar la cepa
375 del BRSV. Esta cepa virulenta del BRSV tenía su origen en la
Iowa State University, Ames Iowa. En la invención se contempla y se
incluye cualquier cepa adecuada de BRSV. Análogamente, los
BHV-1, BVDV y PI-3V son virus
fácilmente asequibles. Cuando se obtienen en forma virulenta, estos
virus se pueden atenuar, por medios conocidos, para proporcionar
virus vivos modificados, adecuados para utilizar en vacunas. Los
virus también se pueden matar por métodos convencionales para
proporcionar virus inactivados adecuados para el uso en vacunas.
Los métodos de atenuar o inactivar virus para su uso en vacunas son
bien conocidos. Vacunas para los virus BRSV, BHV-1,
BVDV y PI-3V vivos modificados y/o muertos son
conocidas y comercialmente asequibles. Véase, por ejemplo, Thomas
et al., ut supra y Veterinary Pharmaceuticals &
Biologicals, ut supra y Apéndice 2,
A-31-45.
B) Cultivo de células: La línea de
células MDBK (NBL-1), exenta de BVD, se adquirió en
la American Type Culture Collection. Dichas células se mantuvieron
en medio OptiMEM (Gibco, Grand Island, NY), complementado con hasta
el 10% (v/v) de suero bovino, hasta el 0,5% de hidrolizado de
lactalbúmina (JHR, Lenexa, KS), hasta 30 mcg/ml de polimixina B
(Phizer, NY, NY) y neomicina (Upjohn, Kalamazoo, MI) y hasta 2,5
mcg/ml de anfotericina B (Sigma Chemical Co., St. Louis MO).
También se pueden añadir piruvato sódico, bicarbonato sódico,
glucosa, L-glutamina y cloruro cálcico, según se
requiera, para mantener el crecimiento de las células.
Para la propagación del virus, el medio OptiMEM,
el medio MEM de Eagle, el medio 199, o un medio equivalente, se
complementa con hasta un 2% de suero bovino, hasta un 0,5% de
albúmina de suero bovino, hasta un 0,5% de un hidrolizado de
lactalbúmina, hasta 30 mcg/ml de polimixina B y neomicina, y hasta
2,5 mcg/ml de anfotericina B. También se pueden añadir piruvato
sódico, bicarbonato sódico, glucosa, L-glutamina y
cloruro cálcico, según se requiera, para mantener el crecimiento de
las células.
C) Inoculación de los cultivos:
Cultivos subconfluentes individuales de células MDBK se inocularon
con BRSV, BVDV, PI-3V o BHV-1V
utilizando una multiplicidad de infección de unidades infecciosas
1:5 a 1:5.000 por célula. El medio de crecimiento de las células se
desechó y se sustituyó por el medio de propagación para virus (véase
más arriba), tras lo cual el virus de siembra se añadió
directamente al recipiente de cultivo. Los cultivos infectados con
virus se mantuvieron a 36ºC.
El crecimiento vírico se determinó por examen
microscópico del efecto citopático o por tinción fluorescente de
anticuerpos. Para el BRSV, las células infectadas mostraban la
formación de sincitios y de células fusiformes alargadas, que
progresaban hasta que esencialmente se veía implicada toda la
envoltura celular. Para el BHV-1V, las células
infectadas presentaban una granulación citoplásmica seguida por un
redondeo y/o un hinchamiento de las células infectadas. Para el
BVDV, las células infectadas forman vacuolas intracelulares, se
vuelven redondas y dejan zonas circunscritas despojadas de células.
Los cambios citopáticos en las células infectadas con
PI-3V son similares a los observados en las células
infectadas con BHV-1V.
D) Recolecta de virus: Los fluidos de
cultivo se recolectaron en recipientes estériles. Se pueden empezar
recolectas múltiples cuando el 50% de la envuelta de las células
muestra una citopatología característica, y continuar hasta que el
100% de las células se ven afectadas. Los fluidos víricos se pueden
o no clarificar por centrifugación o filtración. Los fluidos
víricos se conservan a -50ºC o menos, o se liofilizan y se conservan
a entre 2 y 8ºC.
Para la preparación de una vacuna final, los
stocks víricos, ya sean solos o en combinación, se mezclan con
adyuvante.
Cuando se utilizan los stocks víricos líquidos,
19 partes de stock vírico se mezclan con una parte de adyuvante,
preferentemente con el adyuvante del Ejemplo 2. Cuando se utilizan
stocks víricos liofilizados, se prepara una disolución diluida, al
5% (v/v), de adyuvante en solución salina (mezclar 1 parte de
adyuvante con 19 partes de solución salina). El stock vírico
liofilizado se reconstituye (rehidrata) con el adyuvante diluido
para formar la composición de vacuna final. Se puede añadir
timerosal a la formulación final hasta una concentración final
de
1:10.000.
1:10.000.
Un adyuvante preferido para utilizar en la
presente invención se preparó de acuerdo con la siguiente
formulación:
| Copolímero de bloque de polioxipropileno/polioxietileno (por ejemplo, Pluronic® | |
| L121, BASF, Parsippany, NJ) | 20 ml |
| Escualeno (por ejemplo, Kodak, Rochester, NY) | 40 ml |
| Monooleato de polioxietilensorbitano (por ejemplo, Tween®-80, Sigma Chemical, | |
| St. Louis, MO) | 3,2 ml |
| Solución salina tamponada (por ejemplo, solución D-V PAS, exenta de Ca y Mg) | 936,8 ml |
Los ingredientes se mezclan y se homogeneizan
hasta que se forma una masa estable o una emulsión. Antes de la
homogeneización, los ingredientes o la mezcla se pueden esterilizar
en un autoclave. La emulsión se puede esterilizar adicionalmente
por filtración. Se puede añadir formalina hasta una concentración
final del 0,2%. El timerosal se puede añadir hasta una dilución
final de 1:10.000.
Para este estudio, se prepararon dos vacunas
BRSV, una con y una sin la mezcla adyuvante descrita en el Ejemplo
2. La vacuna carente de adyuvante contenía 2,52 log unidades
infecciosas por 2 ml, mientras que la vacuna que comprendía
adyuvante contenía 2,96 log unidades infecciosas por 2 ml y un 5%
(v/v) de adyuvante.
Cada una de las veinte terneras recibieron una
dosis de 2 ml de vacuna carente de adyuvante, diez por vía
intramuscular y diez por vía subcutánea. Cinco terneras adicionales
recibieron una dosis de 2 ml de vacuna que contenía adyuvante.
Todas las vacunaciones se repitieron a los 21 días. Se obtuvieron
mezclas de suero el sexto día después de la vacunación, y se
ensayaron para determinar la presencia de anticuerpos de
neutralización del suero anti-BRSV. El ensayo de
anticuerpos de neutralización del suero se describe en el Ejemplo
4.
Los resultados de este estudio indican que 4 de
las 5 terneras inoculadas con la vacuna BRSV que contenía
adyuvantes presentaban evidencia de anticuerpos
anti-BRSV (seroconvensión), mientras que ninguno de
los veinte animales inoculados con vacuna BRSV carente de adyuvante
mostraron evidencia de anticuerpos. Ello indica que el adyuvante
descrito en el Ejemplo 2 tiene la propiedad de intensificar la
inmunogenicidad de las vacunas BRSV vivas modi-
ficadas.
ficadas.
Se llevaron a cabo la siguiente vacunación y el
siguiente estudio de reto a fin de determinar si una sola
inmunización con virus sincítico respiratorio bovino (BRSV) vivo
modificado, formulado con un adyuvante, induciría inmunidad
protectora en las terneras. En segundo lugar, el estudio se diseñó
para determinar si la administración concurrente de virus de la
diarrea vírica bovina (BVDV) modificado, herpes virus bovino del
tipo 1 (BHV-1 o IBRV) y virus de la parainfluenza
bovina (PI3) interfería con la inmunidad protectora frente al
BRSV.
A) Vacunas experimentales: Virus
sincítico respiratorio bovino (BRSV) vivo modificado por cinco pases
después de la siembra madre se hizo crecer sobre células de riñón
bovino Madin Darby (MDBK) en el pase 20 del stock de células madre.
En resumen, células MDBK se plantaron en botellas cilíndricas, de
850 cm^{3} a una densidad de 3 x 10^{7} células por botella en
medio esencial mínimo (MEM) que contenía un 5% de suero bovino, un
0,5% de LAH y 30 \mug/ml de gentamicina. Las células se dejaron
crecer a 37ºC durante 2 días antes de proceder a la infección con
el virus. El medio se decantó de la botella cilíndrica y el virus se
añadió a una multiplicidad de infección de 1:600 en 100 ml de medio
de propagación para el virus, por botella (MEM que contenía un 2%
de suero bovino, un 0,5% de LAH y 30 \mug/ml de gentamicina).
Siete días después de la infección, se hallaba presente un 100% de
citopatología y se recolectaron los fluidos sobrenadantes. El virus
se estabilizó con un 25% (v/v) de estabilizante SGGK3 y se
liofilizó. El día de la vacunación, el virus liofilizado se
reconstituyó con adyuvante diluido al 5% (v/v) en diluyente salino
(Véase el Ejemplo 2). El virus BRSV reconstituido se combinó con
virus PI3, BVDV y BHV-1. El título de cada uno de
los componentes de la vacuna se determinó por valoración por
triplicado en día de la vacunación.
B) Animales experimentales utilizados:
Para este estudio se utilizó un total de 30 terneras. Estas terneras
eran susceptibles al BRSV, tal como indicó un título de anticuerpos
neutralizantes del suero (SN) de <2 el día de la vacunación para
los animales sometidos a ensayo y el día del reto para los
controles. Los animales se alojaron en el exterior con acceso a un
recinto resguardado por tres lados, abierto hacia el sur. Los
controles se alojaron separadamente de los vacunados antes del reto
a fin de evitar una exposición al virus de la vacuna. Se suministró
una ración completa una vez al día, y el heno y el agua se
suministraron ad libitum.
C) Vacunación: A cada uno o de los
animales vacunados se administró un volumen de 2 ml de la
combinación vacunadora. Se vacunaron veinte (20) animales (diez por
vía subcutánea y diez por vía intramuscular) y los diez animales
restantes no se vacunaron y sirvieron de controles del reto.
D) Reto experimental: Los animales se
retaron con virus BRSV virulento catorce días después de la
vacunación. Se administró un mínimo de 10^{5,7} TCID_{50} de
virus BRSV virulentos a cada una de las terneras, por medio de un
reto con un aerosol durante tres días consecutivos.
E) Observaciones clínicas: Las terneras
se observaron diariamente desde el día -2 hasta el día 14, tras el
reto, para determinar los síntomas clínicos de la enfermedad y la
presencia de fiebre (temperatura rectal). Las terneras se
observaron para determinar signos de infección por BRSV incluidos,
pero no limitados a, secreción nasal y ocular, conjuntivitis, tos,
disnea, anorexia, y depresión. La temperatura rectal se registró
diariamente a lo largo de todo el período de observación.
Diluciones seriadas de suero inactivado por el
calor se mezclaron con volúmenes iguales de suspensiones de virus,
en un test cambiante de neutralización de virus en suero constante,
utilizando de 100 a 500 TCID_{50} de BRSV. La mezcla de virus en
suero se incubó a 37ºC durante 1 hora y luego se inoculó sobre
células VERO en placas de microvaloración de 96 pocillos. La
presencia de títulos de anticuerpos SN venía indicada por la
ausencia de virus, detectada por el efecto citopático. Para la
determinación de títulos de anticuerpos SN, se calcularon los
puntos finales de neutralización al 50% de acuerdo con el método de
Reed y Muench.
El título de virus BRSV en la vacuna se
determinó por valoración reiterada el día de la vacunación. En
resumen, la vacuna combinada se juntó con los antisueros
neutralizantes apropiados. La vacuna y la mezcla de antisueros se
incubaron a 37ºC por espacio de 45 a 60 minutos. Se hicieron
diluciones seriadas de la vacuna y de los antisueros y se
inocularon en células VERO. La presencia de virus vino indicada por
la presencia de un efecto citopático, y se confirmó por
inmunofluorescencia específica (FA). Se cálculo el título vírico
para cada uno de los replicados por el método de Reed y Muench. El
título medio de la fracción BRSV de la vacuna era de 10^{3,4}
TCID_{50} por dosis.
La dilución del virus BRSV de reto administrada
se diluyó seriadamente y se inoculó en células MDBK en placas de
microvaloración de 96 pocillos. La presencia de virus venía indicada
por la aparición de un efecto citopático, y se confirmó por
inmunofluorescencia específica, tal como se ha descrito para el
aislamiento del virus.
\newpage
Para interpretar los resultados, las
puntuaciones clínicas se asignaron de la manera siguiente:
Una secreción nasal y ocular serosa suave se
consideró normal para las terneras alojadas en el exterior. La
fiebre se consideró significativa sólo si era por lo menos de un
grado por encima de la temperatura corporal base. La temperatura
corporal base se determinó como la temperatura corporal media para
cada uno de los animales el día antes y el día del reto.
Se sumaron las puntuaciones clínicas para cada
uno de los animales. Las apreciaciones clínicas de los animales
vacunados y de los animales control se compararon por análisis de
sumas ordenado por rangos de Mann Whitney.
Los signos clínicos de la enfermedad se
observaron en las terneras control desde el día 5 al día 10 después
del reto (Tabla 1). Todos los controles (100%) se observaron para
determinar si presentaban signos de enfermedad respiratoria durante
múltiples días. Los signos específicos de una enfermedad
respiratoria incluían: una secreción nasal serosa grave (una
secreción que realmente destilaba de la ventana de la nariz), una
secreción nasal mucopurulenta, una secreción ocular y tos. La
puntuación clínica media para las terneras control fue de 3,7.
Comparativamente, los síntomas respiratorios
eran mucho menos frecuentes en los animales vacunados. Sólo el 40%
de los animales vacunados presentaban algún síntoma de enfermedad
respiratoria y sólo dos (10%) tenían signos clínicos en múltiples
días. La puntuación clínica para el grupo vacunado era de 1,0. El
análisis de sumas ordenado por rangos de Mann Whitney puso de
manifiesto una reducción estadísticamente significativa de la
patología clínica en los animales vacunados, en comparación con los
controles (p<0,05).
Estos datos muestran que una administración a
una dosis única de la vacuna contra el virus BRSV, viva, modificada
con adyuvantes, de acuerdo con la presente invención, proporciona
protección frente a un reto con BRSV virulentos. Esta vacuna y el
método son eficaces, incluso cuando con la vacuna contra el BRSV se
coadministran otras vacunas.
\newpage
Así pues, la invención se refiere a una
composición vacunadora para inmunizar un animal contra la infección
por el virus sincítico respiratorio bovino (BRSV). La vacuna
comprende un virus BRS vivo modificado, un adyuvante, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable, de modo que la combinación proporciona
inmunidad frente a la infección por BRSV después de una
administración única, y crea una respuesta inmunológica específica
al BRSV que se selecciona entre una inmunidad mediada por las
células y una inmunidad local (IgA secretoria).
La inmunidad mediada por células incluye la
estimulación de las células T adyuvantes, las células T asesinas y
las células T de hipersensibilidad retardada, así como la
estimulación de macrófagos, monocitos y la producción de otras
linfoquinas y de interferón. La presencia de una inmunidad mediada
por células se puede determinar por ensayos in vitro e in
vivo convencionales. La inmunidad local, tal como la IgA
secretoria, se puede determinar por ensayos ELISA o IFA
convencionales que muestran un título de anticuerpos neutralizantes
del suero de 1-2 o mayor. De acuerdo con la
invención, la inmunidad mediada por células o la inmunidad local,
resultante, es específica del, o van asociadas al, BRSV.
Claims (5)
1. Utilización de un virus sincítico
respiratorio bovino vivo modificado y uno o más adyuvantes en
combinación con uno o más adyuvantes y vehículos estabilizadores
farmacéuticamente aceptables, siendo dichos adyuvantes
seleccionados de entre adyuvantes que proporcionan una respuesta
inmunitaria multifacética al BRSV vivo modificado, siendo dichos
adyuvantes seleccionados de entre los que proporcionan una inmunidad
mediada por células y una inmunidad local (IgA secretoria) y que son
además seleccionados de entre el grupo constituido por:
el escualano y el escualeno (u otros aceites de
origen animal); copolímeros de bloque de
polioxipropileno/polioxie-
tileno preferentemente el Pluronic® (L121); saponina; detergentes o tensioactivos no iónicos, preferentemente un monooleato de polioxietilen (20) sorbitano como el Tween®-80; Quil® A; aceites minerales preferentemente el Drakeol® o el Marcol®; aceites vegetales; adyuvantes derivados del Corynebacterium preferentemente el Corynebacterium parvum; adyuvantes derivados del Propionobacterium preferentemente el Propionobacterium acne; el Mycobacterium bovis (bacilo de Calmette y Guerin, o BCG); interleuquinas seleccionadas de entre la interleuquina 2 y la interleuquina 12; monoquinas preferentemente la Interleuquina 1; factor de la necrosis tumoral; interferones preferentemente el gamma-interferón; combinaciones saponina - hidróxido de aluminio o Quil®-A - hidróxido de aluminio; liposomas; adyuvante iscom; extracto de la pared celular de micobacterias; glucopéptidos sintéticos preferentemente los dipéptidos de muramilo u otros derivados; Avridina; Lípido A; sulfato de dextrano; DEAE - dextrano o DEAE - dextrano con fosfato de aluminio; carboxipolimetileno preferentemente el Carbopol®; EMA; emulsiones de copolímeros acrílicos preferentemente el Neocryl® A640; vacunas o proteínas de poxvirus animales; adyuvantes basados en partículas subvíricas preferentemente los orbivirus; toxina del cólera; bromuro de dimetildiocledecilamonio; y las mezclas de los mismos, en la preparación de una vacuna del virus sincítico respiratorio bovino de una sola dosis de manera que provoca inmunidad protectora frente a la infección por BRSV, después de una administración única.
tileno preferentemente el Pluronic® (L121); saponina; detergentes o tensioactivos no iónicos, preferentemente un monooleato de polioxietilen (20) sorbitano como el Tween®-80; Quil® A; aceites minerales preferentemente el Drakeol® o el Marcol®; aceites vegetales; adyuvantes derivados del Corynebacterium preferentemente el Corynebacterium parvum; adyuvantes derivados del Propionobacterium preferentemente el Propionobacterium acne; el Mycobacterium bovis (bacilo de Calmette y Guerin, o BCG); interleuquinas seleccionadas de entre la interleuquina 2 y la interleuquina 12; monoquinas preferentemente la Interleuquina 1; factor de la necrosis tumoral; interferones preferentemente el gamma-interferón; combinaciones saponina - hidróxido de aluminio o Quil®-A - hidróxido de aluminio; liposomas; adyuvante iscom; extracto de la pared celular de micobacterias; glucopéptidos sintéticos preferentemente los dipéptidos de muramilo u otros derivados; Avridina; Lípido A; sulfato de dextrano; DEAE - dextrano o DEAE - dextrano con fosfato de aluminio; carboxipolimetileno preferentemente el Carbopol®; EMA; emulsiones de copolímeros acrílicos preferentemente el Neocryl® A640; vacunas o proteínas de poxvirus animales; adyuvantes basados en partículas subvíricas preferentemente los orbivirus; toxina del cólera; bromuro de dimetildiocledecilamonio; y las mezclas de los mismos, en la preparación de una vacuna del virus sincítico respiratorio bovino de una sola dosis de manera que provoca inmunidad protectora frente a la infección por BRSV, después de una administración única.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el adyuvante comprende, adicionalmente, un tensioactivo.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que el adyuvante también comprende un tensioactivo presente a una
concentración final de aproximadamente el 0,0015 al 0,20% (v/v).
4. Utilización según la reivindicación 3 o la
reivindicación 4, en la que el tensioactivo es un monooleato de
polioxietilensorbitano.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que la vacuna comprende además el
virus de la rinotraqueítis bovina (BHV-IV), el
virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) y el virus 3 de la
parainfluenza (PI-3V).
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