JPH08280388A - 繊維状菌類中に発現する異種ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生化学的に活性のある異種ポリペプチドを得
る。 【解決手段】 （イ）異種ポリペプチドを発現し、繊維
状菌類から該異種ポリペプチドの分泌をうながすことが
できるＤＮＡ配列を含むベクターを繊維状菌類にトラン
スフォームすること、及び（ロ）該異種ポリペプチドを
発現及び分泌すること、を含む異種ポリペプチドの製造
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９８５年８月２９日に提出さ
れた米国特許番号７７1,３７４号の一部継続出願であ
る。

【発明の属する技術分野】本発明は、繊維状菌類により
異種ポリペプチドを発現及び分泌させることによる異種
ポリペプチドの製造方法に関し、さらに繊維状菌類によ
り発現及び分泌される異種ポリペプチド、及びそのポリ
ペプチドを発現し、分泌するためのベクターについても
触れる。特に、トランスフォーメーション・ベクター及
び繊維状菌類により生化学的に活性のある仔牛のキモシ
ン及び異種グルコアミラーゼを発現、分泌するためのそ
のベクター使用法を開示する。

【０００２】

【従来の技術】異種ポリペプチド（例えば、宿主生物に
より通常発現及び分泌されないポリペプチド）をコード
するＤＮＡ配列の発現はかなりの高度な状態にまで進歩
してきている。例えば、薬学的に望ましいポリペプチド
（例えば、（イ）ヒトの成長ホルモン（１）、（ロ）ヒ
トの組織プラスミノーゲン活性化因子（２）、（ハ）種
々のヒトインターフェロン（５）、（ニ）第８因子
（４）、（ホ）ヒトの血清アルブミン（３））及び、工
業的に重要な酵素（例えば、（イ）キモシン（７）、
（ロ）アルファアミラーゼ（８）、（ハ）アルカリ・プ
ロテアーゼ（９））をコードする種々のＤＮＡ配列がク
ローン化され、いくつかの異種の発現宿主中で発現する
ことが報告されている。これらの発現は原核生物（例え
ば、大腸菌（Ｅ.coli) （１０）、又は枯草菌（Ｂ．sub
tilis）（１１））、又は真核生物（例えば、サッカロ
ミセス・セレビシアエ (Saccharomyces cerevisiae)
（７）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyce
s lactis) （１２）、又はチャイニーズ・ハムスターの
オバリー細胞（２））にヘテロポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列をトランスフォームすることにより行なわ
れる。

【０００３】異種宿主中で発現される場合、種々の宿主
生物中で発現されるポリペプチドは、それらが天然に生
産されるときのものと同様の生物学的活性を有さない。
例えば、仔牛のキモシンは、大腸菌（Ｅ．coli) （１
３）又はセレビシアエ（Ｓ．cerevisiae）（７）中で発
現されたときは、非常に低い生物学的活性しか持たな
い。キモシンは通常グリコシル化されないので、大腸菌
（Ｅ．coli) 中での、この低い生物学的活性は、大腸菌
が本来、ポリペプチドをグリコシル化する能力が無いこ
とによるものではない（１４）。しかし、このような、
大腸菌（Ｅ．coli)又はＳ．セレビシアエ（Ｓ．cerevis
iae）中での相対的不活性は、種々の操作によって、部
分的に、そのように発現したポリペプチドを発現後活性
化することによって示されるように、そのポリペプチド
鎖の不適当な折りたたみ方によっているようである。そ
のような操作では、発現したキモシンを生物学的活性が
増加するように、いくつかの方法で変性と再生が繰り返
されよう。例えば、（イ）尿素処理（１３）、（ロ）変
性／再生 pＨにさらす、（ハ）変性及びジスルフィド結
合の切断とそれに引き続く再生及び共有イオウ結合の再
生成（１５）。しかし、このような変性／再生操作は、
非常に効率的というわけではないし（例えば、レンニン
の生物学的活性の回復は３０％以下である（１３））。
生物学的に活性のあるポリペプチドを生産するのにはか
なりの時間と経費が必要となる。他の異種ポリペプチド
はより高等な真核生物宿主中で、うまく発現する（例え
ばホ乳類細胞）。通常、そのようなポリペプチドは、そ
の異種ポリペプチド中のあるアミノ酸配列を認識し、グ
リコシル化することのできる発現宿主を必要とするグリ
コポリペプチドである。しかし、このようなホ乳類組織
培養系は、しばしば、微生物系と比較して大量の異種ポ
リペプチドを分泌しない。さらにこのような系を維持す
るのは技術的に難かしく、結果的に、操作に経費がかか
ることになる。

【０００４】生合成デヒドロクイナーゼを欠いたＮ．ク
ラッサ（Ｎ．crassa) のaroD 変異体の相補性を含む繊
維状菌類中でのトランスフォーメーション及び発現が報
告されている（１６）。それ以来、グルタメート・デヒ
ドロジェネース欠損Ｎ．クラッサ（Ｎ．crassa) 変異体
の相補性に基づくトランスフォーメーションも発展して
きている（１７）。各々の場合、相補性に使用されたデ
ヒドロクイナーゼ（ｑａｚ）とグルタメート・デヒドロ
ジェネース（ａｍ）遺伝子はＮ．クラッサ（Ｎ．crass
a) 由来のもので、それ故同種発現も含まれている。繊
維状菌類中での他の同種発現の例には、Ａ．ニドゥラン
ス（Ａ．nidulans) 中の独立栄養マーカーtyp Ｃ（１
８）及び argＢ（１９）の相補性や、アセトアミダーゼ
をコードするＡ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) 遺伝子
の発現によるアセトアミド又はアクリルアミドの利用へ
のＡ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) のトランスフォー
メーションが含まれる。

【０００５】繊維状菌類中での異種ポリペプチドの発現
は、菌類及び細菌類のポリペプチドのトランスフォーメ
ーション及び発現に限定される。例えば、オロチジン−
５’−リン酸・デカルボキシレースを欠いているＡ．ニ
ドゥランス（Ａ．nidulans)は、Ｎ・クラッサ（Ｎ．cra
ssa) 由来の pyr４遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含
むプラスミドによりトランスフォームされた。（２１、
３２）Ａ．ニガー（Ａ．niger)もトランスフォームによ
りＡ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) 由来のアセトアミ
ダーゼをコードする遺伝子を発現し、アセトアミド及び
アクリルアミドを利用している。（２２） 繊維状菌類中での細菌のポリペプチドの異種発現の例に
は、Ｎ．クラッサ（Ｎ．crassa) （２３）、デクチトス
テリウム・ディスコイデウム (Dictyostelliumdiscoide
um)（２４）及びセファロスポリウム・アクレモニウム
(Cephalosporium acremonium)（２５）中での細菌ホス
ホトランスフェラーゼの発現がある。同種及び異種の菌
類中での発現のこれら例の各々において、その発現した
ポリ

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ペプチドはその繊維状
菌類の細胞内に維持されていた。従って、ここで本発明
の目的は、トランスフォームするためのベクターを含む
繊維状菌類から、異種ポリペプチドを発現させ、かつ分
泌させるために、そのような菌類と、そのような異種ポ
リペプチドを発現、分泌するためのプロセスを供給する
ことにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、繊維状菌類か
ら、異種ポリペプチドを発現、分泌するための新しいベ
クターを含んでいる。該ベクターは、該異種ポリペプチ
ドを発現、分泌するために新しいプロセス中で用いられ
る。異種ポリペプチドを発現、分泌させるために、繊維
状菌類をトランスフォームするのに用いられる該ベクタ
ーは、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、与
えられた繊維状菌類中の分泌系で機能性を示し、その異
種ポリペプチドをコードする配列と機能的に結合するシ
グナル配列をコードするＤＮＡ配列を包含する。該シグ
ナル配列は、異種ポリペプチドと正常な組み合せのシグ
ナル配列であるか、又は他のものに由来する場合もあ
る。また、そのベクターは、シグナル配列をコードする
ＤＮＡ配列と機能的に結合し、繊維状菌類によって機能
的に認識されるプロモーター配列をコードするＤＮＡ配
列を含むこともある。機能的ポリアデニレーション配列
が、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’末
端に機能的に結合していることが望ましい。その後、こ
のように合成されたポリペプチドは繊維状菌類から分泌
される。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、広く散在する種からの
異種ポリペプチドを繊維状菌類から発現、分泌させるこ
とができることを示している。特に仔牛のキモシン、ア
スペルギラス・ニガー (Aspergillus niger)及びフミコ
ラ・グリセス (Humicola grises)由来のグルコアミラー
ゼ、及びムコール・ミエヘイ (Mucor miehiei)由来のカ
ルボキシル・プロテアーゼをＡ．ニドゥランス（Ａ．ni
dulans) 中で発現し、分泌させた。加えて、仔牛のキモ
シンをＡ．アワモリ（Ａ．awamori)及びトリコデルマ・
レエセイ(Trichoderma reesei)から発現、分泌させた。
生化学的に活性なキモシンを、さらに処理することなし
に、培地中に検出した。この結果は、Ａ．ニドゥランス
（Ａ．nidulans) をトランスフォームするのに用いたベ
クターが、生化学的に活性なキモシンを作るべく酸性の
環境（約 pＨ２）にさらすことを必要とするプロキモシ
ンを分泌するよう構築されているという意味で驚くべき
ものである。

【０００９】一般に、機能的プロモーターをコードする
ＤＮＡ配列及び、ターミネーター配列（ポリアデニレー
ション配列を含む）を含むベクターは、種々のシグナル
配列及び異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に機
能的に結合している。このように構築されたベクター
は、繊維状菌類をトランスフォームするのに用いた。そ
の後、生存するトランスフォーマントを異種ポリペプチ
ドの発現と分泌に対するスクリーニングにより同定す
る。これとは別に、トランスフォーメーション・ベクタ
ーへ選択特性をコードするＤＮＡ配列を組み込むことに
より、発現可能な選択特性がトランスフォーマントを単
離するのに用いることができる。このような選択特性の
例には種々の抗体耐性（例えば、アミノグリコシド、ベ
ノミル等）や、栄養要求欠失を補う遺伝子をコードする
配列（pyr 4 を欠失したＡ．ニドゥランス（Ａ．nidula
ns) 、Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)トリコデルマ・レエ
セイ(Trichoderma reesei)の pyr４相補性、又は、Arg
Ｂを欠失するＡ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) 又は
Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)のArg Ｂ相補性）又は、栄
養（例えばアセトアミダーゼ）若しくは形態上のマーカ
ーを発現宿主に与える遺伝子をコードする配列、を含ん
でいる。

【００１０】公開された好ましい具体例では、本発明の
トランスフォーメーション・ベクターの構築に、Ａ．ニ
ドゥランス（Ａ．nidulans) 由来のＡＮＳ−１配列をコ
ードするＤＮＡ配列が含まれている。この配列はベクタ
ーのトランスフォーメーション効率を増加する。しか
し、これらの配列は本発明を実施する上で絶対に必要で
あるとは考えていない。加えて、バクテリアのプラスミ
ドｐＢＲ３２５由来のあるＤＮＡ配列が、公開するトラ
ンスフォーメーション・ベクターの一部を構成してい
る。また、これらの配列も繊維状菌類をトランスフォー
ムするのに必要であると考えられていない。そのかわ
り、これらの配列はベクター構築中、そのベクターの細
菌的複製を与える。ベクター構築中用いることができる
他のプラスミド配列にはｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７
０１７）、ＲＫ−２（ＡＴＣＣ ３７１２５）、ｐＭＢ
９（ＡＴＣＣ ３７０１９）、ｐＳＣ１０１（ＡＴＣＣ
３７０３２）が含まれている。公開される好ましい具
体例は、実施例によって示されているが、本発明の範囲
を制限するものではない。

【００１１】（定義）“ポリペプチドの発現”とはポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現を意味する。
“ポリペプチド”とはペプチド結合を通して共有結合し
ているα−アミノ酸のポリマーである。ポリペプチド
は、より一般的にタンパク質と呼ばれる高分子量のポリ
マーと同時に低分子量のポリマーをも含む。加えて、ポ
リペプチドはホスホポリペプチド、グリコポリペプチ
ド、メタロポリペプチドである場合もある。さらに、１
つ以上のポリマー鎖が結合して１つのポリペプチド鎖を
形成する場合もある。ここで用いられている“異種ポリ
ペプチド”とは、そのポリペプチドを発現するのに用い
る繊維状菌類によっては、通常、発現及び分泌されない
ポリペプチドのことである。異種ポリペプチドは原核生
物由来のポリペプチド（例えば、バチルス(Bacillus)種
のα−アミアラーゼ、バチルス(Bacillus)種のアルカリ
・プロテアーゼ、シュードモナスの種々の加水分解酵素
等) 、真核生物由来のポリペプチド（例えば、仔牛のキ
モシン、ヒトの組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒト
の成長ホルモン、ヒトのインターフェロン、ウロキナー
ゼ、ヒトの血清アルブミン、ファクターVIII等）及び発
現宿主以外の菌類由来のポリペプチド（例えば、Ａ．ニ
ドゥランス（Ａ．nidulans) 中で発現される、Ａ．ニガ
ー（Ａ．niger)及びフミコラ・グリセア (Humicola gri
sea)由来のグルコアミラーゼ、Ａ．ニドゥランス（Ａ．
nidulans) 中で発現される、ムコール・ミエヘイ (Muco
r miehei)由来のカルボキシル・プロテアーゼ等) を含
んでいる。

【００１２】また異種ポリペプチドは、少なくとも２つ
の異なるポリペプチドでその各々がその菌類発現宿主に
対して同種又は異種であるもの由来の、一部又は完全な
ポリペプチドの組み合わせを含むハイブリッド・ポリペ
プチドをも含んでいる。そのようなハイブリッド・ポリ
ペプチドの例には、１）Ａ．ニガー（Ａ．niger)のグル
コアミラーゼのシグナル及びプロ配列だけをコードする
ＤＮＡ配列か、又は種々の量のアミノ末端側の成熟グル
コアミラーゼコドンと結合した形で融合したプロキモシ
ンをコードするＤＮＡ配列及び２）機能性シグナル配列
のみをコードするＤＮＡ配列か、又は機能性シグナルと
会合する種々の量のアミノ末端ポリペプチド・コドン若
しくは成熟コドンと融合する菌類のグルコアミラーゼ又
はカルボキシ・プロテアーゼ又はヒトの組織プラスミノ
ーゲン活性化因子又は成長ホルモンをコードするＤＮＡ
配列。

【００１３】さらに、本発明の異種ポリペプチドは、
１）上記のハイブリッドポリペプチドを形成するのに用
いられたものと同様に原核、真核及び菌類生物由来のポ
リペプチド配列中に存在もしくは発生する天然のアレリ
ック (allellic) 変化物 ２）、異種ポリペプチド中、
１つ以上のアミノ酸の種々の欠失、挿入、置換が生ずる
ような、例えば部位特異的突然変異などによってもたら
される上記異種ポリペプチドの処理変化物、も含んでい
る。“生化学的に活性のある異種ポリペプチド”とは、
その能力により媒介されることが明らかな活性型で分泌
される異種ポリペプチドで、例えば、１）天然の部分で
その生化学的活性が媒介され、２）ハイブリッド・ポリ
ペプチドの場合、ハイブリッド・ポリペプチドを構成す
る、少なくとも１つの天然の部分により生化学的活性が
媒介される。上に定義した各異種ポリペプチドは、発現
や分泌が起こる繊維状菌類により認識される終止シグナ
ルを含む異種のＤＮＡ配列によりコードされている。宿
主により認識されると、その終止シグナルは、異種ポリ
ペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を終了する。

【００１４】“本発明”の繊維状菌類とは真核微生物で
あり、副分類のユーマイコチナ (Eumycotina）（２６）
の全ての繊維状型のものを含む。これらの菌類は、チチ
ン、セルロース及び他の複雑なポリサッカライドからな
る栄養生殖ミセリウムにより特徴づけられる。本発明の
繊維状菌類は形態学的、生理学的、遺伝学的に酵母とは
異なるものである。栄養生殖的な生育は、ハイファル
(hyphal) な伸長によるもので、炭素代謝は義務的に好
気的である。これに対して、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ. ce
revisiae）のような酵母による栄養生殖的な生育は単細
胞葉状体の出芽によるものであり、炭素代謝は発酵的で
ある。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ. cerevisiae）は優勢で、
非常に安定なディプロイド相を有し、アスペルギライ
(Aspergilli) やニューロスポラ (Newrospora) のよう
な繊維状菌類中ではディプロイドは減数分裂前に僅かに
存在するにすぎない。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ. cerevisi
ae）は１７個の染色体を有するが一方、Ａ．ニドゥラン
ス（Ａ．nidulans) 及びＮ．クラッサ（Ｎ．crassa) は
それぞれ８個及び７個有する。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ.c
erevisiae）と繊維状菌類との差に対する最近の説明
は、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ. cerevisiae）がアスペルギ
ラス (Aspergillus)及びトリコデルマ (Trichoderma)の
イントロンを持たないことや、繊維状菌類の転写制御因
子の多くを認識できないことを含んでいる。（２７）

【００１５】繊維状菌類の色々な種が、次にあげるゲネ
ラ (genera) を含んで発現宿主として用いることができ
る、アスペルギラス (Aspergillus)、トリコデルマ (Tr
ichoderuma) 、ニューロスポラ (Newrospora) 、ポドス
ポラ (Podospora)、エンドチア・ムコール (Endothia m
ucor) 、コチオボラス (Cochiobolus)及びピリクラリア
(Pyricularia) 。特異的な発現宿主には、Ａ．ニドゥラ
ンス（Ａ．nidulans)１８、１９、２０、２１、６
１）、Ａ．ニガー (Ａ.niger）（２２）、Ａ. アワモリ
（Ａ．awamori)例えば、ＮＲＲＬ３１１２、ＡＴＣＣ２
２３４２（ＮＲＲＬ３１１２）、ＡＴＣＣ４４７３３、
ＡＴＣＣ１４３３１及びＵＶＫ１４３ｆ株、Ａ．オリザ
エ (Ａ.oryzae)、例えば、ＡＴＣＣ１１４９０、Ｎ．ク
ラッサ（Ｎ．crassa) （１６、１７、２３）、トリコデ
ルマ・レエセイ(Tricoderma reesei)、例えば、ＮＲＲ
Ｌ１５７０９、ＡＴＣＣ１３６３１、５６７６４、５６
７６５、５６４６６、５６７６７、及びトリコデルマ・
ビリデ(Tricoderma viride) 、例えば、ＡＴＣＣ３２０
９８及び３２０８６、を含んでいる。

【００１６】ここで用いられているように、“プロモー
ター配列”とは、発現の目的のためにその繊維状菌類に
より認識されるＤＮＡ配列である。それは、上に定義し
たポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に機能的に結合
している。その結合には、公開されるトランスフォーメ
ーション・ベクターのシグナル配列をコードするＤＮＡ
配列の開始コドンに対するプロモーターの位置どりをも
含まれている。そのプロモーター配列はシグナル配列と
異種ポリペプチドの発現を媒介する転写及び翻訳制御配
列を含んでいる。実施例には、Ａ．ニガー（Ａ．niger)
のグルコアミラーゼ（３９、４８）、ムコール・ミエヘ
イ (Mucor miehei) のカルボキシル・プロテアーゼ、
Ａ．ニガー（Ａ．niger)のα−グルコシダーゼ（２
８）、トリコデルマ・レエセイ(Tricoderma reesei) の
セロビオハイドロレースＩ（２９）、Ａ．ニドゥランス
（Ａ．nidulans) のtrp Ｃ（１８）のプロモーター及び
ＳＶ４０の初期プロモーターのようなより高度な真核生
物プロモーター（２４）を含んでいる。

【００１７】同様に、“ターミネーター配列”は、発現
宿主に認識され転写を終止するＤＮＡ配列である。これ
は発現されるべく異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ
の３’端に機能的に結合している。実施例には、Ａ．ニ
ドゥランス（Ａ．nidulans)のtrp Ｃ（１８）、Ａ．ニ
ガー（Ａ．niger)のグルコアミラーゼ（３９、４８）、
Ａ．ニガー（Ａ．niger)のα−グルコシダーゼ（２
８）、及びムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) のカル
ボキシル・プロテアーゼのターミネーターが含まれる
が、いかなる菌類ターミネーターも、本発明において機
能的であるようである。“ポリアデレーション配列”と
は、転写の際、発現宿主により認識され、転写されたｍ
ＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するＤＮＡ配列であ
る。それは、発現すべき異種ポリペプチドをコードする
ＤＮＡの３’端に機能的に結合している。実施例には、
Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) のtrp Ｃ（１８）、
Ａ．ニガー（Ａ．niger)のグルコアミラーゼ（３９、４
８）、Ａ．ニガー（Ａ．niger)のグルコシダーゼ（２
８）、及びムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) のカル
ボキシル・プロテアーゼのポリアデニレーション配列が
含まれる。しかし、いかなる菌類のポリアデニレーショ
ン配列も、本発明において機能的であるようである。

【００１８】“シグナル配列”とは、異種ポリペプチド
のアミノ末端に機能的に結合したとき、宿主の繊維状菌
類からその異種ポリペプチドが分泌するのを助けるアミ
ノ酸配列のことである。そのようなシグナル配列は、異
種ポリペプチドと正常に会合しているシグナル配列であ
る場合もあるし（本来のシグナル配列）、又、他の生物
由来のもの（外来のシグナル配列）である場合もある。
シグナル配列は本来のシグナル配列を利用するか、もし
くは、シグナル配列と異種ポリペプチドの翻訳を許すよ
うな適正な読み枠となるように、異種ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列に外来のシグナル配列をコードする
ＤＮＡ配列を結合することによって、異種ポリペプチド
に機能的に結合している。本発明を実施するのに有用な
シグナル配列は、仔牛のプレプロキモシン（１５）、
Ａ．ニガー（Ａ．niger)のグルコアミラーゼ（３９）、
ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) のカルボキシル・
プロテアーゼ及びトリコデルマ・レエセイ (Tricoderma
reesei)のセルラーゼ（２９）、由来のシグナルを含ん
でいる。しかし、異種ポリペプチドの分泌を許す全ての
シグナル配列は本発明により考慮されている。

【００１９】“プロペプチド”もしくは“プロ配列”と
は、成熟した生物学的に活性なポリペプチドのアミノ末
端に位置するアミノ酸配列である。そのように位置する
場合、そのポリペプチドをザイモゲンと呼ぶ。一般にザ
イモゲンは生物学的に不活性で、ザイモゲンからプロペ
プチドが、触媒的又は自己触媒的に切断することによ
り、成熟した活性ポリペプチドに転換することができ
る。本発明の具体例中、“トランスフォーメーション・
ベクター”とは、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列及び、それと機能的に結合した異種又は同種のシグ
ナル配列をコードするＤＮＡ配列である。さらに、トラ
ンスフォーメーション・ベクターは、機能的プロモータ
ー及びポリアデニレーション配列をコードするＤＮＡ配
列を含むこともある。また、上記の各トランスフォーメ
ーション・ベクターは菌類のトランスフォーメーション
効率を高める配列と同様に、発現可能な選択特性をコー
ドする配列を含むこともある。“トランスフォーメーシ
ョン”は、トランスフォーメーション・ベクターが繊維
状菌類に導入されるプロセスである。本発明のトランス
フォーメーションの方法により、繊維状菌類の遺伝子中
にトランスフォーメーション・ベクターの全部又は一部
が安定に組み込まれる。しかし、自己複製する染色体外
トランスフォーメーション・ベクターを維持するトラン
スフォーメーションも考えられている。

【００２０】（一般的方法）ＤＮＡの“消化”とは、Ｄ
ＮＡ中のある位置のみに作用する酵素でＤＮＡを触媒的
に切断することである。そのような酵素を制限酵素と呼
び、各々の特異的部位を制限部位と呼ぶ。“部分”消化
とは制限酵素による不完全分解のことで、つまり、与え
られた制限エンドヌクレアーゼに対して、ＤＮＡ基質の
全ての部位ではなく、一部が切断される条件が選ばれ
る。ここで用いられる種々の制限酵素は市販されてお
り、酵素提供者により確立されたそれらの反応条件、補
因子及びその他の必要物が用いられる。一般に、約１マ
イクログラムのプラスミド又はＤＮＡフラグメントに対
し、約１ユニットの酵素及び約２０マイクロリットルの
緩衝溶液が使われる。通常、３７℃で約１時間のインキ
ュベーション時間が使われるが、提供者の指示に従って
変化することもある。インキュベーション後、タンパク
質は、フェノール及びクロロホルムによる抽出により除
かれ、消化した核酸はエタノール沈殿により水層から回
収する。制限酵素による消化の後に、末端５’リン酸を
バクテリアのアルカリ・ホスファターゼにより加水分解
し、連結に際し、制限部位での他のＤＮＡフラグメント
の挿入を妨害するべく、ＤＮＡフラグメントの２つの末
端が閉鎖ループを形成するのを防ぐ。制限消化物から
の、決められたＤＮＡフラグメントの“回収”又は“単
離”とはポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による消化
物の分離、そのフラグメントの同定、望ましいフラグメ
ントを含むゲル画分の除去及び一般には電気流出による
ＤＮＡのゲルからの分離を意味する。（３０）

【００２１】“連結”とは２つの二本鎖核酸フラグメン
ト間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味
する。（３０）もしも他言しない場合は、連結は、0.５
マイクログラムの連結すべき、およそ等モル量のＤＮＡ
フラグメントに対し、１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ
（“リガーゼ”）をつかう条件で既知の緩衝液を用いて
行なう。“オリゴヌクレオチド”はクレア (Crea) 等の
方法により（３１）、化学的に合成し、さらにポリアク
リルアミド・ゲルで精製した短かい長さの１本鎖又は２
本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。“トランスフ
ォーメーション”とは、ある生物中にＤＮＡを導入し、
その結果そのＤＮＡが染色体外要素又は染色体組み込み
体として維持されることを意味する。他言しない限り、
大腸菌（Ｅ．coli) のトランスフォーメーションに対し
てここで用いる方法は塩化カルシウム法である（３
０）。

【００２２】Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) のＧ１
９１株（グラスゴー大学、培養収集所）は、Ａ．ニドゥ
ランス（Ａ．nidulans) のスフェロプラストをトランス
フォーメーション・ベクターとインキュベートすること
によりトランスフォームする。Ｇ１９１株の遺伝型は、
pabaＡ１（ｐ−アミノ安息香酸要求）、fwＡ１（色素形
成）、man Ａ２（モノアミン非利用）、及びpyr Ｇ８９
（オロチジン・ホスフェート・デカルボキシレース欠
損）である。スフェロプラストは次の修正を加えて、バ
ランス (Ballance) 等のセロファン法により調製した。
Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) の細胞壁を消化する
ために、まずノボザイム (Novozyme) ２３４（デンマー
クのノボ工業 (Novo Industries)製）を部分的に精製し
た。ノボザイム２３４の１００〜５００mgの試料を2.５
ｍl の0.６ＭＫClに溶解する。その2.5 ｍl 画分を0.６
ＭＫClで平衡化したＰＤ１０カラム（スウェーデンのフ
ァルマシア−アプスラ (Pharmacia-Upsulla)社製) にチ
ャージし、その酵素を3.５ｍl の同様の緩衝液で流出し
た。セロファン・デスクをノボザイム２３４（５mg／m
l）中で２時間インキュベートし、さらに0.６ＭＫClで
洗浄した。その消化物と洗い水を合せ、ミラクロス（カ
リフォルニア州、ラ・ジョラ (La Jolla) のカルバイオ
ケム・ベーリング (Calbiochem-Behring) 社製）で濾過
し、記述されているように洗浄した（２１）。５０又は
１５ｍl のコニカルチューブで１０００×ｇで１０分間
遠心した。氷中で２０分間インキュベートし、２ｍl の
ポリエチレングリコール４０００溶液（２５０mg／ml）
を加え、室温で５分間インキュベートし、さらに４ｍl
の0.４ＭＫCl、５０ mM CaCl₂ 溶液を加えた。トランス
フォームしたプロトプラストを遠心し、0.６ＭＫCl、５
０mM CaCl₂に再懸濁し、さらに記述のとおりプレーティ
ングした（２１）。ゼロ・コントロールは、プラスミド
ＤＮＡなしの２０μl の２０ mＭ Tris −ＨCl、１ mＭ
ＥＤＴＡ、 pＨ7.４でインキュベートしたプロトプラ
ストで行った。ポジティブ・コントロールはここに述べ
ているように構築した５μｇのｐＤＪＢ３でのトランス
フォーメーションを含んでいる。再生頻度は５〜１０pp
m のパバ及び５００ppm のウリジンを補った最少培地に
希釈物をプレーティングすることで決定した。再生は0.
５から５％の範囲であった。

【００２３】ｐＤＪＢＩに関連した低いトランスフォー
メーション効率のために、ムコール(Mucor)酸プロテア
ーゼ遺伝子を含む誘導体（ｐＭｅＪＢ１−７）は非常に
低いトランスフォーメーション効率をもつことが期待さ
れた。結果的に、Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) の
ｐＭｅＪＢ１−７のトランスフォーマントを得るため、
コトランスフォーメーションを用いた。これはまず、非
選択性のＡＮＳ−１を含むベクターを構築し、さらにｐ
ＭｅＪＢ１−７とＡＮＳ−１フラグメントを含有する非
選択性ベクターとの混合物でスフェロプラストをトラン
スフォームすることで成される。このアプローチのため
の原理は、ＡＮＳ−１をもつベクターは多くのコピー中
に組込まれ、ｐＭｅＪＢ１−７の組込みに対し相同的領
域を与えるであろうということである。ＡＮＳ−１ベク
ターは、ｐＤＪＢ−３からのＡＮＳ−１のＰstＩ−Ｐvu
II フラグメント( 図１５、１６）をｐＵＣ１８にサブ
クローンすることにより調整する。（３３）２つのプラ
スミド（ｐＭｅＪＢ１−７とＡＮＳ−１を含むベクタ
ー）を混合し（各2.５μｇ）、上述のトランスフォーメ
ーション・プロトコールに従った。

【００２４】ベクターｐＧＲＧ１−ｐＧＲＧ４及びｐＤ
ＪＢ−gam で得られたトランスフォーマントは３７℃で
３又は４日インキュベーション後、移し替えた。５ppm
のｐ−アミノ安息香酸を補った最小培地寒天プレートの
中央にトランスフォーマント由来のミセリアル・トラン
スファーをイノキュレートした。最小培地プレートへの
イノキュレーション後３〜５日たって、１ｍl 蒸留水、
0.０２％のトウィーンン（Tween)−２０中にミセリアル
・フラグメントを攪拌することにより、胞子サスペンジ
ョンを調製した。およそ５×１０⁴ の胞子を５０ｍl の
次の組成の培地を含む２５０ｍl の振とうフラスコにイ
ノキュレートした。；（ｇ／ｌ）マルトテキストリンＭ
−０４０（アイオワ州、ムスカチン (Muscatine)、グレ
イン・プロセシング・コープ (Grain Processing Cor
p.）５０ｇ、NaNO₃ ６ｇ、MgSO₄ ・7 H₂O 0.5 ｇ、ＫCl
0.5２ｇ、KH₂PO₄ 6８ｇ、１ｍl 微量元素溶液、１ｍl
ＭＡＺＵ ＤＦ−６０ｐ消泡剤（イリノイ州、ガーニィ
ー (Gurnee) 、マゼフ・ケミカル・インク (Mazef Chem
ical Inc.)、１０ppm ｐ−アミノ安息香酸、及び５０pp
m ストレプトマイシン硫酸塩。ＭＡＺＵに代って、仔牛
血清アルブミンもしくは他の適当な界面活性剤のような
ものも用いることができる。ムコール (Mucor)酸プロテ
アーゼ分泌はアスペルギラス(Aspergillus) 完全培地
（１リットル当り２０ｇのデキストローズ、１ｇペプト
ン、２０ｇのマルト抽出物）でテストした。アスペルギ
ラス・ニドゥランス (Aspergillus nidulans) トランス
フォーマントによるキモシン分泌の炭素源制御は、５％
デンプンの代りに、１％のフラクトス、スクロース又は
デキストロースを補った同様の培地に対する上述のデン
プン培地中での分泌を測定することにより検定した。全
ての場合において、培地は３７℃、ロータリー・シェカ
ー（１５０rpm ）でインキュベートした。ｐＤＪＢ３由
来のトランスフォーマントはコントロールとして使われ
た。

【００２５】種々の分泌されたキモシン及びムコール・
ミエヘイ (Mucor miehei) のカルボキシル・プロテアー
ゼのウェスターン・ブロットがトービン (Towbin) 等の
方法に従って行われた（３５）。キモシン・培地中の高
塩濃度とこの塩のゲル電気泳動への影響のために、脱塩
ステップが必要である。予め作られたＧ−２５カラム
（ファルマシア (Pharmacia)、ＰＤ１０）を pＨ6.０の
５０ mＭ Na₂HPO₄で平衡化した。培地の2.５ｍl をその
カラムにかけた。タンパク質を3.５ｍl の同緩衝液で流
出させた。ブロット上に存在する異種ポリペプチドは、
まずニトロセルロース・ブロットをウサギの抗−キモシ
ン（３６）又はウサギの抗−ムコール・ミエヘイ (Muco
r miehei) カルボキシル・プロテアーゼ血清（３６）と
接触させた。次にそのブロットをホースラディッシュ・
パーオキシデース（カルフォルニア、リッチモンド バ
イオ−ラッド社）と結合させたヤギ−抗−ウサギ血清と
接触し、展開した。ゲルにかける前に、５０μl の溶媒
（キモシンの場合には脱塩する）を２５μl のＳＤＳ試
料緩衝液と混合した。最終濃度が１％となるようβ−メ
ルカプトエタノールを加えた。その試料を９５℃で５分
間処理した後、４０〜５０μl の試料をゲルにチャージ
した。また各ゲルには各２μl の６５０、６５、6.５μ
ｇ／mlのキモシン・標準物質と分子量マーカーをチャー
ジした。ｐｍｅＤＪ１−７トランスフォーマントのウェ
スタン・ブロットをゲル浸透を行なわないこと以外、同
様に分析した。

【００２６】プロテアーゼ活性は、ソコール (Sokol)等
（３７）により述べられた方法により検出した。ルリァ
(Luria)培地に１〜1.５％のスキム・ミルク（ディフコ
(Difco ））を補ない、その３０〜３５ｍl を１５０mm
のシャーレに注いだ。培地２〜５μl 画分をシャーレに
スポットし、そのプレートを加湿箱中３７℃で１晩イン
キュベートした。その活性はプレート上に生ずるミルク
のクロッティングの量をmm単位で測定することに基づい
て決定した。そのプレートを１００ CHU／ｍlもしくは
１6.６ CHU／ｍl のレンニン（ＣＨＵ−Ｃhrハンセン単
位、コペンハーゲン、Ａ./Ｓ．、Ｃhr−ハンセン・ラボ
ラトリー (Hamsen's Laboratorium)希釈物で共スポッテ
ィングした。凝結帯の直径（mm）と酸素濃度は、対数関
係にある。プロテアーゼのタイプを区別するのに、カル
ボキシル・プロテアーゼのキモシンタイプの阻害剤であ
るペプスタチンを、キモシン由来のプロテアーゼ活性の
阻害のため使用した。キモシン変異株試料とコントロー
ル培地を、プロテアーゼ活性分析にかける前に、ＤＭＳ
Ｏ中１０ mＭペプスタチンを１００倍希釈したもので５
分間プレインキュベートした。

【００２７】５％デンプン培地中のｐＤＪＢ−gam −１
トランスフォーマントによるグルコアミラーゼ分泌は、
ｐ−ニトロフェノール−α−グルコピラノシド（ＰＮＰ
ＡＧ）（３８）をフリーのグルコースとｐ−ニトロフェ
ノキサイドへの転換を触媒するグルコアミラーゼの活性
に基づく方法により検定した。基質、ＰＮＰＡＧ、をＤ
ＭＳＯ中１５０mg／mlに溶解、３／１５μl 画分を pＨ
4.３ 0.２Ｍ酢酸ソーダ、１ mＭ塩化カルシウム溶液２
００μl で希釈した。２５μl の試料をミクロタイター
・プレートのウェルに入れる。等量の０から１０シグマ
（Sigma)Ａ．ニガー（Ａ．niger)ユニット／ｍl （Ｍ
Ｏ．セントルイス、シグマケミカル社 (Sigma Chemical
Co.) ）の範囲の標準物質を各々別のウェルに入れる。
各ウェルに、2.２５から１1.２５mg／mlのＰＮＰＡＧ溶
液２００μl を加える。反応は６０℃で３０分から１時
間行った。その時間は、酵素濃度に依存する。反応は、
５０μl の２Ｍトルズマーベースを加えることにより停
止した。プレートを４０５ nｍで測定し、酵素濃度は検
量線から算出した。

【００２８】他言がない場合、染色体ＤＮＡは次のよう
な操作で繊維状菌類から抽出した。繊維状菌類を適当な
培地で３から４日間生育させた。マイセリアは、細かい
チーズクロスで培地を濾過することで収穫し、５０ mＭ
Tris−ＨCl、 pＨ7.５、５mＭＥＤＴＡの緩衝液で洗
浄した。過剰の液体はマイセリアをチーズクロスで押し
つけことにより取除いた。湿ったマイセリア約３から５
グラムを同量の殺菌済、酸洗浄済砂と乳鉢、乳棒で混合
した。その混合物を５分間すりつぶし、細かいペースト
を作った。さらに１０ｍl の５０ mＭ Tris−ＨCl、 p
Ｈ7.５、５ mＭＥＤＴＡを加えて、５分間その混合物を
すりつぶした。そのスラリーを５０ｍlのキャップ付遠
心管に注ぎ、２５ｍl のフェノール−クロロホルムで抽
出した（同体積の５０ mＭ Tris−ＨCl、 pＨ7.５、５
mＭＥＤＴＡで平衡化したもの）。低速遠心により相分
離させ、その水層に対し、３回抽出をくり返した。その
水層を合わせて（総体積約２０ｍl ）、殺菌済遠心管中
で、２ｍl の３Ｍ酢酸ナトリウム、 pＨ5.４と混合し
た。氷冷したイソプロパノール（２５ｍl ）を加え、そ
の遠心管を１時間−２０℃で放置した。その遠心管を高
速で遠心し核酸をペレット化し、上清は捨てた。そのペ
レットを３０分間風乾させ、その後４００μlの１０ m
Ｍ Tris−ＨCl、 pＨ7.５、１ mＭＥＤＴＡ（ＴＥ緩衝
液）にサスペンドした。膵リボヌクレアーゼ（ＭＤ、セ
ントルイス、シグマケミカル社 (SigmaChemical C
o.））をｍl 当り１０μｇの濃度になるように添加し、
室温で３０分間インキュベートする（３０）。その後、
リボヌクレアーゼはフェノール−クロロホルム抽出によ
り取り除く。水層を慎重に取って、４０μl の３Ｍ酢酸
ソーダ、 pＨ5.４を含む試験管に移す。その溶液に氷冷
エタノールを重層し、界面にＤＮＡが沈殿するので、そ
れをガラス棒でまきとる。このＤＮＡを乾燥し、少量の
ＴＥ緩衝液（１００〜２００μl ）に溶解する。ＤＮＡ
濃度は２６０ nｍの吸収により決定した。

【００２９】選択したトランスフォーマント中のキモシ
ンＤＮＡ配列の染色体組込みを確かめるためにサウザー
ン・ハイブリダイゼーションを行った（３０）。トラン
スフォーマントの胞子サスペンジョンをアスペルギラス
(Aspergillus)の完全培地にイノキュレートし、ロータ
リー・シェーカー中で、３７℃、２４〜４８時間インキ
ュベートした。培地は非選択的で、５ppm のｐ−アミノ
安息香酸を補い、独立栄養の親株の生育のため十分なウ
ラシルが含まれている。実際には、これらサウザーンは
トランスフォーマントの安定性に対するテストも行っ
た。マイセリアの濾過後、砂ですりつぶし、先に述べた
ようにＤＮＡを精製した。さらにトランスフォーマント
ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、フラグメントをアガ
ロース・ゲル電気泳動により分離した。コントロール・
レーンは消化したｐＤＪＢ３トランスフォーマントＤＮ
Ａ及び非消化ＤＮＡを含んでいる。ゲルをエチジウム・
ブロマイドで染色し、写真撮影し、ニトロセルロース又
はニトラン（ＮＨ、キーン(Keene)、シュレイチャー及
びシュエル (Schleicher and Schuell) 製）にブロット
し、放射性ラベルしたプラスミド又は特異的フラグメン
トで探った。

【００３０】

【実施例】

実施例 １ アスペルギラス・ニドゥランス (Aspergillus nidulan
s) によるアスペルギラス・ニガー (Aspergillus nige
r)のグルコアミラーゼの発現と分泌 Ａ．ｐＧＡ１の構築 アスペルギラス・ニガー (Aspergillus niger)（培養番
号７ (Culture ＃７）、ＣＡ．サウス・サンフランシス
コ (South San Francisco)、カルチャー・コレクション
・ジェネンカー (Culture Collection Genencor)）を激
しい曝気下、３０℃で３日間生育させた。染色体ＤＮＡ
は先に述べた方法で行った。合成オリゴヌクレオチドを
ハイブリダイゼーション・プローブとして使用し、アス
ペルギラス・ニガー (Aspergillus niger)由来のグルコ
アミラーゼ遺伝子の検出を行った。そのオリゴヌクレオ
チドの長さは２８塩基長（２８mer)、公表されているグ
ルコアミラーゼをコードする配列の最初の９１／３コド
ンに相当する。（３９） ＭetＳerＰheＡrgＳerＬeuＬeuＡlaＬeuＳer 5'ATGTCGTTCCGATCTCTACTCGCCCTGA3'

【００３１】そのオリゴヌクレオチドは、製造業者によ
り指示された試薬と方法を用いてバイオサーチ (Bio Se
arch) 製自動ＤＮＡ合成機（ＣＡ，サンラファエル (Sa
n Rafael) 、バイオサーチ (Bio Search) 製）で合成し
た。アスペルギラス・ニガー(Aspergillus niger)のゲ
ノムＤＮＡに対し、サウザーン法によりグルコアミラー
ゼ配列の存否を分析した（３０）。簡単にいうと、アス
ペルギラス・ニガー (Aspergillus niger)ＤＮＡ１０μ
ｇをＥcoＲ１制限エンドヌクレアーゼで消化する。消化
したＤＮＡを標準法に従って１％アガロース・ゲル電気
泳動にかける（３０）。ＤＮＡを１０×ＳＳＣ（1.５Ｍ
NaCl 、0.１５Ｍクエン酸３ナトリウム）中のブロッテ
ィングにより、ゲルからニトロセルロース膜（ＮＨ、キ
ーン (Keene)、シュレイチャー及びシュエル (Schleich
er & Schuell) 製）に移す（３０）。８０℃の真空オー
ブンで焼くことにより、ＤＮＡをニトロセルロースに固
定し、放射性ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを
用いて、低塩濃度（２，４０）ハイブリダイゼーション
を行う。合成オリゴヌクレオチドの放射性ラベル化は７
０ mＭ Tris−ＨCl（ pＨ7.５）１０ mＭ MgCl₂ 、５
mＭジチオスレイトール、３０ｐmole合成オリゴヌクレ
オチド、２０ｐmoleのガンマー〔³²Ｐ〕ＡＴＰ（１リッ
トル、シカゴ、アマーシャム (Amersham) 、比活性５０
００ci／m mol)、及び５ユニットのＴ４ポリヌクレオチ
ド、キナーゼ（ニュー・イングランド、バイオラブ ( N
ew-England・Biolabs ) を含む５０μl 反応溶液中３７
℃で行なわれる。ハイブリダイゼーション後、フィルタ
ーを２×ＳＳＣ、0.１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）で１５分間洗浄し、３７℃、２×ＳＳＣで２度洗
う。フィルターを空気乾燥後、サラン・ラップ（ダウ・
ケミカル (Dow Chemical)で包み、−７０℃でコダック
のＸＯmat −ＡＲ Ｘ線 フィルムにかけてオートラジ
オグラフ像を得た。オートラジオグラム現像後、ハイブ
リダイゼーションのバンドが3.５キロ塩基対のＥcoＲ１
フラグメントに対応して明確に確認できる。

【００３２】アスペルギラス・ニガー (Aspergillus ni
ger)のゲノムＤＮＡをＥcoＲ１で消化し、標準法（３
０）に従って、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によ
ってサイズ別に分画した。３から４ｋｂのサイズのＤＮ
Ａフラグメントが切られ、ゲルから溶出した（３０）。
このＤＮＡフラグメントを大腸菌（Escherichia coli)
のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０
１７）において、クローン・ライブラリーを作るのに用
いた。クローニング・ベクターをＥcoＲ１で切断し、バ
クテリア・アルカリ・ホスファターゼ（ベセスダ・リサ
ーチ・ラブ (Bethesda Research Labs) 製）で脱リン酸
化した。典型的な脱リン酸化反応は、５０μl の５０ m
Ｍ Tris−ＨCl（ pＨ8.０）、５０ mＭ NaCl 中１μｇ
の消化ベクターＤＮＡと１ユニットのアルカリホスファ
ターゼにより行った。その反応物を６５℃で１時間イン
キュベートした。ホスファターゼはフェノール−クロロ
ホルム抽出により除去した。それからＥcoＲ１による、
選ばれたサイズのアスペルギラス・ニガー (Aspergillu
s niger)のＤＮＡをＥcoＲ１で切断し脱リン酸化したｐ
ＢＲ３２２と連結した。典型的な連結反応は次のものを
含んでいる；各１００nｇのベクター及び挿入ＤＮＡ、
１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ・リサーチ
・ラブ (Bethesda Research Labs) ）、２５ mＭ Tris
−ＨCl（ pＨ７．５）、１０ mＭ MgCl₂ 、１０ mＭジ
チオスレイドル、及び１ｍＭＡＴＰが１０μl 体積中に
存在する。連結反応は１６℃で１８から２４時間インキ
ュベートする。

【００３３】連結したＤＮＡは、モリソン (Morrison)
の方法（４１）により調製した大腸菌（Ｅ．coli) ２９
４のコンピテント細胞（ＡＴＣＣ３１４４６）をトラン
スフォームするのに用いた。トランスフォーマントを、
最終濃度５０μｇ／ｍl のカルベネシリンを含むＬＢ寒
天プレート（３０）で選択した。グルコアミラーゼ遺伝
子配列をもつトランスフォーマントは、プローブとし
て、グルコアミラーゼ特異的２８量体を使ったコロニー
・ハイブリダイゼーション法（３０）によって同定し
た。ハイブリダイズしたコロニーを精製し、プラスミド
ＤＮＡをアルカリ−ＳＤＳ−ミニスクリーン操作（３
０）により、その各々から単離した。この方法で選択し
たプラスミドは全て合成グルコアミラーゼプローブにハ
イブリダイズする3.５ｋｂのＥcoＲ１フラグメントを含
んでいた。そのようなｐＧalと命名したプラスミドを、
さらに解析するために選んだ。ｐＧal中の挿入物から1.
1 ｋｂのＥcoＲ１−ＢglIIフラグメントをＭ１３mp９
（４２）にサブクローンし、ダイデオキシ・チェーン・
ターミネーション法（４３）により部分的に配列決定
し、そのクローン化ＤＮＡがグルコアミラーゼ遺伝子を
コードしていることを確かめた。ｐＧal１中に含まれる
3.５ｋb のＥcoＲ１フラグメントの制限エンドヌクレア
ーゼ切断地図を図１に示した。それは、既知のｐＢＲ３
２２の制限部位に関する方向製を知るために、単一及び
２重の制限消化によって作られた。（４４）

【００３４】Ｂ．ｐＧａ５の構築 ｐＧalのヌクレオチド配列及び制限地図はｐＧalが全グ
ルコアミラーゼ・コード領域と２２１ヌクレオチドの
５’側ＤＮＡを含んでいることを示した。この５’側領
域の配列は、驚くべきことに、ＡＴＧの開始コドンの上
流に存在する。ＴＡＴＡＡＡＴ及びＣＡＡＴボックスの
ある典型的な真核生物プロモーター配列と同じである
（４８）。しかし、アスペルギラス・ニガー (Aspergil
lus niger)のグルコアミラーゼ遺伝子のかなり上流の活
性化部位が最終的なトランスフォーメーション・ベクタ
ー中に含まれることを確かめるために、５’側の少なく
とも１０００ｂｐのＤＮＡを含む大きいゲノムフラグメ
ントをクローン化した。すでに述べたと同じサウザーン
・ブロッティング実験により、ｐＧalからの放射性ラベ
ルしたＥcoＲ１グルコアミラーゼフラグメントとハイブ
リダイズする6.５ｋb のＣla Iフラグメントを同定し
た。そのＥcoＲ１フラグメントはアルファー〔³²Ｐ〕−
ｄＣＴＰ（アマーシャム、比活性３０００ci／m mol)を
つかってニック・トランスレーション（３０）により放
射性ラベルした。ラベル反応は、製造業者により提供さ
れた説明に従って、ニック・トランスレーション・キッ
ト（ベセスダ・リサーチ・ラブ (Bethesda Research La
bs) を用いた。フィルターはハイブリダイズされ、高塩
濃度条件で洗浄した（３０）。

【００３５】ハイブリダイゼーションにより同定した6.
５ｋb のＣla Iフラグメントを先に述べたような方法で
クローン化した。アスペルギラス・ニガー (Aspergillu
s niger)のＤＮＡをＣla Iで消化し、ポリアクリルアミ
ド・ゲル電気泳動によりサイズ別に分画した。5.５から
８ｋb の間に移動したＤＮＡフラグメントを切り出し、
ゲルから流出した。このフラクションをＣla I切断し、
脱リン酸したｐＢＲ３２５と連結した（４５）。この連
結混合物を大腸菌（Ｅ．coli) ２９４のコンペテント細
胞をトランスフォームするのに用いた。トランスフォー
マントは、カルベネシリン（５０μｇ／ｍl ）を含むＬ
Ｂ寒天プレート上で選択した。グルコアミラーゼ遺伝子
配列を含むコロニーをコロニー・ハイブリダイゼーショ
ンにより同定した（３０）。ハイブリダイズしたコロニ
ーから抽出したプラスミドＤＮＡは、先にｐＧal中にク
ローン化した3.５ｋb のＥcoＲ１フラグメントを含んで
いた。これらの組換えプラスミドは、シークエント・プ
ライマーとして合成オリゴヌクレオチド（２８量体）を
つかったスーパーコイル・ＤＮＡ配列決定法により確認
されたように、アスペルギラス・ニガー (Aspergillus
niger)のグルコアミラーゼ遺伝子をコードしていた。そ
の6.５ｋb のＣla Iフラグメントの制限エンドヌクレア
ーゼ切断地図を、ｐＢＲ３２５中にクローン化したＤＮ
Ａを単一及び二重消化することにより構築した。ベクタ
ーＤＮＡ中の制限部位を参照点として用い、そのフラグ
メントの方向を決めた。この制限地図を図１に示した。
グルコアミラーゼ遺伝子の位置は、ｐＧa ５’の制限部
位を、先に公表されているグルコアミラーゼ遺伝子のそ
れと比較することにより決定した（３９、４７、４
８）。地図のデータから、クローン化フラグメント内
に、およそ3.３ｋb の５’側フランキングＤＮＡと約１
ｋb の３’側フランキングＤＮＡが含まれることが確か
められた。１９８５年８月２８日、プラスミドｐＧa 5
は大腸菌（Ｅ．coli) ２９４中、ＡＴＣＣに預けられ、
５３２４９番と命名された。

【００３６】Ｃ．アスペルギラス・ニガー (Aspergillu
s niger)のグルコアミラーゼの発現及び分泌のためのベ
クター グルコアミラーゼ遺伝子を含むｐＧa 5 由来の6.５ｋb
のＣla Iフラグメントを大腸菌（Ｅ．coli) −アスペル
ギラス・ニドゥランス (Aspergillus nidulans) のシャ
トルベクターｐＤＪＢ３中に、図２に示すごとくクロー
ン化した。ｐＤＪＢ３シャトルベクターは、大腸菌
（Ｅ．coli) のプラスミドｐＢＲ３２５由来の選択可能
なベータ・ラクトアミラーゼ遺伝子及び複製開始点、ア
スペルギラス・ニドゥランス (Aspergillus nidulans)
のＧ１９１株においてウリジンに対する栄養要求を救済
するニューオスポラ・クラッサ (Newspora crassa)由来
のpyr４遺伝子、アスペルギラス・ニドゥランス（ (Asp
ergillus nidulans) において安定な組込みトランスフ
ォーマントを高頻度に出現させるアスペルギラス・ニド
ゥランス (Aspergillus nidulans) 由来のＡＮＳ１とし
て知られる配列、クローニングのための唯一のＥcoＲ１
及びＣlaＩ制限部位を有している。ｐＤＪＢは図１７に
示したように構築した。プラスミドｐＦＢ６（３２）を
Ｂgl II で完全消化し、さらにＨind III で部分消化し
た。pyr 4 遺伝子（およそ２ｋb ）を含むフラグメント
Ｂをゲル電気泳動により精製し、Ｈind III とＢamＨＩ
で消化したｐＢＲ３２５（フラグメントＡ）と連結し、
プラスミドｐＤＪＢ１を生成した。

【００３７】ＥcoＲ１で消化したｐＦＢ６にＥcoＲ１で
消化したＡ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) ゲノムＤＮ
Ａ（Ｇ１９１株又はＦＧＳＣ＃４−由来の株）を連結す
ることにより、ＡＮＳ−１配列をクローン化した。生じ
たｐＦＢ６中のＥcoＲ１フラグメント・プールを用い、
ura ３−Ｓ・セレビシアエ（Ｓ．Cerevisiae）（例え
ば、ＡＴＣＣ４４７６９、４４７７０等）をトランスフ
ォームした。自己複製プラスミド pＩntＡをＳ．セレビ
シアエ（Ｓ．cerevisiae）から精製する。 pＩntＡをＥ
coＲ１で消化し、ＡＮＳ−１フラグメントをゲル電気泳
動で精製し、ＥcoＲ１で消化したｐＤＪＢ１と連結し、
プラスミドｐＤＪＢ２を生成した。ｐＤＪＢ２をＥcoＲ
１で部分消化し、ＤＮＡポリメレース１（クレノー）で
処理し、再連結によりプラスミドｐＤＪＢ３を生成し
た。ＡＮＳ−１フラグメントの部分的ヌクレオチド配列
及び制限地図を図１５と図１６に示した。プラスミドｐ
Ｇa 5 をＣla１で消化し、大きい方のフラグメント（フ
ラグメントＡ）をアガロース・ゲル電気泳動によりベク
ターから分離した。このフラグメントを、ＣlaＩで消化
し、脱リン酸化したｐＤＪＢ３と連結した（フラグメン
トＢ）。この連結混合物を用いて、大腸菌（Ｅ．coli)
２９４のコンペテント細胞をトランスフォームした。こ
のトランスフォーマントをカルベネシリンを補った（５
０μｇ／ｍl ）ＬＢ寒天プレート上で選択した。これら
のトランスフォーマント由来のプラスミドＤＮＡの解析
は、期待どおり、グルコアミラーゼ・フラグメントが挿
入されていることを示した。両方向を向いたグルコアミ
ラーゼ・フラグメントが種々のトランスフォーマントを
スクリーニングすることにより得られた。ｐＤＪＢ３−
gam 1 と命名した１つのプラスミドをアスペルギラス・
ニドゥランス (Aspergillus nidulans) のプロトプラス
トのトランスフォーメーションに対し、任意に選択し
た。

【００３８】Ｄ．グルコアミラーゼの発現と分泌 前述したように、アスペルギラス・ニドゥランス (Aspe
rgillus nidulans) のＧ１９１株をｐＤＪＢ−gam １で
トランスフォームした。前述したように、ｐＤＪＢ−ga
m −１−４、９、１０、１１及び１３と命名した５個の
トランスフォーマントのグルコアミラーゼ活性を分析し
た。結果を表１に示す。 表 − １ グルコアミラーゼ・活性 試料 （シグマユニット／ｍl ） ｐＤＪＢ３ 0.１２９ ｐＤＪＢ−gam-1-4 0.６８４ ｐＤＪＢ−gam-1-9 0.６６２ ｐＤＪＢ−gam-1-10 0.１３１ ｐＤＪＢ−gam-1-11 0.５０９ ｐＤＪＢ−gam-1-13 0.５６５ Ａ．ニガー 2.６９８ これから分るように各ｐＤＪＢ３−gam −１トランスフ
ォーマントはコントロール以上のグルコアミラーゼ活性
を生じ、これはトランスフォームした菌類から生物学的
に活性のあるグルコアミラーゼが発現、分泌しているこ
とを示している。

【００３９】実施例 ２ アスペルギラス・ニドゥランス (Aspergillus nidulan
s) からの仔牛キモシンの発現と分泌 天然の仔牛キモシンの前駆体（プレプロキモシン）、も
しくはアスペルギラス・ニガー (Aspergillus niger)の
グルコアミラーゼとプロキモシンに対するＤＮＡ配列が
精密に融合している融合前駆体をコードするよう発現ベ
クターを構築した。これらベクターの構築の戦略は次の
ようなステップを含んでいる。まず、グルコアミラーゼ
・プロモーター部分と、グルコアミラーゼの５’側コー
ド領域部分を含むＤＮＡ配列をプレプロキモシンのアミ
ノ末端部分に対応するＤＮＡ配列の上流にクローン化し
た。次に、そのＤＮＡフラグメント間のヌクレオチド
を、特異的プライマー配列をつかい、Ｍ１３の部位特異
的突然変異（４０）により欠失させた。最後に、融合し
た配列を含むＤＮＡセグメントはプロキモシン配列の残
りの部分とともに、アスペルギラス・ニガー (Aspergil
lus niger)のグルコアミラーゼ遺伝子の５’及び３’制
御配列をもつ発現ベクター中に組込んだ。これらのステ
ップは図３から図７に概略を示した。

【００４０】Ａ．mp１９ＧＡＰＲの構築 プラスミド pＧa 5 を用いて、グルコアミラーゼ・プロ
モーター部分とコード領域のアミノ末端セグメントを有
する３３７bpのＥcoＲ１−ＲsaＩＤＮＡフラグメント
（フラグメントＡ）を誘導した。フラグメントＡをＥco
Ｒ１とＳma Iで消化したＭ１３ mp １９ＲＦ−ＤＮＡと
連結した（フラグメントＢ）。その連結混合物を用いて
大腸菌（Ｅ．coli) ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３８７６）
をトランスフォームした。対応するＲＦ−ＤＮＡの制限
解析により、クリア・プラークをフラグメントＡに対し
分析した。 mp １９Ｒ−Ｒsdと命名したフラグメントＡ
を含む１つの単離物をＰst１とＸba Iで消化し、大きい
方のフラグメント( フラグメントＣ) を単離した。小さ
い方のＸba I−ＰstＩ配列（フラグメントＤ）は、５’
側のプレプロキモシン配列を含む pＲ３（４９）から誘
導し、電気泳動により精製したのち、フラグメントＣと
連結することにより、図３に示したようなファージ・テ
ンプレート mp １９ＧＡＰＲを作った。

【００４１】Ｂ．部位特異的欠失突然変異 図８に示したように、 mｐ１９ＧＡＰＲΔＣｌを部位特
異的突然変異により、グルコアミラーゼのシグナルペプ
チドコドンとプロキモシンに対するコドンの間のヌクレ
オチドを欠失させることにより mｐ１９ＧＡＰＲから誘
導した。このように mｐ１９ＧＡＰＲΔＣｌにおいて
は、グルコアミラーゼのシグナルペプチドコドンは、プ
ロキモシンの最初のコドンと精密に融合してある。部位
特異的突然変異は、一本鎖Ｍ１３テンプートで、第２の
鎖の合成開始に唯一のオリゴヌクレオチドを使用するこ
と以外は、先に述べられた方法（４０）で行なわれた。
（図４）（４０）。 mｐ１９ＧＡＰＲΔＣｌを誘導する
のに用いられた合成オリゴヌクレオチドは５’GCTCGGGG
TTGGCAGCTGAGATCACCAG 3' である。望ましい欠失が起こ
ったプラークは、以前に述べた放射性ラベルしたプライ
マーとのハイブリダイゼーションにより同定した。mｐ
１９ＧＡＰＲΔＣ３においては、グルコアミラーゼの開
始コドンの直前のヌクレオチドとプレプロキモシンのＡ
ＴＧ開始コドンの間のヌクレオチドを合成オリゴヌクレ
オチド（フプライマー３）を用いた部位特異的突然変異
により結合している。 5' ACTCCCCCACCGCAATGAGGTGTCTCGT 3' 図８に示すように、結果的にその突然変異は、グルコア
ミラーゼプロモーター領域はプレプロキモシンの開始コ
ドンと精密に結合させている。

【００４２】Ｃ．仔牛キモシンの発現と分泌のためのベ
クターの構築 図４に示されているように、グルコアミラーゼ配列と
５’プロキモシン配列の各融合物（ mｐ１９ＧＡＰＲΔ
Ｃ１及び mｐ１９ＧＡＰＲΔＣ３）は、アスペルギラス
・ニドゥランス (Aspergillus nidulans) のトランスフ
ォーメーションベクターｐＤＪＢ３において、３’プロ
キモシン配列とサッカロミセス・セレビシアエ (Saccha
romyces cerevisiae) のホスホグリセレートキナーゼ
（ＰＧＫ）のターミネーターと結合している。 mｐ１９
ＧＡＰＲΔＣ１と mｐ１９ＧＡＰＲΔＣ３の複製型をＥ
coＲ１とＰst１で消化した。その小さい方のフラグメン
ト（フラグメント１）を単離した。プラスミドｐＢＲ３
２２もＥcoＲ１とＰst１で消化し、その大きい方のベク
ターフラグメント（フラグメント２）を単離した。フラ
グメント１と２を連結し、大腸菌（Ｅ．coli) ２９４を
トランスフォームするのに用いた。

【００４３】プラスミドｐＢＲ３２２ＧＡＰＲΔＣｌも
しくはｐＢＲ３２２ＧＡＰＲΔＣ３を含むテトラサイク
リン耐性コロニーを単離した。フラグメント２も大腸菌
（Ｅ．coli) のポリメレース１（クレノー・フラグメン
ト）で処理した。生じたブラントエンドフラグメントを
連結により環状化し、大腸菌（Ｅ．coli) ２９４をトラ
ンスフォームするのに用いた。プラスミドｐＢＲ３２２
ΔＲＰを含む１つのテトラサイクリン耐性コロニーを単
離し、Ｈind III とＳalＩで消化した。その大きい方の
ベクターフラグメント（フラグメント３）を単離した。
プラスミド pＣＲ１６０をＨind III 及びＰstＩで消化
し、フラグメント５（３’プロキモシン、コドンを融合
したイーストのＰＧＫターミネーターを含む）を単離し
た。フラグメント３、４及び５を連結し、大腸菌（Ｅ．
coli) ２９４をトランスフォームするのに用いた。プラ
スミドｐＢＲ３２２ＧＡＰＲΔＣｌもしくはｐＢＲ３２
２ＧＡＰＲΔＣ３を含むテトラサイクリン耐性のトラン
スフォーマントを単離した。

【００４４】プラスミドｐＣＲ１６０は、イースト中の
プラスミドとして、その維持を許すイーストの２μｍ複
製オリジン、イーストの選択マーカーとしてのイースト
のＴＲＰ−１遺伝子で、プラスミドｐＢＲ３２２由来の
大腸菌（Ｅ．coli) の複製オリジン及びアンピシリン耐
性遺伝子、及びプロレンニン発現ユニットを含んでい
る。プロレンニン発現ユニットは、イーストのＰＧＫ遺
伝子由来のプロモーター、プロレンニンコード領域及び
ＰＧＫ遺伝子由来のターミネーターを含んでいる。この
プラスミドの構築は次のような方法で図９に示されるよ
うに行った。プラスミドＹＥｐ１ＰＴ（５０）をＨind
III で部分消化し、さらにＥcoＲ１で完全消化し、ベク
ター・フラグメントＡを単離した。第２のプラスミドｐ
ＰＧＫ−１６００（５１）をＥcoＲ１及びＨind III で
部分消化し、ＰＧＫプロモーターフラグメントＢを単離
した。フラグメントＡとＢを連結し、中間体ｐInt 1 を
作り、再びＥcoＲ１とＨind III で部分消化して、ベク
ターフラグメントＣを単離した。ＰＧＫターミネーター
フラグメントＤを単離し、さらにプラスミドｐＢ１をＨ
ind III とＳan 3Ａで消化した（５２）。ＰＲ１（４
９）ＤＮＡをＥcoＲ１とＢＣl 1 で切断することによ
り、プロレンニンフラグメントＥを単離した。フラグメ
ントＣ、Ｄ及びＥを連結し、イーストの発現プラスミド
ｐＣＲ１６０を生成した。ＰＧＫプロモーター、構造遺
伝子及びターミネーターのヌクレオチド配列が報告され
ている（５３）。

【００４５】プラスミドｐＢＲ３２２ＧＡＰＲΔＣｌと
ｐＢＲ３２２ＧＡＰＲΔＣ３は各々のプロキモシンに対
する完全な転写ユニットを含んでいる。この転写ユニッ
トは前駆体プロキモシンをコードする配列、グルコアミ
ラーゼ・プロモーター及びイーストのＰＧＫターミネー
ターを含んでいる。しかし、これらのプラスミド誘導体
及び後に述べるプラスミドｐＢＲ３２２ＧＡＰＲΔＣ２
及びｐＢＲ３２２ＧＡＰＲΔＣ４（ pＩnt 1 Cｌ−４）
と命名した。図５）はＡ．ニドゥランス（Ａ．nidulan
s) のＧ１９１にトランスフォームされたとき、検出さ
れうるキモシンを生産しなかった。これらの誘導体プラ
スミドが何故キモシンを発現及び分泌できないかは、分
っていない。しかし、引き続く結果を照らしてみると、
これらプラスミド中のイーストＰＫＧターミネーターも
しくは短かいグルコアミラーゼプロモーター配列はＡ．
ニドゥランス（Ａ．nidulans) Ｇ１９１により認識され
ないようである。これらの結果に基づき、さらにｐＢＲ
３２２ＧＡＰＲΔＣプラスミドを修正した。

【００４６】次のようなステップで、その転写ユニット
を、アスペルギラス・ニドゥランス(Aspergillus nidul
ans) のトランスフォーメーション・ベクターｐＤＪＢ
３に移した。付加的にグルコアミラーゼの５’フランキ
ング配列をそのプロモーターの丁度５’側に組込み、発
現を制御するのに関係するかなり上流の活性化部位の存
在を確保した。さらに、ＰＫＧターミネーターを、ＰＧ
の５由来のＡ．ニガー（Ａ．niger)のグルコアミラーゼ
のターミネーターと置き換えた。特に図５中、各プラス
ミド（ｐＢＲ３２２ＧＡＰＲΔＣ１又はｐＢＲ３２２Ｇ
ＡＰＲΔＣ２）をＣla１で消化し、フラグメント６を単
離した。またプラスミドｐＤＪＢ３もＣla１で消化し、
バクテリア・アルカリ・オスファターゼで処理して、自
己連結を妨いだ。この消化したプラスミド（フラグメン
ト７）をフラグメント６と結合し、プラスミドｐＩntＩ
−１又はＩntＩ−３を含む、アンピシリン耐性コロニー
を単離した。これらのプラスミドをＸho IとＮsiＩで消
化し、より大きいベクターフラグメント( フラグメント
８）を単離した。広範囲の５' 及び３’のフランキング
配列と同様、全グルコアミラーゼ遺伝子を含むプラスミ
ドｐＧa 5 をＸho IとＮsiＩで消化し、より小さいフラ
グメント（フラグメント９、およそ１７００bp の５’
側の配列を含んでいる）を単離した。フラグメント８と
９を連結し、大腸菌（Ｅ．coli) ２９４をトランスフォ
ームした。プラスミド pＩnt２−１又は pＩnt２−３を
含むアンピシリン耐性コロニーを単離した。これらのプ
ラスミドは、グルコアミラーゼ・ターミネーターではな
く、イーストのＰＧＫターミネーターを含んでいる点
で、最終的ベクターとは決定的に異なる（図７参照）。

【００４７】キモシン発現ベクターを構築する上での付
加的ステップ図６に概説してある。プラスミドｐＲ１
（４９）を用いて、プロキモシンのｃＤＮＡの３’端を
含む小さなＢclＩ−Ａsp７１８ＤＮＡフラグメント（フ
ラグメントＡ）を単離した。フラグメントＡを引きつづ
き、ＰＵＣ１８中にクローン化し、Ａsp７１８とＢamＨ
Ｉで消化した（フラグメントＢ）。同様にプラスミドｐ
Ｇa 5 から1.２ｋb のＣla I−Ａsp７１８のＤＮＡフラ
グメント（フラグメントＤ）を単離し、Ａcc 1及びＡsp
７１８で切断したＰＵＣ１８（フラグメントＣ）にクロ
ーン化した。生じめ中間体プラスミド、ＰＵＣ− int１
とＰＵＣ− int２をＳal１とＨind III で消化し、フラ
グメントＥとＦを単離した。さらにこれらのフラグメン
トを連結し、Ｈind III −Ａsp７１８フラグメント（フ
ラグメントＨ）上、グルコアミラーゼ・ターミネーター
配列が引き続く、プロキモシンの３’末端を含むＰＵＣ
−ｉnt３を生成した。

【００４８】ｐＢＲ−linkと命名した新しいクリーニン
グ・ベクターを、ｐＢＲ３２２の唯一のＢamＨＩ部位に
合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより作った。
このリンカーは次の配列を内包している。 5'GATCCATCGATCTCGAGATCGATC3' 3'GTAGCTAGAGCTCTAGCTACCTAG5' このベクターの大きい方のＨind III −Ｘho Iフラグメ
ント（フラグメントＧ）を電気泳動により精製した。同
様にプラスミド pＩnt２−１及び pＩnt２−３のＸho I
−Ａsp７１８制限フラグメントを電気泳動的に精製し
た。一連の三種の連結反応において、異なるＩ−フラグ
メントとフラグメントＧ及びＨを連結して、中間体 pＩ
nt３−１と pＩnt３−３を生成した。これらの重要な中
間体は、グルコアミラーゼ・プロモーター領域種々のシ
グナル及びプロキモシン（又はプレプロキモシン）配列
へのプロペプチド融合体が最後にグルコアミラーゼ・タ
ーミネーター領域を従える形で全て便利なＣla I制限部
位内に含んでいる。ｐＢＲ−linkのリンカー中のものの
ように、あるＣla I部位は、大腸菌（Ｅ．coli) のＤＮ
Ａメチル化により阻害されるので、プラスミド pＩnt３
−１から pＩnt３−４までのものは、ＧＭ４８（ＡＴＣ
Ｃ３９０９９）と命名した大腸菌（Ｅ．coli) のdam −
株にトランスフォームし、そこからプラスミドを再単離
した。メチル化されていないＤＮＡをＣla Iで消化し、
電気泳動により、フラグメントＪを単離した。引きつづ
いて、各々のグルコアミラーゼ−プロキモシン融合体か
らのフラグメントＪをｐＤＪＢ３（フラグメントＫ）の
唯一のＣla I部位にクローン化し最終的発現ベクターｐ
ＧＲＧ１とｐＧＲＧ３を生成した。

【００４９】Ｄ．仔牛キモシンの発現と分泌 先に述べたように、アスペルギラス・ニドゥランス (As
pergillus nidulans)のＧ１９１にｐＧＲＧ１及びｐＧ
ＲＧ３をトランスフォームした。５個のｐＧＲＧ１及び
５個のｐＧＲＧ３トランスフォーマントを解析した。ウ
ェスターン解析（示されていない）は、各トランスフォ
ーマントが、抗キモシンと反応し、仔ウシのキモシンと
同じか又はわずかに高分子量の位置まで移動するタンパ
ク質を分泌した。より高分子量分子種は不適正なプロセ
シング、媒地効果又はグルコシル化によるものかもしれ
ない。組込みはサウザーン・ハイブリダイゼーション
（結果は示していない）により、ひとつのトランスフォ
ーマントに対し確かめた。各トランスフォーマントもキ
モシン活性検定した。この検定結果を表IIに示す。

【００５０】 表 II トランスフォーマント テストしたトランスフォーマントの数 キモシン活性の範囲 (μg/ml) ｐＤＪＢ３ １ ０−0.１３ ｐＧＲＧ１ ５ ０−1.５ ｐＧＲＧ３ ５ 0.０５−7.０

【００５１】これらの結果は、ｐＧＲＧ１及びｐＧＲＧ
３の双方ともｐＤＪＢ３コントロール以上の種々のレベ
ルのプロテアーゼを分泌することを示している。たまた
ま、ｐＤＪＢ３コントロール培地中にバックグランドの
タンパク分解活性が検出された。後に示されるように、
このトランスフォーマントのタンパク分解活性は、キモ
シンを１つのメンバーとするカルボキシル・プロテアー
ゼのアスパラギン酸ファミリーと会合している。

【００５２】実施例 ３ アスペルギラス・ニドゥランス (Aspergillus nidulan
s) からの融合ポリペプチドの発現と分泌 Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) から発現・分泌させ
るための２つの融合ポリペプチドを構築した。１つの融
合ポリペプチドは、アスペルギラス・ニガー (Aspergil
lus niger)のグルコアミラーゼのプロ配列と最初の１０
ケのアミノ酸を含むアミノ末端側の領域と、仔牛のプロ
キモシンを構成するカルボキシル末端側領域を含んでい
る。第２の融合ポリペプチドはアスペルギラス・ニガー
(Aspergillus niger)のグルコアミラーゼのプロ配列の
みのアミノ末端領域と仔牛のプロキモシンのカルボキシ
ル末端領域を含んでいる。

【００５３】Ａ．融合ポリペプチドを発現及び分泌する
ためのベクター 上記の融合ポリペプチドをコードするベクターを前述の
ｐＧＲＧ１とｐＧＲＧ３を構築したときと同様の操作に
従って、 mｐ１９ＧＡＰＲから、特異的配列を欠失させ
ることにより構築した。図８に示すように、 mｐ１９Ｇ
ＡＰＲΔＣ２において、グルコアミラーゼ・プロペプチ
ドコドンと、プロキモシンのコドンの間のヌクレオチド
は上述の部位特異的突然変異により欠失させた。この突
然変異のために合成したオリゴヌクレオチド（プライマ
ー２）の配列は 5'TGATTTCCAAGCGCGCTGAGATCACCAG3' である。この突然変異は、グルコアミラーゼ・プロモー
ター、シグナル・ペプチド及びプロペプチド・コドンを
プロキモシンの最初のコドンに融合することを意図して
いる。 mｐ１９ＧＡＰＲΔＣ４において、成熟グルコア
ミラーゼの１０番目のコドンと、プロキモシンのコドン
との間のヌクレオチドを合成オリゴヌクレオチド（プラ
イマー４）を用いたＭ１３の部位特異的突然変異により
欠失させた。 5'TGAGCAACGAAGCGGCTGAGATCACCAG3' この欠失によりグルコアミラーゼ・プロモーター領域、
シグナルペプチド配列、プロペプチド配列、成熟グルコ
アミラーゼの１０番目までのコドンを、図８に示すよう
にプロキモシンのコドンに融合した。これらの発現及び
分泌ベクターをｐＧＲ２とｐＧＲＧ４と命名し、Ａ．ニ
ドゥランス（Ａ．nidulans) をトランスフォームするの
に用いた。

【００５４】Ｂ．ｐＧＲ２とｐＧＲ４でトランスフォー
ムしたアスペルギラス・ニドゥランス(Aspergillus nid
ulans) からのキモシンの発現と分泌 先に述べたように、ｐＧＲＧ２とｐＧＲＧ４トランスフ
ォーマントを培養した。その培地を、ウェスタン・ブロ
ットにより、キモシン活性を検定し、ｐＧＲＧ１及びｐ
ＧＲＧ３で得られたものと同じ結果を与えた。ｐＧＲＧ
２トランスフォーマントの組込みはサウザーン解析によ
り確かめられた（結果は示していない）。キモシン検定
の結果を表III に示した。

【００５５】 表 III トランスフォーマント テストしたトランスフォーマントの数 キモシン活性の範囲 (μg/ml) ｐＤＪＢ３ １ ０−0.１３ ｐＧＲＧ２ １ 0.００１−0.４２ ｐＧＲＧ４ ６ 0.００４−0.７５

【００５６】再度、各トランスフォーマントはｐＤＪＢ
３コントロール以上のプロテアーゼ活性を示し、そのト
ランスフォーマントにより、プロテアーゼが発現及び分
泌されていることを示した。ｐＧＲＧ１とｐＧＲＧ３の
場合と同様に、それらプロテアーゼは、ペプスタチン阻
害で確かめられたように、カルボキシルプロテアーゼの
アスパラギン酸ファミリーに属している。重要はこと
は、これらの結果により、繊維状菌類の中で、ハイブリ
ッドポリペプチドが発現していることが示されているこ
とである。

【００５７】実施例 ４ ペプスタチン阻害研究 キモシンを含む種々の構築を含む上記ベクターの３個に
ついて、前に述べたようなペプスタチン阻害検定解析を
行った。結果を表IVに示す。

【００５８】 表 IV 試料 キモシン活性（μｇ／ｍl) ｐＤＪＢ３ ０ ｐＤＪＢ３ペプスタチン ０ ｐＧＲＧ１ 0.２ ｐＧＲＧ１ペプスタチン 0.０５ ｐＧＲＧ２ 0.１ ｐＧＲＧ２ペプスタチン ０ ｐＧＲＧ３ ３ ｐＧＲＧ３ペプスタチン 0.６

【００５９】ペプスタチンとプレインキュベートした試
料は活性が著しく減少し、トランスフォーマントにより
生産されるプロテアーゼが、キモシンがその一員である
酸プロテアーゼのアスパラン酸ファミリーに属すること
を示した。ウェスターン解析からのデータと共にこのデ
ータは、生物学的に活性なキモシンが、ｐＧＲＧ１、ｐ
ＧＲＧ２、ｐＧＲＧ３、及びｐＧＲＧ４でトランスフォ
ームしたＡ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) のＧ１９１
により発現及び分泌されることを示している。実施例II
及び実施例III における異なるベクター構築物に対して
検出されたキモシン活性の程度は、各トランスフォーメ
ーション・ベクター内に組込まれた種々のシグナルの認
識の程度の差を反映しているのかもしれない。特別な構
築物においては、キモシン活性の変化は菌類ゲノム中に
組込まれるベクターのコピー数やもしくは、そのような
組込みの位置に関係しているようだ。

【００６０】実施例 ５ 炭素源研究 １つのベクターｐＧＲＧ４でＡ．ニドゥランス（Ａ．ni
dulans) をトランスフォームし、その後、先に述べた種
々の炭素源について生育させてみた。この検定結果を表
５に示す。

【００６１】 表 Ｖ 種々の炭素源により生産されるキモシン活性 （μｇ／ｍl ） デンプン グルコース フラクトース スクロース ｐＤＪＢ３ ０ ０ ０ ０ ｐＧＲＧ４ 3.５ 3.５ 0.９ 1.７５

【００６２】これらの結果は、明らかに、キモシンが炭
素源とは無関係に分泌されていることを示している。こ
れは、グルコアミラーゼ・プロモーターの転写制御が、
Ａ．ニガー（Ａ．niger)中でのものと違い、デンプンに
より誘導されるのではないことを示している。

【００６３】実施例 ６ ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) のカルボキシル・
プロテアーゼの発現と分泌 Ａ．カルボキシルプロテアーゼのゲノムプローブ ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) の酸プロテアーゼ
の部分的一次構造（５４）は低い遺伝的冗長性の領域に
対して調査された。１８７〜１９１残基（ブタのペプシ
ン番号システムを用いた）のtry-try-phe-trp-asp 、を
選んだ。このアミノ酸に対応するコード配列に相補的な
オリゴヌクレオチド 5 '−GC(G/A)TCCCA(G/A)AA(G/A)TA(G/A)TA −３’ を合成し（３１）、ガンマー〔³²Ｐ〕−ＡＴＰとＴ４の
ポリヌクレオチドキナーゼを用いてラベルした（３
０）。

【００６４】Ｂ．ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei)
のカルボキシル・プロテアーゼのクロー ニング ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) （オランダ３７
０、７５、セントラル・ブリュー・ブーア・シメルカル
チャーズ（Central Bureau Voor Schimmelcultures))由
来のゲノムＤＮＡを次のように調製した。ＹＭＢ培地
（３ｇ／ｌイーストエクストラクト、３ｇ／ｌマルトエ
クストラクト、５ｇ／ｌペプトン、１０ｇ／ｌグルコー
ス）中で生育した細胞を遠心により集菌し、0.５Ｍ NaC
l により２度洗って、凍結乾燥した。さらに細胞膜を細
胞に砂を加えて、乳鉢と乳棒でその混合物をすりつぶす
ことにより破壊した。生じた粉を、２５％ショ糖５０ m
Ｍ Tris−ＨCl（ pＨ8.０）、１０ mＭＥＤＴＡを含む
溶液に懸濁（乾燥重量グラム当り１５ｍl ）した。ＳＤ
Ｓを最終濃度0.１％となるように加え、そのサスペンジ
ョンを半分量のフェノールで１度、半分量のクロロホル
ムで３度抽出した。最終的な水層を１０ mＭ Tris−Ｈ
Cl（ pＨ8.０）、１ mＭＥＤＴＡに対して、よく透析し
た。それからＤＮＡを、酢酸ナトリウム（ pＨ5.５）が
0.３Ｍの濃度になるように加え、さらに冷エタノールの
2.５倍容を加えることにより沈殿させた。

【００６５】このＤＮＡ画分を製造業者の指示に従って
種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、サウザーン法
を用いて、先に述べられたプローブの配列と相補的な配
列に対して分析した。およそ2.５ｋb （キロベース）の
正のハイブリダイズバンドをＨind III 消化ＤＮＡ中に
同定した。Ｈind III 消化ゲノムＤＮＡをポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離し、2.０〜3.０ｋb のＤ
ＮＡを含むゲルフラグメントを先に述べたように電気流
出した。ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei)の酸プロ
テアーゼ遺伝子に対応する配列に富んでいると考えられ
るこの電気流出ＤＮＡをエタノール沈殿した。クローニ
ング・ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）を
Ｈind III で消化し、バクテリア・カルカリ・ホスファ
ターゼで脱リン酸した。典型的には１０μl 反応液中、
１０mgのベクターと１００mgの大きさのそろったＤＮＡ
を、ＡＴＰとＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で結合した。
その反応物は、カルシウム・ショック操作（３０）によ
り、大腸菌（Ｅ．coli) ２９４にトランスフォームし
た。約2.０×１０⁴ のアンピシリン耐性コロニーを得
た。これらのおよそ９８％が、テトラサイクリンを含む
培地中で生育できないことによって示されるように、ク
ローン化挿入物を含んでいる。これらのコロニーについ
て、ＤＮＡプローブの配列と相補的な配列の存否を標準
的なコロニー・ハイブリダイゼーション操作により検定
した。プラスミドｐＭｅ５’muc を含む、正のハイブリ
ダイズしたコロニーは、予想される2.５ｋb の大きさの
Ｈind III挿入物を含むことがわかった。このフラグメ
ントの末端をＭ１３シークエンシング・ベクターにサブ
クローンし（３３）、その配列をダイデオキシ・チェー
ン・ターミネーション法により決定した。１つの末端
は、酸プロテアーゼ遺伝子の、既知アミノ末端アミノ酸
配列に対応する配列を含んでいた。隣接する３’領域を
よりＣ末端側のコード配列を得るために配列決定した。
その配列決定の戦略は図１０に示してある。このよう
に、そのタンパク質の成熟型に対する全てのコード配列
が得られた。

【００６６】そのフラグメントの５’末端は成熟型アミ
ノ末端に対応するコドンの１１２ bp （塩基対）上流に
生ずることがわかった。この上流領域は読み枠に合った
開始コドンを含まないのでプロペプチドの一部となると
考えられる。５’側の翻訳されない配列同様、開始コド
ンを含むＤＮＡを得るためにより５’側のクローンを次
のようにして単離した。ｐＭｅ５’Ｃla Ｈind III 挿
入物のＨind III −Ｃla I８１３ bp ５’側サブフラグ
メントを単離し、ニックトランスレーション法によりラ
ベル化した（３０）。このラベル化フラグメントをサウ
ザーン法によりＣla I消化したムコール・ミエヘイ (Mu
cor miehei) ゲノムＤＮＡをつり上げるのに用いた。こ
の実験でおよそ１３００ bp の分子量に対応するハイブ
リダイゼーションの単一バンドが確認された。このサイ
ズの大きさのそろったＤＮＡを単離し、Ｃla Iで消化
し、脱リン酸化したｐＢＲ３２２に、上述の方法でクロ
ーン化した。

【００６７】およそ９０００のアンピシリン耐性コロニ
ーを得た。それらの約９０％はテトラサイクリン含有培
地で生育できなことで示されるようなクローン化挿入物
を含んでいた。これらのコロニーに対し、ニックトラン
スレートしたプローブのものに相補的な配列の存否につ
いて標準的コロニー・ハイブリダイゼーション操作によ
り検定した。プラスミドｐＭｅ２を含む正のハイブリダ
イズをするコロニーは期待されるように1.３ｋb のＣla
I挿入物を含んでいることが分かった。このフラグメン
トの末端の配列決定が、１つの末端はｐＭｅ５’Ｃla中
のＨind III フラグメントのＣla I部位近傍の配列に対
応しており、図１０に示されるフラグメントの配向をと
っていたことを示した。さらに、Ｃla Iフラグメントの
配列決定が開始コドンと５’側の非翻訳配列を明らかに
した。全コード配列と、５’側及び３’側のフランキン
グ配列を図１０に示した。その誘導した一次構造と、直
接的にアミノ酸の配列決定により決定したものとの比較
で、ムコール (Mucor)タンパク質は６９残基のアミノ酸
が延長している前駆体として作られることがわかった。
一般にリーダー配列中に存在する構造特性に基づいて、
−２１から−１の残基がリーターペプチドを包含し、２
１から６９の残基が、キモシン及びペプシンを含む他の
酸プロテアーゼのザイモゲン型中にみられるものと同類
のプロペプチドを包含しているらしい。（５５）

【００６８】Ｃ．ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei)
のカルボキシル・プロテアーゼの発現及び分泌ベクター ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) のカルボキシル・
プロテアーゼを発現し、分泌するためのベクターは、コ
ード配列、５’側フランキング配列（プロモーター）、
及び３’側フランキング配列（ターミネーター及びポリ
アデニレーション部位）を含む全ての本来のムコール・
ミエヘイ (Mucor miehei) 酸プロテアーゼ転写ユニット
を含んでいる。このベクターを作るための全戦略は図１
４に示した。アスペルギラス・ニドゥランス (Aspergil
lus nidulans) のトランスフォーメーション・ベクター
ｐＤＪＢ１をＣla IとＥcoＲ１で消化し、より大きいベ
クターフラグメント（フラグメントＩ）を単離した。プ
ラスミドｐＭｅ５’ＣlaをＥcoＲ１とＣla Iで消化し、
フラグメント２を単離した。このフラグメントは約５０
０ bp の５’側フランキング配列とともに、酸プロテア
ーゼの５’側コドンを含んでいる。フラグメント１と２
を連結し、大腸菌（Ｅ．coli) ２９４をトランスフォー
ムした。プラスミドｐＭｅＪＢint を含むアンピシリン
耐性コロニーを単離した。このプラスミドをＣla Iで消
化し、自己連結を防ぐために、バクテリア・アルカリ・
オスファターゼで処理し、フラグメント３と命名した。
プラスミドｐＭｅ２をＣla Iで消化し、より小さいフラ
グメント（フラグメント４）を単離した。このフラグメ
ントはムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) の酸プロテ
アーゼの３’側コドンと、約１８００ bp の３’側フラ
ンキング配列を含んでいる。フラグメント３と４を連結
し、大腸菌（Ｅ．coli) ２９４をトランスフォームし
た。プラスミドｐＭｅＪＢ１−７を含むアンピシリン耐
性コロニーを単離した。このベクターを、アスペルギラ
ス・ニドゥランス (Aspergillus nidulans) にトランス
フォームした。

【００６９】Ｄ．アスペルギラス・ニドゥランス (Aspe
rgillus nidulans) による、ムコール・ミエヘイ (Muco
r miehei) のカルボキシル・プロテアーゼの発現と分泌 ６個のトランスフォーマントのサウザーン・ブロット解
析はアスペルギラス・ニドゥランス (Aspergillus nidu
lans) ゲノム中に、全ムコール・ミエヘイ (Mucor mieh
ei) 酸プロテアーゼ遺伝子が存在することを示した（結
果は示していない）。さらに、各トランスフォーマント
はウェスタン・ブロット（結果は示していない）と酸プ
ロテアーゼ活性の解析を行った。プロテアーゼ検定の結
果を表VIに示した。

【００７０】 表 VI トランスフォーマント プロテアーゼ活性（mg／ml） １ 0.００３ ２ 0.００７ ３ 0.００３ ４ 0.００５ ５ 0.００５ ６ 0.０１２

【００７１】これらの実験は、ムコール・ミエヘイ (Mu
cor miehei) のカルボキシル・プロテアーゼに対する特
異的抗体と反応し、ミルクの凝固活性をもつタンパク質
の発現と分泌を示している。そのタンパク質は、本来の
（ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) 由来のタンパク
質の分子量より、わずかに大きい、見かけの分子量をも
つことが、電気泳動解析によりわかった。これは、アス
ペルギラス・ニドゥランス (Aspergillus nidulans) が
このグリコプロテインを、ムコール・ミエヘイ(Mucor m
iehei) とは異なるレベルのグリコシル化を行なうこと
を示しているのかもしれない。アスペルギラス・ニドゥ
ランス (Aspergillus nidulans) 由来のムコール・ミエ
ヘイ (Mucor miehei) 酸プロテアーゼは、本来のものと
同様の特異的活性をもっているようであるので、それは
成熟型にまでプロセシング（細胞によってか、又は自己
触媒的に）されているらしい。キモシンやペプチンのよ
うな他の酸プロテアーゼの非プロセシング型はプロセシ
ングをうけて（自己触媒的に）活性を示すザイモゲンで
ある。種々のトランスフォーマントの中での発現のいろ
いろなレベルは、アスペルギラス・ニドゥランス (Aspe
rgillus nidulans)ゲノム中でのプロテアーゼ遺伝子の
位置又はコピー数を反映しているらしい。しかし、生物
学的に活性なカルボキシル・プロテアーゼの発現及び分
泌は、Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) が、ムコール
・ミエヘイ (Mucor miehei) のカルボキシル・プロテア
ーゼのプロモーター、シグナル及びターミネーターシグ
ナルを認識していることを示している。

【００７２】実施例 ７ Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)及びトリコデルマ・レエセ
イ (Tricoderma reesei)pyr Ｇ栄養要求性変異株から
の、ｐＧＲＧ１−４によってコードされたキモシンの発
現と分泌 ｐＧＲＧ１からｐＧＲＧ４までのプラスミド（ｐＧＲＧ
１−４）も、Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)及びトリコデ
ルマ・レエセイ (Trichoderma reesei) のオルチジン−
５’−リン酸デカルボキシレース（ＯＭＰＣase ）欠失
変異株をトランスフォームするのに用いた。ｐＧＲＧ１
−４プラスミドによりコードされているＮ．クラッサ
（Ｎ．crassa) 由来のpyr 4 遺伝子は、ウリジンのない
条件で、これらＯＭＰＣase 変異体を補ない、うまくト
ランスフォーマントを単離させた。このようなＡ. アワ
モリ（Ａ．awamori)及びＴ．レエセイ (T. reesei)のト
ランスフォームした変異株はその培地中に検出可能量の
生物学的に活性なキモシンを分泌した。

【００７３】Ａ．pyr Ｇ栄養要求性株の生成 Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)及びＴ．レエセイ (T. ree
sei)のpyr Ｇ栄養要求性変異体を得るのに用いた方法
は、ピリミジン・アナログの５−フルオロ−オロチン酸
（ＦＯＡ）に関する選択を含んでいる（５６）。ＦＯＡ
が野生株を死滅させる機構は分っていない。しかし、Ｆ
ＯＡに対するＯＭＰＣase −欠失変異株の耐性という見
地から、その毒性が，ＦＯＡの５−フルオロ−ＵＭＰへ
の転換を通して起こるらしい。細胞の死がフッ素化した
リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドによる
ものかどうかは明らかではない。次に示したのがＴ．レ
エセイ(T. reesei)とＡ. アワモリ（Ａ．awamori)のＯ
ＭＰＣase −欠失（ＦＯＡ−耐性）変異株を単離する方
法である。

【００７４】 １．トリコデルマ・レエセイ (Trichoderma reesei) Ｔ．レエセイ (T. reesei)のＰ３７株（ＮＲＲＬ １５
７０９）の新鮮な胞子サスペンジョンを0.０１％のトウ
ィーン８０を含む滅菌した蒸留水で洗浄した。この胞子
サスペンジョン１５ミリリットル（１ミリリットル当り
１×１０⁷ ケの胞子）を滅菌済マグネットスターラーロ
ッドとともに滅菌済シャーレ（１００×２０mm）の中に
入れた。フタ−を取り、暗闇中、ＵＶ光源から２５cm離
して、その胞子を２５４ nｍの紫外光（ＵＶ）で照射し
た（１平方センチメートル当り、７０００マイクロワッ
ト）。胞子を一定に攪拌した。ＵＶ照射を３分間続けた
（これは７０％の胞子を殺すのに十分な時間である）。
照射した胞子を５０ｍl 遠心管中に集め、光回復を防ぐ
ために暗闇中に一時間保存した。胞子を遠心によりペレ
ット化し、そのペレットを0.０１％のトウィーン−８０
を含む２００μl の滅菌水に再懸濁した。

【００７５】そのサスペンジョンを希釈し、0.１５％の
ＦＯＡ（フロリダ、ゲインズヴィル（Gainsville）、Ｓ
ＣＭスペシャルティー・ケミカルズ（Specialty Chemic
als)）を含むＹＮＢ寒天培地（アミノ酸を除いた0.７％
のイーストの窒素塩基、１０mＭウリジン、２％寒天）
上にプレーティングした（５６）。３７℃、４日間のイ
ンキュベーション後、７５ケのコロニーをＦＯＡを含む
新鮮なＹＮＢ培地に選びとった。７５ケのコロニー中６
２ケが生育し、最小寒天培地（６ｇ／ｌ NaNO₃、0.５２
ｇ／ｌ KCl、1.５２ｇ／l KH₂PO₄、１ｍl ／ｌ微量元素
溶液、１％グルコース、0.１％MgSO₄ 、２０ｇ／ｌ寒
天）及び１mg／mlのウリジンを加えた最小培地につまよ
うじで植え込んで、ウリジン栄養要求性を調べた。６２
ケの単離物の全てがウリジン入りの最小寒天培地で生育
したが、そのうち９ケが最小寒天培地のみでは生育でき
なかった。これら９ケの株を再び、最小培地及びウリジ
ン入り最小培地に植え込んだ。その株のうちの２つがウ
リジンを補った。最小寒天培地でのみ生育した。このう
ち、Ｔ．レエセイ (T. reesei)pyr Ｇ２９と命名したも
のは、最小培地のみでは、生育できないがウリジン入り
最小培地ではよく生育した。

【００７６】 ２．アスペルギラス アワモリ (Aspergillus awamori) （ｉ）Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)ＵＶＫ１４３ｆ−株
のグリコアミラーゼのハイパープロデュサーの生産 Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)のＮＲＲＬ３１１２株の胞
子は、３０℃でポテト・デキストロース寒天培地（ＰＤ
Ａ、ディフコ社）上で５〜７日間生育させて得た。プレ
ート表面を滅菌した0.１％トウィーン蒸留水溶液で洗
い、しずかに胞子をはがすことにより胞子を収穫した。
胞子を遠心により洗浄し、最終的に１×１０⁷ から２×
１０⁸ 胞子／ｍl の濃度となるように同緩衝液に再懸濁
した。調製物を４℃で保存した。胞子２ｍl を滅菌シャ
ーレに加えた。シャーレのフタを除いて、胞子を紫外線
（ＵＶ）ランプ（１５ワット、殺菌用）にさらした。露
光時間及びランプからの距離等の条件は、胞子が９０か
ら９9.９％死滅するように調整した。生存した胞子をＰ
ＤＡ培地上にプレーティングし、個々の独立したコロニ
ーを形成させた。個々の突然変異させたコロニーからの
胞子を、５％コーンミール、0.５％イースト・イクスト
ラクト、２％コーン・ステープリカーを含み、 pＨ4.５
に調整後２５０ｍl フラスコ中で滅菌した５０ｍl のス
クリーニング培地にイノキュレートした。しかし、炭素
源として、コーン又はコーン・スターチを含む、どのよ
うな培地でも同様の結果を与えるであろう。培養を一定
にカクハンしながら３０〜３５℃で４〜５日間行った。
検定のため、試料は毎日又は運転の最後を取り出した。

【００７７】グルコアミラーゼ活性の見積りは無色の基
質（パラ−ニトロ−フェニル−アルファーグルコシド、
ＰＮＰＡＧ）からの色形成基（パラ−ニトロ−フェノー
ル）の放出を測定して行った。次の方法を用いた。基質
−１８０mgＰＮＰＡＧを pＨ4.７の0.１Ｍ酢酸ソーダ緩
衝液２５０ｍl にとかし、４℃に保存した。検定、基質
１ｍl を４０℃のウォーターバスで平衡化する。0.２ｍ
l の試料（又は希釈試料）を加え、４０℃で３０分間イ
ンキュベートする。９ｍl の0.１ＭNa₂CO₃ をカクハン
しながら加え、色が出てくるまで室温で１５分間放置す
る。その混合物をワットマン (Wattman)の４２濾紙で濾
過し、適当な分光光度計で４２０ nｍの吸収を測定す
る。すべての変異株のＰＮＰＡＧレベルを親株により生
産される標準値と比較し、親株のＰＮＰＡＧ加水分解に
対する百分率として報告する。ＵＶＫ１４３ｆと命名し
た１つのグルコアミラーゼハイパープロデューシング株
を栄養要求突然変異により選択した。

【００７８】（ii) 栄養要求性突然変異 Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)ＵＶＫ１４３ｆ株からの胞
子の調整、ＵＶ突然変異、及び変異体解析を次の修正に
従い、Ｔ．レエセイ (T. reesei)と同様に行った。 ａ．ＵＶ光による７０％死滅に2.５分必要とした。 ｂ．ＹＮＢ寒天培地の代りに最小培地を用いた。 ｃ．ＦＯＡ濃度を0.１％とした。 １５のpyr Ｇ変異株がみつかった。この単離物のうちの
３つを、pyr 4 −５、pyr 4 −７、pyr 4 −８と命名
し、トランスフォーメーション実験のために選択した。

【００７９】Ｂ．Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)及びＴ．
レエセイ (T. reesei)のpyr 栄養要求性株のトランスフ
ォーメーション Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)及びＴ．レエセイ (T. ree
sei)の栄養要求株をＡ．ニドゥランス（Ａ．nidulans)
に対して、以前に述べた操作を修正してトランスフォー
ムした。およそ１×１０⁸ ケの胞子を、２％グルコー
ス、0.５％イーストイクストラクトに１mg／mlのウリジ
ンを補ったイースト・イクストラクト・グルコース（Ｙ
ＥＧ）培地にイノキュレートした。その培養を３７℃シ
ェーカー中で（２００rpm ）１２〜１５時間行った
（Ｔ．レエセイ (T. reesei)は３０℃で行った）。遠心
により、ジャームリングを収穫し、滅菌したＹＥＧ培地
で１度洗った。その後、滅菌した２００ｍl プラスチッ
クビン（Ｎ．Ｙ．コーニング、コーニング社製）中で、
0.６Ｍ KCl、0.５％ノボザイム（Novozyme) ２３４（デ
ンマーク、ノボ工業(Novo Industries））、0.５％ MgS
O₄・7H₂0、0.０５仔牛血清アルブミンを含む５０％ＹＥ
Ｇ培地を用い、３０℃でインキュベートした。１５０rp
m のカクハンを３０分間行った後、そのプロトプラスト
・サスペンジョンをさらに１時間上記のようにインキュ
ベートし、0.６Ｍ KClで湿らせた滅菌済ミラクロス( カ
リフォルニア、ラジョラ (LaJolla)、カルバイオ・ケム
・ベーリング社(Calbiochem Behring Corp）製）で濾過
した。濾過したプロトプラストを遠心し；洗浄して、先
に述べた各プラスミドｐＧＲＧ１−４でトランスフォー
ムした。Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)のトランスフォー
メーションには次の修正を行った。 1. 0.６Ｍ KClの代りに0.７Ｍ KClを用いた。 2. トランスフォーメーション及び再生培地を浸透圧的
に安定化するため0.６Ｍ KClの代りに1.２Ｍソルビトー
ルを用いた。

【００８０】Ｃ．Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)及びＴ．
レエセイ (T. reesei)トランスフォーマントの解析 Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)及びＴ．レエセイ (T. ree
sei)のトランスフォーマント双方とも、培養培地中にキ
モシンポリペプチドを分泌した。これは、特異的キモシ
ン抗体と反応するキモシン・ポリペプチド及び酵素的に
活性なキモシンということに対して、培養濾液を分析す
ることによって決定した（結果は示していない）（ウェ
スタン・イムノブロッティング技術及びエンザイム・イ
ムノ・アッセイ）。

【００８１】実施例 ８ アスペルギラス（Aspergillus ）種のarg Ｂ栄養要求変
異株からの異種ポリペプチドの発現と分泌。 アスペルギラス（Aspergillus)種のarg Ｂ栄養要求株か
らの異種ポリペプチドの発現と分泌も行った。この実施
例は、Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) 由来のarg Ｂ
遺伝子と、プラスミドｐＧＲＧ１−４の異種ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターによる、Ａ．
ニドゥランス（Ａ．nidulans) 及びＡ. アワモリ（Ａ．
awamori)のarg Ｂ栄養要求株の相補性トランスフォーメ
ーションについて述べている。arg Ｂ遺伝子は、オルニ
チン・トランスカルバミラーゼー（ＯＴＣ）をコードし
ている。ここで用いた遺伝子マーカー、biＡ 1、 argＢ
2 、met Ｇ１を含むＡ．ニドゥランス（Ａ．nidulans)
の argＢ栄養要求株は、ポーランド、ワルシャワ、アル
・ウジャズドゥスキー (Ａl.Ujasdowskie)４００−４７
８、ワルシャワ大学遺伝学科、Ｐ．ウェグレンスキー
（Ｐ．Weglenski)博士から入手したものである。Ａ. ア
ワモリ（Ａ．awamori) argＢ変異株は次のように誘導し
た。

【００８２】Ａ．アスペルギラス・アワモリ (Aspergil
lus awamori)のarg Ｂ栄養要求変異株の単離 Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)のＵＶＫ１４３株の胞子の
新鮮なサスペンジョンを調製し、９５％の胞子が死滅す
るのに十分な露光時間以外は、先に述べたものと同様に
ＵＶ突然変異を行った。それから胞子を遠心し、滅菌水
で洗って、２５ｍl の滅菌した最小培地に再懸濁した。
これらのサスペンジョンを激しく曝気しながら３７℃シ
ェーカでインキュベートした。このような条件下で野生
型の胞子は出芽し、栄養増殖マイセリアへと成育してい
くが、栄養要求株はそうはならない。培地を３日間、６
から８時間毎に滅菌したミラクロスで無菌的に濾過し
た。この段階で、ほとんどの野生型マイセリアを除き、
一方出芽しない栄養要求株はミラクロス・フィルターを
通過する（フィルタレーション・エンリッチメント）。
各濾過ステップにおいて濾過した胞子を遠心し、新鮮な
最小培地に再懸濁した。３日間の濃縮ののち、胞子を希
釈し、５０ mＭのシトルリンを補った最小寒天培地にプ
レーティングした。そのプレートを３７℃で２〜３日間
インキュベートした。個々のコロニーをこれらのプレー
トからつまようじで２つのスクリーニング・プレートに
移した。１つのプレートは１０ mＭのオルニチンを含む
最小寒天培地で、他方は５０ mＭシトルリンを含む最小
寒天培地である。これらのスクリーニングプレートにコ
ロニーを移すのは次のような原理による。ＯＴＣ（arg
Ｂ遺伝子産物）はアルギニン生合成経路の中でオルニチ
ンのシトルリンへの変換を触媒する。このように、arg
Ｂ変異株（ＯＴＣを欠いている）はシトルリンを添加し
た最小培地では生育するが、オルニチンを添加した最小
培地では生育できない。この方法によって、およそ４０
００個のコロニーをスクリーニングして、１５個のarg
Ｂ変異株を得た。Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)arg Ｂ３
と命名した１つの株は最小培地では全く生育を示さない
が、アルギニン又はシトルリンを添加した最小培地では
よく生育する。ＯＴＣ活性レベルを決定する検定（５
７）は、arg Ｂ３変異株は、野生株より少なくとも３０
倍も少ないＯＴＣ活性を生産することを示した。これら
のデータに従って、Ａ. アワモリ（Ａ．awamori)arg Ｂ
３株をトランスフォーメーション実験のために選択し
た。

【００８３】Ｂ．アスペルギラス (Aspergillus ）種の
トランスフォーメーションのための、arg Ｂに基づくプ
ロキモシン発現ベクターの構築 この構築において（図１８参照）、最初のステップは、
トランスフォーメーション促進配列ＡＮＳ−１と選択可
能なarg Ｂ遺伝子を同じプラスミド上で結合することで
ある。これを行うために、Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidu
lans) 由来のarg Ｂ遺伝子を含むプラスミドｐＢＢ１１
６（５９）をＰstＩとＢamＨＩで消化し、arg Ｂ構造遺
伝子を含む、目的とするフラグメントＡを単離した。プ
ラスミドｐＤＪＢ２（５９）をＥcoＲＩとＰstＩで消化
し、ＡＮＳ−１配列を含む、目的のフラグメントＢを単
離した。フラグメントＡとＢを、プラスミドベクターＰ
ＵＣ１８（３３）の大きい方のＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラ
グメントを含むフラグメントＣと結合し、三つの部分が
連結しているプラスミドｐＡＲＧ−ＤＪＢを作った。

【００８４】この構築の第２ステップとして、Ｃla I部
位を含む合成ＤＮＡポリリンカーをｐＡＲＧ−ＤＪＢ中
に挿入し、種々のプロキモシン発現ユニットを含むＣla
Iフラグメントの挿入を可能にした。プラスミドｐＡＲ
Ｇ−ＤＪＢをＢamＨＩで消化し、さらにバクテリア・ア
ルカリ・ホスファターゼで脱リン酸した。指示された合
成ＤＮＡポリリンカーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
でリン酸化し、切断したｐＡＲＧ−ＤＪＢと連結してｐ
ＣＪ１６Ｌを生成した。このプラスミドをＣlaIの消化
に対して耐性であると分かったので、まず、Ｃla I部位
のメチル化を防ぐために、大腸菌（Ｅ．coli) のdam −
変異株ＧＭ４８をトランスフォームするのに用いた。Ｇ
Ｍ４８トランスフォーマントからのプラスミドの単離し
てうまくＣla Iで切断し、バクテリア・アルカリ・ホス
ファターゼで脱リン酸した。この構築の最終ステップで
は、Ｃla Iで切断したｐＣＪ１６Ｌベクターを、プラス
ミドｐＧＲＧ１〜ｐＧＲＧ４からの各Ｃla Iプロキモシ
ン発現フラグメントと結合した。生じた４つのプラスミ
ド、ｐＣＪ：：ＧＲＧ１〜ｐＣＪ：：ＧＲＧ４を原栄養
株に対し、Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) 及びＡ.
アワモリ（Ａ．awamori)のarg Ｂ変異株をトランスフォ
ームするのに用いた。生じたトランスフォーマントをプ
ロキモシンポリペプチドの発現に対し分析した。

【００８５】Ｃ．Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) 及
びＡ. アワモリ（Ａ．awamori)のトランスフォーマント
の分析 ｐＣＪ：：ＧＲＧ１〜ｐＣＪ：：ＧＲＧ４でトランスフ
ォームしたＡ. アワモリ（Ａ．awamori)及びＡ．ニドゥ
ランス（Ａ．nidulans) から分泌したキモシンポリペプ
チドをミルク凝固検定及びエンザイム・イムノアッセイ
及びウェスタン・イムノブロッティング技術により検出
した。各々の場合（結果は示していない）、トランスフ
ォームした菌類は、培養培地中に生物学的に活性のある
キモシンを分泌した。

【００８６】実施例 ９ Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) からの、フミコラ・
グリセア (Humicola grisea)のグルコアミラーゼの発現
と分泌 菌類フミコラ・グリセア (Humicola grisea)から、グル
コアミラーゼ遺伝子を単離し、クローン化した。それか
ら、この遺伝子をarg Ｂ発現プラスミドｐＣＪ１６Ｌに
連結した。生成したベクター、ｐＣＪ：ＲＳＨ１及びｐ
ＣＪ：ＲＳＨ２を、フミコラ・グリセア (Humicola gri
sea)のグルコアミラーゼを発現、分泌させるべく、arg
Ｂ欠失Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) （実施例８）
をトランスフォームするのに用いた。

【００８７】Ａ．フミコラ・グリセア (Humicola grise
a)のグルコアミラーゼ遺伝子の単離とクローニング １．フミコラ・グリセア (Humicola grisea)のグルコア
ミラーゼの精製 正しいＨ．グリセア (Ｈ．grisea) ( サーモイデア (th
ermoidea) の変化物・ＮＲＲＬ１５２１９）のグルコア
ミラーゼをＡ．Ｅ．スティリー社（Ａ．Ｅ．Staley Com
pany) から入手した。その酵素を、4.６mm×２５０mmの
シンクロムパック (SynchromPak)Ｃ４逆相カラムでのク
ロマトグラフィーにより、同質なものに精製した。最
初、カラムを0.０５％トリエチルアミン及び0.０５％ト
リフルオロ酢酸（溶液Ａ）で0.５ｍl ／min の流速で平
衡化した。グルコアミラーゼ試料注入後、カラムを溶液
Ａで２分間洗い、それから、毎分５％の溶液Ｂの勾配を
４０％溶媒Ｂになるまで流した。その後、勾配を分当り
0.５％の溶媒Ｂとなるように変え、グルコアミラーゼは
およそ５５％溶媒Ｂのときに流出してきた。この時点
で、グルコアミラーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって均一であると判定された。

【００８８】２．Ｈ．グリセア (Ｈ．grisea) のグルコ
アミラーゼのアミノ酸配列 精製したＨ．グリセア (Ｈ．grisea) のグルコアミラー
ゼのアミノ末端配列を先に述べた方法で得た（６０）。
配列は、次のようである。 AAVDTFINTEKPSAXNSL ここに示した、これら及び他の文字によるペプチド配列
は、各文字が次のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味し
ている。

【００８９】 アミノ酸 ３文字記号 １文字記号 アラニン Ａla Ａ グルタミン酸 Ｇlu Ｅ グルタミン Ｇln Ｑ アスパラギン酸 Ａsp Ｄ アスパラギン Ａsn Ｎ ロイシン Ｌeu Ｌ グリシン Ｇly Ｇ リジン Ｌys Ｋ セリン Ｓer Ｓ バリン Ｖal Ｖ アルギニン Ａrg Ｒ スレオニン Ｔhr Ｔ プロリン Ｐro Ｐ イソロイシン Ｉle Ｉ メチオニン Ｍet Ｍ フェニルアラニン Ｐhe Ｆ チロシン Ｔyr Ｙ システイン Ｃys Ｃ トリプトファン Ｔrp Ｗ ヒスチジン Ｈis Ｈ

【００９０】さらに付加的アミノ酸配列決定を行うため
のペプチドフラグメントを得るために、精製したグルコ
アミラーゼ（１mg／ml）を、１０８℃で２時間、２％酢
酸により消化した。その物質を直接、上記のように平衡
化したシンクロムパック (Synchorompak) Ｃ４カラム
（4.８mm×１００mm）に注入した。１００％溶媒Ａ（上
記参照）で２分間洗った後、そのペプチドを溶媒Ｃの直
線勾配で流出した（毎分１％）。溶媒Ｃは、プロパノー
ル中、0.０５％トリエチルアミンと0.０５％トリフルオ
ロ酢酸を含んでいるものである。この時点で、三つのペ
プチドをさらに解析する為に選んだ。ひとつのペプチド
（ＣＡ３）は直接配列決定した。他の２つのペプチド
（ＧＡ１とＧＡ２）の混合物は次のように4.８mm×２５
０mmのシンクロムパック (Synchorompak) Ｃ４カラムで
さらに精製した。ＧＡ１とＧＡ２の混合物を３倍容の溶
媒Ａで希釈し、カラムに注入した。２分間洗浄した後、
そのペプチドを溶媒Ｄの直線勾配で流出した（毎分0.５
％）。溶媒Ｄは３５％プロパノール−６５％アセトニト
リル中に0.０５％トリエチルアミン、0.０５％トリフル
オロ酢酸を含むものである。分離したＧＡ１とＧＡ２は
再び同様な方法で精製され、上述に従ってアミノ酸の配
列決定がなされた。ペプチドＧＡ１、ＧＡ２、ＧＡ３の
配列は、次のとおりである。 GA1 PLWSITVPIKATGXAVOYKYIKVXQL GA2 AAVRPLINPEKPIAWNXLKANIGPN GA3 INTEKPIAWNKLLANIGPNGKAAPGAAAGVVIASPSRTD

【００９１】３．合成オリゴヌクレオチドプローブ Ｈ．グリセア (Ｈ．grisea) のグルコアミラーゼ遺伝子
をコードするゲノムＤＮＡは、次のようにクローン化し
た。４８ケのオリゴヌクレオチドの合成混合物を、グル
コアミラーゼ遺伝子を検出するハイブリダイゼーション
・プローブとして用いた。オリゴヌクレオチドの長さは
１７塩基（１７量体）で、Ｈ．グリセア(Ｈ．grisea)
のグルコアミラーゼ由来の６ケのアミノ酸（上記、ＧＡ
１ペプチドのアンダーラインの個所）の配列に対応して
いる。 ４８ケのオリゴヌクレオチドの混合物は６ケのプール
で、その各々が８ケの異なる合成１７量体を含むよう合
成した。 オリゴヌクレオチドは、製造業者により指定された試薬
と方法に従い、バイオサーチ社製自動ＤＮＡ合成機（Ｃ
Ａ、サン・ラファエル・バイオサーチ社）。

【００９２】４．正しいオリゴヌクレオチド・プローブ
の選択 Ｈ．グリセア (Ｈ．grisea) 由来のゲノムＤＮＡを、サ
ウザーン法により（３０）、グルコアミラーゼ配列の存
否について分析した。手短かに、Ｈ．グリセア(Ｈ．gri
sea) ＤＮＡをＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化
した。この消化したＤＮＡの６画分（各プローブ・プー
ル当り１ケ）を、１％アガロース・ゲル電気泳動によ
り、サイズ別に分画した。先に述べた方法で、そのＤＮ
Ａをニトロセルロースにブロッティングしたあと、その
ＤＮＡは、８０℃で真空オーブン中、ニトロセルロース
上に固定した。そのフィルターを、ＢamＨＩ消化ＤＮＡ
の６画分に従って６片に切り、各小片を１８時間、合成
オリゴヌクレオチドプローブのプールの１つと低塩濃度
でハイブリダイズさせた（２、４０）。（そのプローブ
は、以前に述べたように、ガンマ〔³²Ｐ〕ＡＴＰとＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射性ラベルしてあ
る。）ハイブリダイゼーション後、そのフィルターを２
×ＳＳＣ、0.１％ＳＤＳを用い、３７℃で１５分間洗
い、さらに同温度で２×ＳＳＣを用いて２度洗った。フ
ィルターを空気乾燥し、サランラップで包み、そして、
コダック（Kodak)のＸＯ mat−ＡＲＸ線フィルムにかけ
て、オートラジオグラフ像を得た。オートラジオグラフ
の現像後、3.７ｋb のＢamＨＩフラグメントに対応する
かすかなバンドが、プール３でハイブリダイズした小片
に見ることができた。

【００９３】ハイブリダイゼーション・シグナルを改善
するために、８ケの個々のオリゴヌクレオチドとして、
プール３を再合成した。８ケの各オリゴヌクレオチドを
プローブとして、サウザーン・ハイブリダイゼーション
実験をくり返した。それらの１７量体プローブのうちの
１つがＨ．グリセア (Ｈ．grisea) のゲノムＤＮＡの3.
７ｋb ＢamＨＩフラグメントとハイブリダイズすること
が分かった。そのオリゴヌクレオチドの配列は５’CAGT
ACAAGTATATCAA である。この１７量体はＨ．グリセア
(Ｈ．grisea) のグルコアミラーゼ遺伝子のクローニン
グのためのハイブリダイゼーション・プローブとして用
いた。

【００９４】５．グルコアミラーゼ遺伝子配列のクロー
ニング Ｈ．グリセア (Ｈ．grisea) のゲノムＤＮＡをＢamＨＩ
で消化し、標準法（３０）に従ってポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動によりサイズ別に分画した。２から４ｋ
b までの大きさのＤＮＡフラグメントを切り出しゲルか
ら流出させた。このＤＮＡ画分を大腸菌（Ｅ．coli) ク
ローニング・ベクターｐＢＲ３２２（ＡＲＣＣ３７０１
７）中にクローン・ライブラリーを作るのに用いた。そ
のクローニング・ベクターをＢamＨＩで消化し、バクテ
リア・アルカリ・ホスファターゼで脱リン酸化した。そ
のホスファターゼをフェノール−クロロホルム（１：１
ｖ／ｖ）で抽出し除去した。ＢamＨＩで切断し、大きさ
の決ったＨ．グリセア (Ｈ．grisea) ＤＮＡを、ＢamＨ
Ｉで切断し、脱リン酸化したｐＢＲ３２２に連結した。
このように連結したＤＮＡを、モリソン (Morrison)
（４１）の方法により調製した大腸菌（Ｅ．coli) ２９
４（ＡＴＣＣ３１４４６）のコンペテント細胞をトラン
スフォームするのに用いた。トランスフォーマントを５
０μｇ／ｍl の濃度でカルベネシリンを含むＬＢ寒天プ
レート（３０）で選択した。グルコアミラーゼ遺伝子配
列をもつトランスフォーマントは、プローブとして特異
的１７量体（上述）を使うことにより、コロニー・ハイ
ブリダイゼーション法（３０）により同定した。ハイブ
リダイズしたコロニーは精製され、その各々から、アル
カリ−ＳＤＳミニスクリーン操作（３０）によってプラ
スミドを単離した。このようにして選び出されたプラス
ミドは、全て、グルコアミラーゼ特異的１７量体プロー
ブにハイブリダイズする3.７ｋb のＢamＨＩフラグメン
トを含んでいた。ｐＲＳＨ１と命名したその１つのプラ
スミドが次の解析のために選ばれた。ｐＲＳＨ１からの
６００ bp のＳan３Ａフラグメントをバクテリオファー
ジＭ１３mp（３３）にサブクローンし、部分的にダイデ
オキシ・チェーン・ターミネーション法により配列決定
を行って、そのクローン化したＤＮＡが、グルコアミラ
ーゼ遺伝子をコードしていることを確かめた。ｐＲＳＨ
１中に含まれる3.７ｋb のＢamＨＩフラグメントの制限
エンドヌクレアーゼ切断地図を図１９に示した。ｐＢＲ
３２２中、既知の制限部位に対するＤＮＡフラグメント
の配向に、１ケ所及び２ケ所の制限消化が生ずる（４
４）。我々が得たＤＮＡの配列データと、制限地図に基
づき、グルコアミラーゼ遺伝子の全コード配列が、ｐＲ
ＳＨ１中の3.７ｋb のＢamＨＩフラグメント内に含まれ
る確率が高いことが分かった。

【００９５】Ｂ．フミコラ・グリセア (Humicola grise
a)のグルコアミラーゼ遺伝子を含むarg Ｂベクターの構
築 ｐＲＳＨ１からの3.７ｋb ＢamＨＩフラグメントを、選
択可能な、Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) 由来のar
g Ｂ遺伝子を含むｐＣＪ１６Ｌ中にクローン化した（両
配向を含んで）（図２０）。生じたベクター、ｐＣＪｉ
ＲＳＨ１及びｐＣＪｉＲＳＨ２をarg 欠失Ａ．ニドゥラ
ンス（Ａ．nidulans) をトランスフォームするのに用い
た。

【００９６】Ｃ．Ｈ．グリセア (Ｈ．grisea) のグルコ
アミラーゼの発現と分泌 原栄養トランスフォーマントを精製し、単一の炭素源と
してデンプンを含んだ最小培地にイノキュレートした
（この培地は、 pＨを5.０に調整したこと以外は、キモ
シンの生産の際に述べたものと同一のものである）。培
養濾液について、Ｈ．グリセア (Ｈ．grisea) のグルコ
アミラーゼ活性の検定を行った。図２１は、ｐＣＪｉＲ
ＳＨ１でトランスフォームしたＡ．ニドゥランス（Ａ．
nidulans)によるＨ．グリセア (Ｈ．grisea) のグルコ
アミラーゼの細胞外生産を示している。ネガティブ・コ
ントロールとしては、トランスフォームしていないarg
Ｂ欠失Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) を用いた。先
に特に好ましい具体例を記述したが、本発明がそれに制
限されるものではないことを理解されよう。この分野に
精通した人にとっては、公開された具体例に対して、種
々の修正がなされるであろうし、そのような修正が本発
明の範囲を逸脱するものではないことは明らかであろ
う。

【００９７】次の文献目録中にまとめられ、そして各
々、先のテキスト中にカッコ付数字で示した参照資料を
参考のため組み入れた。 文献目録 1. ヒッツェマン (Hitzeman) 、Ｒ．Ａ．等、１９８４
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【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＧa １及びｐＧa 5 にアスペルギラス・ニガ
ー (Aspergillus niger)のグルコアミラーゼを挿入した
制限地図。

【図２】ｐＤＪＢ−gam −１の構成を示す。

【図３】mｐ１９ＧＡＰＲの構成を示す。

【図４】ｐＧＲＧ１、ｐＧＲＧ２、ｐＧＲＧ３及びｐＧ
ＲＧ４の構成を示す。

【図５】ｐＧＲＧ１、ｐＧＲＧ２、ｐＧＲＧ３及びｐＧ
ＲＧ４の構成を示す。

【図６】ｐＧＲＧ１、ｐＧＲＧ２、ｐＧＲＧ３及びｐＧ
ＲＧ４の構成を示す。

【図７】ｐＧＲＧ１、ｐＧＲＧ２、ｐＧＲＧ３及びｐＧ
ＲＧ４の構成を示す。

【図８】mｐ１９ＧＡＰＲから mｐ１９ＧＡＰＲΔＣｌ
〜Ｃ４を発生させるために用いた戦略を示す。

【図９】ｐＣＲ１６０の構成を示す。

【図１０】５’及び３’フランキング（flanking) 配列
を含むムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) カルボキシ
ル・プロテアーゼ遺伝子の部分的な制限地図。

【図１１】完全なコード配列及び５’及び３’フランキ
ング配列を含むムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) カ
ルボキシル・プロテアーゼのＤＮＡ配列である。

【図１２】完全なコード配列及び５’及び３’フランキ
ング配列を含むムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) カ
ルボキシル・プロテアーゼのＤＮＡ配列である。

【図１３】完全なコード配列及び５’及び３’フランキ
ング配列を含むムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) カ
ルボキシル・プロテアーゼのＤＮＡ配列である。

【図１４】ｐＭe ＪＢ−７の構成を示す。

【図１５】部分的なヌクレオチド及びＡＮＳ−１の制限
地図である。

【図１６】部分的なヌクレオチド及びＡＮＳ−１の制限
地図である。

【図１７】ｐＤＪＢ−３の構成を示す。

【図１８】プラスミドｐＣＪ：ＧＲＧ１〜ｐＣＪ：ＧＲ
Ｇ４の構成を示す。

【図１９】ｐＲＳＨ１からの3.７ｋb ＢamＨＩフラグメ
ントの制限エンドヌクレアーゼ分裂地図である。

【図２０】ｐＣＪ：ＲＳＨ１及びｐＣＪ：ＲＳＨ２の構
成を示す。

【図２１】Ａ．ニドゥランス（Ａ．nidulans) からの
Ｈ．グリセア (Ｈ．grisea) グルコアミラーゼの発現を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/14 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/14 Ａ 9/34 9/34 9/58 9/58 9/62 9/62 9/64 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 9/34 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/34 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/58 Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｎ 9/62 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:785） (72)発明者 ダニエル カレン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 95125ハーフ ムーン ベイ シー クレ スト コート 11 (72)発明者 グレゴリー エル グレイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94980サウス サンフランシスコ エルム コート 530 (72)発明者 カーク ジェイ ハイエンガ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94010バーリンゲイム ガーデン ドライ ヴ 1910 アパートメント 108 (72)発明者 ヴァージル ビー ローリス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94044パシフィカ グレイシャー 1218

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （イ）異種ポリペプチドを発現し、繊維
   状菌類から該異種ポリペプチドの分泌をうながすことが
   できるＤＮＡ配列を含むベクターを繊維状菌類にトラン
   スフォームすること、及び（ロ）該異種ポリペプチドを
   発現及び分泌すること、を含む異種ポリペプチドの製造
   方法。