ES2211877T3 - Linea celular linfoblastoide b humana que secreta un anticuerpo anti-gangliosido. - Google Patents
Linea celular linfoblastoide b humana que secreta un anticuerpo anti-gangliosido.Info
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Abstract
UNA LINEA DE CELULAS B-LINFOBLASTOIDE HUMANAS QUE SE IDENTIFICA COMO L612. LA LINEA DE CELULAS L612 ES UNA LINEA DE CELULA DE VIRUS EPSTEIN-BARR TRANSFORMADA QUE SEGREGA UN ANTICUERPO MONOCLONAL HUMANO (L612) QUE ES REACTIVO CON GLICOCONJUGADOS QUE TIENEN UN EPITOPO DE TERMINAL NEUAC 2-3 RESIDUOS DE GALACTOSA, COMO GM3 Y GM4 PRESENTES EN UNA VARIEDAD DE TEJIDOS DE TUMORES HUMANOS. EL ANTICUERPO L612 ES UTIL EN EL TRATAMIENTO DE PACIENTES CON EL EPITOPO QUE CONTIENE TUMORES Y TAMBIEN EN EL AUMENTO DE ANTICUERPOS ANTI-ID PARA USAR COMO SUSTITUTOS DE ANTIGENOS Y REAGENTES DE DIAGNOSTICO.
Description
Línea celular linfoblastoide B humana que secreta
un anticuerpo anti-gangliósido.
Esta invención se realizó con el apoyo del
gobierno con las concesiones nº CA 30647, CA 42396 y CA 12582
otorgadas por el National cáncer Institute.
La presente invención se refiere en general a
líneas celulares humanas linfoblastoides B transformadas por el
virus de Epstein-Barr. Más particularmente, la
presente invención se refiere a dichas líneas celulares las cuales
son capaces de producir anticuerpos los cuales se pueden usar para
tratar directamente tumores o los cuales se pueden usar para crear
anticuerpos anti-id para su uso como sustitutos de
antígenos o reactivos de diagnóstico.
Las publicaciones y otros materiales de
referencia que se mencionan en el presente documento para describir
los antecedentes de la invención y para proporcionar detalles
adicionales referentes a su práctica se mencionan numéricamente y
están agrupados en la bibliografía adjunta.
La posibilidad de que las zonas variables de
inmunoglobulinas pudieran actuar como antígenos externos fue
reconocida en primer lugar por Jerne en su teoría de la red de
idiotipos (1). Según esta teoría, el reconocimiento de idiotipos en
el sitio de combinación de los antígenos, o en el marco del AB1, da
como resultado la producción de anti-idiotipos
(anti-ids o AB2) beta y alfa, respectivamente.
Dichos anti-idiotipos de "imagen interna",
gracias a su complementariedad con el lugar de unión de los
antígenos originales, imitan el antígeno original y frecuentemente
se comportan de una manera biológicamente similar. El concepto de
imagen interna se refiere al hecho de que algunas moléculas AB2
pueden actuar como sustitutos de antígenos y su administración puede
llevar a la producción de anticuerpos
anti-anti-idiotipos que presentan
características similares al AB1.
La inmunización que usa anti-ids
como sustitutos de antígenos ha generado mucho interés entre los
investigadores, muchos de los cuales han experimentado con vacunas
AB2 para una inmunización específica activa contra virus, bacterias,
y otros patógenos (2, 3). Este enfoque es útil cuando no se puede
disponer de una vacuna o anticuerpos convencionales, o son difíciles
de producir o cuando el antígeno correspondiente no es un producto
adecuado para la ingeniería genética. Además, los
anti-ids se pueden usar como inmunomoduladores para
estimular la inmunidad contra el cáncer, y como inmunosupresores
para evitar el rechazo de órganos trasplantados y para evitar la
progresión de enfermedades autoinmunes.
Los gangliósidos son glicosfingolípidos que son
componentes fundamentales de la membrana en tejidos humanos. Los
gangliósidos experimentan cambios característicos durante la
transformación maligna de células normales y por lo tanto son
antígenos objetivo deseables para la inmunoterapia del cáncer. El
melanoma sintetiza un gran número de gangliósidos y por lo tanto ha
servido como un modelo útil para valorar el potencial de los
gangliósidos como objetivos de inmunoterapia. Se ha definido un
número de gangliósidos asociados al tumor de melanoma humano y su
inmunogenicidad respectiva (12-29). Además, una
serie de estudios ha dado a conocer que la inmunización activa con
antígenos gangliósidos da como resultado una supervivencia
prolongada de los pacientes con melanoma (4, 5). Sin embargo, esta
técnica se resiente en muchas áreas, en concreto los antígenos
gangliósidos son poco comunes o escasean.
Los antígenos asociados a tumores, en la mayoría
de los casos, están presentes en la naturaleza solamente a niveles
bajos y son relativamente difíciles de purificar en grandes
cantidades. Por el contrario, los anti-ids se pueden
secretar a partir de células hibridoma con costes bajos durante
periodos de tiempo prolongados. Además, la tecnología de la
ingeniería genética actual, aunque no es aplicable a epítopos de
gangliósidos, se puede usar para sintetizar los péptidos
anti-id. Los anti-ids desarrollados
anteriormente para la inmunoterapia específica activa del cáncer
humano han usado anticuerpos monoclonales murinos (MuMabs) como
inmunógenos (6-11).
Además de su uso como sustitutos de antígenos,
los anticuerpos monoclonales murinos también se han utilizado para
definir y caracterizar muchas moléculas antigénicas en células
cancerígenas humanas. Los anticuerpos monoclonales murinos presentan
varias ventajas con respecto a los anticuerpos monoclonales humanos
incluyendo una fuerte afinidad a los antígenos tumorales, una mayor
secreción de anticuerpos por la ascitis del hibridoma, y una mayor
densidad de antígenos en células tumorales. No obstante, con
respecto al uso terapéutico, ensayos clínicos recientes con
monoclonales murinos han indicado que los anticuerpos monoclonales
humanos (HuMAbs) pueden ser preferibles ya que las inyecciones
repetidas de MuMAbs inducen anticuerpos Ig
anti-murinos en prácticamente todos los pacientes.
Esto conduce a la formación de complejos inmunes y reacciones
inmunes con complicaciones potencialmente peligrosas. Además, los
HuMAbs pueden reconocer epítopos que son pasados por alto por el
sistema inmune murino.
Se tiene conocimiento del desarrollo de HuMAbs
que reaccionan con antígenos gangliósidos en células cancerígenas
humanas y de la demostración de su efecto antitumoral en el nivel
clínico (23, 12). Pacientes con melanoma recurrente recibieron
inyecciones intratumorales de HuMAb a gangliósido GD2 o GM2, y se
observó una regresión parcial o completa en aproximadamente el 70%
de los pacientes. En aquellos pacientes con melanoma en los que la
inmunoterapia resultó ineficaz, el antígeno objetivo GD2 o GM2 no se
expresó en las células tumorales. Dos HuMAbs identificados como L55
y L72 han sido producidos a partir de líneas celulares humanas
linfoblastoides B las cuales han sido transformadas por el virus de
Epstein-Barr (29). Se observó que ambos anticuerpos
L55 y L72 reaccionaban con una variedad de células tumorales.
Como la cantidad y calidad de gangliósidos en el
melanoma humano son ampliamente heterogéneas entre diferentes
pacientes con cáncer, es deseable evitar una administración
innecesaria de HuMAb mediante la examinación de una biopsia
pretratamiento para identificar qué gangliósidos dominan en las
células tumorales de cada paciente.
Existen tres ensayos inmunológicos diferentes los
cuales se han usado para detectar la calidad y cantidad de
gangliósidos presentes en un tumor determinado. Los mismos incluyen:
el ensayo de adherencia inmune (IA); inmunofluorescencia directa con
microesferas fluoresceínadas; y absorción IA, y un ensayo
bioquímico. Cada uno de estos ensayos tiene ciertas limitaciones y
ventajas. El ensayo inmunológico requiere suspensiones celulares
individuales a partir de los tejidos tumorales en los que se ha
realizado la biopsia. No obstante, con frecuencia resulta difícil
obtener poblaciones de células tumorales de alto rendimiento
viables. Además, en un microscopio óptico, las células tumorales no
se pueden diferenciar fácilmente con respecto a los monocitos y los
macrófagos. El ensayo bioquímico no requiere células intactas. No
obstante, se requiere un volumen relativamente grande de tumor para
la extracción de gangliósidos y la medición del ácido sálico en la
preparación de glicolípidos.
La técnica inmunológica más comúnmente usada para
definir la expresión antigénica en especímenes de biopsia usando
anticuerpos monoclonales murinos es la coloración inmunohistoquímica
de secciones de tejidos. No obstante, este método delicado no se
puede aplicar fácilmente a combinaciones de anticuerpos monoclonales
humanos y tejidos humanos. Habitualmente la coloración indirecta de
tejidos tumorales humanos con el segundo anticuerpo (Ig
anti-humana) da como resultado un alto ruido de
fondo a partir de la unión no específica a Ig humana endógena
abundante. La inmunocoloración directa usando anticuerpos
monoclonales humanos biotinilatados puede superar este alto ruido de
fondo (30). No obstante, habitualmente este método es menos delicado
y es el más eficaz cuando en la superficie celular hay presente un
antígeno de alta densidad.
Actualmente, existe una necesidad constante de
desarrollar líneas celulares humanas adicionales las cuales sean
capaces de producir un anticuerpo que sea inmunogénico con respecto
a los gangliósidos presentes en tumores. Los anticuerpos
anti-gangliósidos producidos por las líneas
celulares nuevas serán útiles en el tratamiento directo de tumores y
también en la producción de anti-ids para ser usados
como sustitutos de antígenos o reactivos de diagnóstico.
El documento EP 0 480 440 A describe un
anticuerpo monoclonal humano contra células de melanoma. No hace
referencia al anticuerpo de la presente invención. El documento EP 0
492 409 A describe un anticuerpo monoclonal humano capaz de
reconocer un antígeno gangliósido presente en la superficie de
ciertas células de melanoma. No describe la presente invención.
Según la presente invención, se ha desarrollado
una línea celular humana linfoblastoide B la cual secreta un
anticuerpo anti-gangliósido el cual reacciona con
una variedad de tumores y el cual se ha demostrado que es eficaz en
el tratamiento del melanoma. La línea celular de la presente
invención se identifica en L612 y se mantiene en la Division of
Surgical Oncology en la University of California en la School of
Medicine de Los Ángeles. La línea celular L612 se ha depositado en
la American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) con el
número de registro ATCC CRL 10724.
Como característica de la presente invención, la
línea celular L612 se usa para producir un anticuerpo kappa IgM el
cual reacciona con un antígeno tumoral. Se ha demostrado que el
anticuerpo L612 es eficaz en el tratamiento de tumores de melanoma
cuando se administra por inyección intralesional.
Como otra característica de la presente
invención, el anticuerpo L612 se usa para preparar anticuerpos
monoclonales anti-id murinos los cuales son útiles
como sustitutos de antígenos o los cuales se pueden usar en
procedimientos de diagnóstico.
Las características descritas anteriormente junto
con muchas otras características y las ventajas relacionadas de la
presente invención se pondrán de manifiesto cuando la invención se
llegue a entender mejor en referencia a la siguiente descripción
detallada.
La Fig. 1 es la secuencia de
nucleótidos/aminoácidos para la región variable de la cadena pesada
del anticuerpo L612. Las regiones determinantes complementarias
están subrayadas.
La Fig. 2 es la secuencia de
nucleótidos/aminoácidos para la región variable de la cadena ligera
del anticuerpo L612. Las regiones determinantes complementarias
están subrayadas.
La línea celular según la presente invención es
una línea celular linfoblastoide B la cual ha sido transformada por
medio de la técnica de transformación del virus de
Epstein-Barr. La línea celular se identifica como
L612 y se mantiene en la Division of Surgical Oncology en la
University of California en la School of Medicine de Los Ángeles. La
línea celular L612 se ha depositado en la American Type Culture
Collection con el número de registro ATCC CRL 10724.
La línea celular L612 se estableció en un cultivo
de linfocitos por medio de la misma técnica de transformación del
virus de Epstein-Barr que se usó para producir otros
dos anticuerpos anti-gangliósidos monoclonales
humanos, L55 (anti-GM2) y L72
(anti-GD2) (26 a 27 y 29). El mismo procedimiento de
transformación que se expone detalladamente en la referencia (29) se
siguió en el establecimiento de la línea celular L612. La técnica de
transformación del virus de Epstein-Barr usada para
establecer las líneas celulares anteriores L55 y L72, así como la
presente línea celular L612, es un procedimiento convencional el
cual es conocido y usado por los investigadores en este campo.
El procedimiento específico que se usó para
establecer la línea celular L612 es el siguiente.
Se recibieron ganglios linfáticos regionales de
una paciente con cáncer de mama durante la mastectomía. Los
linfocitos se separaron de estos ganglios linfáticos cortando en
primer lugar los ganglios linfáticos en trozos pequeños y dejándolos
en suspensión en una disolución salina equilibrada de Hank (HBSS). A
continuación, la suspensión se pasó a través de una malla de acero
inoxidable para separar bloques de tejido grandes, y se centrifugó
en una disolución de gradiente de densidad de Ficoll para condensar
y separar los linfocitos. Se usó la técnica de formación de rosetas
E para eliminar los linfocitos T, y la fracción de linfocitos B se
lavó con HBSS tres veces y a continuación se incubaron con virus de
Epstein-Barr (EBV) durante 20 horas en RPMI 1640 que
contenía suero de ternera fetal al 10%. Las células se clonaron por
medio de la técnica de dilución de limitación y se monitorizaron en
relación con la producción de anticuerpos mediante el ensayo IA tal
como se ha descrito previamente (29).
Como objetivos se usaron una línea celular humana
de cáncer de mama, MDA-MB 436 (31) y una línea
celular humana de melanoma,
UCLA-SO-M12 (32). Aunque los clones
que secretaban anticuerpos positivos a la línea celular de cáncer de
mama 436 dejaron de producir anticuerpos muy pronto después del
establecimiento, aquellos que reaccionaban a la línea celular de
melanoma M12 continuaron produciendo anticuerpos y eran estables.
Los clones que secretaban anticuerpos se adaptaron a un RPMI 1640
que contenía una concentración menor de suero de ternera fetal
gradualmente. A continuación, los clones se volvieron a clonar 7
veces en un medio sin suero que contenía un factor de crecimiento
(medio sin suero de la serie HB aprobado por la FDA obtenido de
Irvine Scientific Co.) (Irvine, CA). El tiempo de duplicación de la
línea celular L612 es menor que un día. La línea celular secreta más
de 20 \mug/ml de anticuerpo monoclonal kappa IgM. El anticuerpo
L612 en el medio consumido se purificó tal como se ha descrito
previamente (25). Además, el anticuerpo producido por la línea
celular L612 se aísla según cualquiera de los procedimientos
convencionales usados para eliminar y purificar anticuerpos de
cultivos celulares.
El anticuerpo L612 purificado se sometió a prueba
en relación con su reactividad con una variedad de tejidos tumorales
humanos. El anticuerpo L612 tiene una actividad citotóxica fuerte
para con células tumorales humanas positivas al antígeno en
presencia del complemento. La reactividad se sometió a prueba usando
ensayos tanto de adherencia inmune (IA) como de absorción de
adherencia inmune (IAA). Los resultados se resumen en la TABLA
I.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se sometió a prueba un total de 21 melanomas
sometidos a biopsia, linfocitos sanguíneos periféricos (PBL) de 32
donantes diferentes y eritrocitos de otros 44 donantes. Trece de los
21 tejidos de melanoma (62%) eran positivos a los antígenos, ninguno
de los PBL (0/32) ni de los eritrocitos (0/44) eran positivos. Se
investigaron también líneas celulares malignas humanas cultivadas en
relación con la presencia del antígeno (Tabla 1). De 16 líneas
celulares de melanoma sometidas a prueba mediante el ensayo IA
directo, 12 (75%) eran positivas. La reactividad positiva de otras
líneas celulares cancerígenas fueron las siguientes: cáncer de
pulmón, 4/4; cáncer de mama, 5/7; cáncer gastrointestinal, 2/7;
otros tipos de cáncer, 1/4. No obstante, ninguna de las once líneas
celulares B transformadas por el virus de
Epstein-Barr autólogas a las líneas celulares de
melanoma sometidas a prueba eran positivas ni siquiera mediante la
delicada técnica de absorción IA. Aunque el porcentaje de
especímenes positivos de melanoma era inferior al de cáncer de
pulmón, la reactividad global por espécimen era mucho mayor en el
melanoma que en otro tipo histológico de cáncer. De las líneas
celulares de melanoma sometidas a prueba la M15 y la M12 mostraron
la mayor reactividad. El tratamiento de las células con
neuraminidasa suprimió completamente la antigenicidad de las líneas
celulares mientras que el tratamiento con tripsina no.
También se determinó la reactividad del
anticuerpo L612 con varios glicolípidos auténticos. Los glicolípidos
y su título de antígeno respectivo con respecto al anticuerpo L612
se presentan en una lista en la Tabla II.
Los glicolípidos auténticos (5 nmol) se
sometieron a prueba en relación con la actividad del antígeno L612
mediante la prueba de inhibición IA. Tres gangliósidos, GM_{4},
GM_{3} y SPG mostraron una reactividad positiva; no obstante, dos
de estos, GM_{4} y GM_{3} mostraron una unión más fuerte (1:64)
que el SPG (1:16). Otros gangliósidos que incluyen
II^{3}NeuGc-Lac-Cer,
IV^{3}NeuGc-nLcOse_{4}-Cer,
GM_{2}, GM_{1a}, GD_{3}, GD_{2}, GD_{1a}, GD_{1b} y
GT_{1b}, y glicolípidos neutros que incluyen
GbOse_{3}-Cer, GbOse_{4}-Cer y
GgOse_{4}-Cer no mostraron actividad antigénica.
Para confirmar adicionalmente los resultados anteriores, se
realizaron el ELISA y una inmunocoloración enzimática en placas TLC
con glicolípidos auténticos. Los resultados obtenidos mediante el
ELISA y la inmunocoloración enzimática eran similares a los del
ensayo de inhibición IA. El ELISA se realizó usando 15 glicolípidos
auténticos unidos a pocillos microtiter. Nuevamente, los tres
gangliósidos, GM_{3}, GM_{4} y SPG mostraron una actividad de
unión clara en el ELISA en fase sólida. Ninguno de los glicolípidos
restantes mostraron reactividad.
También se realizó una inmunocoloración
enzimática de placas TLC con GM4, GM3, SPG, GD3, GD2, GM2,
N-glicoril GM3, CDH, globósido y asialo GM1
(pulmón). Se observó una positividad fuerte con el GM3 y el GM4. Con
el SPG se observó una reactividad más moderada. Con el GM2 se
observó una reactividad muy débil. No se consiguió colorar otros
glicolípidos. Los resultados de estos tres tipos diferentes de
ensayos inmunológicos demuestran que el HuMAb L612 detecta el
terminal de azúcar de gangliósidos, tales como el GM3 y el GM4, los
cuales tienen un residuo de Galactosa NeuAc
\propto2-3.
La inmunocoloración de secciones congeladas con
HuMab L612 indicó una especificidad fuerte para el tejido
neoplásico, incluyendo melanoma, adenocarcinomas de colon y
adenocarcinomas de pulmón. El HuMab proporciona un marcador
excelente para identificar ciertos tipos de tejidos neoplásicos. Se
ha demostrado que el HuMab L612 se une a carcinomas de células
renales (35).
La secuencia del ADN de las regiones variables
para las cadenas tanto ligera como pesada del anticuerpo L612 se
determinó mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR). El
procedimiento de tiocianato de guanidio/cloruro de cesio se usó para
preparar el ARN total a partir de la línea de linfoblastos B L612
(34). Diez \mug de ARN se mezclaron con 60 pmol de cebadores de 3'
de cadena bien pesada mu o bien ligera kappa y se
calentaron a 70ºC durante 10 minutos. A continuación, la mezcla se
añadió a 50 \mul de una disolución de reacción de transcriptasa
inversa que contenía 10 \mul de tampón de transcriptasa inversa
(BRL) 5X, 4 \mul de una mezcla de dNTP 10 mM (200 \muM de
concentración final de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP) y 3 \mul de
transcriptasa inversa 600 unidades (Superscript, BRL). La mezcla se
incubó a 37ºC durante 1 hora.
A continuación, se realizó una reacción PCR
estándar con: 97 \mul de mezcla PCR se añadieron a 3 \mul de
mezcla ARN-cADN. La mezcla PCR contenía un tampón
pCR 10X (Perkin Elmer, CA), una mezcla de dNTP 10 mM con una
concentración final 60 \muM de cada dNTP, 5 unidades de Taq
polimerasa (Perkin Elmer), y cebadores adecuados de cadena pesada y
ligera de 5' y 3' 60 \muM. Las mezclas se sometieron a 35 ciclos
de amplificación a 91ºC durante 1 minuto, 52ºC durante 2 minutos, y
72ºC durante 1,5 minutos, seguido por una incubación final a 72ºC
durante 10 minutos en un termociclador Perkin Elmer/Cetus. Una parte
alícuota del producto PCR estuvo en un gel de agarosa al 2% para
verificar el producto con la banda del tamaño correcto. Los
cebadores de la cadena pesada mu y la cadena ligera
kappa produjeron un producto de cADN de un par de bases 495 y
603, respectivamente. Cuando el gel mostró un producto individual de
tamaño correcto el resto del producto PCR-cADN se
sometió a PCR para obtener más producto.
Los productos de gel se aislaron, se combinaron,
se sometieron a extracción con fenol/cloroformo y a precipitación
con etanol. A continuación, el ADN se digirió con enzimas de
restricción adecuados, se extrajo, se precipitó y se purificó con
GeneClean (Bio101, CA). El ADN se ligó en sitios de restricción
cortados adecuados del vector Bluescript (Stratagene, CA). Se
aislaron y secuenciaron diez clones independientes de la cadena
mu de la región variable y cuatro clones independientes de la
cadena kappa de la región variable. Una sonda de cadena
pesada J_{H} se usó para tamizar y verificar los clones de la
cadena pesada. La secuenciación se realizó con el método del
dideoxinucleótido con polimerasa del ADN del T7 (Sequenase, USB,
Cleveland, OH) según el protocolo del fabricante. Los cebadores
usados fueron los siguientes. Cebadores líderes de la cadena
mu pesada (3 cebadores) (29):
GGGAATTCATGGACTGGACCTGGAGG(AG)TC(CT)TCT(GT)C;
GGGAATTCATGGAG(CT)TTGGGCTGA(CG)CTGG(CG)TTT(CT)T;
y
GGGAATTCATG(AG)A(AC)(AC)(AT)ACT(GT)TG(GT)(AT)(CG)C(AT)(CT)(CG)CT(CT)CTG.
Esto contiene un sitio de restricción EcoRI
(subrayado) para facilitar la clonación. El cebador de la región J
de la cadena mu pesada fue
CCAAGCTTAGACGAGGGGGAAAAGGGTT. Este contiene un sitio Hind
III (subrayado). Los cebadores líderes de la cadena kappa
ligera fueron los siguientes (2 cebadores) (30).
GACATCGAGCTCACCCAGTC
TCCA; y GAAAT TGAGCTCACGAGTCTCCA. Estos cebadores contienen un sitio Sac I (subrayado). El cebador de la región J de la cadena kappa ligera fue GCGCCGTCTAGAACTAACA CTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCAAG. Este cebador contiene un sitio Xba (subrayado).
TCCA; y GAAAT TGAGCTCACGAGTCTCCA. Estos cebadores contienen un sitio Sac I (subrayado). El cebador de la región J de la cadena kappa ligera fue GCGCCGTCTAGAACTAACA CTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCAAG. Este cebador contiene un sitio Xba (subrayado).
La secuencia clonada de nucleótidos de cADN y la
secuencia codificada de aminoácidos para la región variable de la
cadena pesada se expone en la SEC Nº de ID:1. La anterior secuencia
de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada se expone
en la SEC Nº de ID: 2. La secuencia clonada de nucleótidos de cADN y
la secuencia codificada de aminoácidos para la región variable de la
cadena ligera se expone en la SEC Nº de ID:3. La anterior secuencia
de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera se expone
en la SEC Nº de ID:4.
La secuencia de nucleótidos/aminoácidos para la
región variable de la cadena pesada se muestra también en la Fig. 1.
Las regiones determinantes complementarias (CDR) 1, 2 y 3 están
subrayadas. La secuencia de nucleótidos/aminoácidos para la región
variable de la cadena ligera se muestra también en la Fig. 2. Las
CDR 1, 2 y 3 también están subrayadas.
El anticuerpo L612 según la presente invención se
administra a pacientes para tratar tumores que contienen el
gangliósido II3NeuAc-Lac-Cer (GM3),
GM4 o IV3NeuAc-nLcOse4-Cer (SPG).
El gangliósido GM3 incluye un terminal de azúcar que tiene un
residuo de Galactosa Neu\propto2-3. Se puede usar
cualquiera de los procedimientos convencionales usados para
administrar anticuerpos a pacientes para tratar dichos tejidos.
Estos procedimientos incluyen inyecciones intravenosas o
intraperitoneales e inyecciones intralesionales. La inyección
intralesional es un método preferido de administración para tumores
recurrentes cutáneos. El anticuerpo L612 y la línea celular que
produce el anticuerpo se pueden modificar o alterar por medio de
procedimientos conocidos para formar otros isotipos de
inmunoglobulinas y células que produzcan los mismos los cuales se
pueden unir a y matar eficazmente células tumorales (33). La
dosificación específica usada variará dependiendo de la
antigenicidad tumoral y se puede determinar según procedimientos
conocidos para administrar anticuerpos tales como el L55 y el L72.
El anticuerpo monoclonal L612 reacciona intensamente con biopsias
tumorales de melanomas humanos. Además, el anticuerpo L612 reacciona
menos intensamente con biopsias tumorales humanas de cáncer de
pulmón, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de colon y cáncer
de riñón. La línea celular de melanoma UCLASO-M12 se
identificó como la línea celular más reactiva de entre las líneas
sometidas a prueba con el anticuerpo monoclonal L612. La línea
celular UCLASO-M12 se mantiene en la Division of
Surgical Oncology en la University of California en la School of
Medicine de Los Ángeles.
El HuMab L612 se usó como agente terapéutico para
el tratamiento de melanoma maligno cutáneo. El HuMab L612 se
purificó para uso humano tal como se ha descrito previamente (25).
Se demostró en estudios anteriores que la inyección intralesional de
HuMab L72 anti-G_{D2} humano podría inducir la
regresión del melanoma cutáneo (23). En el ejemplo presente se
compara el efecto del HuMab L612 y el HuMab L72.
Una hembra de 84 años se sometió a una escisión
quirúrgica de una lesión de melanoma cutáneo que crecía rápidamente
(1,9 x 1,6 cm). El examen patológico de la sección de tejido reveló
un melanoma de nivel de Clark IV. Se observó que la expresión de los
gangliósidos de la biopsia de la lesión era moderadamente positiva
para el G_{M3} y negativa para el G_{D2}. Dos semanas después de
la cirugía, se desarrolló una recidiva en el lugar de la incisión.
Las lesiones superiores se trataron semanalmente con 1 ml de HuMab
L612, y las lesiones inferiores se trataron con 1 ml de HuMab L72
HuMab. Después del tratamiento durante un mes (3 tratamientos), se
observaron una necrosis y un reblandecimiento de las lesiones
tratadas con HuMab L612. Por el contrario las tratadas con HuMab L72
HuMab no mostraron ninguna respuesta, y de hecho, habían progresado
adicionalmente. Finalmente la paciente falleció debido a metástasis
intensiva en el hígado y el cerebro.
El anticuerpo L612 también es útil en la
producción de hibridomas los cuales a su vez se pueden usar para
producir anti-ids para su uso como sustitutos de
antígenos o reactivos de diagnóstico. La producción de hibridomas y
la subsiguiente generación de anti-ids se describen
en el siguiente procedimiento ilustrativo:
Unos ratones BALB/c se inmunizaron mediante una
inyección subcutánea de 200 \mug de anticuerpo monoclonal L612
purificado en adyuvante completo de Freund. Después de 2 semanas los
animales se reforzaron por medio de otra inyección subcutánea de
L612 en adyuvante incompleto de Freund. Once días después de la
dosis de refuerzo, los ratones se inyectaron intraperitonealmente
con 200 \mug de L612 en disolución salina. Después de tres días
los bazos se extrajeron y los esplenocitos se fundieron con una
línea celular de mieloma SP2/O usando el procedimiento estándar para
producir hibridomas.
Después de una selección en medio HAT, los
pocillos de cultivo de hibridomas se sometieron a prueba en relación
con el anticuerpo usando el ELISA. Los hibridomas que secretaban
anti-ids (AB2) se identificaron por su reactividad
de unión intensa con el HuMab L612 y ausencia de reactividad con
otras tres IgMs humanas de control: L55, L72 e IgM en suero humano.
Las proteínas no relacionadas usadas como antígenos incluían suero
bovino fetal y seroalbúmina humana. 50 \mul de IgMs o proteínas
(50 \mug/ml) se recubrieron en una placa ELISA de 96 pocillos y
sirvieron como antígenos para detectar AB2. IgM + IgG
anti-ratón de cabra, conjugada con peroxidasa se usó
como sonda de detección de AB2 seguida por el sustrato y la lectura
de la absorción a 490 nm tal como se ha descrito previamente
(19).
La selección en HAT de aproximadamente 2500
pocillos de cultivo de hibridomas los cuales se prepararon tal como
se ha descrito anteriormente produjo 40 hibridomas que secretaban
anticuerpos con una reactividad clara al HuMab L612, aunque sin
reactividad a otras tres IgMs humanas de control y dos antígenos de
proteína sérica no relacionada. Para determinar si estos anticuerpos
anti-L612 eran AB2 del tipo beta dirigido contra el
sitio de combinación de antígenos del L612, o eran anticuerpos AB2
alfa unidos a regiones peptídicas fuera del sitio de combinación de
antígenos del L612, la actividad inhibidora de estos anticuerpos
anti-L612 contra la unión del L612 a líneas
celulares objetivo positivas al GM3 o al antígeno purificado,
gangliósido GM3, se sometió a prueba usando tres sistemas de ensayo:
inhibición IA, inhibición ELISA-celular, e
inhibición GM3-ELISA. De los 40 anticuerpos
probados, siete inhibieron la unión del L612 a una línea celular de
melanoma objetivo, positiva al antígeno,
(UCLASO-M12), y al GM3 mayor del 50% en los ensayos,
mientras que otros 12 presentaron una actividad débil o no
inhibidora.
De los siete anti-ids
inhibidores, uno identificado como 4C10 se seleccionó para la
clonación como el anti-id de tipo beta preferido
para su uso en el tratamiento de tumores. De entre el grupo no
inhibidor el anti-id identificado como 18C6 se
seleccionó para la clonación como el anti-id de tipo
alfa preferido para su uso en ensayos de inmunodiagnóstico. Ambos
anti-ids, 4C10 y 18C6, se sometieron a prueba con
antiglubolinas isotipo y se observó que eran de la clase IgG1 y
contenían cadenas ligeras kappa.
Las líneas celulares hibridoma clonadas en 4C10 y
18C6 se cultivaron en un medio RP MI 1640 que contenía FCS y
secretaron entre 5-10 \mug/ml de anticuerpo en
sobrenadantes de cultivo. Los títulos de los
anti-ids en estos sobrenadantes de cultivo contra el
L612 por medio del ELISA estaban comprendidos entre 1:200 y
1:1000/10^{6} hibridomas. El 18C6 anti-id demostró
una baja inhibición de la unión del HuMab L612 a células objetivos
en el ensayo IA y al gangliósido GM3 en el ELISA mientras que el
4C10 con la misma concentración de anticuerpos mostró una inhibición
intensa tanto en el ensayo ELISA como en el ensayo IA. Como ensayo
de control, el 4C10 y el 18C6 no consiguieron inhibir la unión de un
sistema antígeno no relacionado, el HuMAb L72, a células objetivos
M14, o al antígeno GD2. La falta de inhibición de la unión del 18C6
indica una posición de unión en el anticuerpo L612 fuera del sitio
de combinación de los antígenos GM3, y la inhibición específica de
la unión del 4C10 indica que su posición de unión está dentro o
cerca del sitio de combinación de los antígenos.
Las líneas celulares hibridoma las cuales
secretan los anti-ids monoclonales 4C10 y 18C6 se
están manteniendo en la Division of Surgical Oncology en la
University of California en la School of Medicine de Los
Ángeles.
El anti-id 4C10 y otros
anti-ids de tipo beta creados contra el L612 se
pueden usar en solitario o en combinación con otros agentes para
tratar tumores. Se prefieren para su uso en el tratamiento de
tumores de melanoma. Estos anti-ids de tipo beta
también se pueden usar como inmunomodulador para mejorar la
inmunidad anti-cancerígena, suprimir el rechazo al
trasplante de órganos y suprimir enfermedades autoinmunes.
Los anti-ids beta se pueden
administrar por medio de cualquiera de los procedimientos
convencionales usados para introducir anticuerpos en pacientes.
Estos procedimientos incluyen inyecciones subcutáneas, intravenosas
o intratumorales. Los anti-ids de tipo beta se
conjugan preferentemente con KLH y se emulsionan en un portador
adecuado tal como un adyuvante completo de Freund. Las dosis
específicas usadas para los anti-ids de tipo beta
variarán dependiendo del tumor que se esté tratando y de otros
muchos factores. Los niveles de dosificación se establecen por medio
de las técnicas y principios conocidos, reconocidos de forma general
y usados en el tratamiento de pacientes con agentes de inmunización
de antígenos o anticuerpos monoclonales.
Se demostró que la utilidad inmunogénica de los
anti-ids de tipo beta al anticuerpo L612 es la
siguiente:
Cinco ratones Balb/c singénicos se inmunizaron
con 4C10-KLH purificado. Como controles, cuatro
ratones se inmunizaron con IgG1-KLH de ratón y un
ratón con solamente KLH. Los sueros inmunizados se monitorizaron por
medio del ELISA usando GM3 purificado como fuente de antígenos y por
medio del ensayo IA usando la línea celular de melanoma M12 positiva
al antígeno. En el ELISA, como segundo anticuerpo se usó IgG + IgM
anti-ratón de cabra, conjugada con peroxidasa
(Boeringer Mannheim).
Se produjo un anticuerpo medible (AB3) en tres de
las cinco inmunizaciones con 100 \mug de 4C10-KLH.
Los sueros inmunizados se unieron al GM3 aunque no al CDH
(asialo-GM3). Los sueros de los cinco ratones
inmunizados con IgG-KLH o solo KLH no dieron ninguna
respuesta a ningún glicolípido. En otro análisis para determinar la
clase Ig del AB3 (ELISA e inmunocoloración TLC), la mayor parte de
la reactividad se identificó como IgM.
Para excluir los anticuerpos naturales
específicos de cada especie que podrían reaccionar con células M12
en el ensayo IA, los sueros murinos inmunizados fueron preabsorbidos
por glóbulos rojos humanos a 4ºC durante la noche. Se obtuvo una
puntuación IA de 4+ con una dilución 1:10 de los sueros absorbidos.
Los sueros de control no proporcionaron ninguna reactividad ni
siquiera con una dilución de 1:2. Para confirmar que la reactividad
positiva iba dirigida contra el antígeno GM3 en la superficie
celular, se realizó una inhibición IA usando GM3 (10 \mug), CDH
(10 \mug), 4C10 (10 \mug) e IgG1 no relacionado (10 \mug)
purificado a partir de ascitis de hibridoma Balb/c. Aunque la
reactividad fue completamente inhibida por el GM3 o el 4C10
purificado, no se obtuvo ninguna inhibición con el CDH o la IgG1 no
relacionada.
El ejemplo anterior demuestra que los
anti-ids de tipo beta producen anticuerpos AB3 los
cuales son imunorreactivos con tumores de melanoma. Por
consiguiente, estos anti-ids de tipo beta los cuales
se crean en respuesta al anticuerpo L612 son eficaces como agente de
inmunización en el tratamiento del melanoma.
Los anti-ids de tipo alfa
producidos en respuesta al anticuerpo L612 pueden ser usados por
procedimientos de imunodiagnóstico tales como un procedimiento
ELISA-celular de tres etapas y una coloración con
inmunoperoxidasa de tres etapas de secciones de tejidos tumorales.
Los ejemplos de la práctica son los siguientes:
Unas células M12 viables (1 x 10^{5}) se
aplicaron como revestimiento sobre una placa microtiter de 960
pocillos de fondo en forma de U (Immulon-1, Dynatec)
después de un prebloqueo con BSA-PBS al 1%. Se
añadieron 50 ul de L612 (100 \mug/ml) y se incubaron durante 1
hora a temperatura ambiente. Después de lavar la mezcla para
eliminar el HuMAb L612 no unido, las células se incubaron con 18C6
anti-id monoclonal murino (100 \mug/ml) durante 1
hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadieron 50
\mul de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra,
conjugado con peroxidasa (1/10.000 diluido) (Jackson Immuno
Research) y la placa se incubó durante 30 minutos. Después del
lavado con la disolución de PBS, se añadió el sustrato para la
peroxidasa y se determinó la actividad de unión como una función de
la absorción a 490 nm con un lector cinético de microplacas
V_{max}.
Cuando los sitios de combinación de los antígenos
del L612 son ocupados por el GM3 expresado en células tumorales, el
HuMAb L612 unido a las células debería haber reducido su actividad
de unión al anti-id beta, aunque manteniendo la
actividad de unión total al anti-id alfa. El
procedimiento descrito anteriormente confirmó este proceso usando
células de melanoma M12 cultivadas las cuales expresan una alta
densidad del antígeno correspondiente.
El ensayo de unión de células descrito
anteriormente representa una forma modificada de la técnica ELISA.
Se incluyeron varios ensayos de control para establecer la
especificidad de la reacción positiva. Los HuMAbs
anti-gangliósidos de control incluían L55 (IgM
anti-GM2) y L72 (IgM anti-GD2),
presentando ambos una capacidad de unión fuerte al GM2 y a la línea
celular de melanoma M14 rica en GD2 (26, 27). El 186C6
anti-id reaccionaba intensamente con células M12
después de la pre-incubación con el HuMaB L612,
aunque no reaccionaba con células M14 que fueron
pre-incubadas con HuMAb L55 o L72. La Ig
anti-ratón conjugada con peroxidasa tampoco
consiguió reaccionar con células M12 en otros controles que incluyen
el anti-id murino solo, L612, o el L612 más
(anti-id beta).
A continuación, el ensayo
ELISA-celular se aplicó a otras varias líneas
celulares tumorales humanas. Un ensayo de unión de células de dos
etapas (HuMAb + IgM anti-humana conjugada con
peroxidasa) se comparó con el ensayo de unión de células de tres
etapas para evaluar la validez del ensayo de tres etapas. El ensayo
de tres etapas presentaba una reactividad paralela con respecto al
ensayo de dos etapas y era ligeramente más sensible en casi todas
las líneas celulares. Estos datos indican que el valor de absorción
de ELISA del ensayo de tres etapas refleja de forma precisa las
diferencias en la densidad de los antígenos GM3 de la superficie
celular y presenta una correlación intensa con los ensayos in
vitro de dos etapas.
Se cortaron secciones de tejido de un grosor de 4
\mum de tejidos recién congelados en compuesto OTC y se fijaron
inmediatamente en tampón de formaldehído frío (12 g de tampón Tris,
9 g de cloruro de sodio, 40 ml de formaldehído al 37%, pH 7,4) y se
secaron al aire. Las platinas se sumergieron en tampón Tris durante
cinco minutos y a continuación se trataron con peróxido de hidrógeno
al 3% durante 10 minutos para apagar la actividad de la peroxidasa
endógena.
Después de un lavado en agua corriente durante
cinco minutos, las secciones se cubrieron con suero humano normal al
5% durante 20 minutos. A continuación, se aplicó HuMAb L612 (10
\mug de IgM en 200 \mul) y se incubó durante 45 minutos. Las
platinas se lavaron en tampón Tris durante 5 minutos, el 18C6
anti-id purificado (10 \mug de IgG1 en 200 ul) se
aplicó y se incubó durante 30 minutos.
Después de lavar las platinas nuevamente, se
aplicó el tercer anticuerpo, una IgG anti-ratón de
cabra, biotinilatada (Vector Laboratories, Burlingame, CA) en una
dilución de 1/100 y se incubó durante 25 minutos. Después del lavado
se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa (dilución de
1/1000) (Zymed Laboratories, San Francisco) y se incubó durante 20
minutos. Después del lavado, las platinas se sumergieron en una
disolución del sustrato que contenía 6 ml de carbazol de aminoetilo,
50 ml de tampón de acetato de sodio 0,02 M (pH 5,1) y 0,4 ml de
óxido de hidrógeno al 3% recién preparado durante 5 minutos. Las
platinas se lavaron una vez más en agua del grifo, se
contracolorearon con hematoxilina, y a las secciones coloreadas se
les aplicaron cubreobjetos usando gelatina de glicerina. El ensayo
de tres etapas de la inmunoperoxidasa se aplicó satisfactoriamente
para detectar la unión del anticuerpo L612 a tejidos tumorales a los
que se ha sometido a una biopsia quirúrgica que habían sido
congelados instantáneamente.
Tras describir de este modo realizaciones
ilustrativas de la presente invención, aquellos expertos en la
técnica deberían observar que las descripciones incluidas son
solamente ilustrativas y que se pueden realizar otras alternativas,
adaptaciones y modificaciones dentro del ámbito de la presente
invención. Por ejemplo, el anticuerpo L612 se puede usar para
realizar anticuerpos quiméricos los cuales son también útiles en una
variedad de tratamientos o como reactivos de diagnóstico. Por
consiguiente, la presente invención no se limita a las realizaciones
específicas según se ilustra en el presente documento, sino que está
limitada solamente por las siguientes reivindicaciones.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Irie, Reiko F
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: LÍNEA CELULAR LINFOBLASTOIDE B HUMANA QUE SECRETA ANTICUERPO ANTI-GANGLIÓSIDO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Poms, Smith, Lande y Rose
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2121 Avenue of the Stars Suite 1400
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Los Ángeles
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 90067
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disco floppy
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICTUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/609803
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 DE NOVIEMBRE DE 1990
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Oldenkamp, David J
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 29421
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: 94268
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 3107885046
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 3102771297
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº DE ID:1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 432 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo Sapiens
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Célula B transformada por el virus de Epstein Barr
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- LÍNEA CELULAR: L612
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..432
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cadena Pesada"
\hskip3,4cm/producto= "Región Variable de las Inmunoglobulinas"
\hskip3,4cm/nombre_estándar= "Secuencia de la Región Variable de la Cadena Pesada del HuMab L612"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características_misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 148..162
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función= "Región determinante complementaria 1"
\hskip3,4cm"(CDR1)"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características-misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 271..300
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función= "Región determinante complementaria 2"
\hskip3,4cm"(CDR2)"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características-misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 397..429
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función= "Región determinante complementaria 3"
\hskip3,4cm"(CDR3)"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº DE ID:2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 144 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID:2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº DE ID:3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 360 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo Sapiens
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADA: Célula B transformada por el virus de Epstein Barr
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Célula B
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- LÍNEA CELULAR: L612
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..360
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cadena ligera de las Inmunoglobulinas"
\hskip3,4cm/producto= "Región Variable de la Cadena ligera del HuMab L612"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características_misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 58..108
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función= "Región determinante complementaria 1"
\hskip3,4cm"(CDR1)"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características_misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 154..174
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función= "Región determinante complementaria 2"
\hskip3,4cm"(CDR2)"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características_misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 271..297
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función= "Región determinante complementaria 3"
\hskip3,4cm"(CDR3)"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID:3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. N.º DE ID:4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID:4:
Claims (13)
1. Línea celular humana linfoblastoide B la cual
está depositada en el American Type Culture Collection con el número
de registro ATCC CRL 10724.
2. Composición de materia que comprende un
anticuerpo anti-gangliósido el cual es secretado por
una línea celular según la reivindicación 1, e isotipos del
mismo.
3. Uso de un anticuerpo secretado por una línea
celular según la reivindicación 1, en la fabricación de una
composición para el tratamiento de tejido tumoral el cual contiene
antígenos gangliósidos
II^{3}NeuAc-Lac-Cer (GM_{3}),
GM4 o IV^{3}NeuAc-nLcOse_{4}-Cer
(SPG) que se unen al L612.
4. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 3
en el que el tejido tumoral es tejido tumoral de melanoma.
5. Composición de materia según la reivindicación
2 en la que la composición de materia consta esencialmente del
anticuerpo y un isotipo del anticuerpo, y un portador
farmacéuticamente aceptable.
6. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 3
o la reivindicación 4, en el que la composición para el tratamiento
de tejidos tumorales es administrable por inyección
intralesional.
7. Composición de materia que comprende un
anticuerpo el cual comprende una región variable de cadena pesada
que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. Nº de
ID: 2.
8. Composición de materia que comprende un
anticuerpo el cual comprende una región variable de cadena ligera
que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. Nº de
ID: 4.
9. Composición de materia según la reivindicación
7 en la que el anticuerpo comprende una región variable de cadena
ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC.
Nº de ID: 4.
10. Composición de materia que comprende un
anticuerpo el cual comprende una región variable de cadena pesada
que comprende regiones determinantes complementarias según se expone
en la Fig. 1.
11. Composición de materia que comprende un
anticuerpo el cual comprende una región variable de cadena ligera
que comprende regiones determinantes complementarias según se expone
en la Fig. 2.
12. Composición de materia según la
reivindicación 10 en la que dicho anticuerpo comprende una región
variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes
complementarias según se expone en la Fig. 2.
13. Secuencia de nucleótidos que codifica por lo
menos una parte de un anticuerpo, codificando dicha secuencia de
nucleótidos una secuencia seleccionada de entre las secuencias de
aminoácidos expuestas en la SEC. Nº de ID: 2 y la SEC. Nº de ID:
4.
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|---|---|---|---|
| US08/026,320 US5419904A (en) | 1990-11-05 | 1993-02-26 | Human B-lymphoblastoid cell line secreting anti-ganglioside antibody |
| US26320 | 1993-02-26 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2211877T3 true ES2211877T3 (es) | 2004-07-16 |
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ID=21831157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94909585T Expired - Lifetime ES2211877T3 (es) | 1993-02-26 | 1994-02-09 | Linea celular linfoblastoide b humana que secreta un anticuerpo anti-gangliosido. |
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