JPH08507209A - 抗ガングリオシド抗体を産生するヒトのｂリンパ芽腫細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｌ６１２として同定されるヒトのＢリンパ芽種細胞系。Ｌ６１２細胞系は、エプスタインバーウイルスで形質変換された細胞系で、Ｎｅｕα２−３末端のエピトープを有する複合糖質に反応するヒトのモノクローナル抗体（Ｌ６１２）を分泌する。ＧＭ３やＧＭ４などのガラクトース残基は、種々の腫瘍組織上に存在する。Ｌ６１２抗体は、エピトープ含有腫瘍の患者の治療に有用であり、抗原代用物質および診断用試薬として使用する抗イディオタイプ抗体を産生させるのにも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 抗ガングリオシド抗体を産生するヒトのＢリンパ芽腫細胞系 この出願は、１９９０年１１月５日に出願された係属中の出願第０７／６０９ ，８０３号の部分継続出願である。 発明の背景 この発明は、米国国立癌研究所から授与された許可番号ＣＡ３０６４７、ＣＡ ４２３９６およびＣＡ１２５８２の下に米国政府の援助でもってなされたもので ある。１． 発明の分野 当発明は、エプスタインバーウイルス（ＥＢウイルス、ＥＢＶ）によって感染 し形質転換されたヒトのＢリンパ芽腫細胞系（B-lymphoblastoid cell line）に 関するものである。より詳しくは、この発明は、直接腫瘍を治するのに使用でき または抗原代用物質や診断用試薬用の抗イディオタイプ抗体を産生するのに使用 でる抗体を産生する能力のある同細胞系に関するものである。２． 関連技術の説明 発明の背景を説明しかつその実施に関し詳細な追加説明を行うためにここに参 照する出版物および他の参照資料は、ここに参照として編入するものである。便 宜のため、参照資料は、付属の参考文献のところに番号を付しグループ分けして ある。これらの出版物および参照資料の内容は、この明細書に参照として編入す る。 免疫グロブリンの可変部が外部抗原として作用し得る可能性は、Ｊｅｒｎｅに よりイディオタイプネットワーク説（参照資料１）によって最初に唱えられた この説によると、抗原結合部位上のまたはＡＢ１の骨格上のイディオタイプの認 識は、それぞれ抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄまたはＡＢ２）βまたはαの 産生をもたらす。このような「内部像」抗イディオタイプは、その元の抗原結合 部位との相補性のため、元の抗原を模倣し、しばしば類似の生物学的挙動を呈す る。内部像（internal image）の概念は、ある種のＡＢ２分子が抗原代用物質と して振る舞うことができ、それらの投与がＡＢ１の類似特性を呈する抗抗イディ オタイプ抗体の産生をもたらすことができる事実を称している。 抗イディオタイプを抗原代用物質として使用する免疫発生は、研究者らの間に 非常な興味を生じさせ、多くの研究者がウイルス、バクテリアそして他の病原体 に対して作用する特異な免疫を発生させるためにＡＢ２ワクチンで実験してきて いる（参照資料２、３）。この手法は、従来のワクチンや抗体が入手不能なとき 、または対応する抗原が遺伝子工学にとって好ましくない産生物であるときに有 用である。そのうえ、抗イディオタイプは、癌に対する免疫性を向上させるため の免疫調節剤として、さらには移植臓器の拒絶反応を抑制したり自己免疫病の進 行を抑制したりするための免疫抑制剤として使用することができる。 ガングリオシドは、ヒトの組織において基本的な膜構成要素であるグリコスフ ィンゴリピドである。ガングリオシドは、正常細胞の悪性形質転換の際に特性が 変化するので、癌の免疫療法のための好ましい標的抗原である。悪性黒色腫瘍は 、大量のガングリオシドを合成するため、ガングリオシドの免疫療法標的として の可能性を評 価するための有用な実験モデルとしての役を果たしてきた。多くのヒトの黒色腫 瘍の腫瘍関連ガングリオシドおよびそれらの各免疫原性が定義されてきている（ 参照資料１２〜２９）。加えて、多数の研究がガングリオシド抗原による活性免 疫で黒色腫瘍患者の生存を延ばしたことを報告している（参照資料４、５）。し かしながら、この技術は、多くの方面で、ガングリオシド抗原が何倍も希である 、すなわち供給が足りないという不便に遭遇している。 腫瘍関連の抗原は、多くの場合、自然界に低いレベルでしか存在せず、大量に 精製することが比較的困難である。これに対して、抗イディオタイプは、ハイブ リドーマ細胞から低コストで長期に亘って産生できる。そのうえ、現代の遺伝子 工学の技術は、ガングリオシドエピトープには応用できないものの、抗イディオ タイプペプチドを合成するのには使用することができる。以前にヒトの癌の活性 特異免疫療法のために開発された抗イディオタイプは、免疫原としてマウスのモ ノクローナル抗体（ＭｕＭａｂｓ）を使用してきた（参照資料６〜１１）。 マウスのモノクローナル抗体は、抗原代用物質としての使用に加えて、ヒトの 癌細胞の多くの抗原分子を定義し特徴づけるのにも採用されてきている。マウス のモノクローナル抗体は、ヒトのモノクローナル抗体に比べて、腫瘍抗原への強 い親和性、ハイブリドーマ腹水による高い抗体産生、そして腫瘍細胞上の高い抗 原密度を含むいくつかの利点を有している。しかしながら、治療上の使用に関し ては、マウスのモノクローナルを用いた最近の臨床的試みによると、ＭｕＭＡｂ ｓの繰り返し注入は実質上全患者に抗マウスＩｇ抗体を誘発するので、ヒトのモ ノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂｓ）の方が好ましいであろうことを示している。 これは、潜在的に危険な複雑 さを伴う免疫複合や免疫反応の形成につながる。加えて、ＨｕＭＡｂｓは、マウ スの免疫系では見逃されたエピトープを認識できる。 ヒトの癌細胞上のガングリオシド抗原と反応するＨｕＭＡｂｓの開発および臨 床レベルにおける抗腫瘍効果の実証が報告されている（参照資料２３、１２）。 再発性黒色腫瘍の患者がガングリオシドＧＤ２またはＧＭ２に対するＨｕＭＡｂ の腫瘍内注入を受け、役７０％の患者において部分的または完全な退行が認めら れた。免疫療法が効かなかった黒色腫瘍患者においては、標的抗原ＧＤ２もＧＭ ２も腫瘍細胞上に現れなかった。Ｌ１５およびＬ７２として同定される２種類の ＨｕＭＡｂがＥＢウイルスにより形質転換されたヒトのＢリンパ芽腫細胞系から 産生された（参照資料２９）。Ｌ１５およびＬ７２抗体は、いずれも多種の腫瘍 細胞に反応することが分かっていた。 ヒトの黒色腫瘍上のガングリオシドの量および質は異なる癌患者の間で大きく 異なるので、各々の患者の腫瘍細胞上でどのガングリオシドが優位であるかを同 定するための処置前バイオプシの検査により、不必要なＨｕＭＡｂの投与を避け ることが好ましい。 与えられた腫瘍上に存在するガングリオシドの質および量を検出するために使 われてきた免疫学的検定には、３種類の異なるものがある。それらは、免疫粘着 検定法（ＩＡ）、蛍光性ミクロスフェアを用いる直接免疫蛍光法、並びにＩＡ吸 収法および生化学的検定法を含む。これらの検定には、それぞれある限界および 利点がある。免疫学的検定には、生体採取した腫瘍組織からの単細胞懸濁液が必 要である。しかしながら、生存可能な高収率の腫瘍細胞個体群を得るのはしばし ば困難である。また、光学顕微鏡の下では、腫瘍細胞は、単球やマクロファージ から容易に区別できないかも知れない。 生化学的検定は、無傷の細胞を必要としない。しかしながら、ガングリオシドの 抽出および糖脂質製剤中のシアル酸の測定のために、比較的大きいボリュームの 腫瘍が必要である。 マウスのモノクローナル抗体を使用する生体採取標本上の抗原表記を定義する ために最も普通に利用される免疫学的技法は、組織セクションの免疫組織化学的 染色である。しかしながら、この好感度の方法は、ヒトのモノクローナル抗体お よびヒトの組織の組合せには容易には応用することができない。二次抗体（抗ヒ トＩｇ）を用いたヒト腫瘍組織の間接的な染色は、通常、豊富な内生的ヒトＩｇ への非特異的結合からの高レベルの背景ノイズという結果になる。バイオティニ レートされたヒトモノクローナル抗体を使った直接免疫染色法は、この高レベル 背景ノイズを克服するかも知れない（参照資料３０）。しかしながら、この方法 は、通常感度が低く、細胞表面に高密度の抗体が存在するときに最も効果的であ る。 現在、腫瘍上に存在するガングリオシドについて免疫性の抗体を産生する能力 のある追加のヒト細胞系を開発すべき必要性が引き続き存在している。新しい細 胞系により産生される抗ガングリオシド抗体は、腫瘍の直接的な処置に、および 抗原代用物質または診断用試薬として使うための抗イディオタイプの産生にも有 用であろう。 発明の概要 この発明により、各種の腫瘍に反応し黒色腫の治療に効果的であることが実証 された抗ガングリオシド抗体を分泌するヒトのＢリンパ芽腫細胞系（Ｂリンパ芽 球様細胞系（B-lymphoblastoid cell line））が開発された抗体は、癌の治療や 診断に応用可能である。この発明の細胞系は、Ｌ６１２と名付けられており、カ リフォルニ ア大学ロサンゼルス校医学部外科腫瘍学科（Division of Surgical Oncology at the University of California at Los Angeles School of Medicine）におい て保存維持されている。Ｌ６１２細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクション（メリーランド州ロックビル）（American Type Culture Collecti on，Rockville，Maryland）にＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０７２４として寄託さ れている。 この発明の特徴として、Ｌ６１２細胞系は、腫瘍抗原に反応するＩｇＭκ抗体 を産生するのに使われる。Ｌ６１２抗体は、局所注射により投与したときに、黒 色腫瘍の治療に効果があることが示されている。 この発明の他の特徴として、Ｌ６１２抗体は、抗原代用物質として利用できま たは診断手法において使用できるマウスの抗イディオタイプモノクローナル抗体 を作るのに使われる。 以下の詳細な説明を参照してこの発明がよりよく理解されるにつれて、この発 明の上記特徴および他の多くの特徴並びに付随する利点が明らかになるであろう 。 図面の簡単な説明 図１は、Ｌ６１２抗体Ｈ鎖の可変部（Ｖ領域）のためのヌクレオチド／アミノ 酸の配列である。相補性決定領域（complementary determining regions）に下 線を施した。 図２は、Ｌ６１２抗体Ｌ鎖の可変部（Ｖ領域）のためのヌクレオチド／アミノ 酸の配列である。相補性決定領域に下線を施した。 発明の詳細な説明 この発明の細胞系は、エプスタインバーウイルス形質転換法で形質転換された Ｂリンパ芽腫細胞系である。この細胞系は、Ｌ６１２と命名され、カリフォルニ ア大学ロサンゼルス校医学部外科腫瘍学部に保存されている。このＬ６１２細胞 系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Cultur e Collection，Rockville，Maryland）にＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０７２４で 寄託される。 Ｌ６１２細胞系は、２種の他のヒトモノクローナル抗ガングリオシド抗体類、 Ｌ５５（抗−ＧＭ２）およびＬ７２（抗ＧＤ２）を産生するために使用したのと 同じエプスタインバーウイルス形質転換法（参照資料２６〜２７および２９）に よってリンパ球から培養によって樹立した。（参照資料２９）に詳細に述べられ ているのと同じ形質転換法に従って、Ｌ６１２細胞系を樹立した。従来のＬ５５ とＬ７２の細胞系およびこの発明のＬ６１２の細胞系を樹立するのに用いられる エプスタインバーウイルス形質転換法は、公知でかつこの技術分野の研究者が使 用する通常の方法である。 Ｌ６１２細胞系を樹立するのに使用した具体的方法は、次のとおりである。 乳房切除中の乳癌患者から所属リンパ節を入手した。まず、このリンパ節を小 片に切断し、次いで、その小片をハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に懸濁 させることによって、リンパ球をこれらリンパ節から単離した。次に、この懸濁 液をステンレス金網を通過させて大きな組織の塊を分離し、次にＦｉｃｏｌｌの 密度勾配溶液を用いて遠心分離してリンパ球を凝集分離した。Ｅロゼット形成法 を用いてＴリンパ球を除去し、次いでＢリンパ球画分をＨＢＳＳで３回洗浄し、 次に１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０ 中でエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）とともに２０時間インキュベートした 。細胞を限界希釈法によってクローン化し、先に記載したＩＡ検定法（参照資料 ２９）によって抗体の産生について監視した。 ヒト乳癌細胞系のＭＤＡ−ＭＢ４３６（参照資料３１）とヒト黒色腫細胞系の ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１２（参照資料３２）を標的として使用した。４３６乳癌細 胞系に対して陽性の抗体を分泌するクローンは、樹立後すぐに抗体の産生を停止 した力（Ｍ１２黒色腫細胞系に反応するクローンは、抗体の産生を続け、そして 安定であった。抗体を分泌するクローンを、低濃度のウシ胎仔血清を含有するＲ ＰＭＩ１６４０に徐々に添加した。次に、そのクローンを、成長因子を含有する 血清なしの培地（ＦＤＡはIrvine Scientific Co．社（米国、カリフォルニア州 、アービン所在）から入手できるＨＢシリーズの血清なしの培地を承認した）内 で７回再クローン化した。Ｌ６１２細胞系の倍加時間は、１日間より短い。この 細胞系は、２０μｇ／ｍｌを越える量のＩｇＭκモノクローナル抗体を分泌した 。使用済培地中のＬ６１２抗体を先に述べたようにして精製した（参照資料２５ ）。さらに、Ｌ６１２細胞系によって産生された抗体は、細胞培養物から抗体を 取り出して精製するのに用いるいずれかの通常の方法によって単離する。 精製されたＬ６１２抗体は、各種のヒト腫瘍組織との反応性について試験した 。Ｌ６１２抗体は、補体の存在下で、抗原陽性ヒト腫瘍細胞に対して強い細胞障 害活性を有する。その反応性は、免疫粘着（ＩＡ）検定法と免疫粘着吸収（ＩＡ Ａ）検定法の両者を用いて試験した。試験結果を表Ｉに要約した 合計２１個の生検黒色腫、３２名の別個のドナー由来の末稍血リンパ球（ＰＢ Ｌ）および別の４４名のドナー由来の赤血球を試験した。２１個の黒色腫組織の うちの１３個（６２％）が抗原陽性であったが、これに対してＰＢＬ（０／３２ ）と赤血球（０／４４）は全く陰性であった。培養したヒト悪性細胞系も抗原の 存在について試験した（表Ｉ）。直接ＩＡ検定法で試験した１６個の黒色腫細胞 系のうち１２個（７５％）が陽性であった。残りの癌細胞系の陽性反応性は、次 のとおりであった肺癌：４／４、乳癌：５／７、消化器癌：２／７、他のタイプ の癌：１／４。しかし、試験した黒色腫細胞系に対して自己由来の、エプスタイ ンバーウイルスで形質転換されたＢ細胞系１１個は、敏感なＩＡ吸収検定法でも 陰性であった。黒色腫の陽性試料の百分率は肺癌の試料より低いが、単位試料当 たりの全反応性は、他の組織学的タイプの癌より黒色腫の方がはるかに高かった 。試験した黒色腫細胞系のうち、Ｍ１５とＭ１２が最高の反応性を示した。これ らの細胞系をノイラミニダーゼ（受容体破壊酵素）で処理すると、これら細胞系 の抗原性は完全に破壊されたが、トリプシンで処理したものは、破壊されなかっ た。 各種の基準糖脂質に対するＬ６１２抗体の反応性も測定した。これらの糖脂質 と、それぞれのＬ６１２抗体に対する抗原力価を、表ＩＩに示す。 基準糖脂質（５ｎｍｏｌ）をＩＡ阻害試験法でＬ６１２の抗原活性について試 験した。３種のガングリオシド：ＧＭ₄、ＧＭ₃およびＳＰＧは陽性の反応性を示 したが、これらの中の２種のＧＭ₄とＧＭ₃はＳＰＧ（１：１６）より強い結合性 （１：６４）を示した。ＩＩ³ＮｅｕＧｃ−Ｌａｃ−Ｃｅｒ、ＩＶ³ＮｅｕＧｃ− ｎＬｃＯｓｅ₄−Ｃｅｒ、ＧＭ₂、ＧＭ_1a、ＧＤ₃、ＧＤ₂、ＧＤ_1a、ＧＤ_1bおよび ＧＴ_1bを含む他のガングリオシド類ならびにＧｂＯｓｅ₃−Ｃｅｒ、Ｇｂ Ｏｓｅ₄−ＣｅｒおよびＧｇＯｓｅ₄−Ｃｅｒを含む中性糖脂質は、抗原活性を全 く示さなかった。上記結果をさらに確認するため、基準の糖脂質について、ＴＬ Ｃプレート上でＥＬＩＳＡ法と酵素免疫染色法を行った。ＥＬＩＳＡ法と酵素免 疫染色法で得た結果は、ＩＡ阻害検定法の結果と類似していた。ＥＬＩＳＡ法は 、微量滴定ウェル（microtiter wells）に結合させた１５個の基準糖脂質を用い て行った。やはり３種のガングリオシドＧＭ₃、ＧＭ₄およびＳＰＧが固相ＥＬＩ ＳＡ法で明確な結合活性を示した。残りのガングリオシド類は反応性を全く示さ なかった。 ＧＭ４、ＧＭ３、ＳＰＧ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＭ２、Ｎ−グリコリルＧＭ３、 ＣＤＨ、グロボシドおよびアシアロＧＭ１（１μｇ）によるＴＬＣプレートの酵 素免疫染色試験も実施した。ＧＭ３とＧＭ４で強い陽性を示した。ＳＰＧについ ては、より緩やかな反応性が観測された。ＧＭ２については、ごく僅かな反応性 が観察された。その外の糖脂質は、染色できなかった。これら異なる３種の免疫 検定法の結果は、ＨｕＭＡｂのＬ６１２がＮｅｕＡｃα２−３ガラクトース残基 を有するＧＭ３とＧＭ４のようなガングリオシド類の末端の糖を検出することを 実証している。 凍結切片をＨｕＭａｂＬ６１２で免疫染色すると、黒色腫、結腸腺癌および肺 腺癌を含む新生物組織に対する強い特異性を示した。ＨｕＭａｂは、ある種の新 生物組織を同定するためま優れたマーカを提供する。ＨｕＭａｂのＬ６１２は、 腎細胞線癌に結合することが報告されている（参照資料３５）。 Ｌ６１２抗体のＬ鎖とＨ鎖の両者の可変部のＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖 反応（ＰＣＲ）で決定した。チオシアン酸グアニジウム／塩化セシウム法を用い て、Ｌ６１２Ｂ−リンパ芽球系から全Ｒ ＮＡを調製した（参照資料３４）。１０μｇのＲＮＡを６０ｐｍｏｌのμＨ鎖ま たはκＬ鎖の３′プライマと混合し、７０℃で１０分間加熱した。得られた混合 物を、１０μｌの５Ｘ逆転写酵素緩衝液（ＢＲＬ）、４μｌの１０ｍＭのｄＮＴ Ｐ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの最終濃度：２００μ Ｍ）および３μｌの６００単位逆転写酵素（Superscript，ＢＲＬ）を含有する 、５０μｌの逆転写酵素反応溶液に添加した 得られた混合物を３７℃で１時間 インキュベートした。 次に、９７μｌのＰＣＲ混合物を３μｌのＲＮＡ−ｃＤＮＡ混合物に添加して 、標準のＰＣＲ反応を実施した そのＰＣＲ混合物は、１０ＸのＰＣＲ緩衝液（ 米国、カリフォルニア州所在のPerkin Elmer社）、各ｄＮＴＰの最終濃度が６０ μＭである１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物、５単位のＴａｑポリメラーゼ（Perkin E lmer社）および６０μＭの適正な５′と３′のＨ鎖とＬ鎖のプライマを含有して いた。得られた混合物を、Perkin Elmer/Cetus熱サイクラの中で、９１℃で１分 間、５２℃で２分間および７２℃で１．５分間の増幅を３５サイクル行い、次い で最終のインキュベーションを７２℃で１０分間行った。そのＰＣＲ産物の一部 は、２％アガロースゲル上に正しい大きさのバンドを生成した。μＨ鎖とκＬ鎖 のプライマは、それぞれ４９５個と６０３個の塩基対のｃＤＮＡ産物を生成した ゲルが正しい大きさの単一産物を示した場合、残りのＰＣＲ−ｃＤＮＡ産物をＰ ＣＲに付してさらに産物を得た。 ゲルによる産物を単離し、集め、フェノール／クロロホルムで抽出し、次いで エタノールで沈澱させた。次に、そのＤＮＡを、適正な制限酵素で消化し、抽出 し、沈澱させ、次にGeneClean（米国、カリフォルニア州、Ｂｉｏ１０１）で精 製した。そのＤＮＡを、Blue scriptベクター（米国、カリフォルニア州、Stratagene社）の適正な切断制限部 位に結合させた。可変部のμ鎖の１０個の独立クローンおよび可変部のκ鎖の４ 個の独立クローンを単離して、配列を決定した。Ｊ_H Ｈ鎖のプローブを用いて、 Ｈ鎖クローンを選別して確認した。配列決定は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequ enase，米国、オハイオ州、クリーブランド所在のＵＳＢ社）を用い、メーカの プロトコルにしたがって、ジデオキシヌクレオチド法によって行った。使用した プライマは次のとおりであった。Ｈμ鎖のリーダプライマ（３個のプライマー） （参照資料２９）： ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧ（ＡＧ）ＴＣ（ＣＴ） ＴＣＴ（ＧＴ）Ｃと、ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧ（ＣＴ）ＴＴＧＧＧＣＴＧ Ａ（ＣＧ）ＣＴＧＧ（ＣＧ）ＴＴＴ（ＣＴ）Ｔと、そしてＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴ Ｇ（ＡＧ）Ａ（ＡＣ）（ＡＣ）（ＡＴ）ＡＣＴ（ＧＴ）ＴＧ（ＧＴ）（ＡＴ）（ ＣＧ）Ｃ（ＡＴ）（ＣＴ）（ＣＧ）ＣＴ（ＣＴ）ＣＴＧである。これらのプライ マには、クローン化を容易にするＥｃｏＲＩ制限部位（下線を付けた部分）が含 まれている。Ｈμ鎖のＪ領域のプライマは、ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＣＧＡＧＧ ＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴであった。このプライマは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（下 線部分）を含んでいる。Ｌκ鎖のリーダプライマは、次のとおりであった（２個 のプライマ）（引例文献３０）。すなわち、ＧＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣ ＡＧＴＣＴＣＣＡと、ＧＡＡＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＧＡＧＴＣＴＣＣＡである 。これらのプライマには、ＳａｃＩ部位が含まれている（下線部分）。Ｌκ鎖の Ｊ領域のプライマは、ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣ ＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＡＡＧであった。このプラ イマには、Ｘ ｂａ部位が含まれている（下線部分）。 Ｈ鎖の可変部についてクローン化されたｃＤＮＡヌクレオチド配列とそのコー ド化アミノ酸配列を配列ＩＤ番号１に示す。上記のＨ鎖可変部のアミノ酸配列を 配列ＩＤ番号２に示す。Ｌ鎖の可変部についてクローン化されたｃＤＮＡヌクレ オチド配列とそのコード化アミノ酸配列を配列ＩＤ番号３に示す。上記のＬ鎖可 変部のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号４に示す。 また、Ｈ鎖可変部についてヌクレオチド／アミノ酸配列を図１に示す。その相 補性決定領域（complementary determining regions，ＣＤＲ）１、２および３ には、下線を付けてある。また、Ｌ鎖可変部についてヌクレオチド／アミノ酸配 列を図２に示す。また、そのＣＤＲ１，２および３にも下線を付けてある。 この発明によるＬ６１２抗体は、ＧＭ３ガングリオシドまたはＮｅｕＡｃ２− ３ガラクトースエピトープを含有する腫瘍を治療するため患者に投与される。Ｇ Ｍ３ガングリオシドは、Ｎｅｕα２−３ガラクトース残基を有する末端糖を有し ている。上記のような組織を治療するため、患者に抗体を投与するのに用いられ る通常の手法のいずれも用いることができる。これらの手法としては、静脈注射 もしくは腹腔注射および病変部内注射がある。病変部内注射は、再発性の皮膚腫 瘍に対する好ましい投与法である。Ｌ６１２抗体およびこの抗体の産生細胞系は 、公知の方法で変形もしくは変化させて、他の免疫グログリンのイソタイプおよ び腫瘍細胞を効率よく結合して殺すことができる抗体を産生する細胞を形成させ ることができる（参照資料３３）。利用される特定の投与量は、腫瘍の抗原性に よって変わり、そしてＬ５５およびＬ７２のような抗体を投与する公知の方法に したがって決定することができる。Ｌ６１２モノクロー ナル抗体は、ヒト黒色腫瘍の生検試料と強く反応する。また、Ｌ６１２抗体は、 肺癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌および腎臓癌由来のヒト腫瘍生検試料とも反応する が、反応程度は低い。ＵＣＬＡＳＯ−Ｍ１２黒色腫細胞系は、Ｌ６１２モノクロ ーナル抗体で試験した細胞系のなかで最高の反応性細胞系であると確認された。 ＵＣＬＡＳＯ−Ｍ１２細胞系は、カリフォルニア大学ロスアンゼルス校医学部外 科腫瘍学科に保存されている。 Ｌ６１２ＨｕＭａｂを、悪性皮膚黒色腫を治療する治療剤として使用した。Ｈ ｕＭａｂＬ６１２は、ヒトに使用する場合、先に述べたようにして生成した（参 照資料２５）。ヒト抗Ｇ_D2ＨｕＭａｂＬ７２の病変部内注射によって皮膚黒色腫 を退行させることができるということは、以前の研究で実証された（参照資料２ ３）。この実施例において、ＨｕＭａｂＬ６２とＨｕＭａｂＬ７２の効能を比較 する。 ８４歳の女性が、（彼女の左頬の急速に増殖する皮膚黒色腫病変部（１．９× １．６ｃｍ）の外科切除を受けた組織切片の病理試験を行ったところ、クラーク レベルＩＶの黒色腫であることが分かった。病変部生検試料のガングリオシド発 現は、Ｇ_M3に対しては中程度に陽性でありＧ_D2に対して陰性であることが分かっ た。外科手術を行ってから２週間後、その切開部位に再発が起こった。上部病変 部位は１週間毎に１ｍｌのＨｕＭａｂＬ６１２で治療し、下部病変部を１ｍｌの ＨｕＭａｂ７２ＨｕＭａｂで治療した。１カ月間治療した後（３回治療後）、Ｈ ｕＭａｂＬ６１２で治療された病変部の壊死と軟化が観察された。これに対して 、ＨｕＭａｂＬ７２ＨｕＭａｂで治療された病変部は全く反応を示さず、実際に はさらに進行した。この患者は、肝臓と脳に広く転移したため結局死亡した。 また、Ｌ６１２抗体は、抗原代用物質または診断用試薬として用いられる抗イ ディオタイプを産生するのに利用できるハイブリドーマを産生するのに有用であ る。ハイブリドーマの産生とそれに続く抗イディオタイプの生成は、以下の実施 手法において説明する。 完全フロイントアジュバント中の精製Ｌ６１２モノクローナル抗体２００μｇ を皮下注射することによって、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。２週間後に、 不完全フロイントアジュバント中のＬ６１２を別個に皮下注射してマウスの追加 免疫を行った。この追加免疫を行ってから１１日後、マウスに食塩水中のＬ６１ ２の２００μｇを腹腔内に注射した。３日後に脾臓を取り出し、標準手法を用い て脾細胞を黒色腫細胞系ＳＰ２／０と融合させてハイブリドーマを製造した。 ＨＡＴ培地選択を行った後、ハイブリドーマの培養ウェルを、ＥＬＩＳＡ法を 用いて抗体について試験した。抗イディオタイプ（ＡＢ２）を分泌するハイブリ ドーマを、ＨｕＭＡｂＬ６１２に対する強力な結合反応性があることと、３種の 他の対照のヒトＩｇＭ：Ｌ５５、Ｌ７２およびヒト血清ＩｇＭに対する反応性が ないことで同定した。抗原として用いる関連のないタンパク質としては、ウシ胎 仔血清とヒト血清アルブミンがある。５０μｌのＩｇＭまたはタンパク質（５０ μｇ／ｍｌ）で９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートをコートして抗原として用い、 ＡＢ２を検出した。ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭをＡＢ２ 検出プローブとして使用し、続いて基質を加え次いで先に記載したように４９０ ｎｍにおける吸光度を読み取った（参照資料１９）。 上記のようにして調製した約２５００個のハイブリドーマ培養ウェルのＨＡＴ 選択を行って、Ｌ６１２ＨｕＭＡｂに対して明確な反 応性を有しているが、３種の他の対照のヒトＩｇＭおよび２種の関連のない血清 タンパク質抗原には全く反応性を示さない抗体を分泌する４０個のハイブリドー マを得た。これらの抗６１２抗体がＬ６１２の抗原結合部位に対するＡＢ２βタ イプの抗体であるか、またはＬ６１２の抗原結合部位の外側のペプチド領域に結 合されたＡＢ２α抗体であるかを決定するために、ＧＭ３陽性標的細胞系にもし くは精製抗原のガングリオシドＧＭ３に結合するＬ６１２に対するこれらの抗６ １２抗体の阻害活性を３種の検定システム：ＩＡ阻害法、細胞ＥＬＩＳＡ阻害法 およびＧＭ３−ＥＬＩＳＡ阻害法を使って試験した。検定において、試験した４ ０個の抗体のうち、７個が抗原陽性標的黒色腫細胞系（ＵＣＬＡＳＯ−Ｍ１２） に結合するＬ６１２を阻害し、５０％以上がＧＭ３に結合するＬ６１２を阻害し たが、残りの１２個は阻害活性が弱いかまたは阻害活性を全く示さなかった。 ７個の阻害活性抗イディオタイプのうち、４Ｃ１０として識別されたものを、 腫瘍を治療するのに用いる好ましいβ型抗イディオタイプとして、クローン化す るために選択した。非阻害性群から１８Ｃ６として識別された抗イディオタイプ を、免疫診断検定法に使用する好ましいα型抗イディオタイプとして、クローン 化するため選択した。抗イディオタイプの４Ｃ１０と１８Ｃ６の両者を、イソタ イプの抗グロブリンで試験した結果、ＩｇＧ１クラスのものでありかつκＬ鎖を 含有することが見出された。 ４Ｃ１０と１８Ｃ６でクローン化されたハイブリドーマ細胞系を、ＦＣＳ含有 ＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させ、５〜１０μｇ／ｍｌの抗体を培養物上澄液中 に分泌させた。これら培養物の上澄み液中の、Ｌ６１２に対する抗イディオタイ プのＥＬＩＳＡ法による力価 は、１：２００〜１：１０００／１０⁶ハイブリドーマの範囲内であった。抗イ ディオタイプの１８Ｃ６は、ＩＡ検定法において標的細胞に対しおよびＥＬＩＳ Ａ法においてガングリオシドＧＭ３に対しＨｕＭＡｂＬ６１２の低い結合阻害活 性を実証し、一方４Ｃ１０は、同じ抗体濃度で、ＥＬＩＳＡ検定法とＩＡ検定法 の両方において強い阻害性を示した。対照標準の検定として、４Ｃ１０と１８Ｃ ６は、関連のない抗原システムのＨｕＭＡｂＬ７２の、Ｍ１４標的細胞またはＧ Ｄ２抗原に対する結合を阻害できなかった。１８Ｃ６の結合阻害性が欠如してい ることは、ＧＭ３抗原結合部位の外側に、Ｌ６１２抗体の結合部位があることを 示し、そして４Ｃ１０の特異的結合阻害は、その結合部位が抗原結合部位の中か その近傍にあることを示す。 ４Ｃ１０と１８Ｃ６のモノクローナル抗イディオタイプを分泌するハイブリド ーマ細胞系は、カリフォルニア大学ロスアンゼルス校医学部の外科腫瘍学科に保 存されている。 Ｌ６１２に対して産生される４Ｃ１０抗イディオタイプおよび他のβ型抗イデ ィオタイプは、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用して腫瘍を治療するこ とができる。それらは、黒色腫の治療に用いられるのに好まれる。これらのβ型 イディオタイプは、抗癌免疫を高め、臓器移植の拒絶反応を抑制し、そして自己 免疫病を抑制するための免疫モジュレータとして使用することもできる。 β−抗イディオタイプは、抗体を患者に導入するのに使用する通常の手法のい ずれによっても投与することができる。これらの手法としては、皮下注射、静脈 注射または腫瘍内注射がある。β型の抗イディオタイプは、ＫＬＨと結合させ次 いでフロイントの完全アジュバントのような適切な担体中に乳化することが好ま しい。β型抗 イディオタイプに用いる特定の投与量は、治療される腫瘍および多数の他の要因 によって変わる。投与レベルは、一般的に知られていて、抗原免疫化剤またはモ ノクローナル抗体で患者を治療する場合に利用される公知の方法と原理によって 規定される。 Ｌ６１２抗体に対するβ型抗イディオタイプの免疫原的有用性が以下のように 実証された ５頭の共通遺伝子系のＢａ１ｂ／ｃマウスを精製４Ｃ１０−ＫＬＨで免疫化し た。対照標準として４頭のマウスをＩｇＧ１−ＫＬＨで免疫化し一頭のマウスを ＫＬＨ単独で免疫化した。その免疫化された血清を、精製ＧＭ３を抗原の起源と して用いてＥＬＩＳＡ法によって監視し、そして抗原陽性Ｍ１２黒色腫細胞系を 用いてＩＡ検定法で監視した。ＥＬＩＳＡ法の場合、ペルオキシダーゼを結合さ せたヤギ抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社） を二次抗体として用いた。 測定可能な抗体（ＡＢ３）が、１００μｇの４Ｃ１０−ＫＬＨによる５頭の免 疫化のうちの３頭に産生された。免疫化血清は、ＧＭ３に結合したが、ＣＤＨ（ アシアロＧＭ３）には結合したかった。ＩｇＧ−ＫＬＨによりまたはＫＬＨだけ により免疫化された５頭のマウス由来の血清は、いずれの糖脂質にも全く反応を 示さなかった。ＡＢ３のＩｇクラスを決定する別の分析法（ＥＬＩＳＡ法とＴＬ Ｃ免疫染色法）では、反応性の大部分は、ＩｇＭであると同定された。 ＩＡ検定法において、Ｍ１２細胞と反応するかも知れない種特異性の天然抗体 を除くために、免疫化されたマウス血清を、ヒト赤血球で、４℃で一夜、予め吸 収させた。４＋のＩＡスコアを、吸収血清の１：１０希釈によって得た。対照標 準の血清は、１：２の希釈でも反応性を全く示さなかった。陽性反応性が細胞表 面上でＧＭ３ 抗原に対して起こったことを確認するため、ＩＡ阻害試験を行った。この試験に は、ＧＭ３（１０μｇ）、ＣＤＨ（１０μｇ）、４Ｃ１０（１０μｇ）およびＢ ａｌｂ／ｃハイブリドーマ腹水から精製した関連のないＩｇＧ１（１０μｇ）を 用いた。ＧＭ３や精製４Ｃ１０では反応性が完全に阻害されたが、ＣＤＨや関連 のないＩｇＧ１では全く阻害されなかった 上記の実施例によって、β型抗イディオタイプが黒色腫に免疫反応性であるＡ Ｂ３抗体を産生することが実証された。したがって、Ｌ６１２抗体に応答して生 成するこれらβ型抗イディオタイプは、黒色腫を治療する際の免疫化剤として有 効である。 Ｌ６１２抗体に応答して産生されるα型抗イディオタイプは、３ステップ細胞 ＥＬＩＳＡ法および腫瘍組織切片の３ステップ免疫ペルオキシターゼ染色法のよ うな免疫診断法に使用することができる。実施例は次のとおりである。３ステップ細胞ＥＬＩＳＡ法 生育可能なＭ１２細胞（１×１０⁵）を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでプリブロッキ ング（pre-blocking）を行った後、Ｕ字型底の９６０ウェル微量滴定プレート（ Immulon-1，Dynatec）上にプレートした。５０μｌのＬ６１２（１００μｇ／ｍ ｌ）を添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。混合物を洗浄して未結 合のＨｕＭＡｂＬ６１２を除いた後、細胞を、マウスモノクロナル抗イディオタ イプの１８Ｃ６（１００μｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間インキュベートした 。洗浄した後、５０μｌのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１／ １０，０００希釈）（Jackson Immuno Research）を添加し、プレートを３０分 間インキュベートした。ＰＢＳ 溶液で洗浄した後、ペルオキシダーゼに対する基質を添加し、次いで結合活性を 、Ｖｍａｘ動的マイクロプレートリーダを用いて、４９０ｎｍにおける吸光度の 関数として求めた。 Ｌ６１２の抗原結合部位力（腫瘍細胞に発現されるＧＭ３で占有されている場 合、細胞に捕捉されたＨｕＭＡｂＬ６１２は、抗イディオタイプβに対するその 結合活性は減少している筈であるが、抗イディオタイプαに対しては充分な結合 活性を依然として保持している。高密度の対応する抗原を発現する培養Ｍ１２黒 色腫細胞を用いて、上述の手法により、このプロセスが確認された。 上記の細胞結合検定法は、ＥＬＩＳＡ技法の変形である。陽性反応の特異性を 確証するために、いくつかの対照標準検定を行った。対照標準の抗ガングリオシ ドＨｕＭＡｂとしてはＬ５５（ＩｇＭ抗ＧＭ２）およびＬ７２（ＩｇＭ抗ＧＤ２ ）があるが、これら両者は、ＧＭ２およびＧＤ２が豊富なＭ１４黒色腫細胞系に 対して強い結合活性を示す（参照資料２６、２７）。抗イディオタイプの１８６ Ｃ６は、ＨｕＭａＢＬ６１２とともに予めインキュベートした後のＭ１２細胞に 強く反応したが、Ｌ５５またはＬ７２のＨｕＭＡｂとともに予めインキュベート したＭ１４細胞には反応しなかった。ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇも、マ ウス抗イディオタイプ単独、Ｌ６１２、またはＬ６１２プラス（抗イディオタイ プβ）を含む他の対照標準の場合、Ｍ１２細胞と反応しなかった。 次いで、細胞ＥＬＩＳＡ検定法を、他のいくつかのヒト腫瘍細胞系に適用した 。２ステップ細胞結合検定法（ＨｕＭＡｂ＋ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＭ ）を、３ステップ細胞結合検定法と比較して、３ステップ検定法の有効性を評価 した。３ステップ検定法は、２ステップ検定法と並行した反応性を有し、そして ほとんどすべて の細胞系で感度がわずかに高かった。このデータは、３ステップ検定法のＥＬＩ ＳＡ吸光度値が、細胞表面のＧＭ３抗原の密度の違いを正確に反映し、かつ生体 外の検定法の２ステップ法と密接に関連していることを示している。組織切片の３ステップ免疫ペルオキシダーゼ染色法 ４μｍ厚の組織切片を、ＯＴＣ化合物中に新たに凍結させた組織から切り取り 、直ちに冷ホルムアルデヒド緩衝液（１２ｇのトリス緩衝液、９ｇの塩化ナトリ ウム、４０ｍｌの３７％ホルムアルデヒド、ｐＨ７．４）で固定し、次いで風乾 した。スライドをトリス緩衝液中に５分間浸漬し、次に３％過酸化水素で１０分 間処理して、内因性のペルオキシダーゼ活性をクエンチした。 流動水中で５分間洗浄した後、切片を５％の正常ヒト血清で２０分間覆った。 次いで、ＨｕＭＡｂＬ６１２（２００μｌ中１０μｇのＩｇＭ）を添加し、４５ 分間インキュベートした。スライドをトリス緩衝液中で５分間洗浄し、精製抗イ ディオタイプ１８Ｃ６（２００μｌ中１０μｇのＩｇＧ１）を添加し、３０分間 インキュベートした。 スライドを再び洗浄した後、三次抗体として１／１００に希釈したビオチニル 化ヤギ抗マウスＩｇＧ（米国、カリフォルニア州、バーリンゲーム所在のVector Laboratories社）を添加し、２５分間インキュベートした。洗浄後、ペルオキ シダーゼ結合ストレプタビジン（１／１０００希釈度）（米国、サンフランシス コ所在のZymed Laboratories社）を添加し、２０分間インキュベートした。洗浄 後、スライドを、６ｍｌのアミノエチルカルバゾール、５０ｍｌの０．０２Ｍ酢 酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．１）および０．４ｍｌの新たに調製した３％過酸 化水素水を含有する基質溶液中に５分間浸漬 した。スライドを水道水でもう一度洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色を行い、 次いでグリセリン−ゼラチンを用いてカバースリップで染色切片をカバーした免 疫ペルオキシダーゼの３ステップ検定法を用いて、スナップ凍結されていた外科 採取腫瘍組織に対するＬ６１２抗体の結合を検出するのに成功した。 この発明の代表的な実施態様を説明してきたが、ここに開示されているのは例 示に過ぎず、その外の各種の代替、適合および変更がこの発明の範囲内でなされ 得ることを、当該技術分野の当業者は理解すべきである。例えば、Ｌ６１２抗体 を用いて、各種の治療にまたは診断用試薬として有用なキメラ抗体を製造するこ とができる。したがって、この発明は、ここに例示されている特定の実施態様に 限定されず、後記の請求の範囲によってのみ限定される。 参照文献 配列リスト （１）一般情報 （ｉ）出願人 イリエ レイコ エフ （ｉｉ）発明の名称 抗ガングリオシド抗体を産生するヒトのＢリンパ芽 腫細胞系 （ｉｉｉ）配列の数 ４ （ｉｖ）連絡住所 （Ａ）宛先 Ｐｏｍｓ，ｍｉｔｈ，Ｌａｎｄｅ ＆ Ｒｏｓｅ （Ｂ）街 アベニューオブザスターズ ２１２１ １４００号 室 （Ｃ）市 ロサンゼルス （Ｄ）州 カリフォルニア （Ｅ）国 アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号 ９００６７ （ｖ）コンピュータ読み取り書式 （Ａ）メディアタイプ フロッピディスク （Ｂ）コンピュータ ＩＢＭ−ＰＣコンパチ （Ｃ）ＯＳ ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＃１ ．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５ （ｖｉ）本出願データ （Ａ）出願番号 ＵＳ （Ｂ）出願日 （Ｃ）分類 （ｖｉｉ）先出願データ （Ａ）出願番号 ＵＳ ０７／６０９８０３ （Ｂ）出願日 １９９０年１１月０５日 （ｖｉｉｉ）代理人情報 （Ａ）氏名 Ｏｌｄｅｎｋａｍｐ，Ｄａｖｉｄ Ｊ （Ｂ）登録番号 ２９４２１ （Ｃ）整理番号 ９４２６８ （ｉｘ）通信情報 （Ａ）電話 ３１０７８８５０４６ （Ｂ）ＦＡＸ ３１０２７７１２９７ （２）配列情報 配列ＩＤ番号 １ （ｉ）配列特性 （Ａ）配列の長さ ４３２塩基対 （Ｂ）配列の型 核酸 （Ｃ）鎖の数 一本鎖 （Ｄ）トポロジ 直鎖状 （ｉｉ）配列の種類 ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス Ｎｏ （ｖｉ）起源 （Ａ）生物名 ホモサピエンス （Ｇ）細胞の種類 ＥＢウイルスによる形質転換Ｂ細胞 （Ｈ）セルライン Ｌ６１２ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ＣＤＳ （Ｂ）存在位置 １．．４３２ （Ｄ）他の情報 ／機能＝「Ｈ鎖」 ／生産物＝「免疫グロブリン可変部」 ／標準名称＝「ＨｕＭａｂ Ｌ６１２ Ｈ鎖可変部配列」 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ （Ｂ）存在位置 １４８．．１６２ （Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域１ （ＣＤＲ１）」 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ （Ｂ）存在位置 ２７１．．３００ （Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域２ （ＣＤＲ２）」 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ （Ｂ）存在位置 ３９７．．４２９ （Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域３ （ＣＤＲ３）」 （ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 １ （２）配列情報 配列ＩＤ番号 ２ （ｉ）配列特性 （Ａ）配列の長さ １４４アミノ酸 （Ｂ）配列の型 アミノ酸 （Ｄ）トポロジ リニア （ｉｉ）配列の種類 蛋白質 （ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 ２ （２）配列情報 配列ＩＤ番号 ３ （ｉ）配列特性 （Ａ）配列の長さ ３６０塩基対 （Ｂ）配列の型 核酸 （Ｃ）鎖の数 一本鎖 （Ｄ）トポロジ 直鎖状 （ｉｉ）配列の種類 ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル Ｎｏ （ｉｖ）アンティセンス Ｎｏ （ｖｉ）起源 （Ａ）生物体 ホモサピエンス （Ｃ）個体単離 ＥＢウイルスによる形質転換 Ｂ細胞 （Ｇ）細胞の種類 Ｂ細胞 （Ｈ）セルライン Ｌ６１２ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ＣＤＳ （Ｂ）存在位置 １．．３６０ （Ｄ）他の情報 ／機能＝「免疫グロブリンＬ鎖」 ／生産物＝「ＨｕＭａｂ Ｌ６１２ Ｌ鎖可変部」 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ （Ｂ）存在位置 ５８．．１０８ （Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域１ （ＣＤＲ１）」 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ （Ｂ）存在位置 １５４．．１７４ （Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域２ （ＣＤＲ２）」 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ （Ｂ）存在位置 ２７１．．２９７ （Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域３ （ＣＤＲ３）」 （ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 ３ （２）配列情報 配列ＩＤ番号 ４ （ｉ）配列特性 （Ａ）配列の長さ １２０アミノ酸 （Ｂ）配列の型 アミノ酸 （Ｄ）トポロジ リニア （ｉｉ）配列の種類 蛋白質 （ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 ４

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】請求内容は、下記のとおりである。 １．Ｌ６１２として同定され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （American Type Culture Collection）にＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ１０７２４と して寄託されているヒトのＢリンパ芽腫細胞系。 ２．Ｌ６１２ヒトＢリンパ芽腫細胞系から分泌される抗ガングリオシド抗体およ びそのイソタイプを含んで成る物質の組成物。 ３．腫瘍組織を免疫的に効果のある分量のＬ６１２抗体を用いて治療するステッ プを含んで成るガングリオシド含有腫瘍組織の治療方法。 ４．請求項３に記載の腫瘍組織の治療方法であって、 該腫瘍組織が黒色腫瘍組織であることを特徴とするもの。 ５．請求項２に記載の物質の組成物であって、 該物質の組成物が本質的に該抗体および薬学的に許容し得る担体から成ることを 特徴とするもの。 ６．薬学的に効果のある分量の請求項５に記載の組成物を患者に投与するステッ プを含んで成るガングリオシド含有腫瘍組織を持った患者の治療方法。 ７．請求項６に記載の患者の治療方法であって、該組成物が局所注射により投与 されることを特徴とするもの。 ８．ガングリオシド抗体ＧＭ３およびＧＭ４に反応し、他のガングリオシド抗原 には本質的に反応しない抗体を分泌することのできるヒトのＢリンパ芽腫細胞系 。 ９．配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列を含んで成るＨ鎖可変部を含む抗体を 含んで成る物質の組成物。 １０．配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列を含んで成るＬ鎖可変部を含む抗体 を含んで成る物質の組成物。 １１．請求項９に記載の物質の組成物であって、該抗体が配列ＩＤ番号４に記載 のアミノ酸配列を含む成るＬ鎖可変部を含んで成ることを特徴とするもの。 １２．図１に記載の相補性決定領域を含んだＨ鎖可変部を含む抗体を含んで成る 物質の組成物。 １３．図２に記載の相補性決定領域を含んだＬ鎖可変部を含む抗体を含んで成る 物質の組成物。 １４．請求項１３に記載の物質の組成物であって、該抗体が図２に記載の相補性 決定領域を含むＬ鎖可変部を含んで成ることを特徴とするもの。