JPH0889267A

JPH0889267A - Ｓ−（＋）−マンデルアミドおよびその誘導体の製造法

Info

Publication number: JPH0889267A
Application number: JP25156294A
Authority: JP
Inventors: Yuji Hirata; 祐司平田; Aki Oikawa; 亜季及川; Koji Tamura; 鋼二田村; Ryuichi Endo; 隆一遠藤
Original assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 1994-09-21
Publication date: 1996-04-09
Anticipated expiration: 2017-08-12
Also published as: JP3313000B2

Abstract

(57)【要約】【構成】微生物の作用により、ラセミ体のシアンヒドリ
ン、またはアルデヒドと青酸から光学活性なＳ−（＋）
−マンデルアミドまたはその誘導体を製造する際に、ア
ルデヒドを、反応系内に溶解し得る範囲内で、且つシア
ンヒドリンに対しては１〜１０倍モル、また青酸に対し
ては２〜１１倍モル添加する。【効果】酵素の失活を抑制し、ラセミ体のシアンヒドリ
ン、またはアルデヒドと青酸から直接優位量（５０〜１
００％）のＳ−（＋）−マンデルアミド等を高収率で生
産、蓄積することができ、原料の全てを化学量論的に目
的物に変換することも可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は微生物を用いてラセミ体
のシアンヒドリンまたはこのシアンヒドリンに対応する
アルデヒドと青酸から光学活性なＳ−（＋）−マンデル
アミドおよびその誘導体を製造する方法に関する。Ｓ−
（＋）−マンデルアミドおよびその誘導体は、加水分解
することによりＳ−（＋）−マンデル酸およびその誘導
体に変換することができる。Ｓ−（＋）−マンデルアミ
ドおよびＳ−（＋）−マンデル酸ならびにこれらの誘導
体は医・農薬の合成原料として重要な物質である。

【０００２】

【従来技術】微生物によりニトリル化合物を水和して対
応するアミドを生産する技術に関する発明は多く、不斉
炭素を分子内に有するニトリルからのアミドの生産に関
しては、バチルス属、バクテリジューム属、マイクロコ
カス属、ブレビバクテリウム属に属する微生物をＤ，Ｌ
−α−アミノニトリルに作用させＬ−α−アミノ酸とＤ
−α−アミノアミドの混合物を得る方法（特表昭５６−
５００３１号公報参照）、ブレビバクテリウム属Ｒ３１
２株のＡ４変異株を用いてラセミ体のα−アミノ−γ−
メチルチオブチロニトリル、α−アミノプロピオニトリ
ル、α−アミノブチロニトリル、α−アミノ−β−フェ
ニルプロピオニトリル、α−アミノ−γ−メチルペンチ
ルニトリルおよびα−アミノイソバレロニトリルから対
応するＬ−体のアミノ酸とＤ−体のアミノアミドを５０
％づつの混合比で得る方法〔Adv.Biochem. Engineer.
１４１（１９８０）参照）、シュードモナス属、ロド
コッカス属、ノカルディア属によるＤ，Ｌ−アミノニト
リルから光学活性なα−アミノ酸および／またはα−ア
ミノアミドを生産する方法（特開平２−３１６９４号公
報参照）、およびＤ，Ｌ−α−アミノニトリルから立体
特異的加水分解酵素により約４０％eeのＬ−α−アミノ
アミドを得る方法（特表昭６３−５００００４号公報参
照）などが知られている。

【０００３】また、α−アミノニトリル類からＬ−アミ
ノ酸類を製造する際に、対応するアルデヒドを存在させ
ることによりアミド類の副生を抑え、Ｌ−アミノ酸を選
択的に産生させる方法（特開平１−３１７３９３号公報
参照）があるが、この方法におけるアルデヒドの添加は
アミド類の副生を防止することを意図したものであり、
対応するアルデヒドを添加することによる反応速度およ
び生産性の改良を目的としたものではない。

【０００４】一方、本発明者の一部らは、これらの方法
が光学活性なアミドとアミノ酸の混合物を与えるため
に、純粋な一方の化合物を取得するには煩雑な分離操作
が要求されること、また原理的にもアミドの収率が半分
にしか達し得ないことなど、製造上、技術的に解決すべ
き諸々の問題が見られることから、原料のすべてを一方
の光学活性体に変換する手法の開発を行い、微生物を用
いてラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体、ま
たはベンズアルデヒドおよびその誘導体と青酸の混合物
から直接優位量の光学活性なＳ−（＋）−マンデルアミ
ドおよびその誘導体を製造する方法（特開平４−２２２
５９１号公報参照）を提案した。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】この特開平４−２２２
５９１号公報記載の方法は、原料のラセミ体シアンヒド
リンが水溶液中でベンズアルデヒドと青酸に解離平衡す
ることにより容易にラセミ化する性質を利用し、このラ
セミ化と光学特異的なニトリル水和活性を有する微生物
とを組合わせることにより、シアンヒドリンの全てをＳ
−体マンデルアミドおよびその誘導体に変換するもので
ある。しかしながら、反応時に酵素活性が除々に低下
し、菌体当りのマンデルアミド生産性が充分に高いもの
ではなかった。したがって、如何に酵素の失活を抑制
し、Ｓ−（＋）−マンデルアミドおよびその誘導体の生
産性を上昇させるかが課題であった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく研究を重ねた結果、反応時に原料のシアン
ヒドリンに対応するアルデヒドを特定量添加することに
より酵素の失活を抑制し得ることを見い出し本発明を完
成した。

【０００７】すなわち、本発明は、下記一般式（１）で
示されるラセミ体のシアンヒドリン、または該シアンヒ
ドリンに対応する下記一般式（２）で示されるアルデヒ
ドと青酸に、中性または塩基性の水性媒体中で、該シア
ンヒドリンのシアン基を立体特異的に水和する能力を有
する微生物またはその処理物を作用させることにより、
一般式（１）で示されるラセミ体のシアンヒドリンまた
は一般式（２）で示されるアルデヒドと青酸から直接優
位量の下記一般式（３）で示される光学活性なＳ−
（＋）−マンデルアミドまたはその誘導体を製造する方
法において、該シアンヒドリンに対応する一般式（２）
で示されるアルデヒドを、反応系内に溶解し得る範囲内
で、且つ一般式（１）で示されるラセミ体のシアンヒド
リンに対しては１〜１０倍モル、また青酸に対しては２
〜１１倍モル添加することを特徴とするＳ−（＋）−マ
ンデルアミドおよびその誘導体の製造法、である。

【０００８】

【化２】〔Ｘは水素、メチル基、メトキシ基、イソプロピル基、
ヒドロキシル基、ニトロ基、スルホン基またはハロゲン
を表す〕

【０００９】本発明においては、微生物反応の基質とし
て、一般式（１）で示されるラセミ体のシアンヒドリ
ン、またはこのシアンヒドリンに対応する、すなわち水
溶液中で該シアンヒドリンと解離平衡する下記一般式
（２）で示されるアルデヒドと青酸を使用する。

【００１０】一般式（１）のシアンヒドリンとしては、
例えば、マンデロニトリル、２−メチルマンデロニトリ
ル、２−メトキシマンデロニトリル、４−イソプロピル
マンデロニトリル、４−ヒドロキシマンデロニトリル、
３−および４−ニトロマンデロニトリル、３−スルホマ
ンデロニトリル、２−、３−および４−クロルマンデロ
ニトリル、２−、３−および４−ブロムマンデロニトリ
ルが挙げられ、一般式（２）で示されるアルデヒドは、
ベンズアルデヒド等のそれぞれ一般式（１）のシアンヒ
ドリンに対応するアルデヒドである。

【００１１】基質としてシアンヒドリンを用いる場合、
シアンヒドリンの濃度は、通常０．１〜１０重量％、好
ましくは０．２〜５．０重量％であり、このシアンヒド
リンに対応するアルデヒドを反応系内に溶解し得る範囲
内で、且つ該シアンヒドリンに対して１〜１０倍モル、
好ましくは１〜５倍モル添加する。また、基質としてア
ルデヒドと青酸を用いる場合には、青酸濃度は、通常
０．１〜１．０重量％、好ましくは０．１〜０．５重量
％であり、アルデヒドを反応系内に溶解し得る範囲内
で、且つ青酸に対して２〜１１倍モル、好ましくは２〜
６倍モル添加する。

【００１２】アルデヒドの添加量は、使用する基質の種
類、濃度により異なるが、上記範囲内で適宜決めること
ができる。添加量が反応系内に溶解し得る範囲を越える
と、アルデヒドの油滴が生成し、この油滴に基質が移行
するためか、反応速度が低下する。また、上記下限値未
満では効果が少なく、一方上限値地を越えても効果は頭
打ちとなる。

【００１３】反応媒体としては、基質であるシアンヒド
リンのラセミ化を促進するために、水または緩衝液など
の水性媒体を用い、反応系を中性付近ないしは塩基性、
すなわちｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０に調整
する。

【００１４】本発明に用いられる微生物としては、例え
ば、ロドコッカス属の微生物としてＡＴＣＣ３３２７
８、ロドコッカスｓｐ．ＨＮ６−１（微工研菌寄第１
１７７３号）、ロドコッカスｓｐ．ＨＴ４０−６（微
工研菌寄第１１７７４号）、ロドコッカスｓｐ．ＰＮ
４２−２（微工研菌寄第１１７７５号）およびシュード
モナス属の微生物としてシュードモナスクロロラフィ
スＢ２３（微工研条寄第１８７号）を挙げることがで
きる。

【００１５】次に本発明の一般的実施態様について説明
する。本発明に使用される微生物の培養は資化し得るグ
ルコース、グリセロール、サッカロースなどの炭素源、
尿素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの窒素
源、生育に必須の塩化マグネシウム、塩化カルシウム、
塩化鉄などの無機栄養素などを含有した通常の培地を用
いて行なわれる。また、これらの培地に酵母エキス、肉
エキス、糖蜜などの天然培地を添加したものも使用する
ことができる。さらに、培養初期から中期に生育を大き
く阻害しない濃度のベンゾニトリル、ベンジルシアニ
ド、イソブチロニトリルなどのニトリル類、ε−カプロ
ラクタムなどのラクタム類、イソブチルアミド、フェニ
ルアセトアミドなどのアミド類を酵素誘導物質として、
またコバルトイオン、鉄イオンなどを酵素の補欠分子族
として添加することにより高い酵素活性が得られる。

【００１６】使用する培地のｐＨは４〜１０、培養温度
は５〜５０℃の範囲で選べばよく、培養は１〜１４日程
度好気的に行い活性が最大となるまで継続すればよい。

【００１７】一般式（１）で示されるシアンヒドリン等
の水和反応は、上記の方法にて培養した微生物の菌体ま
たは菌体処理物（菌体の破砕物、粗・精製酵素、固定化
菌体・酵素等）を所定のｐＨに調製した水または緩衝液
などの水性媒体中で、所定量の基質およびアルデヒドに
接触させることによって行われる。

【００１８】微生物等の使用量は基質に対して乾燥菌体
として０．０１〜５．０重量％であり、反応温度は０〜
５０℃、好ましくは１０〜３０℃、反応時間は１〜７２
時間程度である。

【００１９】かくして、一般式（１）で示されるラセミ
体のシアンヒドリンまたは一般式（２）で示されるアル
デヒドと青酸から高収率で光学活性Ｓ−（＋）−マンデ
ルアミドおよびその誘導体が生産、蓄積される。生成物
の単離は濃縮、抽出、晶析などの公知の方法を利用して
行うことができる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。

【００２１】実施例１（１）培養下記培地にロドコッカス属のＰＮ４２−２、ＨＮ６−１
およびＨＴ４０−６株を各々接種し３０℃で９６時間好
気的に培養を行った。培地（ｐＨ７．４）グルコース２７ｇポリペプトン４ｇ酵母エキス２ｇ硫酸アンモニウム０．２ｇ硝酸アンモニウム２ｇＭｇＣｌ₂ ０．２ｇＣａＣｌ₂ ４０mg ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ４mg ＦｅＣｌ₃・７Ｈ₂Ｏ０．７mg ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．１mg ε−カプロラクタム４ｇＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ３０mg ３０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０００ml

【００２２】（２）活性測定培地から菌体を採取し、遠心分離により各々の菌体を２
０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３回洗浄した。沈
殿した菌体を上記緩衝液に懸濁し、これを終濃度が１０
ｍＭマンデロニトリルと０〜４０ｍＭベンズアルデヒド
となるようにりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、３
０℃、３０分間攪拌しながら反応を行った。反応の停止
は反応液を遠心分離し菌体を除去することにより行っ
た。上清中のマンデルアミド含量を液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）（カラム；SHODEXODS F511A キャリ
ア；0.1M H₃PO₄：アセトニトリル＝４：１，モニタ
ー；254nm)で分析した。活性は、３０℃において乾燥菌
体１ｍｇが１分間に反応液１ｍｌ当り１μmolの生成物
を与える能力を１ユニット（１Ｕ）と定義して求めた。
ベンズアルデヒド添加区の活性を無添加区を１００とし
たときの相対活性で表−１に示した。

【００２３】（３）生産性１０ｍＭマンデロニトリルと０〜４０ｍＭベンズアルデ
ヒドを含むりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）に微量（反応時
ＯＤ630 ＝ 0.005）の菌体を添加し、３０℃、７２時間
攪拌しながら反応させた。反応後、上清中のマンデルア
ミド含量を測定し、使用した菌体重量当たりのアミド生
産量を計算で求めた。ベンズアルデヒド無添加区の生産
性を１００としたときの相対生産性で表−１に示した。

【００２４】実施例２（１）培養下記培地にシュードモナスクロロラフィスＢ２３株
を接種し２５℃で９６時間好気的に培養を行った。培地（ｐＨ７．２）シュークロース１０ｇ味液１０ｇメタクリルアミド２ｇＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１０mg ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２０mg 蒸留水１０００ml

【００２５】（２）活性、生産性測定実施例１と同様にして行った。結果を表−１に示した。

【００２６】実施例３（１）培養実施例１と同様にしてロドコッカスＨＴ４０−６株を
培養した。

【００２７】（２）活性測定実施例１と同様に洗浄、懸濁したＨＴ４０−６菌体を、
２または３ｍＭのシアンヒドリンおよび各シアンヒドリ
ンに対応するアルデヒド２〜９ｍＭを含む２０ｍＭりん
酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、３０℃、３０分間攪
拌しながら反応を行い、実施例１と同様に相対活性を求
めた。結果を表−２に示した。

【００２８】（３）生産性測定実施例１と同様に洗浄、懸濁したＨＴ４０−６菌株を、
２または３ｍＭのシアンヒドリンおよび各シアンヒドリ
ンに対応するアルデヒド２〜９ｍＭを含む２０ｍＭりん
酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、３０℃で７２時間攪
拌しながら反応を行い、実施例１と同様にして相対生産
性を求めた。結果を表−２に示した。

【００２９】実施例４（１）培養実施例１と同様にロドコッカスＨＴ４０−６株を培養
した。

【００３０】（２）蓄積反応実施例１と同様に洗浄、懸濁したＨＴ４０−６株（乾燥
菌体として０．６ｇ）を１０ｍＭのマンデロニトリルと
３０ｍＭのベンズアルデヒドを含む３００ｍｌの２０ｍ
Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、１５℃で攪拌
しながら反応を行い、実施例１に示したＨＰＬＣにより
反応の進行を確認しながら、マンデロニトリルを手動で
供給し４８時間蓄積反応を行った。また、比較のためベ
ンズアルデヒド無添加でも同様な実験を行った。結果を
表−３に示した。

【００３１】なお、上記実施例１〜４において、生成し
たマンデルアミドおよびその誘導体の光学純度を光学分
割用カラム（ＣＨＩＲＡＬＣＥＬＣＡ−１，ダイセル
化学工業、キャリア；１００％エタノール）を用いて測
定した。その結果、いずれの実施例においても光学純度
はＳ−（＋）体として９０％ｅｅ以上であった。

【００３２】

【表１】

【００３３】

【表２】

【００３４】

【表３】

【００３５】

【発明の効果】本発明によれば、酵素の失活が抑制で
き、ラセミ体のシアンヒドリン、またはアルデヒドと青
酸から直接優位量（５０〜１００％）のＳ−（＋）−マ
ンデルアミド等を高収率で生産、蓄積することができ、
原料の全てを化学量論的に目的物に変換することも可能
である。

フロントページの続き (72)発明者遠藤隆一神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号日東化学工業株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記一般式（１）で示されるラセミ体の
シアンヒドリン、または該シアンヒドリンに対応する下
記一般式（２）で示されるアルデヒドと青酸に、中性ま
たは塩基性の水性媒体中で、該シアンヒドリンのシアン
基を立体特異的に水和する能力を有する微生物またはそ
の処理物を作用させることにより、一般式（１）で示さ
れるラセミ体のシアンヒドリンまたは一般式（２）で示
されるアルデヒドと青酸から直接優位量の下記一般式
（３）で示される光学活性なＳ−（＋）−マンデルアミ
ドまたはその誘導体を製造する方法において、該シアン
ヒドリンに対応する一般式（２）で示されるアルデヒド
を、反応系内に溶解し得る範囲内で、且つ一般式（１）
で示されるラセミ体のシアンヒドリンに対しては１〜１
０倍モル、また青酸に対しては２〜１１倍モル添加する
ことを特徴とするＳ−（＋）−マンデルアミドおよびそ
の誘導体の製造法。【化１】〔Ｘは水素、メチル基、メトキシ基、イソプロピル基、
ヒドロキシル基、ニトロ基、スルホン基またはハロゲン
を表す〕