JPH09131180A - バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 本発明はペプチド鎖内のグルタミン残基
のγ−カルボシキアミド基のアシル移転反応を触媒する
バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼ及び当該
トランスグルタミナーゼによる架橋高分子物の製造法に
関する。 【効果】 本トランスグルタミナーゼはカルシウム非要
求性であることから用途が制限されないし、コスト的に
も有利であるという利点を有する。また、本発明のＴＧ
を利用すると豆腐、練製品等の架橋高分子化物を製造で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、（１）バチルス・
ズブチリス等のバチルス属細菌の生産するトランスグル
タミナーゼ（以下ＴＧという）、（２）該トランスグル
タミナーゼ活性を有する画分、及び（３）ＴＧもしくは
ＴＧ活性を有する画分の作用により、タンパク質、非タ
ンパク性アミノ酸ポリマー、ペプチド又はこれらの誘導
体に含まれるグルタミンとリジン残基を架橋結合させ、
タンパク質、非タンパク性アミノ酸ポリマー、ペプチド
又はこれらの誘導体の分子内及び分子間にε−（γ−Ｇ
ｌｕ）−Ｌｙｓ架橋結合を形成させることを特徴とする
架橋構造を有するタンパク質、非タンパク性アミノ酸ポ
リマー、ペプチド又はこれらの誘導体の製造法である。
さらに本発明は、（４）バチルス・ズブチリス等のバチ
ルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼをコードする
ＤＮＡ、（５）該ＤＮＡとベクターＤＮＡが接続されて
得られる組み換えＤＮＡ、（６）該組み換えＤＮＡによ
って形質転換体された細胞、（７）該形質転換体を培養
することを特徴とするバチルス属細菌由来のトランスグ
ルタミナーゼの製造法に関する。尚、本発明に於いて
は、ＴＧ又はＴＧ活性を有する画分の作用により生じる
架橋構造を有するタンパク質、非タンパク性アミノ酸ポ
リマー、ペプチド又はこれらの誘導体を架橋高分子化物
と称する。

【０００２】ＴＧは、ペプチド鎖内にあるグルタミン残
基のγ−カルボキサミド基を基質とし、アシル転移反応
を触媒する酵素である。該反応において、ペプチド鎖内
のリジン残基のε−アミノ基がアシル受容体となるとき
は、ペプチド分子内あるいは分子間にε−（γ−Ｇｌ
ｕ）−Ｌｙｓ架橋結合（以下、「ＧＬ結合」と略する）
が形成する。水がアシル受容体となるときは、グルタミ
ン残基に脱アミド反応が生じ、グルタミン残基がグルタ
ミン酸残基になる。

【０００３】なお、本発明のバチルス属細菌のＴＧを利
用して架橋高分子化物を製造することができる。このよ
うにして製造された架橋高分子化物は、豆腐、プリン、
ヨーグルト、チーズ、摺り身、練製品、ソーセージ等の
畜肉製品等の食品、化粧料等として用いられる。

【０００４】

【従来の技術】従来、ＴＧは多くの動物組織に存在する
ことが知られていた。例えば、モルモットの肝臓（Conn
ellan et al., Journal of Biological Chemistry 246
巻1093〜1098頁(1971)）に存在し、研究されている。し
かし、微生物のＴＧについては放線菌、枯草菌（M.V.Ra
manujam et al., FASEB J.4巻A2321）と粘菌（J.D.klei
n et al., J.Bacteriol.174巻2599〜2605頁）でのみ報
告されている。現在、産業的には放線菌の生産するＴＧ
が実用化されている（特公平６−６５２８０、特開平１
−２７４７１）。

【０００５】モルモット等の動物由来のＴＧの産業への
利用、特に架橋高分子化物の製造方法には以下に述べる
ような欠点がある。即ち、動物由来のＴＧを安価かつ大
量に入手することが困難である。また、該ＴＧはカルシ
ウムイオン要求性であるため、その用途が制限される。

【０００６】放線菌由来のＴＧも若干の欠点を有する。
すなわち、放線菌は一般の細菌に比べて生育速度が遅い
ため、培養時間が長くなり、それゆえ生産コストの増大
を招く。

【０００７】枯草菌由来のＴＧについては、ニューメキ
シコ州立大学の Ramanujam らが、その存在を報告して
いる。しかし、その報告に記載されるＴＧは、以下の性
質を示す。 １）至適ｐＨが９．５以上である。２）キレート剤（Ｅ
ＧＴＡ）により、その活性が強く阻害されるので、金属
イオンの要求性があると思われる。３）５ｍＭ以上のＣ
a²⁺で阻害される。４）ＤＴＴにより阻害される。５）
栄養細胞及び胞子形成細胞の両者によって生産される。
これらの性質のうち特に、至適ｐＨが高いこと、金属イ
オンにより影響を受けることから実用上用途が制限され
ると思われる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、１）
動物由来のＴＧを産業に応用する場合、カルシウム要求
性であることから用途が制限されるという問題、及び生
産コストが高くなるという問題、２）放線菌由来のＴＧ
を産業に応用する場合、細菌に比べるとその増殖が遅
く、生産コストが高くなるという問題、又３）ニューメ
キシコ大学の研究者らが報告した枯草菌由来のＴＧを産
業に応用する場合、該ＴＧが５ｍＭのＣa²⁺によって阻
害されるので実際の食品系では使用できないという問題
がある。従って、本発明の目的は、コスト面で問題がな
く、かつ、古来から食品に利用されている枯草菌等のバ
チルス属細菌から新しいＴＧを単離し、該ＴＧによる架
橋高分子化物を製造する方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、古来から
食品に利用されている微生物である枯草菌等のバチルス
属細菌由来のＴＧを新たに見い出すべく鋭意検討を行っ
た結果、枯草菌等のバチルス属細菌が新規なＴＧを有す
ることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本
発明は、以下の性質を有するバチルス属細菌由来のＴＧ
及び当該ＴＧ若くは当該ＴＧを有する画分を用いるタン
パク質、非タンパク性アミノ酸ポリマー、ペプチド又は
これらの誘導体に含まれるグルタミンとリジン残基を架
橋結合させ、タンパク質、非タンパク性アミノ酸ポリマ
ー、ペプチド又はこれらの誘導体の分子内及び分子間に
ε−（γ−Ｇｌｕ）−Ｌｙｓ架橋結合を形成させること
を特徴とする架橋構造を有するタンパク質、非タンパク
性アミノ酸ポリマー、ペプチド又はこれらの誘導体の製
造法である。 （バチルス属細菌由来のＴＧの性質） １）至適ｐＨ：約７〜約９ ２）至適温度：約４０〜約６５℃ ３）温度安定性：約６０℃以下で安定 ４）活性にＣa²⁺イオンの要求性はない。即ち、Ｃa²⁺非
依存性で、かつ５ｍＭのＣa²⁺存在下で５０％以上活性
を有する。 ５）ＮＥＭ，Cystamine、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄のいずれかで
阻害される。 ６）ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、２−ＭＥのいずれにも阻害され
ない。 ７）分子量：（ａ）約１８０００−約２２０００（ゲル
濾過法）、（ｂ）約２８０００−約３００００（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ法） ８）ペプチド鎖内に存在するグルタミン残基のγ−カル
ボキシアミド基のアシル移転反応を触媒する さらに本発明は、バチルス・ズブチリスに代表されるバ
チルス属細菌由来のＴＧをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡ
とベクターＤＮＡが接続されて得られる組み換えＤＮ
Ａ、該組み換えＤＮＡによって形質転換体された細胞、
該形質転換体を培養することを特徴とするバチルス属細
菌由来のトランスグルタミナーゼの製造法である。

【００１０】

【発明の実施の形態】枯草菌等のバチルス属細菌の胞子
が、物理的、化学的及び生化学的に、著しい耐性を示す
ことはよく知られている。本発明者らは、ＧＬ結合がこ
れらの耐性をもたらしていると考えた。なぜなら、ＧＬ
結合は動物の血管や毛等、結合組織に広く存在してお
り、該結合が結合組織の強度を補強していると考えられ
るからである。ところで、ＧＬ結合は、動物の血管や毛
等、結合組織に広く存在するが、これらの組織にＴＧが
存在することも認められている。即ち、ＴＧの作用によ
りＧＬ結合が作られ、組織の強度が補強されるのであろ
う。

【００１１】そこで、本発明者らは、固体ＮＭＲ、ＨＰ
ＬＣ分析法等の手法を用いて枯草菌等のバチルス属細菌
の胞子の構造を分析した結果、同胞子中にＧＬ結合が存
在することを発見した。この発見に基づき、本発明者ら
は、ＧＬ結合の形成を触媒するＴＧがバチルス属細菌に
も存在すると考えた。

【００１２】この考えに基づき、本発明者らは、自然
界、特に土壌より、枯草菌に代表されるバチルス属細菌
等の有胞子細菌にターゲットを絞り、ＴＧを産生する細
菌を単離するためにスクリーニングを行った。有胞子細
菌が胞子形成期に達したときに、そのＴＧ活性を調べた
ところ、ＴＧ活性を強く有する菌株を２株発見した。本
発明者らは該菌株をそれぞれ AJ12866及び AJ1307 と命
名した。AJ12866 及び AJ1307 を通常の同定方法を行
い、Bergey's Manual of Systematic Bacteriologyに基
づき同定したところ、両者ともバチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）であることが判明した。尚、こ
のバチルス・ズブチリス AJ12866 は通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所（以下、「生命研」と略す
る）に、１９９５年２月２日付けで寄託されており、そ
の寄託番号は FERM P-14750 である。また、バチルス・
ズブチリス AJ12866 は、１９９５年１２月４日付けで
ブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されており、そ
の国際寄託番号は FERM BP-5325 である。バチルス・ズ
ブチリス AJ1307 は生命研に、１９９５年８月２２日付
けで寄託されており、その寄託番号は FERM P-15123 で
ある。また、バチルス・ズブチリス AJ1307 は、１９９
６年１月１８日付けでブタペスト条約に基づく国際寄託
に移管されており、その国際寄託番号は FERM BP-5367
である。

【００１３】本発明であるＴＧは、胞子を有するバチル
ス属細菌に広く存在する。つまり、バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis）を初め、以下のバチルス属細
菌にもＴＧが存在する。即ち、バチルス・リケニフォル
ミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリ
ウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ステアロサ
ーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチ
ルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・スフ
ェリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・ポリミ
キサ（Bacillus polymyxa）、バチルス・アルカロフィ
ラス（Bacillus alcalophilus）等である。

【００１４】次に、これらバチルス属細菌を培養し、そ
の培養物からＴＧを取得するための培養方法及び精製法
等について述べる。

【００１５】その培養形態は液体培養、固体培養いずれ
も可能であるが、工業的に有利な方法は、深部通気攪拌
培養法である。栄養培地の栄養源としては、微生物培養
に通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩及びその他の
微量栄養源を使用できる。バチルス属細菌が利用できる
栄養源であればすべてを使用できる。通気条件として
は、好気条件を採用する。培養温度としては、菌が発育
し、ＴＧが生産される範囲であれば良い。従って、厳密
な条件は無いが、通常１０〜５０℃、好ましくは３０〜
４０℃である。但し、高温菌として分類されるバチルス
属細菌を培養する場合には、上記温度より高い温度で培
養することができる。培養時間は、その他の培養条件に
応じて変化する。例えば、ＴＧが最も生産される時間ま
で培養すれば良く、通常５時間〜７日間、好ましくは１
０時間〜３日間程度である。

【００１６】ＴＧ活性が見られる時期は、胞子形成期に
限定される。これがニューメキシコ州立大学のグループ
が報告した枯草菌由来のＴＧと大きく異なる点である。
胞子が形成され始めた後、ＴＧ活性は上昇し始める。Ｔ
Ｇ活性はおよそ胞子形成IV期〜第VI前後に最大となった
後、やがて減少する。ＴＧ活性は培養液中に極わずか検
出されるが、菌体中にいっそう強い活性が検出される。
低温条件下で、菌体を破砕するかあるいは溶菌させる。
これらの処理を受けた菌体を２００００ｘｇ、１０分間
の遠心分離する。上澄画分と沈殿画分とを分離した後、
両者それぞれのＴＧ活性を検定すると、該活性が沈澱画
分、すなわち胞子を含む画分に存在することが判明す
る。これらのことから、ＴＧが胞子表面に存在すること
が分かった。

【００１７】バチルス属細菌由来のＴＧを精製する場
合、細菌を培養した培養液を出発材料としてＴＧを精製
することも可能だが、バチルス属細菌の胞子嚢を破砕す
ることにより、又は、溶菌することにより得られる胞子
を出発材料とする方が有利である。

【００１８】バチルス属細菌を培養して得られる胞子嚢
を破砕することにより、又は、溶菌することにより胞子
を得ることができる。該処理を行うと、ＴＧ活性は胞子
を含む不溶性画分中に回収される。このため、該不溶性
画分を濃縮して酵素剤とすることもできる。不溶性画分
中に回収されるＴＧ活性を可溶性画分中に回収するため
には（すなわちＴＧ活性を可溶化するためには）、下記
の操作が必要となる。例えば、トリトンＸ−１００、ア
ルキルグルコシド等の界面活性剤を該不溶性画分に添加
することによってＴＧ活性を可溶性画分中に回収するこ
とができる。胞子を含む画分を塩基性の緩衝液（例え
ば、２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０）で
処理することによっても、ＴＧ活性を可溶性画分中に回
収することが可能である。あるいは、胞子を含む画分を
緩衝液に懸濁し、得られる懸濁液を加温することによっ
ても、ＴＧ活性を可溶性画分中に回収することが可能で
ある。例えば１０℃以上にすることでＴＧ活性を可溶性
画分中に回収することが可能である。

【００１９】可溶化したＴＧは、ゲル化剤として利用さ
れ得る。酵素を精製するために用いられる全ての常法、
例えばゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法等
を採用することにより、可溶化したＴＧをさらに精製す
ることができる。その結果、より比活性が高いＴＧを得
ることができる。精製されたＴＧは、ＴＧ比活性がより
高いゲル化剤となる。

【００２０】ＴＧ活性の測定法は、以下の方法で行う。
基質として¹⁴Ｃで標識されたプトレシンとジメチルカゼ
インを採用し、これらにＴＧを含む試料を作用させて反
応を進行させる。プトレシンが結合したジメチルカゼイ
ンを１０％ＴＣＡで沈澱させ、これを濾紙に吸着させ
る。濾紙に存在する放射線活性は、試料中のＴＧ活性に
比例するので、試料中にあるＴＧ活性を定量することが
できる。放射線活性は液体シンチレーションカウンター
で測定できる。

【００２１】尚、バチルス・ズブチリス AJ1307 由来の
ＴＧをＴＧ−１と、バチルス・ズブチリス AJ12866 由
来のＴＧをＴＧ−２と、それぞれ表記する場合もある。
また、ＴＧ−１及びＴＧ−２のデータを基に本発明のＴ
Ｇの酵素化学的性質を以下に述べる。

【００２２】至適ｐＨ：約７〜約９付近にある。作用至
適ｐＨの範囲を求めるために、３７℃の条件下で３０分
間反応を行った。

【００２３】至適温度：約４０〜６５℃付近にある。作
用至適温度範囲を求めるために、ｐＨ７.５の条件下で
３０分間反応を行った。

【００２４】温度安定性：約６０℃以下で安定であっ
た。ｐＨ７.５の条件下で１０分間高温処理した場合の
温度安定性を調べた。６０℃での高温処理を行った場合
にも、約８０％のＴＧ活性が残存した。

【００２５】阻害剤の影響：バチルス属細菌由来のＴＧ
はＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）、Cystamine（シス
タミン）によって強く阻害される。また、（ＮＨ₄）₂Ｓ
Ｏ₄（硫酸アンモニウム）によって強く阻害される。

【００２６】ＤＴＴ、ＥＤＴＡの影響：バチルス属細菌
由来のＴＧは、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）が共存す
ることによって活性が上昇する。一方、ＥＤＴＡ（エチ
レンジアミン四酢酸）が共存しても、ＴＧ活性はほとん
ど影響を受けなかった。

【００２７】Ｃa²⁺の影響：本発明のＴＧは、Ｃa²⁺イオ
ンの要求性はない。即ち、Ｃa²⁺非依存性の酵素であ
る。また、５ｍＭのＣa²⁺存在下で５０％以上の活性を
有する。

【００２８】分子量：ａ）約１８，０００−約２２，０
００（ゲル濾過法）、ｂ）約２８，０００−約３０，０
００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）

【００２９】作用：ペプチド鎖内にあるグルタミン残基
のγ−カルボキサミド基を基質とし、アシル転移反応を
触媒する。該反応において、ペプチド鎖内のリジン残基
のε−アミノ基がアシル受容体となるときは、ペプチド
分子内あるいは分子間にε−（γ−Ｇｌｕ）−Ｌｙｓ架
橋結合が形成する。水がアシル受容体となるときは、グ
ルタミン残基に脱アミド反応が生じ、グルタミン残基が
グルタミン酸残基になる。このように、バチルス・ズブ
チリス AJ12866 及びバチルス・ズブチリス AJ1307 由
来の本発明のＴＧは、ニューメキシコ州立大学のグルー
プが報告したバチルス・ズブチリス由来のＴＧとは明ら
かに性質の異なるものであった。

【００３０】次に、本ＴＧを用いる架橋高分子化物の製
法について述べる。架橋高分子化物の製造反応に用いる
ＴＧとしては、（１）バチルス属細菌を培養して得た胞
子嚢を破砕もしくは溶菌して得た胞子を含む不溶性画分
を濃縮したものを用いても良い、又（２）この不溶性画
分を種々の可溶性処理をして得られるＴＧ活性を有する
画分を用いても良いし、更には（３）精製された比活性
の高いＴＧを用いても構わない。後述するような、バチ
ルス属細菌由来のＴＧをコードするＤＮＡとベクターが
接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換さ
れた細胞を培養することによって得られたバチルス属由
来のＴＧを用いることもできる。その他、バチルス属細
菌由来のＴＧ活性を有する画分であれば、全てを使用す
ることが可能である。

【００３１】ＴＧ又はＴＧ活性画分の基質としては、タ
ンパク質、非タンパク性アミノ酸ポリマー、ペプチド又
はこれらの誘導体を１種以上用いればよい。タンパク質
としては、リジン残基及びグルタミン残基を有し、上述
の触媒を受けるものであれば、その起源、性状に制約さ
れるものではない。例えば、カゼイン、ゼラチン、大豆
タンパク等が基質として用いられる。また、プロテアー
ゼ等で部分的に切断したタンパク質等も用いることがで
きる。非タンパク性アミノ酸ポリマーとしては化学合成
で得られるポリリジン等のアミノ酸高分子ポリマーを挙
げることができる。ペプチドとしては化学合成により得
たペプチドを用いてもよいし、又天然のタンパク質を
酸、アルカリ、プロテアーゼ等でで分解したものを用い
ることができる。更に、これらの誘導体としては、糖タ
ンパク質、化学修飾したタンパク質等を用いることがで
きる。いずれにしても、リジン残基、グルタミン残基を
有する条件が満たされれば、ＴＧ又はＴＧ活性画分の基
質となる。

【００３２】基質濃度が０.１％以上のタンパク質等の
含有溶液又はスラリーに、本ＴＧ又は本ＴＧ活性を有す
る画分を添加、作用させることにより架橋高分子化物が
得られる。尚、本発明においては、架橋高分子化物は、
架橋度の違いにより、ゲル状物、高粘性物、更には単に
高分子化したものに分類されることがあるが、本発明に
いう架橋高分子化合物はこれら全てを含む。

【００３３】一般的に、反応溶液のｐＨは約４〜１０、
反応温度は約５〜８０℃、反応時間は約１０秒〜２４時
間である。これにより、架橋高分子化物（ゲル状物、高
粘性物等）が得られる。

【００３４】次に、組み換えＤＮＡ技術によってバチル
ス属細菌由来のＴＧを製造する方法について説明する。

【００３５】組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理
活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知ら
れている。組み換えＤＮＡ技術を用いることの利点は、
天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる
ことである。

【００３６】組み換えＤＮＡ技術を利用してバチルス属
細菌由来のＴＧを製造するためには、バチルス属細菌由
来のＴＧをコードするＤＮＡが必要である。該ＤＮＡと
ベクターＤＮＡとを接続して組み換えＤＮＡを得る。該
組み換えＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換する。バチ
ルス属細菌由来のＴＧを生産するように形質転換された
細胞を培地中で培養し、培地中及び／又は細胞中にバチ
ルス属細菌由来のＴＧを生成蓄積させ、該ＴＧを回収す
る。

【００３７】バチルス属細菌由来のＴＧをコードするＤ
ＮＡを取得する方法について説明する。はじめに、精製
されたＴＧのアミノ酸配列を決定する。エドマン法（Ed
man,P., Acta Chem. Scand. 4, 227 (1950)）を用いて
アミノ酸配列を決定することができる。またApplied Bi
osystems社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を
決定することができる。本発明のバチルス属細菌由来の
ＴＧについて、Ｎ末端から３５残基のアミノ酸配列を決
定したところ、配列表配列番号１に示される配列が明ら
かとなった。

【００３８】明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、
これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮ
Ａの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンある
いはバチルス属細菌の遺伝子中でもっとも頻繁に用いら
れるコドンを採用する。

【００３９】演繹された塩基配列に基づいて、３０〜５
０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を
合成する方法はTetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)
に開示されている。また、Applied Biosystems社製のシ
ンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該Ｄ
ＮＡ分子は、バチルス属細菌由来のＴＧをコードするＤ
ＮＡ全長を、バチルス属細菌染色体遺伝子ライブラリー
から単離する際に、プローブとして利用できる。あるい
は、バチルス属細菌由来のＴＧをコードするＤＮＡをＰ
ＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。
ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡはバチルス
属細菌由来のＴＧをコードするＤＮＡ全長を含んでいな
いので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブ
として用いて、バチルス属細菌由来のＴＧをコードする
ＤＮＡ全長をバチルス属細菌染色体遺伝子ライブラリー
から単離する。ＰＣＲ法の操作については、White, T.
J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載され
ている。バチルス属細菌の染色体ＤＮＡを調製する方法
については、Molecular Biological Methods for Bacil
lus, John Wiley & Sons Ltd (1990)等に記載されてい
る。バチルス属などの細菌染色体遺伝子ライブラリーを
作成する方法については、Molecular Biological Metho
ds for Bacillus, JohnWiley & Sons Ltd (1990)等に記
載されている。ＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺
伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する
方法については、Molecular Cloning, 2nd edition, Co
ld Spring Harbor press (1989)等に記載されている。

【００４０】単離されたバチルス属細菌由来のＴＧをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、A Practi
cal Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons,
Inc. (1985)に記載されている。また、Applied Biosys
tems社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を
決定することができる。バチルス属細菌由来のＴＧをコ
ードするＤＮＡの一つを配列表配列番号２に示す。該Ｄ
ＮＡはバチルス・ズブチリス AJ1307 株の染色体ＤＮＡ
から単離されたものである。バチルス属細菌由来のＴＧ
をコードするＤＮＡは、配列表配列番号２に示されるＤ
ＮＡだけではない。すなわち、バチルス属に属する細菌
の種及び株ごとに、塩基配列の違いが観察されるはずだ
からである。また、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡから
単離されたＴＧをコードするＤＮＡに人工的に変異を加
えて塩基配列を変更することができる。人工的に変異を
加える方法として頻繁に用いられるものとして、Metho
d. in Enzymol.,154 (1987)に記載されている部位特異
的変異導入法がある。人工的に変異が加えられたＤＮＡ
であっても、バチルス属細菌由来のＴＧをコードする場
合には、本発明のバチルス属細菌由来のＴＧをコードす
るＤＮＡである。バチルス・ズブチリス AJ1307 由来の
ＴＧをコードするＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続され
て得られる組み換えＤＮＡを細胞内に有するエシェリヒ
ア・コリAJ13172 は生命研に、１９９５年１２月２０日
付けで、ブタペスト条約に基づいて国際寄託されてお
り、その国際寄託番号は FERM BP-5346 である。

【００４１】バチルス属細菌由来のＴＧをコードするＤ
ＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡを取得
し、該組み換えＤＮＡによって細胞を形質転換して形質
転換体を取得し、そして該形質転換体を培地中で培養
し、培地中及び／又は細胞中にバチルス属細菌由来のＴ
Ｇを生成蓄積させて、該ＴＧを回収することによってバ
チルス属細菌由来のＴＧを大量生産することができる。

【００４２】タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大
量生産する場合、該タンパクを生産する形質転換体内で
該タンパクが会合し、タンパクの封入体（inclusion bo
dy）を形成する場合が多い。この発現生産方法の利点
は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼ
による消化から保護することができる点であり、あるい
は、目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作に
よって簡単に精製できる点等である。このようにして得
られるタンパク封入体は、タンパク変性剤により可溶化
され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操
作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパ
クに変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の
活性再生（特開昭61-257931号）等多くの例がある。タ
ンパク封入体から活性型タンパクを得るためには、可溶
化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型
タンパクを生産する場合よりも操作が複雑になる。しか
し、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパクを菌体内
で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク封入体と
して菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑える
ことができる。

【００４３】目的タンパクを封入体として大量生産させ
る方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタン
パクを単独で発現させる方法の他、大量発現することが
知られているタンパクとの融合タンパクとして発現させ
る方法がある。さらに、融合タンパクとして発現させた
後に、目的のタンパクを切り出すため、制限プロテアー
ゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効であ
る。

【００４４】タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大
量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細
菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、
動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸菌、好
ましくはエシェリヒア・コリが用いられる。大腸菌を用
いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見
があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用い
てバチルス属細菌由来のＴＧを製造する方法を説明す
る。

【００４５】バチルス属細菌由来のＴＧをコードするＤ
ＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌にお
ける異種タンパク生産に用いられるプロモータを使用す
ることができ、例えば、T7プロモータ、trpプロモー
タ、la cプロモータ、tacプロモータ、PLプロモータ等の
強力なプロモータが挙げられる。

【００４６】バチルス属細菌由来のＴＧを融合タンパク
封入体として生産させるためには、バチルス属細菌由来
のＴＧ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク、好
ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連
結して、融合タンパク遺伝子とする。このような他のタ
ンパクをコードする遺伝子としては、融合タンパクの蓄
積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパクの溶
解性を高めるものであればよく、例えば、T7 gene 10、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−
２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられ
る。これらの遺伝子とバチルス属細菌由来のＴＧをコー
ドする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフ
レームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連
結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すれ
ばよい。

【００４７】また、生産量を増大させるためには、融合
タンパク遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネー
ターを連結することが好ましい。このターミネータとし
ては、T7ターミネータ、fdファージターミネータ、T4タ
ーミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネー
タ、大腸菌trpA遺伝子のターミネータ等が挙げられる。

【００４８】バチルス属細菌由来のＴＧ、又は、バチル
ス属細菌由来のＴＧと他のタンパクとの融合タンパクを
コードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターと
しては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、Co
l E1由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばpUC
系のプラスミドやpBR322系のプラスミド、あるいはその
誘導体が挙げられる。また、形質転換体を選別するため
に、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカー
を有することが好ましい。このようなプラスミドとし
て、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販され
ている（pUC系（宝酒造（株）製）、pPROK系（クロンテ
ック製）、pKK233-2（クロンテック製）ほか）。

【００４９】プロモータ、バチルス属細菌由来のＴＧ又
はバチルス属細菌由来のＴＧと他のタンパクとの融合タ
ンパクをコードする遺伝子、ターミネータの順に連結し
たＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換え
ＤＮＡを得る。

【００５０】該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転
換し、この大腸菌を培養すると、バチルス属細菌由来の
ＴＧ又はバチルス属細菌由来のＴＧと他のタンパクとの
融合タンパクが発現生産される。形質転換される宿主
は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用するこ
とができるが、特にエシェリヒア・コリ JM109(DE3)
株、JM109株が好ましい。形質転換を行う方法、及び形
質転換体を選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edi
tion, Cold Spring Harbor press (1989)等に記載され
ている。

【００５１】融合タンパクとして発現させた場合、血液
凝固因子Xa、カリクレインなどの、ＴＧ内に存在しない
配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてＴＧを
切り出せるようにしてもよい。

【００５２】生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培
地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる
培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件
は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等
の種類に応じて適宜選択する。

【００５３】バチルス属細菌由来のＴＧ又はバチルス属
細菌由来のＴＧと他のタンパクとの融合タンパクを回収
するには、以下の方法などがある。ＴＧあるいはその融
合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回
収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液とし
て使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾
過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりＴＧある
いはその融合タンパク質を精製して用いることも可能で
ある。この場合、ＴＧあるいは融合タンパク質の抗体を
利用した精製法も利用できる。

【００５４】タンパク封入体が形成される場合には、変
性剤でこれを可溶化する。菌体タンパクとともに可溶化
してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を
取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を
菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。
例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体
を回収する。タンパク封入体を可溶化させる変性剤とし
ては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や
尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。

【００５５】これらの変性剤を透析等により除くと、活
性を有するタンパクとして再生される。透析に用いる透
析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液など
を用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐ
Ｈとしては５〜８が挙げられる。再生工程時のタンパク
濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好まし
い。再生したバチルス属細菌由来のＴＧが自己架橋を行
うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが
好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法
のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用い
ても活性の再生が期待できる。

【００５６】バチルス属細菌由来のＴＧをコードするＤ
ＮＡとして、配列表配列番号２に示されるＤＮＡを用い
た場合には併記されるアミノ酸配列を有するバチルス属
細菌由来のＴＧが生産される。該ＤＮＡ中のオープン・
リーディング・フレームは、１１８番目のアデノシン残
基から８２９番目のシトシン残基までである。

【００５７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明す
る。尚、本発明は実施例の記載に限定されない。

【００５８】（ 実施例１）ＴＧの生産及び精製 バチルス・ズブチリス AJ1307 を培養し、充分にＴＧ活
性を有する菌体を得た。培養は総てSchaeffer培地を用
い、３７℃で液体振盪培養ないしは液体通気攪拌培養に
て行った。Schaeffer培地の組成はBacto-nutrient brot
h ８ｇ／ｌ、ＫＣl １ｇ／ｌ、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．１２ｇ／ｌ、１ｍＭ ＣaＣl₂、１０μＭ ＭnＣ
l₂、１μＭ ＦeＳＯ₄、ｐＨ ７．０である。まず、種
培養としてAJ1307株を２０ｍｌの培地で２４時間培養し
た。この培養液５ｍｌを種菌として、１００ｍｌ培養を
３連にて行った。培養が対数増殖後期になったとき、各
培養液を９００ｍｌの培地に移し、３連にて培養を続け
た。培養が同じく、対数増殖後期になった時、培養液３
Lを２７Lの培地に移し、通気１／４ｖｖｍ、攪拌３５０
ｒｐｍにて培養を行った。更に、培養が対数増殖後期に
なった時、同培養液３０Ｌを２７０Ｌの培地に移し、通
気１／２０ｖｖｍ、攪拌２００ｒｐｍにて本培養を行っ
た。増殖が定常期に入った後、６時間後に培養を終了し
た。培養液は冷水を用いて速やかに２０℃以下に冷却
し、連続遠心機を用いて、菌体を回収した。こうして得
られた菌体をＴＧを精製するための材料として用いた。

【００５９】なお、ＴＧ活性は、以下の酵素活性測定法
により行った。酵素液１０μｌを含む５０μｌ反応液
（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、６．３ｍｇ／ｍ
ｌジメチルカゼイン、１０ｎＭ¹⁴Ｃ−プトレシン１．２
μＣｉ）を３７℃、３０分反応させた後、４０μｌを濾
紙に吸着させ、１０％ＴＣＡで固定化した。さらに、5%
ＴＣＡ溶液で３回洗浄した後、これを液体シンチレーシ
ョンカウンターを用いて放射活性を測定し、ＴＧ活性と
した。

【００６０】１．菌体の洗浄：培養後に集菌した菌体
を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁
し、２０，０００ｘｇで３０分間遠心し、沈澱画分に再
度集菌した。この懸濁及び遠心の作業を、菌体の洗浄と
した。この菌体の洗浄を２回繰り返した。

【００６１】２．溶菌：洗浄した菌体の湿重量１に対し
て、氷冷した９倍量の緩衝液１（１００ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、０．５ｍｇ／ｍｌ リゾチー
ム、２０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２ｍＭ フェニルメタンスルホニルフルオリド（Ｐ
ＭＳＦ））を加え、菌体を緩衝液に懸濁した。この溶液
を氷上で１〜３時間攪拌することにより、菌体は溶菌し
た。

【００６２】３．胞子の調製：溶菌後の溶液を４℃で２
０，０００ｘｇで３０分間遠心し、遠心上清、及び沈澱
物を緩衝液２（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して得た懸濁液の
それぞれのＴＧ活性を測定した。この結果、ＴＧ活性は
沈澱懸濁液中に検出された。この沈澱懸濁液を検鏡した
ところ、胞子および溶菌後の菌体細胞残査が観察され
た。活性の検出された沈澱懸濁液を、氷冷しながら３０
分間攪拌した。その後、２０，０００ｘｇで３０分間遠
心し、再び遠心上清及び沈澱物を緩衝液２に懸濁した懸
濁液のそれぞれのＴＧ活性を測定した。この結果、ＴＧ
活性は沈澱懸濁液中に検出された。この緩衝液２による
懸濁、攪拌及び遠心の作業をもって、胞子の洗浄とし
た。この胞子の洗浄を４回繰り返した。この操作中、Ｔ
Ｇ活性は常に遠心沈澱画分中に検出された。胞子の洗浄
を４回行った後、活性の検出された沈澱画分の懸濁液を
検鏡したところ、菌体細胞残査はほぼ見られなくなり、
胞子のみが観察された。また、この検鏡によっては、胞
子が発芽した様子は観察されなかった。

【００６３】４．ＴＧの可溶化：洗浄後、遠心によって
沈澱画分に集められた胞子を、あらかじめ３７℃に暖め
た緩衝液３（０．１Ｍ 炭酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、５０ｍＭ ジチオスレイトール、ｐＨ １０．
０）に懸濁し、ｐＨを１０．０に再度調整した後、３７
℃において３０分間攪拌した。その後、２０，０００ｘ
ｇで３０分間遠心し、遠心上清及び沈澱物を緩衝液３に
懸濁して得た懸濁液のそれぞれのＴＧ活性を測定した。
この結果、ＴＧ活性は遠心上清中に検出され、ＴＧの可
溶化が達成された。このＴＧを含む溶液を粗ＴＧ溶液と
した。

【００６４】５．酸性条件下における共雑タンパク質の
沈澱除去 粗ＴＧ溶液を濾紙で濾過した後、酢酸を添加してそのｐ
Ｈを５．８に調整し、５℃において１時間攪拌した。こ
の操作によりタンパク質の等電沈澱と見られる白沈が生
じた。２０，０００ｘｇで３０分間遠心して、この沈澱
と遠心上清を分離した。沈澱物を緩衝液３に溶解した。
この遠心上清と沈澱溶解溶液中のＴＧ活性をそれぞれ測
定したところ、遠心上清中にＴＧ活性が検出された。

【００６５】６．ＴＧの硫安沈澱 活性が検出された遠心上清に、２０分の１容の１Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えた後、終濃度で５
０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、溶解し
た。水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．５に調整した
後、氷上で２時間攪拌し、２０，０００ｘｇで３０分間
遠心した。得られた遠心上清を緩衝液４（２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、５ｍＭ アジ化ナト
リウム）に対して透析し、一方、沈澱を緩衝液４に溶解
した後、同じく緩衝液４に対して透析した。透析を通じ
て十分に硫酸アンモニウムを除去した後、遠心上清画分
および沈澱画分中のＴＧ活性を測定した。この結果、遠
心沈澱画分、すなわち、５０％飽和硫安により沈澱した
画分中にＴＧ活性が検出された。

【００６６】７．疎水性クロマトグラフィー：活性が検
出された溶液を緩衝液５（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、０．７５Ｍ硫酸マグネシウム、０．０２％（Ｗ／
Ｖ） アジ化ナトリウム、ｐＨ ９．０）に対して透析
した。透析後に得られた溶液を２０，０００ｇ×３０分
間遠心し、その上清を得た。ここで得られた上清を、緩
衝液で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＰｈ
ｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ファルマシア社
製）に供した。この操作によりＴＧは担体に吸着した。
次に、担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパ
ク質）を緩衝液５を用いて洗い流した後、エチレングリ
コールを含む緩衝液を溶出液として用いて、吸着したタ
ンパク質の溶出を行った。このとき、緩衝液中の硫酸マ
グネシウム濃度とエチレングリコール濃度を直線的変化
させた。即ち、硫酸マグネシウム濃度を０．７５Ｍから
０Ｍへ直線的に変化させ、またこれと同時に緩衝液中の
エチレングリコール濃度を０％（ｖ／ｖ）から１０％
（ｖ／ｖ）に直線的に変化させるという溶出方法を用い
た。このとき得られた各溶出画分についてＴＧ活性を測
定したところ、硫酸マグネシウム濃度がおよそ１５０〜
２００ｍＭ、エチレングリコール濃度がおよそ７〜８％
（ｖ／ｖ）の溶出位置にＴＧ活性が認められた。

【００６７】８．ゲル濾過：ＴＧ活性を含む画分を膜濃
縮装置（アミコン社製、セントリプレップ）を用いて濃
縮し、緩衝液６（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ） エチレングリコー
ル、０．０２％（ｗ／ｖ） アジ化ナトリウム、ｐＨ
８．０）に対して透析した。透析後の溶液を２０，００
０ｇ×１０分間遠心し、その上清を得た。ここで得られ
た上清を、緩衝液６で平衡化されたゲル濾過カラムＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００ＨＲ（ファルマシア社製）に
供した。各流出画分のＴＧ活性を測定したところ、分子
量が約１８，０００−約２２，０００程度と見積もられ
る位置に活性が認められた。

【００６８】９．陰イオン交換クロマトグラフィー：得
られたＴＧ画分を膜濃縮し、緩衝液７（２５ｍＭ ピペ
ラジン、１％（ｖ／ｖ） エチレングリコール、０．０
２％ アジ化ナトリウム、ｐＨ １０．５）に対して透
析した。透析後に得られた溶液を２０，０００ｇ×１０
分間遠心し、その上清を得た。ここで得られた上清を、
緩衝液７で平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィ
ーカラム Ｍｏｎｏ−Ｑ（ファルマシア社製）に供し
た。この操作により、ＴＧは担体に吸着した。次に、緩
衝液７により非吸着タンパク質を洗い流した後、ＮaＣl
を含む緩衝液を溶出液として用いて、吸着されたタンパ
ク質の溶出をおこなった。このとき、緩衝液中のＮaＣl
濃度を直線的に０ｍＭから５００ｍＭへ変化させるとい
う溶出方法を用いた。このとき得られた各溶出画分につ
いてＴＧ活性を測定したところ、ＮaＣl濃度がおよそ５
０ｍＭから１５０ｍＭの溶出位置に活性が認められた。
得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、クマジー
ブリリアントブルー染色したところ、ＴＧは１本のバン
ドになるまでに精製されていることが確認され、その分
子量は約２８，０００−約３０，０００と見積もられた
（図１参照）。

【００６９】上記精製を行った結果の比活性の上昇を測
定した。前出の粗ＴＧ溶液、及び精製により得られた活
性画分のＴＧ活性を測定した結果、この一連の精製操作
により、単位タンパク質重量あたりの比活性は約６００
倍に上昇したことがわかった。なお、今回用いた活性測
定法においては、精製したＴＧの比活性は、約２．５ｘ
１０⁴ｄｐｍ／ｍｇ／３０ｍｉｎ（３７℃、ｐＨ ７．
５）と見積もられた。

【００７０】１０.ＴＧのＮ末端付近のアミノ酸配列の
決定 上記のように精製されたＴＧのＮ末端付近の配列を以下
のようにして決定した。即ち、精製されたＴＧ画分のう
ち、タンパク質量約１０μｇ分をＳＤＳ存在下ポリアク
リルアミドゲル電気泳動した後、ゲル中のＴＧを膜フィ
ルターに転写し、プロテインシーケンサーによってアミ
ノ酸配列をＮ末端から解析した。即ち、ミリポア社ミリ
ブロットを用い、セミドライ方式（タンパク質構造解
析、平野久著、東京化学同人）によって電気泳動後のゲ
ルからポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に目的
酵素を転写した。続いて、ＰＶＤＦ膜上の目的酵素をプ
ロテインシーケンサー（ＡＢＩ社製、モデル４７６Ａ）
に供し、Ｎ末端アミノ酸配列解析を行った。

【００７１】Ｎ末端から３５残基のアミノ酸配列が決定
した。決定されたトランスグルタミナーゼのＮ末端付近
のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。

【００７２】（実施例２）：ＴＧの至適ｐＨと至適温度
の決定 反応ｐＨによる酵素活性の変化（至適ｐＨ）を以下の方
法で測定した。

【００７３】酵素反応緩衝液にはギ酸ナトリウム（ｐＨ
２.０、３.０、３.５、４.０）、酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ ４.５、５.０、５.５、６.０）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ ７.０、７.５、８.０、８.５、９.０）及び炭
酸ナトリウム（ｐＨ ９.０、９.５、１０.５、１２.
０）緩衝液を用いた。

【００７４】ＴＧ活性の測定は、前出の¹⁴Ｃで標識され
たプトレシンとジメチルカゼインを基質とする方法を用
いた。それぞれの緩衝液は反応溶液中で５０ｍＭの濃度
となるように添加した。酵素源として、上述の精製した
ＴＧ画分を濃度２μｇ／ｍｌにて用いた。反応は、３７
℃において３０分間行った。

【００７５】測定結果は、それぞれの反応溶液の実測の
ｐＨに対する酵素活性の相対値の形で示した。便宜上、
最も高い活性を示したｐＨ８.２の場合（Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８.５）を緩衝液として用いた場合）の活性
を１００とした。測定結果は図２に示した。

【００７６】本発明のＴＧの至適ｐＨは約７〜約９、厳
密にはｐＨ約７．７〜８．８の範囲であることが分かっ
た（図２参照）。ところで、ニューメキシコ州立大学の
グループが報告したバチルス・ズブチリス由来のＴＧ
は、その至適ｐＨが９.５以上であるので、本発明であ
るバチルス属細菌由来のＴＧとは明らかに異なるもので
ある。

【００７７】反応温度による酵素活性の変化（至適温
度）を以下の方法で測定した。活性測定法としては、前
出の¹⁴Ｃで標識されたプトレシンとジメチルカゼインを
基質とする方法を用いた。反応液のｐＨを０．１ＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌを用いて７．５に調整した。酵素源とし
て、上述の精製したＴＧ画分を濃度２μｇ／ｍｌで加え
た。この反応液を２５℃から８０℃の各温度の温浴中で
３０分間反応させた。

【００７８】測定結果を、それぞれの反応温度に対する
酵素活性の相対値の形で示した。便宜上、最も高い活性
を示した６０℃の場合の活性を１００とした。測定結果
を図３に示した。

【００７９】本発明のＴＧは、その至適温度を約４０〜
約６５℃、より厳密には約５０〜約６２℃の範囲に持つ
ことがわかった（図３参照）。

【００８０】（実施例３）：ＴＧの温度安定性の決定 反応温度による酵素活性の安定性を以下の方法で測定し
た。上述の精製ＴＧ画分を１０℃から８０℃の各温度の
温浴中で１０分間反応させた。その後、実施例２と同様
の方法により、活性を測定した。測定結果は、それぞれ
の反応温度に対する酵素活性の相対値の形で示した。便
宜上、最も高い活性を１００とした。測定結果を図４に
示した。

【００８１】本発明のＴＧは、約６０℃以下の範囲にお
いて安定であることがわかった（図４参照）。

【００８２】（実施例４）：ＴＧによるタンパク質の架
橋反応 ＴＧのタンパク質架橋活性を以下のように測定した。反
応溶液として、終濃度で１ｍｇ／ｍｌ α−カゼイン、
０.１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５ｍＭジチオ
スレイトール、５ｍＭアジ化ナトリウムとなるような溶
液を調製した。尚、α−カゼインとしてシグマ社製のも
のを用いた。この溶液に終濃度で４４０μｇ／ｍｌとな
るように、上述の精製したＴＧ画分を添加した。

【００８３】この反応溶液を３７℃の温浴中で、１８時
間反応させた。この溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付したと
ころ、基質であるα−カゼインのバンドの他に、高分子
側に新たなバンドが出願した。即ち、α−カゼインの高
分子化が観察された。この結果を図５に示す。

【００８４】この結果から、本発明のＴＧはタンパク質
の架橋活性を有することが判明した（図５参照）。な
お、同様の基質タンパク質の高分子化が、本発明のＴＧ
を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に作用させた場合にも観
察された。

【００８５】（実施例５）：ＴＧ活性に対する各種試薬
の効果 ＴＧに対する各種試薬の効果を調べた。使用した試薬
は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、シスタミン、フ
ェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、硫酸
アンモニウム、硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、
塩化カルシウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−
メルカプトエタノール（２−ＭＥ）である。全てをナカ
ライテスク社より購入した。酵素源として、上述の精製
したＴＧ画分を濃度２μｇ／ｍｌで用いた。タンパク質
濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）
により定量した。

【００８６】ＴＧ活性を測定する方法として、前出の¹⁴
Ｃで標識されたプトレシンとジメチルカゼインを基質と
する方法を用いた（ｐＨ７.５、３７℃）。酵素源とし
て、上述の精製したＴＧ画分を濃度２μｇ／ｍｌで用い
た。反応は、３７℃において３０分間行った。活性測定
は以下のように行った。上述の精製ＴＧ画分を、それぞ
れ適当な濃度に調整した各試薬と混合した後、氷上で３
０分間静置した。各試薬による処理を受けたこれらの溶
液を酵素源とし、ＴＧ濃度が２μｇ／ｍｌとなるように
調整して基質に作用させ、残存するＴＧ活性を測定した
（ｐＨ７.５、３７℃）。

【００８７】試薬によって処理を受けなかったＴＧ画分
を用いた場合の活性（コントロール）を１００として、
それぞれの試薬によって処理を受けたＴＧ画分を用いた
場合の残存活性を相対値で示して、これを測定結果とし
た。この結果を表１に示した。本発明のＴＧの活性は、
ＮＥＭによって阻害されること、及びＤＴＴや２−ＭＥ
などの還元剤によっては阻害されず、むしろ少し活性化
されることから、活性の発現にはシステイン残基が関与
している可能性が示唆された。また、本発明のＴＧはＤ
ＴＴで阻害されないにもかかわらず、ニューメキシコ州
立大学のグループが報告したバチルス・ズブチリス由来
のＴＧはＤＴＴによって阻害される。つまり、両者は明
らかに異なる性質をもつものである。

【００８８】また、硫酸ナトリウムには阻害されず、硫
酸アンモニウムにより阻害されること、及びシスタミン
によって活性が阻害されることから、反応溶液中にある
種のアミンが存在すると活性が阻害されるという性質を
有していることが判明した。更に、本発明のＴＧがキレ
ート剤であるEGTA、EDTAで阻害されないことも、ニュー
メキシコ州立大学が報告したＴＧとは異なる性質であ
る。即ち、本発明のＴＧはＣａ²⁺等の金属イオンの要求
性は無いと言える。また、本ＴＧの活性測定の反応系に
はＣａ²⁺は含まず、かつこの測定系で活性を示している
ことからも本ＴＧはＣａ²⁺非依存性であるといえる。更
に、本発明のＴＧは５mM以上のCa²⁺ で５０％以上活性
を有する。５mM以上のCa²⁺ で強力に阻害されるという
ニューメキシコ州立大学が報告したＴＧとは異なる点で
ある（表１参照）。

【００８９】

【表１】

【００９０】（実施例６）バチルス・ズブチリス AJ128
66株 から由来するＴＧをも、精製し、その諸性質を決
定した。

【００９１】バチルス・ズブチリス AJ12866株をSchae
ffer培地を用いて３７℃で１６時間振盪培養した。培養
液３ｍｌを３０ｍｌのSchaeffer培地に加え、３７℃で
１２時間培養した。Schaeffer培地の組成はBacto-nutri
ent broth ８ｇ／ｌ、ＫＣl１ ｇ／ｌ、ＭgＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ０．１２ｇ／ｌ、１ｍＭ ＣaＣl₂、１０μＭＭ
nＣl₂、１μＭ ＦeＳＯ₄、ｐＨ ７．０である。培養
液を１０，０００ｘｇ、２０分間遠心分離を行い、沈澱
と上清とに分けた。沈澱をさらにガラスビーズを用いて
破砕した。培養液上清、培養液沈殿及び沈澱破砕液（菌
体破砕液）それぞれのＴＧ活性を測定した。酵素活性測
定法は次のとおりである。試料１０μｌを含む５０μｌ
反応液（１００ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ７．５、６．３ｍｇ
／ｍｌジメチルカゼイン、１０ｎＭ¹⁴Ｃ−プトレシン
１．２μＣｉ）を３７℃で３０分間静置して反応を進行
させた後、反応後の反応液４０μｌを濾紙に吸着させ
た。反応液中では、ＴＧの触媒によってプトレシンがジ
メチルカゼインに結合する反応が起きている。濾紙には
該プトレシンとジメチルカゼインとの結合物が吸着して
いる。１０％ＴＣＡを加えることによって、吸着してい
る結合物を濾紙に固定した。濾紙を５％ＴＣＡ溶液で３
回洗浄した後、液体シンチレーションカウンターを用い
て、濾紙に固定している¹⁴Ｃの放射活性を測定し、測定
値をＴＧの相対活性とした。結果を表２に示す。これよ
り、沈澱破砕液、すなわち胞子が存在する画分に圧倒的
にＴＧ活性が存在することが分かった。

【００９２】

【表２】

【００９３】（実施例７）バチルス属細菌由来のＴＧが
誘導される時期の決定 実施例６と同様に、バチルス・ズブチリス AJ12866 株
を培養し、経時的に菌体破砕懸濁液のＴＧ活性を調べ
た。菌体破砕懸濁液の調製及びＴＧ活性測定法は、実施
例１及び実施例６に準じた。バチルス・ズブチリス AJ1
2866 株の生育の程度を培養液の濁度で示したが、濁度
の測定は６１０ｎｍの波長をもつ光が培養液を透過する
際の吸光度を求めて行った。結果を図６に示した。この
結果から分かるように、ＴＧ活性は、生育が定常期に入
ってから後、胞子が形成され始めて（約４時間後）から
増大し始めた。

【００９４】（実施例８）バチルス属細菌由来のＴＧの
精製 実施例７と同様の方法で培養した菌体を用いて以下の実
験を行った。バチルス・ズブチリス AJ12866 株の菌体
を反応液（０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，２０
μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ
７．５，２ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ
ＰＭＳＦ）に懸濁し、氷上で２時間反応を行い溶菌さ
せた。この反応液を２０，０００ｘｇ、２０分の遠心分
離操作に供し、得られた沈澱画分を洗浄液（０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ
ＰＭＳＦ）に懸濁した。該懸濁液を遠心分離操作に供し
て沈澱を回収した。この操作を２回繰り返した。得られ
た沈澱画分を緩衝液（０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒ
ｂｏｎａｔｅｐＨ１０，１ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ Ｐ
ＭＳＦ）に懸濁し、３７℃で３０分間静置した。この間
に、沈澱画分にあった物質の一部が緩衝液に溶解して、
ＴＧ活性は可溶性画分に移行した。遠心分離操作を行っ
た後に得られる上清はＴＧ活性を有した。該上清のｐＨ
を酢酸を用いてｐＨ６．０に調整した。これを粗酵素液
とした。この粗酵素液を限外濾過により濃縮した後、緩
衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，０．１Ｍ Ｎ
aＣl）を用いて透析を行い、緩衝液の交換を行った。こ
の粗酵素液を、ゲル濾過操作に供し、溶出してきたＴＧ
活性画分を試料として酵素学的性質を調べた。

【００９５】その結果、以下の事がわかった。諸性質の
測定は実施例１から５に記載された方法に準じて行っ
た。 （１）至適ｐＨは約７−約９であった（図７参照）。
（２）至適温度は約４０−約６５℃であった（図８参
照）。（３）温度安定性は約６０℃以下で安定であった
（図９参照）。（４）シスタミン、ＮＥＭ、（ＮＨ₄）₂
ＳＯ₄により強く阻害された（図１０、表３参照）。
（５）また、ＤＴＴにより活性が阻害されず、むしろＤ
ＴＴが１ｍＭ存在する条件下で約１.５倍以上活性が上
昇した（図１１参照）。（６）ＥＤＴＡはほとんど本Ｔ
Ｇの活性に影響を与えなかった（図１２参照）。（７）
５ｍＭ以上のＣa²⁺イオン濃度で活性が阻害されること
はない。又、活性発現にＣa²⁺イオンは必要ない。即
ち、Ｃa²⁺非依存性の酵素である（図１３参照）。
（８）分子量は（ａ）約１８，０００−約２２，０００
（ゲル濾過法）、（ｂ）約２８，０００−約３０，００
０（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）であった。更に、実施例１に
記載される方法に準じて精製を行い、Ｎ末端付近のアミ
ノ酸配列、即ちＮ末端から３５残基のアミノ酸配列を決
定した。その結果、バチルス・ズブチリス AJ1307株由
来のＴＧと高い相同性を有していた。すなわち、両者の
ＴＧのアミノ酸配列において、２２番目のアミノ酸残基
のみが相違していた。AJ1307 株由来のＴＧでは２２番
目のアミノ酸残基はアスパラギンであるが、AJ12866 株
由来のＴＧでは２２番目のアミノ酸残基はアスパラギン
酸であった。

【００９６】

【表３】

【００９７】この実験結果から、バチルス・ズブチリス
AJ12866 株由来のＴＧは前述したバチルス・ズブチリ
ス AJ1307 株由来のＴＧと同一の性質を有しているこ
とが分かった。

【００９８】（実施例９）本発明のＴＧによるゲル化反
応 実施例８で得られたゲル濾過操作後のＴＧ活性画分と１
０％カゼイン溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，
５ｍＭ ＤＴＴ）とを１：９の割合で混合して、３７℃
で２４時間反応を行ったところ、該溶液はゲル化した。

【００９９】実施例１で得られた精製ＴＧを、２ユニッ
ト／１ｇタンパクとなるように、７％ゼラチン溶液に添
加して３５℃で２時間反応させた。その結果、ゼラチン
タンパク溶液はゲル化した。

【０１００】（実施例１０）バチルス属由来のＴＧ遺伝
子の単離 （１）ＴＧの精製及びＮ末端アミノ酸配列の決定 実施例１で決定され配列表の配列番号１に示されてい
る、バチルス属細菌由来のＴＧの部分アミノ酸配列が既
知のペプチドのアミノ酸配列との間に相同性を有するか
どうか調べた。しかし、ＧｅｎＢａｎｋ（ＬＡＳＬ−Ｇ
ＤＢ）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＮＢＲＦ（ＰＩＲ）に
登録されているアミノ酸配列との間には相同性は認めら
なかった。該アミノ酸配列をユニバーサル・コドンに基
づいて逆翻訳し、該アミノ酸配列をコードする塩基配列
を演繹した。該塩基配列が既知の核酸の塩基配列との間
に相同性を有するかどうか調べた。その結果、ＧｅｎＢ
ａｎｋ（ＬＡＳＬ−ＧＤＢ）に登録されている塩基配列
との間に高い相同性が認められた。相同性を示した塩基
配列のアクセッション番号はＬ２９１８９であり、出典
は、D. W. Hanlon &G. W. Ordal, J. Biol. Chem. 269
巻, 14038-14046頁 (1994)である。該塩基配列は、もと
もと枯草菌のトランスメンブラン・レセプターをコード
する遺伝子群の塩基配列を開示するものであり、相同性
が認められた配列は上流のフランキング領域に位置す
る。具体的には、該塩基配列の１番目から６８番目まで
の配列との間に相同性が認められた。この６８塩基対か
らなる配列は、枯草菌のｍｃｐＢ遺伝子の５’上流に位
置しており、転写の方向はｍｃｐＢ遺伝子のそれとは逆
向きである。また、該６８塩基対からなる配列にコード
されるペプチドの機能については、D. W. Hanlon & G.
W. Ordal, J. Biol. Chem. 269巻, 14038-14046頁(199
4)中には言及はない。本発明者らは、該６８塩基対から
なる配列が、バチルス属細菌由来のＴＧをコードする遺
伝子の一部であると仮定して、該遺伝子の全長を単離す
ることとした。

【０１０１】（２）菌体の取得 バチルス・ズブチリス AJ1307 株を以下の条件で培養し
た。培養は全て Schaeffer 培地を用いて、３７℃で液
体振盪培養にて行った。まず、種培養として、AJ1307
株を２０ｍｌの Schaeffer 培地を用いて一晩培養し
た。この培養液５ｍｌを種菌として、１００ｍｌの Sch
aeffer 培地を用いて本培養を行った。

【０１０２】（３）菌体からの染色体ＤＮＡの取得 上記条件下で対数増殖後期まで培養した後、培養液１０
０ｍｌを遠心分離操作（１２０００ｘｇ、４℃、１５分
間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌの５０：２
０ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，２
０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、洗浄し、遠心分離操作に
より、菌体を回収した。再び、この菌体を１０ｍｌ５
０：２０ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁液に、０．
５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍｌの１０
％ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間インキュベ
ートした。インキュベート後、１倍容の１０：１ＴＥ飽
和のフェノールを加えて除タンパクを行った。分離した
水層に対して、１倍容の２−プロパノールを加えて、Ｄ
ＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡを０．５ｍ
ｌ５０：２０ＴＥに溶解した後、５μｌの１０ｍｇ／ｍ
ｌ ＲＮａｓｅ、５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ Proteinase
Ｋを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応後、１倍
容の１０：１ＴＥ飽和のフェノールで除タンパクを行っ
た。さらに、分離した水層に対して、１倍容の２４：１
クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて撹拌
し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に
得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ酢酸
ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を加え、さらに２倍容の
エタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡを回収
し、７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させ、１ｍｌ
の１０：１ＴＥに溶解させた。

【０１０３】（４）ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の取得 バチルス属細菌由来のＴＧをコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡ分子の単離・増幅には、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣ
Ｒ in vitro Cloning Kit（宝酒造社製）を用いた。以
下断わりの無い限り、説明書の方法に基づき実験を行っ
た。（３）の手法によって調製した染色体ＤＮＡ５μｇ
を制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化した。次に、エタノール
沈澱操作により回収したＤＮＡ断片に、ＨｉｎｄIII
Ｃａｓｓｅｔｔｅを連結した。さらにエタノール沈澱操
作を行った後、回収したＤＮＡに対して、Ｐｒｉｍｅｒ
Ｃ１及びＰｒｉｍｅｒ Ｓ１を用いて１回目のＰＣＲ
を行った。Ｐｒｉｍｅｒ Ｃ１の塩基配列を配列表の配
列番号３に示し、Ｐｒｉｍｅｒ Ｓ１の塩基配列を配列
表の配列番号４に示した。Ｐｒｉｍｅｒ Ｃ１はＴａＫ
ａＲａ ＬＡ ＰＣＲ in vitro Cloning Kitに含まれ
ており、ＨｉｎｄIII Ｃａｓｓｅｔｔｅ内の配列であ
る。Ｐｒｉｍｅｒ Ｓ１は、上記した枯草菌のトランス
メンブラン・レセプターをコードする遺伝子群の塩基配
列中５６６番目のグアノシン残基から６００番目のアデ
ノシン残基までの領域に相補する配列である。ＰＣＲ反
応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６０
０（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を用いて行い、以
下の条件で３０サイクル行った。

【０１０４】 ９８℃ ２０秒 ６８℃ ３分

【０１０５】次にこの反応液を１００倍に希釈して、Ｐ
ｒｉｍｅｒ Ｃ２及びＰｒｉｍｅｒＳ２を新たに加えて
２回目のＰＣＲを行った。条件は１回目と同じである。
ＰｒｉｍｅｒＣ２及びＰｒｉｍｅｒ Ｓ２の配列をそれ
ぞれ配列表配列番号５と配列番号６に示す。Ｐｒｉｍｅ
ｒ Ｃ２はＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ in vitroCloni
ng Kitに含まれており、ＨｉｎｄIII Ｃａｓｓｅｔｔ
ｅ内の配列である。Ｐｒｉｍｅｒ Ｓ２は、上記した枯
草菌のトランスメンブラン・レセプターをコードする遺
伝子群の塩基配列中３４番目のチミジン残基から６８番
目のチミジン残基までの領域に相補する配列である。

【０１０６】反応後、反応液３μｌを０．８％アガロー
スゲル電気泳動に供した。約２ｋｂのＤＮＡ断片が増幅
されていることが確認された。

【０１０７】（５）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片のｐ
ＵＣ１８へのクローニング ＰＣＲで増幅された約２ｋｂのＤＮＡ断片をｐＵＣ１８
と連結してクローニングを行った。クローニングを Sur
eClone Ligation Kit（ファルマシア社製）を用いて行
った。以下、断わりの無い限り、説明書の方法に基づき
実験を行った。増幅された約２ｋｂのＤＮＡ断片４００
ｎｇの両末端を平滑化し、続いてリン酸化した。リン酸
化処理後に該ＤＮＡ断片を精製し、ＳｍａＩによって消
化されたｐＵＣ１８と連結した。このライゲーション反
応液を用いて大腸菌エシェリヒア・コリＪＭ１０９を形
質転換した。

【０１０８】得られた形質転換体より、目的とする約２
ｋｂのＤＮＡ断片を含むｐＵＣ１８で形質転換されたＪ
Ｍ１０９を数株選抜した。選抜の方法はMolecular Clon
ing,2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)に
記載されている。

【０１０９】（６）ＴＧ遺伝子のＤＮＡシーケンス 選抜した形質転換体が保有するプラスミドをMolecular
Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (19
89)に記載される方法に従って調製し、増幅された約２
ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。シーケンス反
応は、 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ
社製）を用いて説明書に従って行った。また、電気泳動
は、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３（ＡＢＩ社
製）を用いて行った。

【０１１０】シーケンスの結果、ＰＣＲで増幅されたＤ
ＮＡ断片は配列表配列番号２に示される塩基配列のう
ち、１１８番目のアデノシン残基から１０４２番目のチ
ミジン残基に至る配列を有することが解った。配列番号
２に示される塩基配列中、１１８番目のアデノシン残基
から８５９番目のシトシン残基までがオープン・リーデ
ィング・フレームである。該ＯＲＦがコードするポリペ
プチドのアミノ酸配列は、ユニバーサル・コドンに基づ
いて推定されうる。該アミノ酸配列は配列番号２に併記
されている。該アミノ酸配列のＮ末端から３５番目まで
の配列は、上記（１）において開示した３５残基からな
るアミノ酸配列と完全に一致していた。このことから、
ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、目的のバチルス属細
菌由来のＴＧ遺伝子であると判断された。なお、配列番
号２として記載される塩基配列と、D. W. Hanlon & G.
W. Ordal, J. Biol. Chem. 269巻, 14038-14046頁 (199
4)に記載される塩基配列との相違は、使用された菌株の
違いによるものと判断される。

【０１１１】バチルス属細菌由来のＴＧ遺伝子が、ｐＵ
Ｃ１８に由来するｌａｃプロモーターからの転写を受け
る向きに挿入されたプラスミドをｐＢＳＴＧ７５−１１
と命名した。

【０１１２】（実施例１１）染色体ＤＮＡライブラリー
からのバチルス属細菌由来のＴＧ遺伝子のクローニング （１）染色体ＤＮＡライブラリーの作成 実施例１０で調製した染色体ＤＮＡ１μｇをＨｉｎｄII
Iで完全に消化した。エタノール沈澱によってＤＮＡを
回収した後、１０μｌの１０：１ＴＥに溶解した。この
うちの５μｌと、ＨｉｎｄIIIで消化されてさらにＢＡ
Ｐによる脱リン酸化処理を受けたｐＵＣ１１８（宝酒造
製）１ｎｇとを混合し、ＤＮＡ Ligation Kit Ver.2
（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。エシェリヒア
・コリＪＭ１０９株のコンピテント・セル（宝酒造製）
１００μｌとライゲーション反応液３μｌとを混合し
て、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラ
リーを作成した。

【０１１３】（２）プローブの作成 プローブには、実施例１で取得したＴＧ遺伝子の全長を
用いることにした。ｐＢＳＴＧ７５−１１を鋳型にし
て、Ｐｒｉｍｅｒ Ｓ２及びＰｒｉｍｅｒ Ｓ３を用い
てＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａ
ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２に従って行った。鋳
型であるｐＢＳＴＧ７５−１１を１０ｎｇ、Ｐｒｉｍｅ
ｒ Ｓ２及びＰｒｉｍｅｒ Ｓ３を各２０ｐｍｏｌを含
む１００μｌの反応液を調製して反応を行った。なお、
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓ３はＴＧ遺伝子の配列番号２の塩基配
列８１８番目から８５２番目の３５塩基に相補する３５
ｍｅｒの長さのプライマーであり、その塩基配列を配列
表配列番号７として示した。ＰＣＲの反応は以下の条件
で３０サイクル行った。

【０１１４】 ９４℃ ３０秒 ５５℃ ３０秒 ７２℃ １分

【０１１５】上記の反応で増幅されたＤＮＡ断片を１％
アガロースゲル（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ ＧＴＧ、ＦＭＣ
社製）電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出
し、ＥａｓｙＰｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア社
製）とＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ
（ファルマシア社製）を用いてＤＮＡを精製した。最終
的に４ｎｇ／μｌのＤＮＡ溶液２００μｌを得た。

【０１１６】このＤＮＡ断片を³²Ｐで標識し、プローブ
とした。［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ ３０００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ（アマシャム社製）とＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ
ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒
造社製）を用いて説明書通りにプローブの標識を行っ
た。

【０１１７】（３）コロニーハイブリダイゼーション コロニーハイブリダイゼーションの操作はMolecular Cl
oning, 2nd edition,Cold Spring Harbor press (1989)
に説明されている。染色体ＤＮＡライブラリーのコロニ
ーをナイロンメンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−
Ｎ、アマシャム社製）にうつし、アルカリ変性、中和、
固定化の処理を行った。

【０１１８】ハイブリダイゼーションはＲａｐｉｄ−ｈ
ｙｂ ｂｕｆｆｅｒ（アマシャム社製）を用いて行っ
た。フィルターを該バッファー中に浸し、６５℃で４時
間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上記
（２）で作成した標識プローブを添加し、６５℃で２時
間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルタ
ーを０．１％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣで室温、２０分間
洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣ
で６５℃、１５分間洗浄を２回行った。

【０１１９】その結果、プローブとハイブリダイズする
コロニーを５株確認できた。

【０１２０】（４）ＴＧ遺伝子のＤＮＡシーケンス 実施例５と同様にして、ｐＵＣ１１８に挿入されたＤＮ
Ａ断片の塩基配列を決定した。その結果、配列表配列番
号２に示した塩基配列を有することを確認した。

【０１２１】（実施例１２）バチルス属細菌由来のＴＧ
遺伝子の大腸菌における発現 （１）組換えＴＧ遺伝子を有する大腸菌の培養及び発現
誘導 実施例１０で取得したｐＢＳＴＧ７５−１１では、バチ
ルス属細菌由来のＴＧをコードするＤＮＡがｌａｃＺタ
ンパクの一部をコードするＤＮＡの下流に接続されてお
り、その塩基配列から推定して、バチルス属細菌由来の
ＴＧの１番目のメチオニン残基の前に配列表配列番号８
に示される１１アミノ酸残基からなるペプチドが付加さ
れた融合タンパクを発現するようにデザインされてい
た。

【０１２２】実験には、ｐＢＳＴＧ７５−１１によって
形質転換された大腸菌ＪＭ１０９と、コントロールとし
て、ｐＵＣ１８によって形質転換された大腸菌ＪＭ１０
９を使用した。培養を、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを
含むＬＢ培地を用いて、３７℃で、液体振盪培養によっ
て行った。培地３０ｍｌに各菌をそれぞれ植菌し、一晩
振とう培養を行い、これを種培養とした。次に、新しい
培地３０ｍｌを入れたフラスコを４本用意した。ｐＢＳ
ＴＧ７５−１１によって形質転換された大腸菌ＪＭ１０
９の種培養を２本のフラスコに５％植菌し、それぞれを
実験区１及び実験区２とした。一方ｐＵＣ１８によって
形質転換された大腸菌ＪＭ１０９の種培養も２本のフラ
スコに５％植菌し、それぞれを実験区３及び実験区４と
した。各実験区の培養を行い、６１０ｎｍの波長を有す
る光の吸光度が約０．７になったところで、実験区１及
び実験区３のみにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添
加した。その後、４時間経過したところで培養を終了し
た。

【０１２３】（２）誘導発現した蛋白質の確認 培養終了後、培養液中の菌体の様子を顕微鏡にて観察し
たところ、ｐＢＳＴＧ７５−１１によって形質転換され
たＪＭ１０９のうちＩＰＴＧが添加されたもの（実験区
１）のみが、その菌体内に封入体を有していた。

【０１２４】培養終了後、培養液１０ｍｌを遠心分離
（12,000xg、１５分間）し、菌体を回収した。この菌体
を２ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に懸
濁し、洗浄した後、再び遠心分離により菌体を回収し
た。この菌体を１ｍｌ同バッファーに懸濁した後、ミニ
ビード・ビーター（和研薬（株）製）を用いて、０．１
ｍｍジルコニアビーズで３分間振盪破砕した。この破砕
懸濁液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色したとこ
ろ、実験区１（ｐＢＳＴＧ７５−１１によって形質転換
されたＪＭ１０９、ＩＰＴＧによって誘導を受けた）に
のみにおいて、約 29,000〜30,000 のバンドが確認され
た。この分子量から推定して、期待した融合蛋白質が発
現したものと考えられた。

【０１２５】（３）ＴＧ活性の確認 発現された蛋白質のＴＧ活性を測定した。上記菌体破砕
懸濁液１０μｌを、ジメチルカゼイン、¹⁴Ｃ標識プトレ
シンを含む反応液に加え、反応終了後、ジメチルカゼイ
ンを濾紙に吸着させ、取り込まれたプトレシン量を液体
シンチレイションカウンターにて測定した。結果は、表
４に示す通りであった。この結果より、ｐＢＳＴＧ７５
−１１によって形質転換されたＪＭ１０９で、ＩＰＴＧ
で誘導を受けたもの（実験区１）において、ＴＧ活性が
確認された。ｐＢＳＴＧ７５−１１によって形質転換さ
れたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株はエシェリヒア・
コリ AJ13172 と命名された。AJ13172 は生命研に、１
９９５年１２月２０日付けで、ブタペスト条約に基づい
て国際寄託されており、その国際寄託番号は FERM BP-5
346 である。

【０１２６】

【表４】

【０１２７】配列表配列番号２に示される塩基配列を有
するＤＮＡがＴＧ活性を有する酵素をコードしているこ
とが確認された。すなわち、該ＤＮＡがバチルス属細菌
由来のＴＧ遺伝子を有することが明らかになった。ま
た、該遺伝子は他のペプチドをコードするＤＮＡが付加
された場合でも発現し、この場合の産物である融合タン
パクがＴＧ活性を有するが確認された。該融合タンパク
は、大腸菌内で発現して封入体を形成得ること、適当な
プロモーターにより発現調節が可能であることなどが明
らかになった。

【０１２８】

【発明の効果】本発明によれば、食品微生物である枯草
菌等のバチルス属細菌からこれまで知られていないＴＧ
を得ることができる。このＴＧは従来知られている１）
動物由来のＴＧに比較して、カルシウム非要求性である
ことから用途が制限されないし、コスト的にも有利であ
るという利点を有し、２）放線菌由来のＴＧに比較して
も細菌の増殖が早い分、コスト的にも有利であるという
利点を有する。更に、本発明のＴＧは、（１）５ｍＭ以
上のＣa²⁺では活性が阻害されない、（２）至適ｐＨが
中性−微アルカリ性である、（３）ＤＴＴにより阻害さ
れない、（４）ＥＧＴＡ等のキレート剤により阻害され
ないこと、及び（５）胞子形成時のみにＴＧが作用する
こと等から、ニューメキシコ州立大のグループが報告し
たＴＧとは異なるものである。

【０１２９】また、本発明のＴＧを用いると架橋高分子
化物を製造できることから、本ＴＧは各種食品工業に応
用できるものである。更に、本発明のＴＧは実際に食品
に用いられているBacillus 属細菌由来であるというこ
とも、食品工業上極めて実用価値が高いといえる。

【０１３０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：35 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ハ゛チルス ス゛フ゛チルス (Bacillus subtilis) 株名： AJ1307 配列 Met Ile Ile Val Ser Gly Gln Leu Leu Arg Pro Gln Asp Ile Glu Asn 1 5 10 15 Trp Gln Ile Asp Gln Asn Leu Asn Pro Leu Leu Lys Glu Met Ile Glu 20 25 30 Thr Pro Val 35

【０１３１】配列番号：２ 配列の長さ：1042 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ハ゛チルス ス゛フ゛チルス (Bacillus subtilis) 株名： AJ 1307 配列 CTGCTTAAAA AGTTTTAAAA TAAAAAATGG AAGAAGTTCT TTTTGGCAGT CTTCTGTCTT 60 TTTAGCTTTC ATTGCCCAAG CTCTTTGCAT ATCTTATATA AACAAGGGGG GCTAAAC 117 ATG ATT ATT GTA TCA GGA CAA TTG CTC CGT CCC CAG GAT ATT GAA AAT 165 Met Ile Ile Val Ser Gly Gln Leu Leu Arg Pro Gln Asp Ile Glu Asn 1 5 10 15 TGG CAG ATT GAT CAA AAT CTG AAT CCG CTG TTA AAA GAG ATG ATT GAG 213 Trp Gln Ile Asp Gln Asn Leu Asn Pro Leu Leu Lys Glu Met Ile Glu 20 25 30 ACG CCT GTT CAG TTT GAT TAT CAT TCA ATT GCT GAA CTG ATG TTT GAG 261 Thr Pro Val Gln Phe Asp Tyr His Ser Ile Ala Glu Leu Met Phe Glu 35 40 45 CTT AAA CTG CGG ATG AAT ATT GTA GCA GCG GCA AAG ACG CTG CAC AAA 309 Leu Lys Leu Arg Met Asn Ile Val Ala Ala Ala Lys Thr Leu His Lys 50 55 60 AGC GGG GCG AAG TTT GCC ACT TTT TTA AAA ACA TAC GGG AAT ACA ACG 357 Ser Gly Ala Lys Phe Ala Thr Phe Leu Lys Thr Tyr Gly Asn Thr Thr 65 70 75 80 TAT TGG AGG GTT TCA CCG GAG GGC GCC TTG GAG CTG AAA TAC AGA ATG 405 Tyr Trp Arg Val Ser Pro Glu Gly Ala Leu Glu Leu Lys Tyr Arg Met 85 90 95 CCG CCT TCA AAA GCG ATT CGG GAC ATT GCA GAG AAC GGC CCG TTT TAT 453 Pro Pro Ser Lys Ala Ile Arg Asp Ile Ala Glu Asn Gly Pro Phe Tyr 100 105 110 GCG TTT GAA TGC GCA ACC GCA ATC GTT ATC ATT TAT TAC TTG GCC TTA 501 Ala Phe Glu Cys Ala Thr Ala Ile Val Ile Ile Tyr Tyr Leu Ala Leu 115 120 125 ATC GAT ACA ATC GGT GAA GAT AAA TTC AAT GCC AGC TTT GAC AGA ATT 549 Ile Asp Thr Ile Gly Glu Asp Lys Phe Asn Ala Ser Phe Asp Arg Ile 130 135 140 ATT TTA TAT GAC TGG CAT TAT GAG AAA TTG CCG ATC TAT ACG GAA ACA 597 Ile Leu Tyr Asp Trp His Tyr Glu Lys Leu Pro Ile Tyr Thr Glu Thr 145 150 155 160 GGA CAC CAC TTT TTC CTT GGA GAT TGT TTG TAT TTT AAG AAT CCT GAA 645 Gly His His Phe Phe Leu Gly Asp Cys Leu Tyr Phe Lys Asn Pro Glu 165 170 175 TTT GAT CCG CAA AAG GCG CAA TGG AGA GGC GAA AAT GTG ATT TTA CTG 693 Phe Asp Pro Gln Lys Ala Gln Trp Arg Gly Glu Asn Val Ile Leu Leu 180 185 190 GGG GAA GAT AAA TAT TTT GCC CAT GGT CTT GGA ATC TTA AAC GGA AAG 741 Gly Glu Asp Lys Tyr Phe Ala His Gly Leu Gly Ile Leu Asn Gly Lys 195 200 205 CAA ATT ATA GAT AAG CTG AAT TCT TTT AGG AAA AAA GGA GCC TTA CAG 789 Gln Ile Ile Asp Lys Leu Asn Ser Phe Arg Lys Lys Gly Ala Leu Gln 210 215 220 TCA GCC TAC CTT CTG TCT CAG GCG ACC AGA CTG GAT GTT CCG TCT CTT 837 Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Gln Ala Thr Arg Leu Asp Val Pro Ser Leu 225 230 235 240 TTC CGC ATC GTC CGC TAAAAAGCCC CATCGCCTAT TTTCGGGACG ATGGGGTTTC 892 Phe Arg Ile Val Arg 245 AAATGCCTTT CGTTTTCGAT AGAAGGGGGC TGTGCCGAAA TATTGGTTCG CAGCCCACTC 952 CATTTTTTCA AGGTCATTTC TTGTCACGAT TGGATCCTGG CTGCTCCATT TGATAAAGCG 1012 GACAAAATAG TAGCCTTTGA TAGGAACCAT 1042

【０１３２】配列番号：３ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA ＰＣＲ用プライマーＣ１ 配列 GTACATATTG TCGTTAGAAC GCGTAATACG ACTCA 35

【０１３３】配列番号：４ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA ＰＣＲ用プライマーＳ１ 配列 TGGCGCTTGT ACATAAGTGC CGTTATCTGC GCCCC 35

【０１３４】配列番号：５ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA ＰＣＲ用プライマーＣ２ 配列 CGTTAGAACG CGTAATACGA CTCACTATAG GGAGA 35

【０１３５】配列番号：６ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA ＰＣＲ用プライマーＳ２ 配列 ATGATTATTG TATCAGGACA ATTGCTCCGT CCCCA 35

【０１３６】配列番号：７ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA ＰＣＲ用プライマーＳ３ 配列 GCGGACGATG CGGAAAAGAG ACGGAACATC CAGTC 35

【０１３７】配列番号：８ 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 配列 Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro 11 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】 精製したＴＧ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
を示す図である。

【図２】 ＴＧ−１の至適ｐＨ曲線を示す図である。

【図３】 ＴＧ−１の至適温度曲線を示す図である。

【図４】 ＴＧ−１の温度安定曲線を示す図である。

【図５】 ＴＧ−１によるα−カゼインの架橋を示す図
である。

【図６】 ＴＧ−２の活性と生育との関係を示す図であ
る。

【図７】 ＴＧ−２の至適ｐＨ曲線を示す図である。

【図８】 ＴＧ−２の至適温度曲線を示す図である。

【図９】 ＴＧ−２の温度安定曲線を示す図である。

【図１０】 ＴＧ−２の阻害剤の影響を表す曲線を示す
図である。

【図１１】ＴＧ−２のＤＴＴの影響を表す曲線を示す図
である。

【図１２】ＴＧ−２のＥＤＴＡの影響を表す曲線を示す
図である。

【図１３】ＴＧ−２のＣａ²⁺イオンの影響を表す曲線を
示す図である。

【手続補正書】

【提出日】平成８年１月３１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１１０】シーケンスの結果、ＰＣＲで増幅されたＤ
ＮＡ断片は配列表配列番号２に示される塩基配列のう
ち、１１８番目のアデノシン残基から１０４２番目のチ
ミジン残基に至る配列を有することが解った。配列番号
２に示される塩基配列中、１１８番目のアデノシン残基
から８５２番目のシトシン残基までがオープン・リーデ
ィング・フレームである。該ＯＲＦがコードするポリペ
プチドのアミノ酸配列は、ユニバーサル・コドンに基づ
いて推定されうる。該アミノ酸配列は配列番号２に併記
されている。該アミノ酸配列のＮ末端から３５番目まで
の配列は、上記（１）において開示した３５残基からな
るアミノ酸配列と完全に一致していた。このことから、
ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、目的のバチルス属細
菌由来のＴＧ遺伝子であると判断された。なお、配列番
号２として記載される塩基配列と、D. W. Hanlon & G.
W. Ordal, J. Biol. Chem. 269巻, 14038-14046頁 (199
4)に記載される塩基配列との相違は、使用された菌株の
違いによるものと判断される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/04 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 鈴木 俊一 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 江藤 譲 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 谷田 有子 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 横関 健三 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 橋口 賢一 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の性質を有するバチルス属細菌由来
   のトランスグルタミナーゼ。 １）至適ｐＨ：約７〜約９ ２）至適温度：約４０〜約６５℃ ３）温度安定性：約６０℃以下で安定 ４）Ｃa²⁺非依存性で、かつ５ｍＭのＣa²⁺存在下で５０
   ％以上の活性を有する。 ５）ＮＥＭ，Cystamine、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄のいずれかで
   阻害される。 ６）ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、２−ＭＥのいずれにも阻害され
   ない。 ７）分子量：ａ）約１８，０００−約２２，０００（ゲ
   ル濾過法）、ｂ）約２８，０００−約３０，０００（Ｓ
   ＤＳ−ＰＡＧＥ法） ８）ペプチド鎖内に存在するグルタミン残基のγ−カル
   ボキシアミド基のアシル移転反応を触媒する
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
   を有する請求項１記載のバチルス属細菌由来のトランス
   グルタミナーゼ。
3. 【請求項３】 バチルス属細菌を培養して得た胞子嚢を
   破砕又は溶菌して得た胞子から取得されるバチルス属細
   菌由来のトランスグルタミナーゼ画分。
4. 【請求項４】 バチルス属細菌がバチルス・ズブチリス
   である請求項１記載のトランスグルタミナーゼ。
5. 【請求項５】 バチルス属細菌がバチルス・ズブチリス
   である請求項３記載のトランスグルタミナーゼ画分。
6. 【請求項６】 請求項１記載のトランスグルタミナーゼ
   の作用により、タンパク質、非タンパク性アミノ酸ポリ
   マー、ペプチド又はこれらの誘導体に含まれるグルタミ
   ンとリジン残基を架橋結合させ、タンパク質、非タンパ
   ク性アミノ酸ポリマー、ペプチド又はこれらの誘導体の
   分子内及び分子間にε−（γ−Ｇｌｕ）−Ｌｙｓ架橋結
   合を形成させることを特徴とする架橋構造を有するタン
   パク質、非タンパク性アミノ酸ポリマー、ペプチド又は
   これらの誘導体の製造法。
7. 【請求項７】 請求項３記載のトランスグルタミナーゼ
   画分の作用により、タンパク質、非タンパク性アミノ酸
   ポリマー、ペプチド又はこれらの誘導体に含まれるグル
   タミンとリジン残基を架橋結合させ、タンパク質、非タ
   ンパク性アミノ酸ポリマー、ペプチド又はこれらの誘導
   体の分子内及び分子間にε−（γ−Ｇｌｕ）−Ｌｙｓ架
   橋結合を形成させることを特徴とする架橋構造を有する
   タンパク質、非タンパク性アミノ酸ポリマー、ペプチド
   又はこれらの誘導体の製造法。
8. 【請求項８】 請求項１記載のトランスグルタミナーゼ
   をコードするＤＮＡ。
9. 【請求項９】 配列表配列番号２記載の塩基配列のうち
   １１８番から８５２番までの配列を少なくとも有する請
   求項８記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】請求項８記載のＤＮＡとベクターＤＮＡ
    とが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載の組み換えＤＮＡによ
    って形質転換された細胞。
12. 【請求項１２】請求項１１記載の細胞を培地中で培養
    し、培地中及び／又は細胞中にバチルス属細菌由来のト
    ランスグルタミナーゼを生成蓄積させ、該トランスグル
    タミナーゼを回収することを特徴とするバチルス属細菌
    由来のトランスグルタミナーゼの製造法。
13. 【請求項１３】請求項１２記載の製造法によって製造さ
    れるバチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼ。