ES2277679T3 - Deteccion de tuberculosis microbacteriana mediante amplificacion de secuencias de acido nucleico. - Google Patents
Deteccion de tuberculosis microbacteriana mediante amplificacion de secuencias de acido nucleico. Download PDFInfo
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Abstract
La invención se refiere a conjuntos, oligonucleótidos y un procedimiento para amplificar el rARN de M. tuberculosis.
Description
Detección de tuberculosis microbacteriana
mediante amplificación de secuencias de ácido nucleico.
Esta invención se refiere a métodos para
incrementar el número de copias de una secuencia de ácido nucleico
específica o "secuencia objetivo" de rRNA de M.
tuberculosis que puede estar presente tanto sola como en forma
de un componente, grande o pequeño, de una mezcla homogénea o
heterogénea de ácidos nucleicos. La mezcla de ácidos nucleicos
puede ser la que se encuentra en una muestra tomada para valorar un
diagnóstico, una valoración medioambiental, para estudios de
investigación, para la preparación de reactivos o materiales, para
otros procedimientos tales como la clonación, o para otros
objetivos.
La amplificación selectiva de secuencias
específicas de ácidos nucleicos es de utilidad para incrementar la
sensibilidad de ensayos de diagnóstico y medioambientales a la vez
que mantener la especificidad; para incrementar la sensibilidad,
comodidad, precisión y fiabilidad de una variedad de procedimientos
de investigación; y para proporcionar abundantes fuentes de
oligonucleótidos específicos para diferentes objetivos.
La presente invención es particularmente
adecuada para la aplicación a ensayos de diagnóstico debido a la
comodidad con la que puede ser llevada a la práctica.
La detección y/o cuantificación de secuencias
específicas de ácidos nucleicos es una técnica de creciente
importancia para la identificación y clasificación de
microorganismos, el diagnóstico de enfermedades infecciosas, la
detección y caracterización de anormalidades genéticas, la
identificación de cambios genéticos asociados con el cáncer, el
estudio de la susceptibilidad genética a la enfermedad, y la
medición de la respuesta a varios tipos de tratamiento. También se
han encontrado nuevos usos de dichos procedimientos en la detección
y cuantificación de microorganismos en comestibles, muestras
medioambientales, reservas de semillas y otros tipos de material en
donde la presencia de microorganismos específicos puede precisar ser
monitorizada. Se han encontrado otras aplicaciones en las ciencias
forenses, la antropología, arqueología, y la biología donde se ha
utilizado la medición de la relacionabilidad de las secuencias de
ácidos nucleicos para identificar sospechosos criminales, resolver
disputas de paternidad, construir árboles genealógicos y
filogenéticos, y ayudar en la clasificación de una variedad de
formas de vida.
Un método común para la detección y
cuantificación de las secuencias específicas de ácidos nucleicos es
la hibridación de ácido nucleico. Este método está basado en la
capacidad de dos hebras de ácido nucleico que contienen secuencias
complementarias o esencialmente complementarias para asociarse
específicamente, bajo condiciones apropiadas, para formar una
estructura de doble hebra. Para detectar y/o cuantificar una
secuencia específica de ácido nucleico (conocida como la
"secuencia objetivo"), se preparó un oligonucleótido marcado
(conocido como una "sonda") que contiene secuencias
complementarias a las de la secuencia objetivo. La sonda es
mezclada con una muestra sospechosa de contener la secuencia
objetivo, y se crean condiciones adecuadas para la formación
híbrida. La sonda hibrida a la secuencia objetivo si está presente
en la muestra. Los híbridos de la sonda objetivo son separados a
continuación de la sonda de hebra única en una manera seleccionada
entre una variedad de diferentes modos. A continuación se mide la
cantidad de sonda asociada con los híbridos como una indicación de
la cantidad de secuencia objetivo en la muestra.
La sensibilidad de los ensayos de hibridación de
ácido nucleico está limitada ante todo por la actividad específica
de la sonda, la velocidad y extensión de la reacción de hibridación,
la realización del método para la separación de sonda hibridada y
no hibridada, y la sensibilidad con la que puede detectarse el
marcado. Los procedimientos más sensibles pueden carecer de muchos
de los rasgos requeridos para los ensayos clínicos y medio
ambientales de rutina tales como velocidad, comodidad, y economía.
Además, sus sensibilidades pueden no ser suficientes para muchas
aplicaciones deseadas.
Como resultado de las interacciones entre los
diferentes componentes y etapas de componentes de este tipo de
ensayo, casi siempre hay una relación inversa entre la sensibilidad
y la especificidad. De este modo, los pasos realizados para
incrementar la sensibilidad del ensayo (tales como incrementar la
actividad específica de la sonda) pueden dar lugar a un porcentaje
mayor de los resultados del ensayo de falso positivo. El vínculo
entre sensibilidad y especificidad ha sido una barrera significativa
para mejorar la sensibilidad de los ensayos de hibridación. Una
solución a este problema sería incrementar de forma específica la
cantidad de secuencia objetivo presente utilizando un procedimiento
de amplificación. La amplificación de una porción única de la
secuencia objetivo sin amplificación de una parte significativa de
la información codificada en las restantes secuencias de la muestra
podría dar un incremento en la sensibilidad mientras que al mismo
tiempo no comprometería la especificidad.
Se ha descrito un método para la amplificación
específica de las secuencias de ácido nucleico llamado "reacción
de la cadena de polimerasa" o "PCR" por Mullis y col., (Ver
patentes U.S. 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159 y las solicitudes de
patentes europeas 86302298.4, 86302299.2 y 87300203.4 y Methods
in Enzymology, Volumen 155, 1987, págs.
335-350). El procedimiento utiliza ciclos repetidos
de prímero dependiente de la síntesis de ácido nucleico que se
produce de forma simultánea utilizando cada hebra de una secuencia
complementaria como molde. La secuencia que es amplificada es
definida por las localizaciones de las moléculas de prímero que
inician la síntesis. Los prímeros son complementarios del terminal
3' de la secuencia objetivo o su complemento y debe acomplejarse
con dichos sitios con el fin de que se inicie la síntesis de ácidos
nucleicos. Después de la extensión de la síntesis de productos, se
separan las hebras, generalmente por desnaturalización térmica,
antes de la siguiente etapa de síntesis. En el procedimiento de la
PCR, se sintetizan copias de ambas hebras de una secuencia
complementaria.
La etapa de separación de hebras utilizada en la
PCR para separar las hebras recién sintetizadas en la finalización
de cada ciclo de la reacción de la PCR es a menudo la
desnaturalización térmica. Como resultado, se requiere la adición
tanto una enzima termoestable como de una nueva enzima entre las
etapas de desnaturalización térmica y la iniciación del siguiente
ciclo de la síntesis del DNA. El requerimiento de ciclos repetidos
de temperatura de reacción entre varias temperaturas diferentes y
extremas es una desventaja del procedimiento de la PCR. Con el fin
de hacer la PCR más cómoda, se requieren instrumentos de ciclos
térmicos programables.
El procedimiento de la PCR se ha acoplado a la
transcripción del RNA por incorporación de una secuencia de
promotor en uno de los prímeros utilizados en la reacción de la PCR
y a continuación, después de la amplificación por el procedimiento
de la PCR para varios ciclos, utilizando el DNA de doble hebra como
molde para la transcripción del RNA de simple hebra. (Ver, por ej.,
Murakawa y col., DNA 7: 287-295 (1988)).
Otros métodos para la amplificación de una
secuencia específica de ácido nucleico comprenden una serie de
etapas de hibridación, extensión y desnaturalización de prímero para
proporcionar un intermedio de molécula de DNA de doble hebra
conteniendo una secuencia de promotor mediante el uso de una
secuencia de promotor conteniendo prímero. Se utilizó el DNA de
doble hebra para producir copias de RNA múltiples de la secuencia
objetivo. Las copias de RNA resultantes pueden ser utilizadas como
secuencias objetivo para producir copias adicionales, y pueden
llevarse a cabo ciclos múltiples. (algunas veces llamado "sistema
de amplificación de" o TAS; ver, por ej., Burg y col., WO
89/1050; Gingeras, y col., WO 88/10315; solicitud de patente europea
No. 89313154.0 publicada bajo el número 0373960 (Gingeras y col.,);
solicitud de patente europea No. 88113948.9 publicada bajo el no.
0329822 (Davey y Malek); Malek y col., WO 91/02818 y solicitud de
patente europea No. 90307503.4 publicada bajo el No. 0408295
(Kacian y Fultz), también discutida a continuación).
Walker y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:
392-396 (Enero 1992) describen un método de
amplificación dirigido a oligonucleótidos para uso con molde de
DNA, utilizando una endonucleasa de restricción para producir las
secuencias objetivo iniciales y una enzima para cortar el complejo
DNA/DNA con el fin de permitir una reacción de extensión y por
consiguiente la amplificación. La solicitud de patente europea No.
88306717.5, publicada bajo el No. 0300796 (Becker y col.) describe
un método de amplificación en el que se hibrida un prímero a la
secuencia objetivo y el duplicado resultante es roto antes de la
reacción de extensión y la amplificación; en el caso en que el
prímero se extienda más allá de la región de hibridación, requiere
la rotura antes de la extensión y el prímero debe ser bloqueado en
su terminal 3' para prevenir que se produzca cualquier reacción de
extensión no deseada antes de la amplificación. Urdea, WO 91/10746,
describe un método de amplificación de señal que incorpora una
secuencia de promotor
T7.
T7.
Otros métodos de amplificación de ácido nucleico
incluyen la reacción de la cadena de ligasa (LCR), descrita en la
solicitud de patente europea No. 320308, en la que se utilizan al
menos cuatro oligosondas separadas; dos de las oligosondas hibridan
a terminales opuestos de la misma hebra objetivo en una orientación
apropiada de modo que las tercera y cuarta oligosondas puedan
hibridar con la primera y segunda oligosonda para formar, mediante
unión, sondas conectadas que pueden ser desnaturalizadas y
detectadas. Otro método es el que se ha descrito en la patente
EP-A 0427073 publicada el 15 de Mayo de 1991, en la
que una sonda palindrómica capaz de formar una horquilla y teniendo
una región de promotor funcional en la horquilla es hibridada a una
secuencia objetivo, ligada a continuación a otro oligonucleótido
hibridado a la secuencia objetivo de modo que pueda hacerse dicho
transcrito de RNA
específico.
específico.
Pueden hacerse cantidades relativamente grandes
de ciertos RNAs utilizando una molécula de RNA recombinante de
hebra única que tenga una secuencia de reconocimiento para la unión
de una polimerasa dirigida al RNA, preferiblemente replicasa
Q\beta. (Ver, por ej., la patente U.S. No. 4.786.600 de
Kramer y col.). Se requieren un número de etapas para insertar la
secuencia específica en una copia de DNA de la molécula variante,
clonarla en un vector de expresión, transcribirla en el RNA y a
continuación replicarla con la replicasa Q\beta.
Tal como se utiliza en la presente invención,
los siguientes términos tienen los siguientes significados a no ser
que expresamente se indique lo contrario.
"Ácido nucleico" significa tanto RNA como
DNA, junto con cualquier análogo de nucleótido u otras moléculas
que pueden estar presentes en la secuencia y que no impiden la
realización de la presente invención.
Un "molde" es una molécula de ácido
nucleico que es capaz de ser copiada por una polimerasa de ácido
nucleico. Un molde puede ser tanto RNA o DNA, y puede ser
cualquiera entre hebra única, doble hebra o parcialmente doble
hebra, dependiendo de la polimerasa. La copia sintetizada es
complementaria al molde. En esta invención, el término copias
también incluye el ácido nucleico que tiene la secuencia de RNA o de
DNA equivalente al molde, al que se refiere comúnmente como
secuencias homólogas en el estado de la técnica.
Un "prímero" es un oligonucleótido que es
complementario a un molde que hibrida con el molde para dar un
complejo prímero/molde para la iniciación de la síntesis por una
polimerasa de DNA, tal como una transcriptasa reversa, y que es
extendida por la adición de bases unidas de forma covalente a sus
terminales 3' y que son complementarias al molde. El resultado es
un producto de extensión del prímero. Virtualmente todas las
polimerasas de DNA (incluyendo las transcriptasas reversas) que son
conocidas requieren formar el complejo de un oligonicleótido a un
molde de hebra única ("formación de prímero") para iniciar la
síntesis de DNA. Bajo circunstancias apropiadas, un prímero puede
ser una parte de un prímero promotor. Dichos prímeros tienen
generalmente una longitud de entre 10 y 100 bases, preferiblemente
una longitud de entre 20 y 50 bases.
Un "promotor" o "secuencia de
promotor" es una secuencia específica de ácido nucleico que es
reconocida por una polimerasa de RNA dependiente de DNA
("transcriptasa") como una señal para unirse a una molécula de
ácido nucleico e iniciar la transcripción del RNA a un sitio
específico. Para la unión, dichas transcriptasas requieren
generalmente que el promotor y su complemento sean de doble hebra;
la porción de molde no precisa ser de doble hebra. Las polimerasas
de RNA dependiente del DNA individual reconocen una variedad de
diferentes secuencias de promotor que pueden variar de forma
marcada en su eficiencia de favorecer la transcripción. Cuando una
polimerasa de RNA se une a una secuencia de promotor para iniciar la
transcripción, dicha secuencia de promotor no es parte de la
secuencia transcrita. Así, las trascripciones de RNA producidas de
ese modo no incluirán la secuencia de
promotor.
promotor.
Un promotor-prímero comprende un
promotor y un prímero. Es un oligonucleótido que es suficientemente
complementario a la terminación 3' de una secuencia de ácido
nucleico objetivo para formar un complejo a o cerca de la
terminación 3' de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo, lo
que significa que el promotor-prímero compleja
suficientemente cerca de la terminación de la secuencia objetivo
para permitir la amplificación de suficiente de la secuencia
objetivo de modo que se cumplan los requerimientos del ensayo, la
valoración, la clonación u otro uso para el ácido nucleico
amplificado. Se utiliza el promotor-prímero como un
molde para crear una secuencia de ácido nucleico complementaria que
se extiende desde el terminal 3' (también conocido como el término
3') de una secuencia de ácido nucleico objetivo, para dar lugar
generalmente a un promotor de doble hebra, sometido a cualquier
actividad desnaturalizante o enzimática que pueda interrumpir la
doble hebra. Dichos promotor-prímeros tienen
generalmente una longitud de entre 40 y 100 bases preferiblemente
entre 40 y 60 bases.
Una polimerasa de DNA dependiente de DNA- o de
RNA- también crea una hebra complementaria a la molécula de ácido
nucleico objetivo, utilizando la secuencia objetivo como molde.
La terminación 3' del prímero o del
promotor-prímero puede ser modificada, o bloqueada,
de modo que prevenga o reduzca la velocidad y/o extensión de una
reacción de extensión que tenga tanto miembros modificados como no
modificados que consista de esencialmente la misma secuencia de
ácido nucleico para los objetivos de la presente invención. En
otras palabras, el prímero modificado o el
promotor-prímero no contiene una secuencia de
formar complejos diferente (prímero) de modo que tanto el
oligonuclótido modificado como el no modificado se hibridan en
efectivamente la misma posición (más o menos aproximadamente diez
bases) de la secuencia de ácido nucleico objetivo. También, el
promotor-prímero no contiene una secuencia de
reconocimiento diferente (promotor) a partir del
promotor-prímero no modificado. Esto significa que,
dentro de aproximadamente 10 bases, los prímeros modificados y no
modificados o los promotor-prímeros son los mismos,
son reconocidos por la misma polimerasa de RNA, y se hibridan a más
o menos la misma secuencia objetivo (aunque no necesariamente a
precisamente la misma posición). En una realización preferida, los
prímeros modificados y no modificados o los
promotor-prímeros son idénticos excepto para la
modificación.
La terminación 3' de la parte complementaria
objetivo de un prímero o promotor-prímero puede ser
modificada de una variedad de modos bien conocidos por los expertos
en la materia. Las modificaciones apropiadas para un
promotor-prímero pueden incluir la adición de
ribonucleótidos, residuos de 3' deoxinucleótidos, (por ej.,
cordicepina (CO, Glen Research)), residuos de 3',
2'-dideoxinecleótidos, nucleótidos modificados con
uniones de esqueletos de nofosfodiésteres (tales como
fosforotioatos), y uniones no nucleótidas tales como las descritas
en Arnold y col., WO 89/02439 (RS) o modificaciones
alcano-diol (Wilk y col., Nuc. Acids Res. 18:2065,
1990) (RP), o la modificación puede simplemente consistir en uno o
más residuos de nucleótidos 3' para la secuencia de hibridación que
no sea complementaria al ácido nucleico objetivo. Naturalmente,
también son posibles otras modificaciones efectivas.
Puede utilizarse una mezcla de oligonucleótidos
modificados y no modificados en una reacción de amplificación, y
pueden utilizarse una amplio margen de relaciones de
oligonucleótidos modificados a no modificados (por ej., entre
1:1 y 1.000:1). También puede utilizarse una mezcla de
oligonuclótidos con diferentes modificaciones 3'.
Las discusiones de la síntesis de ácido
nucleicos son ampliamente simplificadas y clarificadas mediante la
adopción de términos para nombrar las dos hebras complementarias de
un duplicado de ácido nucleico. Tradicionalmente, la hebra que
codifica las secuencias utilizada para producir proteínas o RNAs
estructurales se designó como la hebra "positiva" y su
complementaria como la hebra "negativa". Ahora se conoce que en
muchos casos, ambas hebras son funcionales, y la asignación de la
designación "positiva" a una y "negativa" a la otra
debería ser entonces arbitraria. Sin embargo, los términos son muy
útiles para la designación de la orientación de la secuencia de los
ácidos nucleicos y se utilizarán en la presente memoria para dicho
objetivo, con la denominación de hebra "positiva" para la
hebra de la secuencia objetivo original que está complejada con el
primer prímero o promotor-prímero.
Una "secuencia de ácido nucleico objetivo",
o "secuencia objetivo", tiene una secuencia de ácido nucleico
deseada para ser amplificada, y puede ser tanto de hebra simple como
de doble hebra y puede incluir otras secuencias 5' o 3' de las
secuencias a ser amplificadas que pueden ser o no ser
amplificadas.
La secuencia de ácido nucleico objetivo incluye
las secuencias que forman complejos a los que se hibrida el
promotor-prímero durante la realización de la
presente invención. Cuando la secuencia de ácido nucleico objetivo
es originalmente de hebra simple, el término hace referencia tanto a
la hebra (+) como a la (-), y también se referirá a la secuencia
complementaria a la de la secuencia objetivo. Cuando la secuencia de
ácido nucleico objetivo es originalmente de doble hebra, el término
hace referencia tanto a las hebras (+) como a las (-).
Una "polimerasa de DNA dependiente de DNA"
es una enzima que sintetiza una copia de DNA complementaria a partir
de un molde de DNA. Un ejemplo es la polimerasa de DNA del
bacteriofago T7. Todas las polimerasas de DNA dependientes de DNA
requieren un prímero complementario, que puede ser RNA o DNA, o un
copolímero, para iniciar la síntesis. Se conoce que bajo
condiciones adecuadas ciertas polimerasas de DNA dependientes de DNA
pueden sintetizar una copia de DNA complementario a partir de un
molde de RNA.
Una "polimerasa de RNA dependiente de DNA"
o "transcriptasa" es una enzima que sintetiza múltiples copias
de RNA a partir de una molécula de DNA parcialmente de doble hebra o
de doble hebra que tenga una secuencia de promotor (normalmente de
doble hebra). Debe hacerse notar que la presente invención incluye
secuencias de promotor de única hebra en el
promotor-prímero, junto con las polimerasas de RNA
que lo reconocen. Las moléculas de RNA ("transcritos" son
sintetizadas en la dirección 5' \rightarrow 3' de la molécula de
RNA, empezando en una posición específica justo corriente abajo del
promotor. Ejemplos de transcriptasas son las polimerasas de RNA
dependientes de DNA a partir de los bacteriofagos T7, T3, y SP6.
Una "polimerasa de DNA dependiente de RNA"
o "transcriptasa reversa" es una enzima que sintetiza una copia
de DNA complementario a partir de un molde de RNA. Todas las
transcriptasas reversas conocidas también tienen la habilidad de
hacer una copia de DNA complementaria a partir de un molde de DNA;
de este modo, son tanto polimerasas de DNA dependientes de RNA como
de DNA. Se requiere un prímero para iniciar la síntesis junto con
los moldes de RNA o de DNA.
Una "H RNAsa" es un enzima que degrada la
parte de RNA de un duplicado RNA:DNA. Las H RNA'sas pueden ser
endonucleasas o exonucleasas. Las transcriptasas reversas de los
virus de mieloblastosis aviar y de leucemia murina Moloney
contienen una actividad de la H RNAsa además de su actividad
polimerasa. Algunas transcriptasas reversas clonadas de este modo
carecen de actividad de la RNAsa. También hay fuentes de H RNAsa
asequibles sin una actividad polimerasa asociada. La degradación
puede resultar en la separación del RNA de un complejo de RNA:DNA.
De forma alternativa, l H RNAasa puede simplemente cortar el RNA a
diferentes localizaciones de modo que dichas porciones del RNA
dejen o permitan a las enzimas desenrollar partes del RNA o los
fragmentos de RNA generados puedan servir como prímeros para la
extensión por una polimerasa.
Los términos "hibridar" y "complejo"
hacen referencia a la formación de duplicados entre las secuencias
de nucleótidos que son suficientemente complementarias para formar
duplicados (o "complejos") por medio del apareamiento de bases
de Watson-Crick. Cuando un
promotor-prímero o prímero se "hibrida" con un
objetivo (molde), dichos complejos (o híbridos) son suficientemente
estables para servir la función de prímero requerida papa que una
polimerasa de DNA inicie la síntesis de DNA.
La especificidad es una característica de una
secuencia de ácido nucleico que describe su capacidad para
distinguir entre secuencias objetivo y no- objetivo, dependientes
de la secuencia y de las condiciones de ensayo.
La presente invención proporciona un kit que
contiene un primer oligonucleótido que consiste en la secuencia
xGCCGTCACCCCACCAACAAGCT (SEC ID No. 22), y un segundo
oligonucleótido que consiste en la secuencia
xGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC (SEC ID No. 2) en donde x es nada
o es una secuencia reconocida por una polimerasa de RNA. Dicho kit
puede ser utilizado para llevar a cabo un método
auto-catalítico de síntesis de copias múltiples de
la secuencia del ácido nucleico rRNA del M. tuberculosis
objetivo (es decir, el método cicla automáticamente sin la necesidad
de modificar las condiciones de reacción tales como la temperatura,
el pH, o la fuerza iónica).
Dichas características del método tratando una
secuencia objetivo con un primer ologonucleótido (que tiene una
secuencia de formación de complejos suficientemente complementaria a
una parte 3' de la secuencia objetivo para hibridar con ella (esta
sola es llamada un prímero), y que tiene una secuencia 5' para la
secuencia de formación de complejo que incluye una secuencia que,
en forma de doble hebra, actúa como un promotor para una polimerasa
de RNA (esta reordenación es llamada un
promotor-prímero)), y un segundo oligonucleótido
(que es un prímero o promotor-prímero que tiene una
secuencia de formación de complejos suficientemente complementaria
al complemento de la secuencia objetiva para hibridar con ella),
bajo condiciones en las que puede formarse un complejo de la
secuencia oligonucleótido/objetivo y puede producirse la síntesis de
DNA y de RNA. En una realización, uno o ambos de los primero y
segundo oligonucleótidos es una mezcla de una secuencia de
oligonucleótidos bloqueados y no bloqueados (los oligonucleótidos
bloqueados tienen una terminación 3' modificada para prevenir o
reducir la proporción y/o la extensión de la extensión de prímero
por una polimerasa de DNA), o una mezcla de oligonucleótidos con
diferentes modificaciones 3'. Dicha mezcla incrementa de forma
significativa la eficiencia de la reacción de amplificación
específica en comparación con el uso de oligonucleótidos sólo
bloqueados o sólo no bloqueados. La relación de dichos
oligonucleótidos puede variar dependiendo de la secuencia del molde
específica a amplificar, pero generalmente está comprendida entre
1:1 y 1000:1 de bloqueada a no bloqueada. No hay ningún
requerimiento para que la secuencia objetivo tenga terminaciones 3'
o 5' definidas.
Más específicamente, un método de amplificación
tal como el descrito anteriormente puede incluir (a) el tratamiento
de una secuencia objetivo con un primer oligonucleótido de
promotor-prímero que tiene una secuencia de
formación de complejos suficientemente complementaria a una
terminación 3' de la secuencia objetivo para hibridar con ella, y
que tiene una secuencia 5' a la secuencia de formación de complejos
que incluye una secuencia que, en forma de doble hebra, actúa como
un promotor para una polimerasa de RNA, bajo condiciones en las que
puede formarse un complejo de la secuencia oligonucleótido/objetivo
y puede iniciarse la síntesis de DNA mediante una polimerasa
apropiada (por ej., una polimerasa de DNA), (b) incubando el primer
complejo oligonucleótido/objetivo bajo condiciones de reacción de
extensión de modo que la terminación 3' del objetivo pueda ser
extendida para producir un molde híbrido para una polimerasa de
RNA; y (c) incubando el molde de híbrido bajo condiciones en las
que pueden producirse las copias de RNA múltiples de la secuencia
objetivo utilizando una polimerasa de RNA que reconozca la
secuencia de promotor. La invención también incluye la generación de
una terminación 3' de una secuencia objetivo de RNA en la etapa (b)
mediante la acción de una enzima que degrade de forma selectiva la
parte de RNA de un híbrido RNA:DNA (por ej., H RNAsa). El RNA así
producido puede ciclar de forma autocatalítica para producir más
producto.
En otros métodos, se producen las siguientes
etapas: (a) contacto de una secuencia objetivo de un ácido nucleico
(por ej., RNA o DNA) con un primer prímero o
promotor-prímero oligonucleótido bajo condiciones en
las que se forma un primer complejo de la secuencia
oligonucleótido/objetivo de modo que la síntesis de DNA pueda
iniciarse mediante una polimerasa apropiada (por ej., una polimerasa
de DNA), (b) incubando el primer oligonucleótido bajo condiciones
de reacción de extensión de modo que el objetivo pueda ser utilizado
por la polimerasa como un molde para dar un primer producto de
extensión del DNA complementario al objetivo (si el primer prímero
no está bloqueado); (c) si el objetivo es una molécula de RNA,
separación del producto de extensión del DNA a partir del objetivo
de RNA utilizando una enzima que degrade de forma selectiva el RNA
objetivo, o si el objetivo es una molécula de DNA, separando las
dos hebras de DNA (por ej., por calentamiento a
90-100ºC, o por otros medios); (d) por contacto del
producto de extensión del DNA con un segundo oligonucleótido que
incluye un prímero o un promotor-prímero, y que
tiene una secuencia de formación de complejo suficientemente
complementaria a la terminación 3' del producto de extensión del
DNA para hibridar con ella bajo condiciones en las que se forma un
segundo producto oligonucleótido/extensión y la síntesis de DNA
puede ser iniciada como anteriormente, dependiendo de cualquier
molécula de bloqueo en este prímero. En esta invención, si el primer
oligonucleótido no es un promotor-prímero, entonces
el segundo oligonucleótido es un promotor-prímero,
lo que significa que el segundo oligonucleótido tiene una secuencia
5' a la secuencia de formación de complejos que incluye una
secuencia de promotor para una polimerasa de RNA. Además, el primero
y/o segundo oligonucleótidos consiste tanto en una mezcla de un
oligonucleótido bloqueado como no bloqueado, o una mezcla de
oligonucleótidos con diferentes modificaciones 3'.
La reacción de amplificación se lleva a cabo en
una mezcla que consiste esencialmente de los necesarios reactantes
y reactivos. Sin embargo, dicha mezcla también puede contener
enzimas u otros sustituyentes que no afecten de forma cualitativa a
la amplificación de la invención (por ej., el mecanismo de la
reacción). Dichos sustituyentes pueden afectar la cantidad de
amplificación observada. Por ejemplo, la mezcla puede contener otros
promotor-prímeros para la misma secuencia objetivo,
o puede contener oligonucleótidos "de ayuda". Dichos
oligonucleótidos de ayuda son utilizados de un modo similar a las
sondas de ayuda de la hibridación descritas por Hogan y col.,
patente U.S. 5.030.557 principalmente por unión auxiliar del
promotor-prímero a su ácido nucleico objetivo,
incluso si dicho ácido nucleico objetivo tienen estructura
secundaria significativa. A pesar de la semejanza en el uso de
dichos oligonucleótidos de ayuda, fue sorprendente que dichos
oligonucleótidos de ayuda puedan ser utilizados en protocolo de
amplificación sin efecto adverso en la eficiencia del
procedimiento.
El primer oligonucleótido puede ser un
promotor-prímero y el segundo oligonucleótido puede
ser un prímero, o viceversa, o tanto el primero como el
segundo oligonucleótidos pueden ser
promotor-prímeros, tanto con promotores idénticos
(en el sentido de que los promotores son reconocidos por la misma
polimerasa de RNA) como diferentes promotores. El uso de diferentes
promotores es particularmente útil cuando se utilizará el ácido
nucleico amplificado para la clonación. El primero y el segundo
oligonucleótidos y el RNA producido a partir de la secuencia
objetivo pueden ser utilizados a continuación para sintetizar de
forma autocatalítica copias múltiples (por lo que se quiere
significar tanto secuencias de ácido nucleico complementarias como
homólogas) de la secuencia objetivo.
El prímero modificado o el
promotor-prímero de un kit de la invención consiste
esencialmente en una secuencia de ácido nucleico única que tiene
una modificación en o cerca de (entre las 3 bases) la terminación 3'
del prímero o del promotor-prímero dados que altera
(disminuye o bloquea) la extensión del prímero en un molde por una
polimerasa de DNA. Preferiblemente este prímero o
promotor-prímero modificado consiste esencialmente
de la misma secuencia de ácido nucleico, junto con uno o más otros
prímeros o promotores-prímeros de una secuencia de
ácido nucleico diferente (que también puede ser una mezcla de
oligonuclótidos bloqueados y no bloqueados. Los kits de la
invención también pueden incluir mezclas de prímeros y de
promotor-prímeros con más de una modificación a o
cerca de sus terminaciones 3'.
Puede utilizarse un kit de la invención después
de la generación de una terminación 5' definida (es decir, una de
secuencia conocida) en una secuencia objetivo de RNA por tratamiento
del RNA con un oligonucleótido de DNA que hibrida cerca del segundo
sitio de unión del prímero y con ello forma un sustrato para la H
RNAsa. Este sustrato es hidrolizado a continuación por la H RNAsa
para definir la terminación 5' del RNA objetivo, lo cual puede ser
amplificado tal como se ha discutido anteriormente.
La amplificación utilizando un kit de la
invención puede implicar la acción cooperativa de una polimerasa de
DNA (tal como una transcriptasa reversa) y una polimerasa de RNA
dependiente de DNA (transcriptasa) con una etapa de separación de
híbrido enzimática para producir productos que pueden ser utilizados
ellos mismos para producir un producto adicional, resultando de
este modo en una reacción autocatalítica sin requerir manipulación
de las condiciones de reacción, tales como en el ciclo térmico.
Además, en algunas realizaciones de la presente invención que
incluyen un procedimiento preliminar, todas excepto la etapa inicial
del procedimiento preliminar son llevadas a cabo a una
temperatura.
En un ejemplo de un ensayo típico, se mezcla una
muestra incluyendo el rRNA objetivo a amplificar con un concentrado
de tampón conteniendo el tampón, sales (por ej., cationes divalentes
tales como magnesio), trifosfatos de nucleótidos, prímeros y/o
promotor-prímeros (bloqueados y/o no bloqueados), un
agente de reducción de tiol tal como ditiotreitol, y un policatión
tal como espermidina. A continuación la reacción es incubada de
forma opcional cerca de 100ºC para desnaturalizar cualquier
estructura secundaria. Después de enfriar a temperatura ambiente
(aproximadamente a 20ºC), se añaden enzimas conteniendo actividad de
la polimerasa de DNA dependiente del DNA y RNA y la mezcla se
incuba durante aproximadamente 10 minutos hasta cuatro horas a 37ºC
hasta 42ºC. A continuación puede ensayarse la reacción por adición
de una sonda marcada de forma luminescente, incubando entre 10 y 30
minutos a 60ºC, añadiendo una solución para hidrolizar de forma
selectiva la marca en la sonda no hibridada, incubando la reacción
durante 5 a 10 minutos a 60ºC, y midiendo la quimioluminiscencia
restante en un luminómetro. (Ver, por ej., el ensayo de protección
de hibridación de Arnold, y col. tal como se ha descrito en la
patente WO 89/02476 publicada el 29 de Marzo de 1989 y la
correspondiente solicitud de patente europea publicada no.
0309230).
Los kits de la invención pueden ser utilizados
en muchos otros sistemas de ensayo conocidos por los expertos en la
materia.
Todavía es otro aspecto de las características
de la invención una mezcla de oligonucleótidos modificados y no
modificados o una mezcla de oligonucleótidos modificados de forma
diferente, de modo que dicha mezcla sea una mezcla de prímeros o
una mezcla de promotor-prímeros que tenga la misma
secuencia de promotor y en la que cada oligonucleótido no
modificado se hibride a esencialmente la misma secuencia objetivo y
en donde dichos oligonucleótidos estén seleccionados entre
oligonucleótidos de acuerdo con cualquiera de (a) a (c) a
continuación:
(a) un oligonucleótido que consiste en una
secuencia de ácido nucleico seleccionada entre GGGATAAGCCTGG
GAAACTGGGTCTAATACC (SEC ID No. 2), y el oligonucleótido complementario a dicha secuencia de ácido nucleico;
GAAACTGGGTCTAATACC (SEC ID No. 2), y el oligonucleótido complementario a dicha secuencia de ácido nucleico;
(b) un oligonucleótido tal como se ha señalado
en (a) anteriormente unido a la terminación 5' a una secuencia
reconocida por una polimerasa de RNA; y
(c) un oligonucleótido tal como se ha indicado
en (a) o (b) anteriormente que tiene una modificación a o cerca de
su terminación 3' que reduce o bloquea la extensión por una
polimerasa.
Se apreciará que dicha mezcla puede formar un
componente de un kit de la invención.
Los kits de la invención pueden ser kits
diagnósticos u otros kits para uso en procedimientos de diagnóstico,
u otros procedimientos, y la invención es adaptable a tecnología
multi-pocillo que puede ser proporcionada en
formato kit.
La Figura 1 muestra la estructura de la
modificación alcano-diol referida como RP.
Un kit de la invención puede proporcionar de
forma ventajosa oligonucleótidos para un método de amplificación
que sintetiza copias de RNA de una secuencia objetivo de rRNA de
M. tuberculosis por uso de una mezcla de
promotor-prímeros bloqueados y no bloqueados, o
promotor-prímeros con diferentes modificaciones 3',
consistiendo esencialmente de la misma secuencia de ácido nucleico
en una relación que proporciona para sub-productos
no específicos disminuidos. El procedimiento de amplificación se
produce de forma espontánea e isotérmicamente bajo un amplio rango
de condiciones. Las reacciones de amplificación descritas a
continuación son unas series de etapas lógicas. La relación
relativa de cada etapa determinará el rendimiento efectivo del
producto de amplificación. El uso de una mezcla de prímeros
bloqueados y no bloqueados reduce las reacciones secundarias, y,
por lo tanto, mejora la amplificación. Se han descrito los productos
secundarios, tales como los "prímero-dímeros",
y son bien conocidos en el estado de la técnica por afectar la
eficiencia de las reacciones de amplificación. Un procedimiento de
amplificación tal como se ha presentado en la presente memoria
reduce la eficiencia de la formación de dichos
sub-productos, con lo que se intensifica la
eficiencia de la amplificación.
Las polimerasas de DNA adecuadas incluyen
transcriptasas reversas tales como la transcriptasa reversa del
virus de la mieloblastosis aviar (AMV) y la transcriptasa reversa
del virus de la leucemia murina Moloney (MMLV). Los promotores o
las secuencias de promotor adecuados para la incorporación en los
promotor-prímeros utilizados en la presente
invención son secuencias de ácido nucleico (tanto de origen natural,
como producidos de forma sintética o por una digestión de la
endonucleasa de restricción) que son específicamente reconocidos
por una polimerasa de RNA que reconoce y une a dicha secuencia y que
inicia el procedimiento de transcripción en donde se produce la
transcripción de RNA. Las secuencias de promotor para las que hay
una polimerasa conocida y disponible que sea capaz de reconocer la
secuencia de iniciación son particularmente adecuadas para ser
utilizadas. Dichos promotores incluyen aquellos que son reconocidos
por ciertas polimerasas bacteriófagas tales como las derivadas del
bacteriófago T3, T7 o SP6. La secuencia puede incluir opcionalmente
bases de nucleótidos que se extienden más allá del actual sitio de
reconocimiento para la polimerasa de RNA que puede impartir
estabilidad o susceptibilidad adicional a los procedimientos de
degradación o una eficiencia de transcripción incrementada.
Aunque algunas de las transcriptasas reversas
adecuadas para uso con kits de oligonucleótidos de la invención
tienen una actividad H RNAsa, tal como la transcriptasa reversa de
AMV o MMLV, puede preferirse añadir H RNAsa exógena, tal como H
RNAsa de E. coli. Por ejemplo, aunque los Ejemplos (ver a
continuación) muestran que no se requiere la adición de H RNAsa
exógena, la actividad H RNAsa presente en la transcriptasa reversa
de AMV puede ser inhibida por cantidades relativamente grandes de
DNA heterólogo presente en la mezcla de reacción; una solución al
problema es añadir H RNAsa exógena. Puede requerirse otro caso
cuando se añade la H RNAsa es cuando un oligonucleótido se hibrida
internamente (es decir, el oligonucleótido se hibrida de modo que
los nucleótidos de secuencia objetivo se extienden más allá de las
terminaciones 3' y 5' del oligonucleótido) en el RNA
objetivo.
objetivo.
El segundo oligonucleótido que proporciona una
secuencia de prímero puede ser bloqueado o modificado de forma
similar al primer oligonucleótido. En un aspecto de la presente
invención, si el primer oligonucleótido no está modificado,
entonces el segundo oligonucleótido está modificado. También, si el
primer oligonucleótido no es un promotor-prímero,
entonces el segundo oligonucleótido es un
promotor-prímero. Además, si el primer
oligonucleótido es sólo un prímero, entonces puede ser no bloqueado,
y el segundo oligonucleótido es entonces un
promotor-prímero incluyendo tanto los constituyentes
bloqueados como no bloqueados que consisten esencialmente en una
secuencia de ácido nucleico único. De forma sorprendente, dicha
mezcla de oligonucleótidos bloqueados y no bloqueados que consiste
esencialmente de la misma secuencia de ácido nucleico reduce la
cantidad de formación de producto no específico, y por consiguiente
incrementa la efectividad de la amplificación.
Las copias de RNA o transcritos producidos
pueden multiplicarse de forma autocatalítica sin una posterior
manipulación.
En otro aspecto de la presente invención, el
primer y segundo oligonucleótidos son tanto
promotor-prímeros, y cada uno o ambos pueden
consistir tanto de promotor-prímeros modificados
como no modificados. En dicho caso, se prefiere que ambos
promotores sean reconocidos por la misma polimerasa de RNA a no ser
que se pretenda introducir el segundo promotor para objetivos
diferentes de la amplificación, tales como la clonación. Cuando
ambos oligonucleótidos son promotor-prímeros,
entonces se producirán los transcritos complementarios a ambas
hebras del molde de doble hebra durante la reacción autocatalítica y
el número de copias de la secuencia objetivo sintetizada puede ser
incrementado.
Debe hacerse notar, que el primer
oligonucleótido (prímero o promotor-prímero) define
una terminación de la secuencia objetivo, el segundo
oligonucleótido (prímero o promotor-prímero) define
ahora el otro terminal; las terminaciones también pueden ser
definidas por una endonucleasa de restricción específica, o por
otros medios adecuados (que pueden incluir una terminación 3'
natural). Los transcritos de RNA pueden tener diferentes
terminaciones a partir del ácido nucleico objetivo original, pero la
secuencia entre el primer oligonucleótido y el segundo
oligonucleótido permanece intacta. Los transcritos de RNA así
producidos pueden ciclarse de nuevo de forma automática en el
anterior sistema sin una posterior manipulación. De este modo, esta
reacción es autocatalítica.
También debe señalarse que cualquier
oligonucleótido puede tener secuencias 5' de nucleótidos a su
secuencia de prímero que pueden resultar en la adición de
secuencias de nucleótidos extras al DNA de doble hebra eventualmente
resultante; la secuencia de nucleótido extra no está limitada a una
secuencia de promotor.
En otra realización, la presente invención puede
consistir en un primer y un segundo oligonucleótido en el que se
proporciona un promotor-prímero que consiste sólo de
un oligonucleótido bloqueado, o sólo de un oligonucleótido no
bloqueado, o un oligonucleótido con una mezcla de diferentes
modificaciones a o cerca de la terminación 3'.
La amplificación puede llevarse a cabo en
presencia de aditivos para intensificar la amplificación. Se han
utilizado ejemplos tales como dimetil sulfóxido, dimetil formamida,
etilen glicol, glicerol o zinc.
Los componentes de la mezcla de reacción pueden
ser añadidos en etapas o de una vez. La reacción tiene lugar de
forma ventajosa bajo condiciones adecuadas para mantener la
estabilidad de los componentes de la reacción, tales como el
componente enzimas, y sin requerir modificación o manipulación de
las condiciones de reacción durante el curso de la reacción de
amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos demuestran la utilidad
de los kits de la presente invención. No están limitados y no deben
considerarse como tales.
A no ser que se especifique de otro modo las
condiciones de reacción para la amplificación utilizada en los
siguientes ejemplos fueron de 50 mM de tris-HCl, 35
mM de KCl, 20 mM de MgCl_{2}, 15 mM de
N-acetilcisteina, 4 mM de rATP, 4 mM de rCTP, 4 mM
de rGTP, 4 mM de rUTP, 1 mM de dATP, 1 mM de dCTP, 1 mM de dGTP, 1
mM de dTTP, 10% de glicerol, 10% de dimetil sulfóxido,
300-600 unidades de transcriptasa reversa de MMLV,
200-400 unidades de polimerasa de RNA T7, 0,15
\mum de cada prímero o promotor-prímero, y
cantidades especificadas de molde y de enzimas en volúmenes de 100
\mul a 42ºC durante una hora. También pueden añadirse de forma
ventajosa a la mezcla de reacción ditiotreitol, espermidina y/o
polietilenimina (PEI).
Las enzimas utilizadas en los siguientes
ejemplos son polimerasa de RNA T7 o T3 y la transcriptasa reversa
del virus de la leucemia de murino Moloney (MMLV). También son
adecuadas otras polimerasas de RNA con diferentes especificidades
del promotor.
Se midió la amplificación relativa del modo
siguiente. Se añadió una muestra de la mezcla de la reacción de
amplificación (normalmente 10 \mul) a 100 \mul de una solución
de sonda marcada por luminiscencia (por ejemplo, marcada con un
éster de acridinio - ver la anterior referencia de HPA) conteniendo
aproximadamente 75 fmol de sonda, 0,1 M de succinato de litio, pH
4,7, 2% (peso/v) de lauril sulfato de litio, 15 mM de aldritiol, 20
mM de EDTA, y 20 mM de EGTA, y se mezcló. A continuación se
incubaron las reacciones 20 minutos a 60ºC y se enfriaron. Se
añadió a cada reacción de hibridación 300 \mul de borato sódico
0,6 M de pH 8,5, con un 1% de TritonJX-100. A
continuación se incubaron las reacciones seis minutos a 60ºC para
destruir el marcador quimioluminiscente de la sonda no hibridada.
Este método de destrucción de la marca quimioluminiscente de la
sonda no hibridada es bastante específico; sólo una pequeña fracción
de la sonda no hibridada permanece quimioluminiscente. Se enfriaron
las reacciones y se cuantificó la quimioluminiscencia restante en un
luminómetro con la adición de 200 \mul de peróxido de hidrógeno
al 0,1%, 1 mM de ácido nítrico, y tensioactivo, y 200 \mul de
hidróxido sódico 1,0 N. En el ensayo, la sonda hibridada emite luz.
Se midió la cantidad de fotones emitidos en un luminómetro y los
resultados se describieron como Unidades de Luz Relativa o RLU.
Debido a que la reacción que destruye la marca quimioluminiscente
de la sonda no hibridada no es del 100% efectiva, generalmente hay
un nivel de ruido de la señal que está presente entre
aproximadamente 1000 y 2000 RLU.
También son aplicables muchos otros métodos de
ensayo utilizando la hibridación a sondas marcadas isotópicamente,
técnicas de manchas y electroforesis. Las condiciones de reacción no
son necesariamente optimizadas y han cambiado tal como se ha
señalado para algunos sistemas. Las secuencias de oligonucleótidos
utilizados son ejemplares y no significan que sean limitantes ya
que se han utilizado otras secuencias para estas y otras secuencias
objetivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para mostrar que se produjo amplificación con un
promotor-prímero complementario a una secuencia
dentro de un RNA objetivo, se sintetizó un
promotor-prímero complementario a una secuencia
dentro del rRNA de M. tuberculosis (SEC ID No. 1; la porción
de prímero es la SEC ID No. 22) tanto modificado como con un alcano
diol 3' (RP) o cordicepina 3' (CO) y se incubó con un prímero del
mismo sentido que el RNA objetivo (SEC ID No. 2) y 3 zmol del
objetivo bajo las condiciones anteriormente descritas. Se analizaron
las reacciones con una sonda del mismo sentido que el RNA objetivo
(SEC ID No. 3) con oligonucleótidos auxiliares tal como se ha
descrito en Hogan (Patente U.S. 5.030.557, medios para la
intensificación de la hibridación del ácido nucleico, SEC ID Nos. 4
y 5). Los resultados muestran que no se produce una amplificación
significativa con un promotor-prímero conteniendo
una modificación 3'.
| Modificación promotor-prímero | RLU |
| No modificado | 314.445 |
| 3'cordicepina | 71.382 |
| No modificado | 683.737 |
| 3'-RP | 70.014 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para mostrar que mezclas de
promotor-prímeros modificados y no modificados
funcionan en un ensayo de amplificación, se llevaron a cabo
reacciones con 15 pmol del prímero y un
promotor-prímero (ver a continuación) y se ensayaron
tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se utilizaron 3 zmol del
RNA objetivo.
| Pmol del promotro-prímero | ||||
| No modificado | CO-modificado | RLU | ||
| Experimento 1 | +Objetivo | 15 | 0 | 834.902 |
| +Objetivo | 3 | 12 | 971.938 | |
| -Objetivo | 3 | 12 | 1.456 | |
| Experimento 2 | +Objetivo | 3 | 12 | 1.015.199 |
| +Objetivo | 0,1 | 15 | 961.041 |
Los resultados muestran que una mezcla de
oligonucleótidos bloqueados y no bloqueados funciona igual o mejor
que todos no bloqueados incluso a una relación de 1:150 de no
bloqueados respecto a bloqueados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
En este experimento se incubaron 3 zmol del RNA
objetivo con diferentes concentraciones de prímero CO bloqueado y
no bloqueado y una mezcla de 15 pmol de
promotor-prímero CO bloqueado y 0,1 pmol de
promotor-prímero al igual que en el Ejemplo 1. Se
detectaron los productos por un ensayo de hibridación.
| Pmol de Prímero | RLU | |
| Bloqueado | No bloqueado | |
| 0 | 15 | 969.522 |
| 10 | 5 | 802.840 |
| 13 | 2 | 648.271 |
Además de la satisfactoria amplificación
observada, se encontró de forma sorprendente que la cantidad de
producto dirigido no-moldeado fue
significativamente menor en las reacciones llevadas a cabo con
oligonucleótidos bloqueados en comparación con las reacciones
llevadas a cabo con oligonucleótidos no bloqueados.
Ejemplo
4
En este experimento, se demostró el efecto de la
mezcla de una secuencia de oligonucleótido único con dos diferentes
modificaciones 3'. Se amplificaron 3 zmol del RNA objetivo al igual
que en el Ejemplo 1. Se sintetizó el
promotor-prímero con una terminación 3' no
bloqueada, se bloqueó con RP, o bloqueó con CO. Se utilizaron 2
pmol del prímero.
| Pmol Promotor-prímero | RLU | ||
| RP modificado | CO modificado | No modificado | |
| 0 | 15 | 0,1 | 450.157 |
| 2 | 13 | 0,01 | 681.647 |
| 2 | 13 | 0 | 678.871 |
| 5 | 10 | 0 | 755.839 |
Este ejemplo muestra que una mezcla de no
modificado y modificado o una mezcla de diferentes tipos de
promotor-prímeros modificados se amplifica bien,
permitiendo la detección de 3 zmol del RNA objetivo en una hora.
Ejemplo
5
En este ejemplo, se utilizó una mezcla de
prímeros modificados y no modificados y de
promotor-prímeros para amplificar 3 zmol de rRNA de
M. tuberculosis. Se incubó una mezcla de 2 pmol de
promotor-prímero RP-modificado y 13
pmol de promotor-prímero
CO-modificado con prímero no modificado o una mezcla
de prímero no modificado y prímero sintetizado con 3' fosfotioato
nucleótido (PS). Las secuencias y las sondas de hibridación son tal
como en el Ejemplo 1.
| Modificación de prímero | RLU | |
| No modificado | PS modificado | |
| - - | 15 pmol | 118.411 |
| 1 pmol | 14 pmol | 364.733 |
| Ningún objetivo | 1.266 |
Bajo estas condiciones, la mezcla de prímeros
modificados y no modificados funcionó mejor.
<110> Gen-Probe
Incorporated
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Detección de tuberculosis
microbacteriana mediante amplificación de secuencias de ácido
nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P53256EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 99121906.4
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1993-08-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 93306169.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1993-08-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 07/925,405
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1942-08-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaattaata cgactcacta tagggagacc acagccgtca ccccaccaac aagct
\hfill55
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<210> 2
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgggataagcc tgggaaactg ggtctaatac c
\hfill31
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<210> 3
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcttgtggt ggaaagcgct ttag
\hfill24
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<210> 4
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipccggatagga ccacgggatg cat
\hfill23
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<210> 5
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipcggtgtggga tgaccccgcg
\hfill20
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<210> 6
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<211> 47
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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\hskip-.1em\dddseqskipaatttaatac gactcacactat agggagacca ggccacttcc gctaacc
\hfill47
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<210> 7
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggaacag gctaaaccgc acgc
\hfill24
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<210> 8
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipggaggatatg tctcagcgct acc
\hfill23
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<210> 9
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipcggctgagag gcagtacaga aagtgtcgtg gttagcgg
\hfill38
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<210> 10
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipgggtaaccgg gtaggggttg cgtgtgcggg gttgtg
\hfill36
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<210> 11
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipataatccacc tatcccagta ggagaaat
\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipaatttaatac gactcactat agggagacca caccttgtct tatgtccaga atgct
\hfill55
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<210> 13
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcacgtagtt agccggtgct tattcttcag
\hfill30
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipaatttaatac gactcactat agggagagca agcctgatcc agccatgccg cgt
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipgcttgcgccc attgtccaaa atttcccact gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskiptcggccgccg atattggc
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacggccttt tcttccctga caaaagtcct ttacaacccg
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 18
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\hskip-.1em\dddseqskipcgtagttagc cggtgcttat tcttcaggta ccgtca
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatattaac cctcactaaa gggagaccag gccacttccg ctaacc
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipataatccacc tatcccagta ggagaaat
\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 55
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<212> ADN
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 21
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\hskip-.1em\dddseqskipaatttaatac gactcactat agggagacca caccttgtct tatgtccaga atgct
\hfill55
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido Sintético
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<400> 22
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgtcaccc caccaacaag ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Un kit conteniendo un primer oligonucleótido
que consiste en la secuencia xGCCGTCACCCACCAACAAG
CT (SEC ID No. 22), y un segundo oligonucleótido que consiste en la secuencia xGGGATAAGCCTGGGAAACTGGG
TCTAATACC (SEC ID No. 2), en la que x es nada o es una secuencia reconocida por una polimerasa de RNA.
CT (SEC ID No. 22), y un segundo oligonucleótido que consiste en la secuencia xGGGATAAGCCTGGGAAACTGGG
TCTAATACC (SEC ID No. 2), en la que x es nada o es una secuencia reconocida por una polimerasa de RNA.
2. Un kit tal como se ha reivindicado en la
reivindicación 1 en donde uno de dichos primero y segundo
oligonucleótidos es un promotor-prímero.
3. Un kit tal como se ha reivindicado en la
reivindicación 2 en donde dicho primer oligonucleótido es el
oligonucleótido representado por la SEC ID NO. 1
(GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAGCCGTCACCC
> CACCAACAAGCT) y dicho segundo oligonucleótido es la secuencia representada por la SEC ID No. 2 (GGGA
TAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC).
> CACCAACAAGCT) y dicho segundo oligonucleótido es la secuencia representada por la SEC ID No. 2 (GGGA
TAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC).
4. Un kit tal como se ha reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde una o más de
dichas secuencias tienen un terminal 3' modificado que reduce o
bloque la extensión por una polimerasa.
5. Un kit tal como se ha reivindicado en la
reivindicación 2 o en la reivindicación 3 en donde el
promotor-prímero comprende una mezcla de miembros
modificados y no modificados o una mezcla de miembros
diferencialmente modificados, teniendo cada miembro modificado una
modificación a o cerca del terminal 3' que reduce o bloquea la
extensión por una polimerasa.
6. Un kit tal como se ha reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende además una
sonda de hibridación, de modo que dicha sonda comprenda un
oligonucleótido que consiste en la secuencia GTCTTGTGGTG
GAAAGCGTTTAG (SEC ID No. 3)
GAAAGCGTTTAG (SEC ID No. 3)
7. Un kit tal como se ha reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende además
oligonucleótidos auxiliares representados por la SEC ID No. 4
(CCGGATAGGACCACGGGATGCAT) y la SEC ID No. 5
(CGGTGTGGGATGACCCCGCG).
8. Un método para la amplificación del ácido
nucleico del Mycobacterium en una muestra que comprende la
amplificación de dicho ácido nucleico con un par de
oligonucleótidos seleccionados entre pares de oligonucleótidos para
la amplificación del ácido nucleico tal como se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
9. Un método para la detección del ácido
nucleico de M. tuberculosis que comprende la amplificación de
dicho ácido nucleico con un par de oligonucleótidos seleccionados
entre pares de oligonucleótidos para la amplificación del ácido
nucleico tal como se ha definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 y la detección del ácido nucleico
amplificado con una sonda de hibridación tal como se ha definido en
la reivindicación 6.
10. Uso de un conjunto de oligonucleótidos del
kit tal como se ha reivindicado en la reivindicación 7 para
detector el ácido nucleico del M. tuberculosis por un método
de acuerdo con la reivindicación 9.
11. Un oligonucleótido que consiste en una
secuencia de ácido nucleico seleccionada entre GGGATAAGCCTGG
GAAACTGGGTCTAATACC (SEC ID No. 2), y el oligonucleótido complementario a dicha secuencia de ácido nucleico.
GAAACTGGGTCTAATACC (SEC ID No. 2), y el oligonucleótido complementario a dicha secuencia de ácido nucleico.
12. Un oligonucleótido tal como se ha
reivindicado en la reivindicación 11 unido al terminal 5' a una
secuencia reconocida por una polimerasa de RNA.
13. Un oligonucleótido tal como se ha
reivindicado en la reivindicación 11 o en la reivindicación 12 que
tiene una modificación en o cerca de su terminal 3' que reduce o
bloquea la extensión por una polimerasa.
14. Una mezcla de oligonucleótidos modificados y
no modificados o una mezcla de oligonucleótidos modificados de
forma diferente, de modo que dicha mezcla sea una mezcla de prímeros
o una mezcla de promotor-prímeros que tengan la
misma secuencia del promotor y en donde cada oligonucleótido
modificado o no modificado se hibride a esencialmente la misma
secuencia objetivo y en donde dichos oligonucleótidos estén
seleccionados entre oligonucleótidos de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 13.
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