JPH07509368A - 核酸配列増幅 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列増幅 発明の技術分野 この発明は、単独でかまたは核酸の均一なもしくは不均一な混合物の（大きなま たは小さな）成分としてのいずれかで存在するかもしれない特定の核酸配列すな わち「標的配列」のコピー数を増加させる方法に関する。上記核酸の混合物は、 診断試験、環境試験のため、研究用に、試薬または材料の調製のため、クローニ ングなどの他の方法のため、または他の目的のために採取された試料中に認めら れるものであってよい。

特定の核酸配列を選択的に増幅させることは、特異性を維持しながら診断アッセ イおよび環境アッセイの感度を高めるうえで、種々の研究方法の感度、便利さ、 正確さおよび信頼性を高めるうえで、および種々の目的のために特定のオリゴヌ クレオチドを充分に供給させるうえで価値がある。

本発明は、便利に行うことができることのために、環境および診断試験に使用す るのに特に適している。

発明の技術背景 特定の核酸配列の検出および／または定量は、微生物の同定および分類、感染性 疾患の診断、遺伝子異常の検出および特徴付け、癌に付随する遺伝子変化の同定 、疾患に対する遺伝的罹病性の研究、および種々のタイプの治療に対する応答の 測定のため、ますます重要な技術になっている。そのような方法はまた、食品中 、環境試料中、種中、および特定の微生物の存在をモニターする必要のある他の タイプの物質中に微生物を検出および定量するのに広範に使用されている。他の 応用は、法科学、人類学、考古学、および生物学において見いだされ、その際、 核酸配列の関連性の測定が、犯罪容疑者の同定、実父論争の解決、系統樹および 系統発生樹の構築、および種々の形態の生命の分類の援助に用いられている。

特定の核酸配列を検出および定量するための一般的方法は、核酸ハイブリダイゼ ーションである。この方法は、相補的なまたは本質的に相補的な配列を含有する ２つの核酸鎖が、適当な条件下で特異的に会合して二本鎖構造を形成することが できる能力に基づいている。特定の核酸配列（「標的配列」として知られる）を 検出および／または定量するには、該標的配列の配列に相補的な配列を含有する 標識オリゴヌクレオチド（「プローブ」として知られる）を調製する。このプロ ーブを標的配列を含むと思われる試料と混合し、ハイブリッド形成に適した条件 を生成させる。プローブは、標的配列が試料中に存在するならば該標的配列とハ イブリダイズする。ついで、プローブ−標的ハイブリッドを一本鎖のプローブか ら種々の方法の一つを使って分離させる。ついで、試料中の標的配列の量を表示 するものとして、ハイブリッドに付随する標識の量を測定する。

核酸ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、王として、プローブの比活性、 ハイブリダイゼーション反応の速度および程度、ハイブリダイズしたプローブと ハイブリダイズしなかったプローブとの分離方法の性能、および標識を検出する ことのできる感度によって制限される。最も感度の高い方法は、スピード、便利 さおよび経済性などのような日常的な臨床試験および環境試験に必要とされる特 徴の多くを欠いているかもしれない。さらに、これら方法の感度は、多くの所望 の応用にとって充分でない。

このタイプのアッセイの種々の成分および成分工程間での相互反応の結果、感度 と特異性の間にはほとんど常に逆比例の関係が存在する。それゆえ、アッセイの 感度を高めるためにとった手段（プローブの比活性を高めるなど）は、偽陽性の 試験結果のパーセントが一層高い結果となる。このような感度と特異性との関連 は、ハイブリダイゼーションアッセイの感度を改善するうえで重大な障害であっ た。この問題の一つの解決法は、増幅法を用いて存在する標的配列の量を特異的 に増加させることである。標的配列の独特の部分を増幅させ、試料の残りの配列 中にコードされた情報のかなりの部分を増幅させないことは、感度を高め、それ と同時に特異性を損なうこともないに違いない。

「ポリメラーゼ連鎖反応」またはｒＰＣＲＪと呼ばれる核酸配列を特異的に増幅 させる方法が、マリス（ＭｕＨｊｓ）らによって記載されている。（米国特許第 ４．６８３．１９５号、同第４．６８３，２０２号および同第４．８００．１５ ９号およびヨーロッパ特許出願第８６３０２２９８．４号、８６３０２２９９． ２号および８７３００２０３．４号およびＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ１Ｖｏｌｕａ＋ｅ１５５．１９８７．３３５〜３５０頁参照。）この方 法では、相補的配列の６鎮を鋳型として用い、同時に起こるプライマー依存性の 核酸合成のサイクルを繰り返す。増幅される配列は、合成を開始するプライマー 分子の位置によって定められる。これらプライマーは、標的配列またはその相補 体の３°末端部分に相補的であり、核酸合成を開始するにはこれら部位と複合体 を生成する必要がある。伸長生成物の合成後、つぎの合成工程の前に両鏡を一般 に熱変性により分離する。ＰＣＲ法においては、相補的配列の両鏡のコピーが合 成される。

ＰＣＲ反応の各サイクルの終結時において新たに合成された鎖を分離させるため にＰＣＨにおいて用いる鎖分離手段は、しばしば熱変性である。その結果、熱安 定性の酵素を用いるか、または熱変性工程とＤＮＡ合成の次のサイクルの開始と の間に新たな酵素を添加する必要がある。幾つかの異なる極端な温度間で反応温 度を繰り返し循環させる必要があることは、ＰＣＲ法の欠点である。ＰＣＲを便 利なものとするためには、プログラムに組み込むことが可能な（ｐｒｏｇｒａａ ＋ｍａｂｌｅ）軌循環装置が必要である。

ＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応に使用するプライマーの一つにプロモーター配列を組み 込み、ついでＰＣＲ法を幾つかのサイクル行って増幅した後に一本鎖ＲＮＡの転 写のために二本ｌＤＮＡを鋳型として用いることによって、ＲＮＡ転写と組合ワ サレテイる。（たとえば、ムラカワ（Ｍｕｒａｋａｗａ）ら、ＤＮＡ７　：　２ ８７〜２９５　（１９８８）参照。） 特定核酸配列の増幅のための他の方法は、一連のプライマーハイブリダイゼーノ ヨン、伸長工程および変性工程からなり、プロモーター配列含有プライマーを使 用することによってプロモーター配列を含有する中間体の二本鎖ＤＮＡ分子を与 えることを含む。この二本鎖ＤＮＡを用い、標的配列の複数のＲＮＡコピーを生 成させる。得られたＲＮＡコピーを標的配列として用いてさらにコピーを生成さ せることができ、複数のサイクルを行うことができる。（たとえば、）く−グ（ Ｂｕｒｇ）ら、ＷＯ８９／１０５０号、ノンノエラス（Ｇ　ｉｎｇｅｒａｓ）ら 、ＷＯ３８／１０３１５号（しばしば「転写増幅システム」またはＴＡＳと呼ば れる）：カシアン（Ｋａｃｉａｎ）およびワルツ（Ｆｕｌｔｚ）のＥＰＯ出願第 ８９３１３１５４号；ダベイ（Ｄａｖｅｙ）およびマレク（Ｍａｌｅｋ）のＥＰ Ｏ出願第８８１１３９４８．９号、マレクらのＷ０９１１０２８１８号を参照。

）ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　（ＵＳＡ）８９　：　３９２〜３９６　（１９９２年１月））（従来技術 とは認められない）は、最初の標的配列を生成するための制限エンドヌクレアー ゼおよび伸長反応およびそれゆえ増幅を可能とするためのＤＮＡ／ＤＮＡ複合体 にニックを入れる酵素を用いた、ＤＮＡ鋳型に用いるオリゴヌクレオチドによる 増幅法を記載している。ベッカ−（Ｂ　ｅｃｋｅｒ）ら（ＥＰＯ出願第８８３０ ６７１７．５号）は、プライマーを標的配列とハイブリダイズさせ、得られた二 本鎖を伸長反応および増幅の前に開裂する増幅法を記載しているニプライマーカ いイブリダイゼーンコンの領域を越えて伸長する場合には、伸長の前に開裂する 必要があり、増幅の前に不必要な伸長反応が起こるのを防ぐためにプライマーを ３°末端でブロックしなければならない。

ウルデ７　（Ｕｒｄｅａ）　（ＷＯ９１／　１０７４６号）は、Ｔ７プロモータ ー配列を導入したフグナル増幅法を記載している。

核酸の他の増幅法としては、ヨーロッパ特許出願第３２０．３０８号に記載され たリカーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）　（ＬＣ Ｒ）が挙げられ、この場合、少なくとも４つの別々のオリゴプローブが用いられ る：オリゴブローブのうちの２つは、第三および第四のオリゴプローブが第一お よび第二のオリゴプローブとハイブリダイズしてライゲーンコン後に連結したプ ローブを形成するように、同じ譚的鎖上の反対側の末端に適当な方向でハイブリ ダイズし、該連結したプローブを変性および検出することができる。他の方法は ＥＰＯ出願第０４２７０７３．４２号（１９９１年５月１５日公開）（従来技術 とは認められない）に記載されているものであり、該方法においては、ヘアピン を形成することができヘアピン巾に機能性のプロモーター配列を有するパリンド ローム性のプローブを標的配列にハイブリダイズさせ、ついで該標的配列にハイ ブリダイズさせた他のオリゴヌクレオチドにライゲートさせ、特定のＲＮＡ転写 物が得られるようにする。

ＲＮＡ−指向ポリメラーゼ、好ましくはＱβレプリカーゼの結合のための認識配 列を有する組換え一本鎖ＲＮＡ分子を用いることにより、比較的多量のある種の ＲＮＡを生成させることができる。（たとえば、クレーマー（Ｋｒａ■ｅｒ）ら の米国特許第４．７８６．６００号を参照）変異体分子のＤＮＡコピー中に特定 の配列を挿入し、これを発現ベクター中にクローニングし、これをＲＮＡに転写 し、ついでこれをＱβレプリカーゼを用いて副生するのに多くの工程を必要とす る。

定義 本明細書において特に断らない限り、以下の術語は以下の意味を有する。

Ａ　核酸 「核酸」は、配列中に存在するかもしれず本発明の実施を妨害しないヌクレオチ ド類似体または他の分子に加えて、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを意味する。

Ｂ　鋳型 「鋳型」は、核酸ポリメラーゼによってコピーすることのできる核酸分子である 。鋳型はＲＮＡかまたはＤＮＡのいずれであってもよく、ポリメラーゼに応じて 一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖のいずれであってもよい。合成されたコピ ーは鋳型に相補的である。この発明において、コピーなる術語はまた、鋳型に等 価なＲＮ　ＡまたはＤＮＡ配列（当該技術分野で一般に相同配列と呼ばれる）を 有する核酸をも包含する。

Ｃプライマー 「プライマー」は、鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドであって、鋳型とハイブ リダイズしてＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素など）による合成を開始させるた めのプライマー／鋳型複合体を与え、その３°末端に連結した鋳型に相補的な共 有結合した塩基の付加により伸長するものをいう。その結果、プライマー伸長生 成物が得られる。ＤＮＡ合成を開始するには、知られている実質的にすべてのＤ ＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、オリゴヌクレオチドが一本鎖の鋳型 と複合体を形成すること（「プライミング」）を必要とする。適当な環境下では 、プライマーはブロモ−クー−プライマーの一部である。そのようなプライマー は、一般に１０〜１００塩基の長さ、好ましくは２０〜５０塩基の長さである。

Ｄ　プロモーターまたはプロモーター配列「プロモーター」または「プロモータ ー配列」は、核酸分子に結合して特定の部位でＲＮＡの転写を開始するためのシ グナルとして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によって認識 される特定の核酸配列である。結合のためには、そのような転写酵素は、一般に プロモーターおよびその相補体が二本鎖であることを要求する；鋳型部分は二本 鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、種々の異なる プロモーター配列（その転写促進能は顕著に変わり得る）を認識する。ＲＮＡポ リメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始するとき、該プロモーター 配列は転写される配列の部分ではない。

それゆえ、かくして生成されたＲＮＡ転写物はプロモーター配列を含んでいない プロモーター−プライマーは、プロモーターおよびプライマーからなる。プロモ ーター−プライマーは、標的核酸配列の３°末端に充分に相補的であるため該標 的核酸配列の３°末端またはその近傍で複合体を形成できるオリゴヌクレオチド である。このことは、プロモーター−プライマーが標的配列の末端に充分に近（ て複合体を形成するため、アッセイ、試験、クローニング亥たは増幅された核酸 の他の用途の要件を満たすに充分な標的配列の増幅を可能とすることを意味する 。プロモーター−プライマーは鋳型として用いられて標的核酸配列の３°末端か ら伸長する相補的核酸配列を生成し、その結果、一般に二本鎖のプロモーターを 形成し、該二本鎖を破砕する変性または酵素的活性を受けることになる。そのよ うなプロモーター−プライマーは、一般に長さが４０〜１００塩基、好ましくは ４０〜６０塩基である。

ＤＮＡ−またはＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼはまた、標的配列を鋳型とし て用いて該標的核酸分子に対する相補鎖を生成する。

Ｆ　修飾したプライマーまたはプロモーター−ブライマープライマーまたはプロ モーター−プライマーの３′末端は、該末端から進行する伸長反応の速度および ／または範囲を回避または減少させるため、修飾またはブロックすることができ る。修飾した成員および修飾していない成員をともに有するプライマーまたはプ ロモーター−プライマーは、本発明の目的のためには本質的に同じ核酸配列から なる。言い換えると、修飾したプライマーまたはプロモーター−プライマーは、 修飾したオリゴヌクレオチドおよび修飾していないオリゴヌクレオチドともに標 的核酸配列上の実際上同じ位置で（プラスまたはマイナス約１０塩基）ハイブリ ダイズする点で、異なる複合体形成配列（プライマー）を含有してはいない。ま た、修飾したプロモーター−プライマーは、修飾していないプロモーター−プラ イマーと異なる認識配列（プロモーター）を含有してはいない。このことは、約 １０塩基内で、修飾したおよび修飾していないプライマーまたはプロモーター− プライマーは同じであり、同じＲＮＡポリメラーゼによって認識され、多かれ少 なかれ同じ標的配列とハイブリダイズする（必ずしも正確に同じ部位ではないカ リことを意味する。好ましい態様においては、修飾したおよび修飾していないプ ライマーまたはプロモーター−プライマーは、修飾の点を除１ブば同一である。

プライマーまたはプロモーター−プライマーの標的相補的部分の３°末端は、当 業者によ（知られた種々の仕方で修飾することができる。プロモーター−プライ マーに対する適当な修飾としては、リボヌクレオチドの付加、３゛デオキシヌク レオチド残基（たとえば、コルジセピン（Ｃｏ、グレン・リサーチ（ＧｌｅｎＲ ｅｓｅａｒｃｈ）　）　）の付加、３゛、２°　−７デオキシヌクレオチド残基 の付加、非ホスホンエステル骨格結合（モノチオリン酸エステルなど）を有する 修飾ヌクレオチド類似体加、およびアーノルド（Ａ　ｒｎｏｌｄ）ら（ＰＣＴ　 ＵＳ８８１０３１７３）によって記載されているような非ヌクレオチド結合（Ｒ ３）の付加またはアルカンーノオール修飾（ウイルク（Ｗｉｌｋ）ら、Ｎｕｃ、 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８　：　２０６５．１９９０）（ＲＰ）の付加が挙 げられ、または修飾は単にハイブリダイズする配列の３゛側に標的核酸配列に相 補的てない１または２以上のヌクレオチド残基からなっていてもよい。もちろん 、他の有効な修飾も可能である。

修飾レニオリゴヌクレオチドと修飾していないオリゴヌクレオチドとの混合物を 増幅反応に用いることができ、また広範囲の比率（たとえば、１・１〜１．００ ０１）の修飾したオリゴヌクレオチドおよび修飾していないオリゴヌクレオチド を用いることができる。異なる３°修飾を有するオリゴヌクレオチドの混合物を 用いることもできる。

Ｇ　プラス（＋）およびマイナス（−）鎖核酸合成の議論は、核酸二本鎖の２つ の相補鎖の命名の術語を採用することにより非常に簡単になり明瞭になる。伝統 的に、タンパク質や構造ＲＮＡを生成するのに用いられる配列をコードする鎖は 「プラス」鎖とよばれ、その相補鎖は「マイナス」鎖とよばれる。現在、多くの 場合において両方の鏑とも機能性であり、一方の鎖に「プラス」の表示を他方の 鎖に「マイナス」の表示を当てはめることは恣意的なものであることがわかって いる。にもかかわらず、両術語は核酸の配列の方向性を示すのに非常に有用であ り、本明細書においてその目的のために用いるであろう。その場合、「プラス」 鎖は第一のプライマーまたはプロモーター−プライマーと複合体を形成する最初 の標的配列を示す。

Ｈ１標的核酸配列、標的配列 「標的核酸配列」または「標的配列」は増幅すべき所望の核酸配列を有し、−重 鎖または二本鎖のいずれであってもよく、増幅すべき配列の５゛または３°側に 他の配列（増幅しても増幅しなくてもよい）を含有していてもよい。

標的配列には、本発明を実行する際にプロモーター−プライマーがハイブリダイ ズする複合体形成配列を包含する。標的核酸配列がもともと一本鎖である場合は 、該術語は（＋）または（−）鎖のいずれかを意味し、該標的配列に相補的な配 列をも意味するであろう。標的核酸配列がもともと二本鎖である場合は、該術語 は（＋）および（−）鎖の両方を意味するであろう。

１、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ ｒＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを 合成する酵素である。一つの例は、バクテリオファージＴ７　ＤＮＡポリメラー ゼである。知られているすべてのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開 始するには相補的なプライマー（ＲＮＡまたはＤＮＡであってよい）またはコポ リマーを必要とする。適当な条件下では、ある種のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラ ーゼはＲＮＡ鋳型から相補的なりＮＡコピーを合成することが知られている。

Ｊ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）ｒＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメ ラーゼ」または「転写酵素」は、（通常、二本鎖の）プロモーター配列を有する 二本鎖または部分的に二本鎖のＤＮＡ分子から複数のＲＮＡコピーを合成する酵 素である。本発明は、プロモーター−プライマー中の一末鎖プロモーター配列お よび該−末鎖プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを包含することに 注意すべきである。ＲＮＡ分子（「転写物」）は、プロモーターのすぐ下流の位 置から始まりてＲＮＡ分子の５°→３゛方向に合成される。転写酵素の例として は、バクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＦ３からのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ メラーゼが挙げられる。

Ｋ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）ｒＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ メラーゼ」または「逆転写酵素」は、ＲＮＡ鋳型から相補的なりＮＡコピーを合 成する酵素である。知られているすべての逆転写酵素はまた、ＤＮＡ鋳型から相 補的なりＮＡコピーを作製する能力をも有する：それゆえ、該ポリメラーゼはＲ ＮＡおよびＤＮＡの両方に依存性のＤＮＡポリメラーゼである。ＲＮＡ鋳型また はＤＮＡ鋳型のいずれかを用いて合成を開始するにはプライマーを必要とする。

Ｌ、ＲＮアーゼＨ ｒＲＮアーゼＨ」は、ＲＮＡ　：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を分解する酵素であ る。ＲＮアーゼＨは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼである。ニ ワトリの骨髄芽球症ウィルスおよびモロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素 は、そのポリメラーゼ活性に加えてＲＮアーゼＨ活性をも有する。幾つかのクロ ーニングされた逆転写酵素は、ＲＮアーゼＨ活性を欠いている。ポリメラーゼ活 性を伴わなくとも利用できるＲＮアーゼＨ源もまた存在する。この分解の結果、 ＲＮＡ：　ＤＮＡ複合体からＲＮＡが分離される。別の場合には、ＲＮアーゼＨ は、ＲＮＡの部分が溶は出したり（＠ｅｌｔ　ｏｆｆ）または酵素がＲＮＡの部 分を巻き戻すのを可能にしたり、または生成したＲＮＡ断片がポリラーゼによる 伸長のためのプライマーとして機能するように、単にＲＮＡを種々の位置で切断 するだけである。

Ｍ、ハイブリダイズ、複合体形成 「ハイブリダイズ」および「複合体形成」なる語は、ワトソンークリック塩基対 形成により二本鎖（または「複合体」）を形成するに充分に相補的なヌクレオチ ド配列間での二本鎖の形成を意味する。プロモーター−プライマーまたはプライ マーが標的（ｌＩ型）と「ハイブリダイズ」すると、そのような複合体（または ハイブリッド）はＤＮＡポリメラーゼによって必要とされるブライミング機能を 果たすのに充分安定であり、ＤＮＡ合成を開始する。

Ｎ、特異性 特異性は、配列およびアッセイ条件に応じて標的配列と非標的配列とを識別する 核酸配列の能力を説明する特性である。

発明の概要 本発明は、標的核酸配列の複数のコピーの合成のための新規な自己触媒法（すな わち、該方法は、温度、ｐＨまたはイオン強度などの反応条件を修飾する必要な く自動的に循環する）に関する。

本発明は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が形成されＤＮＡおよびＲＮＡ 合成が起こる条件下、標的配列を第一のオリゴヌクレオチド（標的配列の３′末 端部分とハイブリダイズするに充分に相補的な複合体形成配列（これ単独でプラ イマーと呼ばれる）を有し、該複合体形成配列の５°側に二本鎖の形態にてＲＮ Ａポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列を包含する配列（この配列は プロモーター−プライマーと呼ばれる）を有する）および第二のオリゴヌクレオ チド（標的配列の相補鎖とハイブリダイズするに充分相補的な複合体形成配列を 有するプライマーまたはプロモーター−プライマー）で処理することを特徴とす る。

この発明において、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド の一方または両方が、ブロックされたオリゴヌクレオチド配列とブロックされて いないオリゴヌクレオチド配列との混合物であるか（ブロックされたオリゴヌク レオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長の速度および／または範 囲を回避または減少させるように修飾された３°末端を有する）、または異なる ３°修飾を有するオリゴヌクレオチドの混合物である。そのような混合物は、ブ ロックされたオリゴヌクレオチドのみまたはプロ・ツクされてし）な１隻オリゴ ヌクレオチドのみを用いた場合に比べて特定の増幅反応の効率を有意に促進させ る。そのようなオリゴヌクレオチドの比率は増幅しようとする特定の鋳型配列に よって変わってよいが、一般に１＝１から１０００：１（プロ・ツクされたちの ／ブロックされていないもの）である。本発明では、標的配列は定められた３° 末端または５°末端を有する必要はない。

本発明の一つの態様は、（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が形成され 、適当なポリメラーゼ（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ）によってＤＮＡ合成が 開始される条件下、標的配列の３°末端部分とハイブリダイズするに充分に相補 的な複合体形成配列を有し、該複合体形成配列の５′側に二本鎖の形態にてＲＮ Ａポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列を包含する配列を有する第一 のプロモーター−プライマーオリゴヌクレオチドで標的配ＦｌＦを処理し、（ｂ ）標的の３°末端が伸長されてＲＮＡポリメラーゼのための／シブ１ルノド鋳型 を生成するように、上記第一のオリゴヌクレオチド／標的複合体を伸長反応条件 下でインキュベートし、ついで（Ｃ）該プロモーター配列を認識するＲＮＡポリ メラーゼを用いて標的配列の複数のＲＮＡコピーが生成される条件下、該１１イ ブリツド鋳型をインキュベートすることを包含する。本発明はまた、ＲＮＡ：Ｄ ＮＡ／１イブリツドのＲＮ　Ａ部分を選択的に分解する酵素（たとえばＲＮアー ゼＨ）の作用により、工程（ｂ）におけるＲＮＡ標的配列の３°末端の生成をも 包含する。

かくして生成したＲＮＡは、自己触媒的に循環して一層多（の生成物を生成させ る。

他の方法において、本発明は、（ａ）適当なポリメラーゼ（たとえＩｆ、ＤＮＡ ポリメラーゼ）によってＤＮＡ合成が開始されるように第一のオリゴヌクレオチ ド／標的配列複合体が形成される条件下、核ＩＥ！［（たとえば、ＲＮＡまｔ二 ｆｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）標的配列を第一のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプ ロモーター−プライマーと接触させ、（ｂ）該標的が該ポリメラーゼによって鋳 型として用（１られて該標的に相補的デ；第一のＤＮＡ伸長生成物が得られるよ うに（もしも該第−のプライマーがブロックされていないならば）、該第−のオ リゴヌクレオチドを伸長反応条件下でインキュベートし、（Ｃ）該標的がＲＮＡ 分子である場合は該ＲＮＡ標的を選択的に分解する酵素を用いて該ＲＮＡ標的か らＤＮＡ伸長生成物を分離させ、または該標的がＤＮＡ分子である場合は２つの ＤＮＡ鎖を分離させ（たとえば、９０〜１００℃に加熱するかまたは他の手段に より）、（ｄ）該ＤＮＡ伸長生成物を、プライマーまたはプロモーター−プライ マーを包含し該ＤＮＡ伸長生成物の３′末端部分とハイブリダイズするに充分相 補的な複合体形成配列を有する第二のオリゴヌクレオチドと、第二のオリゴヌク レオチド／伸長生成物複合体が生成され、該プライマー上のブロック分子に応じ て上記のようにＤＮＡ合成が開始される条件下で接触させることを特徴とする。

この発明において、第一のオリゴヌクレオチドがプロモーター−プライマーでな いならば第二のオリゴヌクレオチドがプロモーター−プライマーである（このこ とは、第二のオリゴヌクレオチドが、複合体形成配列の５゛側にＲＮＡポリメラ ーゼのためのプロモーター配列を包含する配列を有することを意味する）。加え て、第一のオリゴヌクレオチドおよび／または第二のオリゴヌクレオチドは、ブ ロックされたオリゴヌクレオチドおよびブロックされていないオリゴヌクレオチ ドの混合物かまたは異なる３°修飾を有するオリゴヌクレオチドの混合物のいず れかから構成される。

増幅反応は、本質的に必要な反応物および試薬からなる混合物中で行われる。

しかしながら、そのような混合物はまた、本発明の増幅に定性的に影響を及ぼさ ない（たとえば、反応のメカニズム）酵素や他の置換物（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎ ｔｓ）を含有していてもよい。そのような置換物は、観察される増幅の量に影響 を及ぼしてもよい。たとえば、該混合物は、同じ標的配列のための他のプロモー ター−プライマーを含有していてもよいし、または「ヘルパー」オリゴヌクレオ チドを含有していてもよい。そのようなヘルパーオリゴヌクレオチドは、ホーガ ン（Ｈｏｇａｎ）らによって記載された（米国特許第５．０３０．５５７号（参 照のため本明細書に引用する））ハイブリダイゼーノコンヘルパープローブと同 様の仕方で、すなわち標的核酸が有意の二次構造を有している場合であってもプ ロモーター−プライマーの該標的核酸への結合を助けることによって、用いられ る。そのようなヘルパーオリゴヌクレオチドの使用の点において類似しているに もかかわらず、そのようなヘルパーオリゴヌクレオチドが本発明の手順の効率に 悪影響を及ぼすことなく増幅プロトコールにおいて用いることができることは驚 くべきことである。

第一のオリゴヌクレオチドがプロモーター−プライマーで第二のオリゴヌクレオ チドがプライマーであるか、またはその逆、または第一のオリゴヌクレオチドお よび第二のオリゴヌクレオチドの両方がプロモーター−プライマーであってよく 、同一のプロモーター（プロモーターが同じＲＮＡポリメラーゼによって認識さ れるという意味において）または異なるプロモーターのいずれを有していてもよ い。増幅した核酸をクローニングに用いる場合には、異なるプロモーターを用い ることが特に有用である。ついで、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリ ゴヌクレオチドおよび標的配列から生成されたＲＮＡを用い、標的配列の複数の コピー（相補的な核酸配列および相同な核酸配列の両方を意味する）を自己触媒 的に合成させることができる。

本発明の修飾したプライマーまたはプロモーター−プライマーは、ＤＮＡポリメ ラーゼによる鋳型上のプライマーの伸長を変化（減少またはブロック）させる修 飾を所定のプライマーまたはプロモーター−プライマーの３゛末端またはその近 傍（３塩基内）に有する単一の核酸配列から本質的になる。好ましくは、この修 飾したプライマーまたはプロモーター−プライマーは、異なる核酸配列を有する １または２以上の他のプライマーまたはプロモーター−プライマー（これらはま た、ブロックされたオリゴヌクレオチドとブロックされていないオリゴヌクレオ チドとの混合物であってもよい）とともに、本質的に同じ核酸配列からなる修飾 していないプライマーまたはプロモーター−プライマーと混合する。本発明はま た、その３°末端またはその近傍に２以上の修飾を有するプライマーおよびプロ モーター−プライマーの混合物の使用をも包含する。

加えて、本発明の他の側面において、増幅しようとする配列がＤＮＡである場合 は、適当な予備的手順により、ＲＮＡコピーの生成（ついで本発明に従って増幅 させることができる）を促進させることができる。それゆえ、本発明はまた、本 発明の増幅法とともに用いるための予備的手順にも関するものであり、該手順は 増幅すべきコピー数を増加させることができるのみならず、増幅のためのＤＮＡ 配列のＲＮＡコピーをも提供することができる。

さらに別の側面において、本発明は、第二のプライマー結合部位の近傍でハイブ リダイズし、それによってＲＮアーゼＨの基質を形成するＤＮＡオリゴヌクレオ チドでＲＮＡ標的配列を処理することによる、該ＲＮＡ中での定められた５゜末 端（すなわち、知られた配列の一つ）の生成を特徴とする。ついで、この基質は ＲＮアーゼＨによって開裂されて該ＲＮＡ標的の５゛末端を定め、これを上記の ようにして増幅させることができる。

他の側面において、本発明は、酵素的ハイブリッド分離工程にＤＮＡポリメラー ゼ（逆転写酵素など）およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）を協 同的に作用させることにより、それ自体数の生成物を生成させるのに用いること のできる生成物を生成させ、その結果、熱サイクルなどにおける反応条件を操作 させる必要な（自己触媒的に反応させることをも包含する。さらに、予備的手順 を包含する本発明の幾つかの態様において、予備的手順の最初の工程以外のすべ てを１の温度で行う。

本発明は、臨床試料、環境試料、法試料および同様の試料中の特定の核酸標的配 列を検出および／または定量するためのアッセイの成分として、または種々の用 途のために特定の標的配列のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの多数のコピーを生成 させるために用いることができる。これら方法はまた、クローニングのためにＤ ＮＡ標的の複数のＤＮＡコピーを生成させたり、またはプローブを生成させたり 、または配列決定のためにＲＮＡおよびＤＮＡコピーを生成させるためにも用い ることができる。

典型的なアッセイの一例において、増幅しようとする試料（ＲＮＡまたはＤＮＡ 標的を含む）を、緩衝液、塩（たとえば、マグネシウムなどの２価カチオン）、 ヌクレオチド三リン酸、プライマーおよび／またはプロモーター−プライマー（ ブロックしたものおよび／またはブロックしていないもの）、ノチオトレイトー ルなどのチオール還元剤、およびスペルミジンなどのポリカチオンを含有する緩 衝トして二次構造を変性させる。室温（約２０℃）に冷却した後、ＤＮＡおよび ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮアーゼＨ活性およびＤＮＡ依存性Ｒ ＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素群を加え、混合物を３７℃〜４２℃で約１０ 分から４時間インキュベートする。ついで、ルミネセンス標識したプローブを加 え、６０℃にて１０〜３０分間インキュベートし、ハイブリダイズしていないプ ローブ上の標識を選択的に加水分解する溶液を加え、反応液を６０℃にて５〜１ ０分間インキュベートし、ついで残留する化学ルミネセンスをルミノメータ−（ ｌｕｍｉ口ｏｍｅｔｅｒ）で測定することにより、反応をアッセイすることがで きる。（たとえば、アーノルドらのＰＣＴ　ＬＪＳ８８１０２７４６号（１９８ ８年９月２１日出願、１９８９年３月２９日公開）を参照、この開示を参照のた めに本明細書に引用し、ｒＨＰＡＪと称する）本発明の生成物は、当業者に知ら れた他の多くのアッセイ系に用いることができる。

場合により、定められた３°末端を有しないＤＮＡ標的を１００℃付近でインキ ュベートして二次構造を変性させ、室温に冷却することができる。逆転写酵素を 加え、反応ａ６物を４２℃で１２分間インキュベートする。反応液を再び１００ ℃付近で変性させ、この場合はプライマー伸長生成物をＤＮＡ鋳型から分離させ る。冷却後、ＤＮＡおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮアーゼＩ ４活性およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素群を加え、反応 液を３７６Ｃ〜４２℃にて１０分から４時間インキュベートする。ＤＮＡｔｌ的 の場合は、定められた３°末端は制限エンドヌクレアーゼを用いて生成させるこ とができる。定められた３°末端はまた、当該技術分野で知られた他の手段によ り生成させることができる。

本発明のさらに別の側面は、それぞれ標的核酸配列およびその相補体の３′末端 またはその近傍にハイブリダイズすることができる反対のセンスの第一のオリゴ ヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドから本質的になる組成物であって 、これらオリゴヌクレオチドの一方はプロモーター−プライマーであり他方はプ ライマーかまたはプロモーター−プライマーのいずれかであり、これらオリゴヌ クレオチドの一方または両方が、修飾された３゛末端かまたは修飾されていない ３°末端のいずれかを有する単一の核酸配列、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ 、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼの混合物から本 質的になり、該混合物は実際上、一定のｐＨ，ｉ１度および温度での増幅を可能 とする（すなわち、これら条件のいずれも使用者によって能動的に変化させる必 要がない）ものを特徴とする。該組成物はまた、ＲＮアーゼＨ活性および／また は本明細書に記載する他の成分も含有していてよい。

他の側面において、本発明は、この増幅法または上記に記載したものなどの他の 増幅法に有用な特定の配列を包含するオリゴヌクレオチドを含有するキットを特 徴とする。そのような配列には、配列表に挙げた配列が含まれ、酵素（ポリメラ ーゼ、または制限エンドヌクレアーゼなど）によって認識される他の配列に結合 させてもよい。とりわけ、これらオリゴヌクレオチドは、マイコバクテリウム（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の核酸、たとえばマイコバクテリウム・チューバ ーキュローノス（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の核酸を増幅させるのに有 用であり、上記のように３゜末端を修飾させることができる。

本発明に使用する材料は、診断キットまたは診断手順もしくは他の手順に用いる 他のキットの一部に組み込むことができ、本発明はキットフォーマットで提供さ れるマルチウェル法に適合させることができる。

図面の簡単な記載 図１は、ＲＰとして言及されるアルカン−ジオール修飾の構造を示す。

発明の詳細な記載 本発明によれば、特定の核酸標的配列の検出および／または定量用のアッセイに 使用するため、または種々の用途のために特定の標的配列のＤＮＡおよび／また はＲＮＡの多数のコピーを生成させるための、特定の核酸標的配列の増幅のため の新規方法、組成物およびキットが提供される。

本発明は、有利にも、非特異的な副生成物の減少する比率にて本質的に同じ核酸 配列からなる、ブロックされたプロモーター−プライマーとブロックされていな いプロモーター−プライマーとの混合物、または異なる３°修飾を有するプロモ ーター−プライマーの混合物を使用することによる、標的配列のＲＮＡコビーを 合成するための増幅法を提供する。本発明において、増幅過程は広範囲の条件下 、自動的および等温的に起こる。以下に記載する増幅反応は、一連の論理的工程 である。各工程の相対速度は、増幅生成物の有効収率を決定するであろう。ブロ ックされたプライマーとブロックされていないプライマーとの混合物を使用する と副反応が減少し、それゆえ増幅が改善される。「プライマー−ダイマー」など の副生成物が記載されており、増幅反応の効率に影響を及ぼすことが当該技術分 野でよく知られている。本発明はそのような副生成物の生成効率を減少させるも のであり、それゆえ増幅効率を高めるものである。

本発明に遇したＤＮＡポリメラーゼとしては、ニワトリ骨髄芽球症ウィルス（Ａ ＭＶ）逆転写酵素やモロニーマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素など の逆転写酵素が挙げられる。本発明に使用するプロモーター−プライマー中に導 入するのに適したプロモーターまたはプロモーター配列は、配列を認識および結 合して転写過程を開始しそれによってＲＮＡ転写物を生成するＲＮＡポリメラー ゼによって特異的に認識される核酸配列（天然に存在するかまたは合成により生 成されるかもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化により生成されるもの）である 。開始配列を認識することのできる公知の利用できるポリメラーゼが存在するプ ロモーター配列が使用するのに特に適している。そのようなプロモーターとして は、バクテリオファージＴ３、Ｔ７またはＳＦ３からのポリメラーゼなどのある 種のバクテリオファージポリメラーゼによって認識されるプロモーターが挙げら れる。該配列は、ＲＮＡポリメラーゼに対する実際の認識部位を越えて広がるヌ クレオチド塩基（安定性を付加し、または分解過程に対する感受性を付与し、ま たは転写効率を高める）を任意に包含していてよい。

本発明において使用するのに遇した逆転写酵素の幾つかは、ＡＭＶ逆転写酵素や ＭＭＬＶ逆転写醇素などのようにＲＮＮアーゼ活性を有するが、大腸ｍＲＮアー ゼＨなどのような外来のＲＮＮアーゼを添加するのが好ましい。たとえば、実施 例（下記参照）では外来ＲＮアーゼＨを添加する必要がないことを示しているが 、ＡＭｖ逆転写酵素に存在するＲＮＮアーゼ活性は、反応混合物中に存在する比 較的多量の異種ＤＮＡによって阻害されることがある：この問題に対する一つの 解決策は外来ＲＮアーゼＨを添加することである。ＲＮＮアーゼを添加する必要 のある他の場合は、オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡ上で内部的にハイブリダイ ズする（すなわち、標的配列ヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドの３°末端お よび５°末端の両方を越えて広がるように、該オリゴヌクレオチドがハイブリダ イズする）場合である。

本発明は、第一のＤＮＡ伸長反応によって生成したＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を分離 するのに変性工程を必要としない。そのような変性工程は、反応混合物の温度を 実質的に高めたり（一般に、周囲温度がら約り０℃〜約１０５℃に）、そのイオ ン強度を減少させたり（一般に１０×またはそれ以上）、またはｐＨを変えたり （通常、ｐＨを１０またはそれ以上に高める）といった反応条件の操作を必要と する。そのような反応条件の操作は、しばしば酵素活性に悪影響を及ぼし、酵素 をさらに添加する必要を生じるし、またさらに核酸合成に適した条件に戻すため に反応混合物をさらに操作する必要も生じる。

混合物中の第二のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと同様にブ ロックまたは修飾されていてよい。本発明の一つの側面において、第一のオリゴ ヌクレオチドに修飾されていないものを用いるならば、第二のオリゴヌクレオチ ドは修飾されているものを用いる。また、第一のオリゴヌクレオチドがプロモー ター−プライマーでないならば、第二のオリゴヌクレオチドはプロモータ−プラ イマーである。さらに、第一のオリゴヌクレオチドがプライマーのみであるなら ば、それはブロックされていなくてよく、第二のオリゴヌクレオチドは、実質的 に単一の核酸配列からなるブロックされた構成員およびブロックされていない構 成員の両方を包含するプロモーター−プライマーである。

驚くべきことに、そのような本質的に同じ核酸配列からなるプロ・ｙりされたオ リゴヌクレオチドとブロックされていないオリゴヌクレオチドとの混合物は、非 特異的な生成物の生成量を減少させ、それにより増幅効率を高める。

生成したＲＮＡコピーまたは転写物は、さらに操作することなく自己触媒的に増 幅する。

本発明の他の側面においては、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌ クレオチドの両方ともプロモーター−プライマーであり、いずれかまたはその両 方が、それぞれ修飾されたプロモーター−プライマーおよび修飾されていないプ ロモーター−プライマーの両方であってよい。そのような場合、クローニングな どの増幅以外の目的のために第二のプロモーターを導入するのでない限り、両プ ロモーターとも同じＲＮＡポリメラーゼによりて認識されるのが好ましい。両方 のオリゴヌクレオチドがプロモーター−プライマーである場合は、自己触媒反応 の間に二本鎖鋳型の両輪に相補的な転写物が生成され、合成される標的配列のコ ピー数が増大される。

第一のオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプロモーター−プライマー）は標 的配列の一方の末端を定めるので、第二のオリゴヌクレオチド（プライマーまた はプロモーター−プライマー）は他方の末端を定めることに注意すべきである： これら末端はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼによって、または他の過当な 手段（天然の３゛末端を含む）によっても定めることができる。ＲＮＡ転写物は 最初の標的核酸と異なる末端を有していてもよいが、第一のオリゴヌクレオチド と第二のオリゴヌクレオチドとの間の配列は完全なままである。かくして生成さ れたＲＮＡ転写物は、さらに操作することなく上記系で自動的にリサイクルする 。

それゆえ、この反応は自己触媒的である。

また、いずれのオリゴヌクレオチドも、そのプライミング配列の５゛側に、最終 的に得られる二本鎖ＤＮＡに余分のヌクレオチド配列を付加する結果となり得る ヌクレオチド配列を有していてもよい；この余分のヌクレオチド配列はプロモー ター配列に限られるものではない。

他の態様において、本発明は、ブロックされたオリゴヌクレオチドのみからなる か、またはブロックされていないオリゴヌクレオチドのみからなるか、または３ °末端またはその近傍に異なる修飾の混合を有するオリゴヌクレオチドからなる プロモーター−プライマーが提供される、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二 のオリゴヌクレオチドからなっていてよい。

さらに別の朝様において、増幅を促進させる添加剤の存在下で増幅を行う。ジメ チルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、グリセリンま たは亜鉛などの例を用いた。

反応混合物の成分は順次または一度に加えることができる。反応は、有利にも、 成分酵素などの反応成分の安定性を維持するのに遇した条件下で、かつ増幅反応 の間に反応条件の修飾または操作の必要なく起こる。

本発明は、臨床試料、環境試料、法的試料、および同様の試料中の特定の核酸標 的配列の検出および／または定態のためのアッセイの成分として、または種々の 用途のために特定の標的配列のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの多数のコピーを生 成させるために用いることができる。

以下の実施例は、本発明の方法の有用性を示す。これら実施例は限定するもので はなく、限定するものと考えるべきでない。

特に断らない限り、以下の実施例において使用する増幅のための反応条件は、１ ００μｌ容量中に５０ｍＭ）リス−ＭＣＩ、３５ｍＭ　ＫＣＩ、２０ｍＭＭｇＣ ｌ、、１５ｍＭＮ−アセチルシスティン、４ｍＭ　ｒＡＴＰ、４ｍＭｒＣＴＰ、 ４ｍＭ　ｒＧＴＰ、４ｍＭ　ｒＵＴＰ、１ｒｎＭ　ｄＡＴＰ、１ｍＭｄＣＴＰ、 １ｍＭ　ｄＧＴＰ、１ｍＭ　ｄＴＴＰｌ　１０％グリセリン、１０％ジメチルス ルホキシド、３００〜６００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素、２００〜４００単位の Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、各０．１５μＭのプライマーまたはブロモ−クー−プ ライマー、および所定量の鋳型および酵素、４２℃で１時間であった。

ジチオトレイトール、スペルミジンおよび／またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ ）もまた反応混合物に有利に添加することができる。

以下の実施例に使用する酵素は、Ｔ７またはＴ３ＲＮＡポリメラーゼおよびモロ ニーマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素である。異なるプロモーター 特異性を有する他のＲＮＡポリメラーゼも適している。

相対的な増幅を以下のようにして測定した。約７５フエムトモルのプローブ、０ ．１Ｍコハク酸リチウム、ｐＨ４，７，２％（Ｗ／Ｖ）リチウムラウリルサルフ ェート、１５ｍＭアルトリチオール（ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ）　、２０ｍＭ　Ｅ ＤＴＡおよび２ＯｍＭ　ＥＧＴＡを含有する１００μｍのルミネセンス標識した プローブ（たとえば、アクリジニウムエステルでｔｌｌＩ謙、上記ＨＰ八へ献を 参照）溶液に、増幅反応混合物の試料（通常、１０μｍ）を加え、混合した。つ いで、この反応液を６０℃にて２０分間インキュベートし、冷却した。各ハイブ リダイゼータ３ン反応液に、３００μＩの０．６Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８， ５）　、１％トリトンＸ−１００を加えた。ついで、反応液を混合し、６０℃で ６分間インキュベートして、ハイブリダイズしなかったプローブの化学ルミネセ ンス標識を破壊した。このハイブリダイズしなかったプローブの化学ルミネセン スＩｌ１ｗＬの破壊法は非常に特異的である。非常にわずかのフラクンジンのハ イブリダイズしなかったプローブのみが化学ルミネセンスを残留させる。この反 応液を冷却し、２００μｍの０．１％過酸化水素、１ｍＭ硝酸および界面活性剤 、および２００μｍの１．ＯＮ水酸化ナトリウムを加えて残留する化学ルミネセ ンスをルミノメータ−で定量した。

このアッセイにおいて、ハイブリダイズしたプローブは光を放つ。放射された光 子の量をルミノメータ−で測定し、その結果を相対光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　 Ｌｉｇｈｔ’［Ｊｎｉｔｓ）またはＲＬｔＪとして報告する。ハイブリダイズし ていないプローブの化学ルミネセンス標識を破壊する反応は１００％有効ではな いので、一般に約１０００〜２０００ＲＬｔＪの範囲でシグナルのバックグラウ ンドレベルが存在する。

同位元素で標識したプローブへのハイブリダイゼー／コン、プロッティング法お よび電気泳動を用いたアッセイを含む他の多くのアッセイもまた適用することが できる。

これら反応条件は必ずしも最適化する必要はなく、幾つかの系において示したよ うに変えることができる。他の配列をこれらおよび他の標的配列に用いたように 、使用したオリゴヌクレオチド配列は例示であって限定することを意図するもの ではない。

実施例ｌ ＲＮＡ標的内の配列に相補的な修飾したプロモーター−プライマーで増幅が起こ ることを示すため、マイコバクテリウム・チューバーキュローノスｒＲＮＡ内の 配列に相補的なプロモーター−プライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）を修飾し ないかまたは３°アルカンジオール（ＲＰ）もしくは３°　コルジセピン（Ｃｏ ）を用いて合成し、該標的ＲＮＡと同じセンスのプライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ：２）および３テラモル（ｔ＋ａｏｌ）の標的とともに上記条件下でインキュ ベートした。

ホーガンにより記載されているヘルパーオリゴヌクレオチド（米国特許第５，０ ３０．５５７号、核酸ハイブリダイゼーンコンの促進手段、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ ：４および５）を用い、標的ＲＮＡと同じセンスのプローブ（ＳＥＱ　［）Ｎｏ ：３）で反応液を分析した。その結果は、３゛修飾を有するプロモーター−プラ イマーで有意の増幅が起こることを示している。

プロモーター−プライマー修飾　ＲＬＵ修飾せず　３１４．４４５ ３°　コルジセピン　７１，３８２ 修飾せず　６８３．７３７ ３°−ＲＰ　７０，０１４ 実施例２ この実験では、マイコバクテリウム・チューバーキュローシスの２３８ｒＲＮＡ に相補的な配列を有するプロモーター−プライマーを３゛モノチオリン酸ヌクレ オチドの存在により修飾した。１５ピコモルのプロモーター−プライマーおよび プライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６および７）を用いて０．３テラモルの標的 ＲＮＡを増幅し、ついでヘルパープローブ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・９および１０ ）を用いて標的ＲＮＡと同じセンスを有するプローブ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：８ ）で検出した。その結果は、３゛モノチオリン酸修飾したプロモーター−プライ マーは修飾していないオリゴヌクレオチドと同様に機能することを示している。

プロモーター−プライマー　ＲＬＵ＋標的　ＲＬＵ−標的修飾せず　２．６１４ ．０７９　８９９３゛モノチオリン酸　２．５７０．７９８　６４７実施例３ 修飾したプロモーター−プライマーおよび修飾していないプロモーター−プライ マーの混合物が増幅アッセイにおいて機能することを示すため、１５ピコモルの プライマーおよびプロモーター−プライマー（以下参照）を用Ｌ１て反応を讐テ Ｌ％。

実施例１に記載するようにしてアッセイした。３テラモルの標的ＲＮＡを用（１ を二。

ピコモル　プロモーター−プライマー 修飾せず　ＣＯ−修飾　ＲＬＬＩ 実験１　＋標的　１５　０　８３４．９０２十標的　３　１２　９７１．９３８ −標的　３　１２　１．４５６ 実験２　＋標的　３　１２　１．Ｏ１５，１９９＋標的　０．１　１５　９６１ ．０４１これら結果は、ブロックしたオリゴヌクレオチド配列対するプロ・ツク してＬ）なし１オリゴヌクレオチドの比が１：１５０であっても、プロ・ツクし ｔこ第１ノゴヌクレオチドとブロノ几ていないオリゴヌクレオチドとの混合物１ よすべてプロ・ツクしていないオリゴヌクレオチドと同等かまた：よ一層良好ζ ；機能したことを示してＬする。

実施例４ この実験では、３テラモルの標的ＲＮＡを、種々の濃度のＣＯプロ・ツクしたプ ライマーおよびブロツ几でいないプライマー、および実施Ｐ＋　１１こお番する ようｊこ１５ピコモルのＣＯプロ・ノルたプロモーター−プライマーと０．１ピ コモルのブロノ几ていないプロモーター−プライマーとの混合物ととも番＝イン キュベートした。生成物を／ヅブリダイセーノコンアツセイにより検出しｔこ。

ピコモルプライマー　ＲＬＵ ブロックしたちの　プロ・ツクして０なし１もの０　１５　９６９．５２２ １０　５８０２．８４０ １３　２　６４８．２７１ 満足のいく増幅結果が観察されたの屹二加えて、驚くべきことに、プロ・ツクし たオリゴヌクレオチドを用いて行った反応におＬｌて１よブロックして０なＬ′ １第１ノゴヌクレオ千トを用いて行った反応に比べて、鋳型１；向１すられなＬ Ｘ生成物の量体く有意に減少することがわかった。

実施例５ この実験では、単一のオリゴヌクレオチド配列を２つの異なる３゛修飾物と混合 することの効果を示した。３テラモルの標的ＲＮＡを実施例１と同様にして増幅 した。プロモーター−プライマーを３゛末端をブロックせずに、ＲＰでプロ、。

りして、またはｃｏでブロックして合成した。２ピコモルのプライマーを用いた 。

ピコモルプロモーター−フライマー　ＲＬＵＲＰで修飾　ＣＯで修飾　修飾せず ０　１５　０．１　４５０．１５７ ２　１３　０．０１　６８１．６４７ ２　１３　０　６７８．８７１ ５　１０　０　７５５．８３９ この実験は、修飾していないプロモーター−プライマーと修飾したプロモーター −プライマーとの混合物または異なるタイプの修飾したプロモーター−プライマ ーの混合物で良好に増幅できることを示しており、１時間で３テラモルのＲＮＡ 標的を検出することができる。

実施例に の実施例では、修飾したおよび修飾していないプライマーおよびプロモーター− プライマーの混合物を用いて３テラモルのマイコノくクテリウム・チ！　””” 　り一キュロー／スのｒＲＮＡを増幅した。２ピコモルのＲＰ修飾したプロモー ター−プライマーと１３ピコモルのＣＯ修飾したプロモーター−プライマーとの 混合物を、修飾していないプライマーまたは修飾していないプライマーと３′モ ノチオリン酸ヌクレオチド（Ｐ　Ｓ）で合成したプライマーとの混合物ととも１ こインキュベートした。配列およびノ＼イブリダイゼーノコンブローブは実施例 １と同じである。

プライマー修飾　ＲＬＵ 修飾せず　ＰＳ修飾 ＝　１５ピコモル　１１８，４１１ １ピコモル　１４ピコモル　３６４，７３３標的なし　１，２６に れら条件下、修飾したプライマーと修飾していないプライマーとの混合物は最良 に機能する。

実施例７ この実施例においては、８０テラモルのネイセリア・ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓ ｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のｒＲＮＡを、該ｒＲＮＡに相補的なプライ ７−　（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ：　１３）および２８ピコモルの該ＲＮＡ標的と同じ センスの３’　−ＲＰブロックしたプロモータープライマーと２ピコモルの該Ｒ ＮＡ標的と同じセンスのブロックしていないプロモータープライマー（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：１４）との混合物を用いて増幅した。幾つかの反応においては、ネ イセリア・ゴノロエアエのｒＲＮＡにハイブリダイズすることができＲＮアーゼ Ｈ基賞を生成することのできる３゜ブロックしたオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ：　１５）を増幅に加えた。

反応液のアリコートを、へＥ標識したプローブおよび該ｒＲＮＡ配列に相補的な ２つのヘルパープローブ（それぞれ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１６．１７および１ ８）にハイブリダイズさせた。

ＲＬＵ　−ＲＮアーゼＨ基質オリゴ　ＲＬ、Ｕ　＋ＲＮアーゼＨ基質オリゴ７、 ９１０　３２．４７３ １６．３３７　７２８．２４６ １７．３０４　８０．４８７ １２．５１８　５１．８９３ 実施例８ この実施例では、３または３０テラモルのマイコバクテリウム・チューバーキュ ローンスのｒＲＮＡを、プライｖ−（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　７）　、およびＴ ３ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含有する１４ピコモルの３°　−ＲＰブ ロックしたプロモータープライマーと１ピコモルのブロックしていないプロモー タープライ７−（ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ　：　１９）　ト１７１を合物で増幅し た。４５０単位のＭＭＬＶＲＴを用い、２００単位のＴ３ＲＮＡポリメラーゼを Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと置換し、反応を４０分後に停止させた池は実施例１と 同様にして反応を行った。

標的濃度　ＲＬＵ値 ３０テラモル　３５８．０５３ ３テラモル　７５，４４０ ０テラモル　５５３ これら結果は、逆転写酵素およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用い、ブロックした プロモータープライマーとブロックしていないプロモータープライマーとの混合 物を用いてＲＮＡを増幅することができることを示している。

実施例９ この実施例においては、ＲＰ修飾したプロモータープライマーを用いたＤＮＡ標 的の増幅を調べた。クローニングしたＨＩＶ−ＩＤＮＡ　（３テラモル）を、３ ０ピコモルの配列２ ５１−　ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡ入ＡＴ−３（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２０）を有するプライマーおよび配列・５１−　ＡＡＴＴ ？ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＧＴＣ？ ＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣｒ−３。

（ＳＥＱ　１．Ｄ　Ｎｏ：　２１）を有するプロモータープライマーとともに９ ５℃にて５分間インキュベートし、ついで室温に冷却した。酵素を添加した後、 反応液を３７℃で２時間インキュベートした。反応条件は、５０ｍＭトリス−Ｈ Ｃｌ、４０ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ８）　、１８ｍＭ　ＭｇＣ＋、、５ｍＭ　Ｄ ＴＴ、２ｍＭスペルミジン、６．２ｍＭ　ＧＴＰ、６．２ｍＭ　ＡＴＰ、２ｍＭ 　ＣＴＰ、２ｍＭＵＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ、０． ２ｍＭ　ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＣＴＰ、８００Ｕ　ＭＭＬＶ　ＲＴ、４００ １Ｊ　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであった。プロモータープライマーは、修飾しな いかまたはＲＰで３°末端を修飾した。プライマーと同じセンスのＡＥ標識プロ ーブを用いて反応液をアッセイした。示した結果は、５回行ったものの平均であ る。

ピコモル　プロモーターブライマー 修飾せず　修飾　平均ＲＬＵ ３０　０　１２７．２２３ ２６　４　４１１．６９２ ０　３０　７４３．８７７ ＤＮＡ標的、とりわけ定められた３゛末端を有しないＤＮＡ標的の増幅が、修飾 したプロモータープライマーの使用によって阻害されないことは予期しないこと であり、驚くべきことであった。

この発明の本態様はすべての観点において例示的なものと考えられるべきであっ て限定するものではなく、本発明の範囲は上記記載によるよりもむしろ添付の請 求の範囲によって示され、該請求の範囲の意味および等個物の範囲内におけるす べての変更は本発明の範囲に包含される。

配列表 配列番号・１ 配列の長さ・５５ 配列の型：核酸 鎖の数−一本鎖 トポロン−１直線状 配列： ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡ　ＣＧＡＣＴＣＡＣｒＡ　ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＧ ＣＣＧＴＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＭＧＣＴ　５５ 配列番号　２ 配列の長さ、３１ 配列の型、核酸 鎖の数　−重鎖 トポロン−・直線状 配列。

ＧＧＧＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧ　ＧＧＴＣＴＡＡＴＡＣＣ３１配列 番号、３ 配列の長さ：２４ 配列の型・核酸 鎖の数　一本鎖 トポロジー・直線状 配列： ＧＴＣＴＴＧＴＧＧＴ　ＧＧＡＡＡＧＣＧＣＴＴＴＡＧ　２４配列番号：４ 配列の長さ　２３ 配列の型・核酸 鎮の数、−末鎖 トポロジー　直線状 配列： 配列番号　５ 配列の長さ　２０ 配列の型　核酸 鎮の数　−末鎖 トポロ／−直線状 配列 ＣＧＧＴＧＴＧＧＧＡ　ＴＧＡＣＣＣＣＧＣＧ　２゜配列番号　６ 配列の長さ　４７ 配列の型　核酸 鎖の数　−末鎖 トポロノー　直線状 配列 ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡ　ＧＧαス σｒＴＣＣＧＣＴＭＣＣ４７配列番号＝７ 配列の長さ：２４ 配列の型、核酸 鎮の数・−末鎖 トポロンー：直線状 配列： 配列番号＝８ 配列の長さ：２３ 配列の型、核酸 鎖の数、−末鎖 トポロジー　直線状 配列。

ＧＧＡＧＧＡＴＡＴＧ　ＴＣＴＣＡＧＣＧＣＴ　ＡＣＣ２３配列番号　９ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数ニ一本鎖 トポロジー・直線状 配列。

ＣＧＧＣＴＧＡＧＡＧ　ＧＣＡＧＴＡＣＡＧＡ　ＡＡＧＴＧＴＣＧＴＧ　ＧＴＴ ＡＧＣＧＧ　３８配列番号　１０ 配列の長さ、３６ 配列の型　核酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー　直線状 配列・ ＧＧＧＴＭＣＣＧＧ　ＧＴＡＧＧＧＧＴＴＧ　ＴＧＴＧＴＧＣＧＧＧ　ＧＴＴＧ ＴＧ　３６配列番号・１１ 配列の長さ　２８ 配列の型　核酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー　直線状 配列。

ＡＴＭＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡ　ＧＧＡＧＡＡＡＴ　２８配列番号・ １２ 配列の長さ・５５ 配列の型　核酸 鎮の数　−末鎖 トポロノー　直線状 配列 配列番号：１３ 配列の長さ　３０ 配列の型　核酸 鎖の数・−末鎖 トポロシー：直線状 配列 配列番号、１４ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー・直線状 配列。

配列番号　１５ 配列の長さ　３２ 配列の型　核酸 饋の数・−末鎖 トポロ／−直線状 配列 配列番号　１６ 配列の長さ、１８ 配列の型・核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列。

ＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧ　ＡＴＡＴＴＧＧＣ配列番号：１７ 配列の長さ・４０ 配列の型・核酸 鎮の数ニー末鎖 トポロン−・直線状 配列 ＭＣＧＧＣＣＴＴＴ　ＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡ　ＣＡＡＡＡＧＴＣＣＴ　ＴＴＡＣ ＡＡＣＣＣＧ配列番号：１８ 配列の長さ　３６ 配列の型　核酸 鎖の数、−末鎖 トポロジー・直線状 配列 ＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡＴ　ＴＣＴｒＣＡＧＧＴＡ　ＣＣＧＴ ＣＡ配列番号　１９ 配列の長さ＝４６ 配列の型・核酸 鎖の数、−末鎖 トポロジー・直線状 配列 ・１８ＴＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ　ＧＧＧＡＧＡＣＣＡＧ　Ｇ ＣＣＡＣＴＴＣＣＧ　ＣＴＡＡＣＣ配列番号　２０ 配列の長さ　２８ 配列の型　核酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー　直線状 配列 ４０ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡ　ＧＧＡＧＡＡＡＴ　２８配列 番号　２１ 配列の長さ、５５ 配列の型　核酸 鎖の数　−末鎖 トポロン−１直線状 配列 ３６　ＡＡＴｒＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡ　Ｃ ＡＣＣＴＴＧＴＣＴ　ＴＡＴＧＴＣＣＡＧＪＡＴＧＣＴ　５５ フロントページの続き （７２）発明者　ダッタグプタ、ナニブフシャアメリカ合衆国９２１３０カリフ ォルニア、サン・ディエゴ、カーウッド・コート４２２１番（７２）発明者　マ カリスター、ダイアン°エルアメリカ合衆国９２１２３カリフォルニア、サン・ ディエゴ、アシロール・アベニュー８６６４番 （７２）発明者　ハモンド、フィリップ・ダブリューアメリカ合衆国９２１１６ カリフオルニア、サン・デイエゴ、ノース・アベニュー４６２０番（７２）発明 者　ライダー、トマス・ビーアメリカ合衆国９２０２９カリフオルニア、ニスコ ンデイド、アシジェレス・グレン１８６３番

Claims (53)

【特許請求の範囲】
1. １．標的核酸配列の複数の相同なまたは相補的なコピーの製造法であって、該標 的核酸配列を含む試料； 該標的核酸配列の３′末端またはその近傍に（イブリダイズすることのできる配 列を含む第一のプライマーまたは第一のプロモーター−プライマーを含む第一の オリゴヌクレオチド； 該標的核酸配列の相補体の３′末端またはその近傍にハイブリダイズすることの できる配列を含む第二のプライマーまたは第二のプロモーター−プライマーを含 む第二のオリゴヌクレオチド； その際、該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドのうち 少なくとも一つはプロモーター−プライマーを含む、別の一つが該標的核酸また はその相補体の同じ鎖にハイブリダイズすることのできる修飾したオリゴヌクレ オチドまたは修飾したオリゴヌクレオチドと修飾していないオリゴヌクレオチド との混合物を含み；該修飾したオリゴヌクレオチドは、修飾していないオリゴヌ クレオチドに比べてポリメラーゼによる該オリゴヌクレオチドの伸長を減少また はブロックすべく修飾したものである；１または２以上のＤＮＡおよび／または ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；および 該第一のプロモーター−プライマーまたは第二のプロモーター−プライマーの一 方または両方内のプロモーターを認識することのできるＲＮＡポリメラーゼから 本質的になる混合物を、第一のオリゴヌクレオチド／標的配列複合体が生成され ＤＮＡおよびＲＮＡ合成が起こる条件下でインキュベートすることを特徴とする 方法。
2. ２．該標的がＲＮＡである請求項１に記載の方法。
3. ３．該標的がＤＮＡであり、該第一のプライマーが、該標的を含む核酸の３′末 端から離れた位置で該標的にハイブリダイズする請求項１に記載の方法。
4. ４．該インキュベーションをＲＮアーゼＨ活性の存在下で行う請求項１に記載の 方法。
5. ５．該ＲＮアーゼＨ活性が外来ＲＮアーゼＨによって供給される請求項２に記載 の方法。
6. ６．該外来ＲＮアーゼＨが大腸菌からのものである請求項５に記載の方法。
7. ７．該修飾したオリゴヌクレオチドと修飾していないオリゴヌクレオチドとの混 合物が、３′末端において異なる修飾を有するオリゴヌクレオチドの混合物であ る請求項１に記載の方法。
8. ８．該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドがともにプ ロモーター−プライマーを含む請求項１に記載の方法。
9. ９．該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドが、それぞ れ修飾したオリゴヌクレオチドと修飾していないオリゴヌクレオチドとの混合物 から本質的になる請求項１または８に記載の方法。
10. １０．修飾したオリゴヌクレオチドと修飾していないオリゴヌクレオチドとの該 混合物が、１または２以上のアルカンジオール修飾、または３′デオキシヌクレ オチド残基、１または２以上のリボヌクレオチド、非ホスホジエステル結合を有 するヌクレオチド、非ヌクレオチド修飾、該標的に相補的でない１または２以上 の塩基、またはジデオキシヌクレオチドの付加を含む修飾を有する、請求項１に 記載の方法。
11. １１．修飾したオリゴヌクレオチドと修飾していないオリゴヌクレオチドとの該 混合物が、１または２以上のアルカンジオール修飾、またはコルジセピン、リボ ヌクレオチド、モノチオリン酸ヌクレオチド、非ヌクレオチド修飾、またはジデ オキシヌクレオチドの付加を含む修飾を有する請求項１０に記載の方法。
12. １２．逆転写酵素が該ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび該ＲＮＡ依存性Ｄ ＮＡポリメラーゼを含む請求項１に記載の方法。
13. １３．該逆転写酸素がさらにＲＮアーゼＨ活性を有する請求項１２に記載の方法 。
14. １４．該逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素またはＡＭＶ逆転写酸素である請求項 １２または１３に記載の方法。
15. １５．該ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６の ＲＮＡポリメラーゼよりなる群から選ばれたものである請求項１に記載の方法。
16. １６．該標的核酸配列の存在を示すためのアッセイをさらに包含する請求項１に 記載の方法。
17. １７．該方法を、１または２以上のヘルパーオリゴヌクレオチドの存在下で行う 請求項１または１６に記載の方法。
18. １８．該インキュベーションを、ＤＭＳＯ、ジメチルホルムアミド、エチレング リコール、グリセリンおよび亜鉛の１または２以上の存在下で行う請求項１に記 載の方法。
19. １９．該方法を本質的に一定温度にて行う請求項１に記載の方法。
20. ２０．該修飾したオリゴヌクレオチドと該修飾していないオリゴヌクレオチドと が１：１〜１０００：１の比で存在する請求項１に記載の方法。
21. ２１．本質的に請求項１に記載の工程からなる請求項１に記載の方法。
22. ２２．ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ が提供される請求項２に記載の方法。
23. ２３．増幅すべきＲＮＡ標的の５′末端を定めるため、該標的の５′末端にハイ ブリダイズすることのできる配列を含む第三のオリゴヌクレオチドが提供される 、請求項１に記載の方法。
24. ２４．標的核酸配列を含む試料、反対のセンスの第一のオリゴヌクレオチドおよ び第二のオリゴヌクレオチド、該第一のオリゴヌクレオチドまたは該第二のオリ ゴヌクレオチドの一方は該標的核酸配列の３′末端またはその近傍にハイブリダ イズすることができ、該第一のオリゴヌクレオチドまたは該第二のオリゴヌクレ オチドの他方は該標的核酸配列に相補的な核酸配列の３′末端またはその近傍に ハイブリダイズすることができ、その際、該第一のオリゴヌクレオチドまたは該 第二のオリゴヌクレオチドのうち一方は第一のプロモーター−プライマーを含み 、木質的に修飾した成員および修飾していない成員の両方を有する単一の核酸配 列からなり、その際、該修飾したオリゴヌクレオチドは、修飾していないオリゴ ヌクレオチドに比べてポリメラーゼによる該オリゴヌクレオチドの伸長を減少す るように修飾されており；該第一のオリゴヌクレオチドまたは該第二のオリゴヌ クレオチドの他方はプライマーまたは第二のプロモーター−プライマーを含む、 １または２以上のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮＡ依存性 ＤＮＡポリメラーゼ、および 該第一のプロモーター−プライマーまたは該第二のプロモーター−プライマーの 一方または両方内のプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼから本質的にな ることを特徴とする組成物。
25. ２５．該標的がＲＮＡである請求項２４に記載の組成物。
26. ２６．該標的がＤＮＡであり、該第一のオリゴヌクレオチドが、該標的を含む核 酸の３′末端から離れた位置で該標的にハイブリダイズする請求項２４に記載の 組成物。
27. ２７．該組成物がＲＮアーゼＨ活性をさらに含む請求項２４に記載の組成物。
28. ２８．該ＲＮアーゼＨ活性が大腸菌からの外来ＲＮアーゼＨによって供給される 請求項２７に記載の組成物。
29. ２９．逆転写酵素が、該ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび該ＲＮＡ依存性 ＤＮＡポリメラーゼの両方を含む請求項２４または２７に記載の組成物。
30. ３０．該逆転写酵素が該ＲＮアーゼＨ活性をさらに含む請求項２９に記載の組成 物。
31. ３１．該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドの両者が 、それぞれ該ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターを有するプロ モーター−プライマーを含む、請求項２４に記載の組成物。
32. ３２．ＤＭＳＯ、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、亜鉛およびグリ セリンの１または２以上をさらに含む請求項２４に記載の組成物。
33. ３３．該混合物が増幅を本質的に一定温度にて行うことを可能にする請求項２４ に記載の組成物。
34. ３４．１または２以上のヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項２４に 記載の組成物。
35. ３５．以下の成分を含むキット： 反対のセンスの第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド、該 第一のオリゴヌクレオチドまたは該第二のオリゴヌクレオチドの一方は標的核酸 配列の３′末端またはその近傍にて複合体を形成することができ、該第一のオリ ゴヌクレオチドまたは該第二のオリゴヌクレオチドの他方は該標的核酸配列に相 補的な核酸配列の３′末端またはその近傍にて複合体を形成することができ、そ の際、該第一のオリゴヌクレオチドまたは該第二のオリゴヌクレオチドのうち一 方は第一のプロモーター−プライマーを含み、修飾した成員および修飾していな い成員の両方または異なって修飾した成員の混合物を有する単一の核酸配列から 本質的になり、該第一のオリゴヌクレオチドまたは該第二のオリゴヌクレオチド の他方はプライマーまたは第二のプロモーター−プライマーを含み、その際、該 修飾した成員は、修飾していないオリゴヌクレオチドに比べてポリメラーゼによ る該オリゴヌクレオチドの伸長を減少するように修飾されている；１または２以 上のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ ラーゼ、および 該第一のプロモーター−プライマーまたは該第二のプロモーター−プライマーの 一方または両方内のプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ。
36. ３６．外来のＲＮアーゼＨをさらに含む請求項３５に記載のキット。
37. ３７．１または２以上のヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項３５に 記載のキット。
38. ３８．該標的リボ核酸またはその相補体の存在を示すことのできる１または２以 上のプローブをさらに含む請求項３５に記載のキット。
39. ３９．それぞれ 【配列があります】， 【配列があります】， 【配列があります】，および 【配列があります】 （式中、ｘは何もないかまたは酵素によって認識される配列である）よりなる群 がら選ばれた単一の核酸配列から本質的になる２つのオリゴヌクレオチドを含有 するキット。
40. ４０．本質的に単一の核酸配列からなり、【配列があります】， 【配列があります】， 【配列があります】，および 【配列があります】 （式中、ｘは何もないかまたは酵素によって認識される配列である）よりなる群 がら選ばれたオリゴヌクレオチド、または該単一の核酸配列のいずれか１に相補 的なオリゴヌクレオチド。
41. ４１．本質的に以下の配列からなるオリゴヌクレオチドを含有するキット：【配 列があります】， 【配列があります】，および 【配列があります】 （式中、Ｘは何もないかまたは酵素によって認識される配列である）。
42. ４２．本質的に以下の配列からなるオリゴヌクレオチドを含有するキット：【配 列があります】， 【配列があります】，および 【配列があります】 （式中、ｘは何もないかまたは酵素によって認識される配列である）。
43. ４３．試料中のマイコバクテリウム核酸の増幅方法であって、該核酸を【配列が あります】， 【配列があります】， 【配列があります】，および 【配列があります】 （式中、ｘは何もないかまたは酵素によって認識される配列である）よりなる群 がら選ばれた本質的に単一の核酸配列からなる１または２以上のオリゴヌクレオ チドで増幅することを特徴とする方法。
44. ４４．試料中のマィコバクテリウム・チューバーキュローシス核酸を検出する方 法であって、該試料に由来する核酸を【配列があります】および 【配列があります】 よりなる群から選ばれた本質的に単一の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドと ハイブリダイズさせることを特徴とする方法。
45. ４５．試料中のマイコバクテリウム・チューバーキュローシス核酸を検出する方 法であって、該核酸を本質的に配列 【配列があります】，および 【配列があります】 からなる１または２以上のオリゴヌクレオチドポリマーで増幅させ、増幅した核 酸を本質的に配列 【配列があります】 （式中、ｘは何もないかまたは酵素によって認識される配列である）からなるヌ クレオチドポリマーで検出することを特徴とする方法。
46. ４６．試料中のマイコバクテリウム・チューバーキュローシス核酸を検出する方 法であって、該核酸を本質的に配列 【配列があります】および 【配列があります】 からなる１または２以上のオリゴヌクレオチドポリマーで増幅させ、増幅した核 酸を本質的に配列 【配列があります】 （式中、ｘは何ないかまたは酵素によって認識される配列である）からなるヌク レオチドポリマーで検出することを特徴とする方法。
47. ４７．該酵素がＲＮＡポリメラーゼである請求項４３、４５または４６に記載の 方法。
48. ４８．該配列の１または２以上が修飾された３′末端を有する請求項４１または ４２に記載のキット。
49. ４９．該配列の１または２以上を含む修飾した成員および修飾していない成員を 含む混合物を含む請求項４１または４２に記載のキット。
50. ５０．該配列または該配列に相補的なオリゴヌクレオチドが、その３′末端に修 飾を有する請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
51. ５１．該配列を含む修飾した成員と修飾していない成員または異なって修飾した 成員の混合物、またはそれに相補的な該オリゴヌクレオチドを含む請求項４０に 記載のオリゴヌクレオチド。
52. ５２．該配列の１または２以上が修飾した３′末端を有する請求項４３、４５ま たは４６に記載の方法。
53. ５３．該配列の１または２以上を含む修飾した成員および修飾していない成員を 含む混合物を含む請求項４３、４５または４６に記載の方法。