JPH06507709A

JPH06507709A - 分析装置

Info

Publication number: JPH06507709A
Application number: JP4509875A
Authority: JP
Inventors: バックル，フィリップ　エドワード; デーヴィス，ロバート　ジョン; ポラード−ナイト，デニス　ヴェラ
Original assignee: ファイスンズ　ピーエルシー
Priority date: 1991-06-04
Filing date: 1992-06-02
Publication date: 1994-09-01
Also published as: WO1992021976A1; EP0643833A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】名称　分析装置本発明はセンサーに係り、特に、フラストレー／替ン全反射の原理に基づく誘電性の表層を有する化学的もしくは生化学的センサーに関する。

近年、溶液中の生化学的な分析対象物を自動的に測定するための装置が数多く提供されている。これらの装置（バイオセンサー）は、一般に、共振範囲のうち極めてわずかな部分に位置する鋭敏な被膜層を含んでいる。また、分析物の同定には、一般的に、例えば表面プラズモン共振（ＳＰＲ）のような光学的手法が用いられる。この手法は被膜層と分析物との相互作用による被膜層の厚みおよび／または屈折中の変化に基づくもので、その結果、例えば共振角度の位置等に変化を及ぼす。

’に’ｌｌ的バイ上ンサーに利用可能な技術の−っに、フラストレーシ璽ン全反ＩＮ（ＦＴＲ）がある。ＦＴＰの原理はよく知られており、またその手技は、例えばＢｏｓｉｃｅ旧および０ａｈｒｌｅ　（＾ｐｐＨｅｄ　Ｏｐｔｌｅｇ　（１９ｇ２）、　１１．　ｐｐ２１６７−２１７３）等に示されている。また、免疫測定法へのＦＴＰ装置の利用は米国特許４．　８５７．　２７３号に開示されている。この装置は、試料の一方に結合する中空層と、試料の他方に結合し、かつ基質上に載置されるスペーサー層を有し、かつ基質とスペーサー層との界面はスペーサー層を透過するわずかな範囲に全反射を起こす単色光でｊｌｔｌｌＭされる。もし、スペーサー層の厚みが適正で、入射した平行な波動ベクトルがある共振モードの伝播係数の一つと一致すると、全反射がフラストレーシ菫ンを起こし、照射光が中空層に入射する。中空層はスペーサー層より高い屈折率を有し、入射した波長に対しては透過性を有している。

更に最近では、（例えばＰＣＴ出＠　ＷＯ９０１０６５０３号に開示されているように、）ＦＴＲバイオセンサーが提案されている。この場合、中空層は例えば無機酸化物のような相対的に屈折率の高い物質でできた薄膜からなっている。

化学的もしくは生化学的な種類の物質が固定化された層を有する鋭敏な被膜層は、あらゆるバイオセンサーにおいて必要不可欠なものである。最近では、ｓＰＲセンサーに関して、この固定化技術を改良するため、ハイドロゲルのような生体適合性を有する多孔質素材の使用が提案されている（ＰＣＴ出願　ＷＯ９０１０５３０３号ｔ−Ｓ＞。この素材は、通常、例えばデキストランのように、センサーの表面（ＳＰＲセンサーは金属製である。）に、望ましくはチオール基やジスルフィド基を結合基を介して結合する素材を含んでいる。しかしながら、チオール基やジスルフィド基は、ＦＴＨに基づくセンサーの酸化物製の表面と多孔質素材との直接的な結合には不適当な結合基である。

本発明者らは、今回、誘電性の表層を有するバイオセンサー表面の感受性を有するコーティングに、生体適応性を有する多孔質素材が固定化可能であることを見いだした。そして、その結果、公知のセンサーでは予期し得ない効果が得られた。

本発明によれば、誘電性素材からなる層を有し、少なくともその一部に、固定化された生化学物質を有し、かつ生体適合性の多孔質素材が結合したバイオセンサーが得られる。

本発明に係るセンサーでは、生化学物質を直接センサーの表面に固定した場合に比べ、固定化された生化学物質の密度が高くなるという利点を有し、その結果、測定信号の値が増大し、かつ測定可能な範囲が増大する。また、固定化された生化学物質の固定化活性が向上する一方、洗剤の使用等に伴う生化学物質の不要な脱離が防止される。多孔質素材は、試料の測定中における分析物の分子との結合のための三次元骨格を提供するもので、分析物の分子との結合がセンサー表層の屈折率に及ぼす影響を増大させる。

更に、この多孔質素材は、使用中センサーと接触する試料の媒質に対し化学的な耐性を付与する一方、タンパクその他の生体高分子に対し親和性を有している。

従って、極めて多くの生体高分子が共有結合によりこの多孔質素材に固定化可能で、その結果、同定可能な分析物の範囲という観点から、センサーの用途を増大させることができる。

加えて、本発明によれば、多孔質素材を、ＰＣＴ出願　ＷＯ９０１０５３０３号にＥｌ！のように適用した場合を含むＳＰＨの技術を用いた従来の装置より高感度で測定が可能である。これは、本願の場合、適当な素材と層の厚みとの選択により、例えば中空層に対する光の伝達距離が最良となるためであると思われる。

更にまた、装置のパラメーター（このパラメーターは、欧州特許第００７５３５３号の原則に準拠して選択される。）を最適なものとすることにより、共振範囲のうち極めてわずかな部分を、対応するＳＰＲ装置の場合よりも更に、誘電性の表層に接近させることが可能となっている。

本発明に係るセンサーの無機酸化物製表面への多孔質素材の結合は、ＳＰＲセンサーの金属性表面への結合より、更に容易となりでいる。また、本発明に係るセンサーにおけるｌｌ！電性を有する構造の組み立ては、金属製の階層を有するＳｒＲ装置に基づくセンサーよりも簡単かつ低コストとなっている。しかも、本発明に係るセンサーの表面に使用された無機酸化物は、表面を銀または金とした場合のように曇ったり、表面をアルミニウムとした場合のように酸化することがない。

本発明に係るセンサーは、ＦＴＨの原理を基礎とし、誘電性の層をセンサーの中空層として形成したものである。

ここで、多孔質素材は、数ｎｍ（例えば約５ｎｍ）から数百ｎｍの範囲の厚みを有するものとする。

また、多孔質素材としては、ハイドロゲルの使用が最適である。このハイド豐ゲルは、例えば、ｋｌｅｒｒｌｌｌら（＝　Ｂｙｄｒｏｇｅｌｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｙ”　、　ＶｏｌＩＩｌ、＋１９８６１．　Ｅｄ、　Ｐａｐｐｍ５　ＮＡ、　Ｃｈａｐｔｅｒ　１．　ＣＲＣＰｒｅｓ＠）に記載されたものから一つ選択される。

ハイドロゲルの例としては、例えば、アガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、およびセルロースのような多糖類、あるいは、カルボキシメチル誘導体、キサンタンガム、およびペクチンのような上記多糖類の誘導体、更には、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、およびポリエチレングリコールのような水膨潤性の有機高分子等が挙げられる。

このうち、デキストランは、生体高分子結合性のクロマトグラフィー用坦体としてよく知られている。従って、ハイドロゲルとして、デキストランを選択する場合が特に多い。

一方、センサー表面への多孔質素材の結合を促進するため、誘電性の表層１ζは、多孔質素材に対する結合部が誘導もしくは活性化により設けられる。

例えば、この表層は、公知の方法によりシランをベースとする結合化合物と反応可能である。ここで使用可能な試薬の例としては、３−アミノプロピル化合物のようなアミノアルキル端末を有するトリメトキシランを、アセトン中で２％Ｗ／Ｖとなるよう施用する場合がある。また、これらの試薬を用いた具体的な固定化の手技は、Ｗｅｅｔｉｌｌらにより開示されている（例えば、米国特許第３６５２７６１号、あるいは＋Ｉｗｍｏｂｌｌｌｚｅｄ　Ｂｌｏｅｂａｍｉｅｉｌｓ　ａｎｄ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ＣｈｒｏｍｍｔｏｇｒｍｐｈＦ”　。

Ｒ，Ｂ、Ｄｕｎｌｏｐ　（Ｅｄ）、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（＋９７４１．　ｐｐ１９１−２１２　ＩＮ）。

アミノシラン試薬との反応後、誘電性の表層に固定化されたアミノ末端を、サクンニイミヂル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１〜カルボキシレート（ＳＭＣＣ）と反応させ、更に、多孔質素材を横かけ結合するためエピクロルヒドリンを加えた後、２−メルカプトエタノールを加え、余剰の試薬を除去し、かつ表層を、固定化されたエポキシド基で活性化するとともに、多孔質素材を含む溶液で処理する。

された誘電性の表層が直接多孔質素材の分子と反応可能となるため、アルデヒド。

は不要である。

しかしながら、この方法の場合、多孔質素材１ｉ、誘電性の表層の誘導および活性化を伴うことなく、誘電性の表層に直接結合する。

も、デキストランが装置の表面から解離することはな−１゜誘電性の表層と多孔質素材との結合は、例え（ｆカルボキンメチル化ヒのような、多孔質素材における誘導体の形成をも含んでｔ４．このような誘導体の形成＋１、表層に対し悪影響を及ぼす試薬による処理を含んで％Ｎるので、表層に結合する前に誘導を行う方が望ましい場合も多い。

誘電性の表層への多孔質素材の結合に次ｔ１で、特定の分析物に対する抗体のような生化学物質が、多孔質素材に結合される。そのために（よ、まず多孔質素材を活性化させる必要がある。例えば、酸化された炭化水素鎖を有する抗体のようなアルデヒド基を有する生化学物質を結合させるためにζよ、デキストランにヒドラジドの機能を付与してお（。この場合、デキストラン１ヨ、まず、ヒドラジド基を形成するため予め部分的に反応済みのカルボキンメチル類により改質される。

一方、反応性エステルの機能は、カルボキンメチル化されたデキストランのカルボキシル基の一部を、例えばＮ−ヒドロキシスクンニアミドやＮ−（３−ジメチル−アミノプロピル）−Ｎ−一エチルカルボジイミドハイドロクロライドの水溶液による処理等で改質することにより付与される。タンパク、ペプチド、あるいはアミ７基を有するオリゴヌクレオチドのような生体高分子は、これら改質されたカルボキシル基を介してデキストランに結合する。

反応性エステルの機能を付与する他の方法は、例えば２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミンのような、ジスルフィド基を有する物質と反応させるものである。こうして得られたジスルフィド基を有するデキストランは、免疫グロブリンの還元されたＦ（ｓｂ）フラグメントのような、チオール基を有する生体高分子と結合する。また、Ｎ−スクシニイミジル３−（２−ピリジニルジチオ）プロピネート（ＳＰＤＰ）で改質されたタンパクのようなジスルフィド基を有するリガンドは、デキストランのジスルフィド結合を、還元またはチオール基とジスルフィド基との置換等により開裂した後に結合可能となる。

更に、生体高分子の多孔質素材への共有結合による固定は、錯体形成によっても起こり得る。例えば、抗体のような生体高分子とデキストランとは、分析物に結合特異性を有する複合体を形成する。

ハイドロゲルは、ハイドロゲル分子と連結する色素分子のような、光吸収性物質とも結合可能である。試料がバイオセンサーの表面に接触し、反射光の強度低下として検知可能な程度の変化が生じると、誘電性の表層に到達する光が、光吸収性分子により吸収される。本発明の装置は、この点においても、ＳＰＲ装置に基づくセンサーよりも優れている。

一般に、本発明に係る、ＦＴＨに基づくバイオセンサーは、＋１）　屈折率がｎ、である誘電性素材からなる中空層と、ｂ）　屈折率がｎ、であるＮＩＩ性の基質および、Ｃ）　中空層と基質との間に挾まれ、屈折率がｎ２であるスペーサー層とを有している。

使用に際しては、基質とスペーサー層との間の界面を、全反射が起こるような光で照射する。ここで、「光」とは、可視光のみならず、例えば紫外線や赤外線のような、可視光以上または可視光以下の波長の光をも含む。

中空層内での導波モードにおける共振の伝搬は、所定波長の励起光を、特定の入射角で照射することにより生じる。従って、波長を固定して入射角を測定するか、入射角を固定して波長を測定するかの二つの基本的な測定方法が適用可能である。前者では、単色光を使用するので、光の平行度に関する問題を単純化し、かつ分散の影響を避けて、分析結果の解析を容易とするためには、レーザー光の使用が望ましい。

バイオ七ノサーを有する装置における共振の角度は、屈折率や、各層の厚み等多くのパラメーターに依存しているが、一般に、中空層の屈折率ｎ、と、基質の屈折率ｎ、とか、ともにスペーサー層の屈折率０２より大となる必要がある。また、共振の促進には空洞が必要なため、中空層は必要最小限以上の厚みを有する必要がある。

中空層は誘電性の素材からなる薄膜であることが望ましく、このｌ？誘電性素材としては、より望ましくは、酸化ジルコニウム、酸化チタニウム、酸化アルミニウム、および酸化チタニウム等が使用される。

そして、中空層は、真空濃縮、スパッタリング、化学蒸着、あるいは拡散等公知の技術にて形成される。

誘電性のスベー号一層は、入射光を相応に伝達し、かつ中空層および基質より低い屈折率を有する必要がある。この層には、例えば弗化マグネシウムを濃縮またはスパッタリングにより層状としたものが使用され、かつ光源としては、−綬に波長８００ｎｍ前後の赤外レーザーが使用される。また、弗化リチウムや二酸化シリコンも使用可能である。濃縮またはスパッタリング以外に、ゾル−ゲル法や基質との化学反応を利用することにより、基質上にスペーサー層を形成することもできる。

一方、基質の屈折率（ｎｌ）は、スペーサー層の屈折率（ｎ２）より大きいが、基質の厚さは、一般に本発明の機能には大きな影響を与えない。

これに対し、中空層の厚さは、結合角内の適切な範囲で共振が起こるよう選択する必要がある。この厚さは、一般に数十ｎｍ〜数百ｎｍ、例えばｌｏｎｍ〜２００ｎｍ、より望ましくは３０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲内から、１１００ｎのように選択される。また、スペーサー層の厚さは、一般に数百ｎｍから数千ｎｍ。

例えば２００ｎｍ−２０００ｎｍ、より望ましくは５００ｎｍ−１５００ｎｍの範囲内から、１１０００ｎのように選択される。

特に、中空層が二酸化ジルコニウム、ハフニア、窒化７リコン、二酸化チタニウム、酸化タンタル、および酸化アルミニウムから選択される素材を有する場合には、中空層の厚さを３０ｎｍ〜１５０ｎｍとすることが望ましい。また、スペーサー層が弗化マグネシウム、弗化リチウム、および二酸化シリコンから選択される素材を有する場合には、スペーサー層の厚さを５００ｎｍ〜１５００ｎｍとすることが望ましい。ここで、これらの素材は、スペーサー層の屈折率が中空層の屈折率未満となるよう選択する。

特に、中空層およびスペーサー層の素材には、それぞれ酸化タンタルおよび二酸化シリコンを使用することが望ましい。

入射光の光源にはあらゆるものが使用可能であるが、単色光であることが望ましく、更に居も望ましくはレーザーが使用される。このレーザーは、特に、上述の例から得られる種々の層に使用された素材に応じて選択される。

照射角度は、例又は平行なビームの光を角度を変えて照射するか、欧州特許出願第０３０５１０９Ａ号における記載のように、扇状のビームの光を所定の角度範囲で同時に照射する等の（ＳＰＨの場合と関連する）方法で、連続的または同時に検査する。前者では、照射角度の範囲を機械的に走査する１チヤンネル型の検出器が使用される。また、後者では、多くの角度範囲で同時に照射が行われるので、角度解析機能を有する多チヤンネル型の検出器が一般に使用される。

共振に関して、入射光はＦＴＰの原理により中空層と対をなしており、中空層との藺に一定の距離を置いて光を伝搬すると、（ＦＴＨの原理により、）この対１１ｇ消される。伝搬距離は装置の様々なパラメーターに依存しているが、一般に、１ｍｍないし２ｍｍである。

通常、共振時には、反射光は位相の変化を受け、角度位置は、この位相の変化カ起こった状態で検出される。

多孔賃素材に固定化された抗体と抗原との結合のような、中空層の表面における変化は、固定化された生化学物質の厚みに変化をもたらし、共振時の角度位置が変化する。例えば、固定化された物質が入射光の波長の光を吸収するような場合には、反射光の強度が減少する。光の強度低下は、結合状況の指標として使用される。

例ｓｌ）　デキストランと誘電性表層とのシランの介在によるカップリングＩ）　誘電性の中空層を有するＦＴＲバイオセンサーの装置をアセトンで５分間洗浄し、空気乾燥させる。

ｚ）　装置１の表面を、真空下、１４０℃にてグリ／ドオキシブロビルトリメチルシランと１時間反応させてシラン化する。

ＩＩＩ）　装置を、４０ｍ１のＯ，ＩＭ　Ｎ５ＯＨ溶液中に１４ｇのデキストラン（分子量５００，０００）を加えた溶液とともに室温で６時間反応させ、デキストランでコーティングする。

ｌｖ）　装置を水洗する。

Ｖ）　装置を、１０ｍ１の２Ｍ　ＮａＯＨ溶液に１．３ｇのブロモ酢酸を加えた溶液とともに室温で一晩反応させ、固定化されたデキストランをカルボキシメチａ２）　デキストランと誘電性表層とのダイレクトカップリングＩ）　誘電性の中空層を有するＦＴＲバイオセンサーの装置をアセトンで５分間洗浄し、空気乾燥させる。

＋１）　装置を、４０ｍ１の０、ＩＭ　ＮａＯＨ溶液中に１４ｇのデキストラン（分子量５００，０００）を加えた溶液とともに室温で４時間反応させ１．デキストランでコーティングする。

ｌ１１）　装置を水洗する。

Ｉｖ）　装置を、ｌＱｍｌの２ＭＮａＯＨ溶液に１．３ｇのブロモ酢酸を加えた溶液とともに一晩反応させ、固定化されたデキストランをカルボ牛ジメチル化する。

■）　装置を水洗する。

ｓ３）　ダイレクトカブブリングのための他の方法Ｉ）　デキストラン（分子量４５０，０００）の２６％マ／マ水溶液１０ｇを、２Ｍ　Ｎ５ＯＨ溶液にＩＭのブロモ酢酸を加えた溶液１００ｍ１とともに一晩反応させる。

ＩＩ）　８Ｍの酢酸により、混合液のｐＨを６〜８に調製する。

ＩＩＩ）　混合液を水で透析し、凍結乾燥させる。

＋ｖ）　凍結乾燥物を、０．１Ｍの塩酸（または水）に、２３％Ｗ／Ｉとなるよう前解する。

Ｖ）　カルボキシメチル化されたデキストラン溶液１０μｍをＦＴＲバイオセンサーの誘電性表層に滴下し、表面に拡げて一晩反応させる。

ｂ）　ハイドロゲルへの生体高分子のカブプリング１）　活性化装置の表面にカルボキシメチル化されたデキストランを上記ｓｌ）Ｎａ３）の方法で固定化し、更に０．１ＭのＮ−ヒドロキシサクシニアミド（ＮＨ８）と、０．４ＭのＮ−エチル−Ｎ−−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で１０分間処理し、デキストランのカルボキＶル基を、Ｎ−ヒトａ牛シサクンニアミドエステルて活性化スる。

ＩＩ）　力１ブリング上記！〉の工程で得られたハイドロゲルを、抗体、タンパク、またはアミノ基が修飾されたオリゴヌクレオチドを、ｐＨ４，０〜５．５の１０ｍＭ　酢酸バッファーに１０℃ｇ／ｍ＋の濃度で加えた溶液で、１ｏ分間処理する。

ｌ１１）　不活化未反応のままハイドロゲルの表面にあるＮ　ＨＳ−エステルを、ｐＨ８，５に調整されたＩＭのエタノールアミンハイドロクロライドで１０分間処理して不活化させる。

補正書の翻訳文の提出書く特許法第１８４条の８）平成５年１２月３日１、国際出願番号　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１００９９２２、発明の名称　分析装置３、特許出願人住　所　イギリス国　ＩＰＩ　ＩＱＨサフォークイビスウィッチ　プリンセス　ストリートファイスン　ハウス　（番地なし）名　称　ファイスンズ　ビーエルシー代表者　ライト、アール　ジー　マクール国　籍　イギリス国４、代理人住　所　東京都新宿区高田馬場３丁目２３番３号　ＯＲビル６、添付書類の目録（１）補正書の翻訳文　１通７、前記以外の代理人住　所　東京都新宿区高田馬場３丁目２３番３号　ＯＲビル化学的もしくは生化学的なＮａの物質が固定化された層を有する鋭敏な被膜層は、あらゆるバイオセンサーにおいて必要不可欠なものである。最近では、ＳＰＲセンサーに関して、この固定化技術を改良するため、Ｉ−イドロゲルのような生体適合性を有する多孔質素材の使用が提案されている（ＰＣＴ出＠　ＷＯ９０１０ｓａｏｓｑ参照）。この素材は、通常、例えばデキストランのように、センサーの表面（ＳＰＲセンサーは金属製である。）に、望ましくはチオール基やジスルフィド基を結合基を介して結合する素材を含んでいる。しかしながら、チオール基やジスルフィド基は、ＦＴＨに基づくセンサーの酸化物製の表面と多孔質素材との直接的な結合には不適当な結合基である。

本発明によれば、誘電性素材からなる層を有し、少なくともその一部に、固定化された生化学物質を有し、かつ生体適合性の多孔質素材が結合したバイオセンサーが得られる。この場合、多孔質素材は、誘電性の表層の誘導および活性化を伴うことな（、誘電性の表層に直接結合する。

本発明に係るセンサーでは、生化学物質を直接センサーの表面に固定した場合に比べ、固定化された生化学物質の密度が高くなるという利点を有し、その結果、測定信号の値が増大し、かつ測定可能な範囲が増大する。また、固定化された生化学物質の固定化活性が向上する一方、洗剤の使用等に伴う生化学物質の不要な脱離が防止される。多孔質素材は、試料の測定中における分析物の分子との結合のための三次元骨格を提供するもので、分析物の分子との結合がセンサー表層の題折率に及ぼす影響を増大させる。

更に、この多孔質素材は、使用中センサーと接触する試料の媒質に対し化学的ＩＩ＋、　（＋９０）、　Ｅｄ、　Ｐｍｐｐｍ５　Ｎ＾、　Ｃｈａｐｔｅｒ　１．　ＣＲＣＰｒｅｓｓ）に記載されたものから一つ選択される。

ハイドロゲルの例としては、例えば、アガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、およびセルロースのような多糖類、あるいは、カルホキ／メチル誘導体、キサンタンガム、およびペクチンのような上記多ｍｓの誘導体、更には、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、およびポリエチレングリコールのような水膨潤性の有機高分子等が挙げられる。

デキストランは、誘電性の表層に直接結合可能なもので、かつデキストランを誘電性の表層に直接結合した装置は、より良好な特性を有している。特に、誘電性の表層に結合したデキストランの密度が高いため、固定される生化学物質の密度も高（なる。デキストランを表面に直接結合させた装置は、デキストランを表面に間接的に結合させた装置と同様に安定である。特に、例えば、７０℃、６Ｍの尿素溶液による洗浄や、高濃度の洗剤による洗浄のような様々な処理を施しても、デキストランが装置の表面から解離することはない。

誘電性の表層と多孔質素材との結合は、例えばカルボキンメチル化のような、多孔質素材における誘導体の形成をも含んでいる。このような誘導体の形成は、表層に対し悪影響を及ぼす試薬による処理を含んでいるので、表層に結合する前に誘導を行う方が望ましい場合も多い。

誘電性の表層への多孔質素材の結合に次いで、特定の分析物に対する抗体のような生化学物質が、多孔質素材に結合される。そのためには、まず多孔質素材を活性化させる必要がある。例えば、酸化された炭化水素鎖を有する抗体のような酸化ンリコ／を使用することが望ましい。

入射光の光源にはあらゆるものが使用可能であるが、単色光であることが望ましく、更に最も望ましくはレーザーが使用される。このレーザーは、特に、上述の例から得られる槽々の暦に使用された素材に応じて選択される。

照射角度は、例えば平行なビームの光を角度を変えて照射するか、欧州特許出願１１４０３Ｄ５１０９Ａ号における記載のように、扇状のビームの光を所定の角度範囲で同時に照射する等の（Ｓ　ＰＨの場合と関連する）方法で、連続的または同時に検査する。前者では、照射角度の範囲を機械的に走査する１チヤンネル型の検出器が使用される。また、後者では、多くの角度範囲で同時に照射が行われるので、角度解析機能を有する多チヤンネル型の検出器が一般に使用される。

共振に関して、入射光はＦＴＨの原理により中空層と対をなしており、中空層との間に一定の距離を置いて光を伝搬すると、（ＦＴＨの原理により、）この対は解消される。伝搬距離は装置の様々なパラメーターに依存しているが、一般に、１ｍｍないし２ｍｍである。

通常、共振時には、反射光は位相の変化を受け、角度位置は、この位相の変化が起ごった状態で検出される。

多孔質素材に固定化された抗体と抗原との結合のような、中空層の表面における変化は、固定化された生化学物質の厚みに変化をもたらし、共振時の角度位置が変化する。例えば、固定化された物質が入射光の波長の光を吸収するような場合には、反射光の強度が減少する。光の強度低下は、結合状況の指標として使用される。

例ａｌ）　デキストランと誘電性表層とのダイレクトカップリングＩ）　誘電性の中空層を有するＦＴＲバイオセンサーの装置をアセトンで６分間洗浄し、空気乾燥させる。

ＩＩ）　装置を、４０ｍ１のＯ，ＩＭ　ＮａＯＨ溶液中に１４ｇのデキストラン（分子量ｓｏｏ、ｏｏｏ）を加えた溶液とともに室温で４時間反応させ、デキストランでコーティングする。

ＩＩＩ）　装ぼを水洗する。

ｌｖ）　装置を、１０ｍ１の２Ｍ　ＮａＯＨ溶液に１．３ｇのブロモ酢酸を加えた溶液とともに一晩反応させ、固定化されたデキストランをカルボキシメチル化する。

Ｖ）　装置を水洗する。

−２）　ダイレクトカップリングのための他の方法Ｉ）　デキストラン（分子量４５０，０００）の２６％Ｖ／Ｖ水溶液１０ｇを、２Ｍ　ＮａＯＨ溶液ｌにＩＭのブロモ酢酸を加えた溶液１００ｍ１とともに一晩反応させる。

ＩＩＩ）　混合液を水で透析し、凍結乾燥させる。

Ｉｖ）　凍結乾燥物を、０．１Ｍの塩酸（または水）に、２３％冒／Ｗとなるよう溶解する。

Ｖ）　カルボキシメチル化されたデキストラン溶液１０μ■をＦＴＲバイオセンサーの誘電性表層に滴下し、表面に拡げて一晩反応させる。

ｂ〉　ハイドロゲルへの生体高分子のカップリングＩ）　活性化装置の表面にカルボキシメチル化されたデキストランを上記ｓｌ）および−２）の方法で固定化し、更に０．１ＭのＮ−ヒドロキシサクシニアミド（ＮＨ８）と、０．４ＭのＮ−エチル−Ｎ′−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で１０分間処理し、デキストランのカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシサクシニアミドエステルで活性化する。

特許請求の範囲１、固定化された生化学物質を含む生体適合性の多孔質素材が少な（ともその一部に結合された誘電性素材の層を有し、かつ多孔質素材が、誘電性素材の層の表面の縛導および活性化を伴うことなく、ＩＲＭ性素材の層の表面に直接結合されているバイオセンサー。

２、多孔質素材がハイドロゲルである請求項１記載のバイオセンサー。

３、ハイドロゲルが、例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロースのような多ｍ＊、例えばカルボキシメチル誘導体、キサンタンガム、ペクチンのような、これら多糖類の誘導体、および例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールのような、水膨潤性の有機高分子からなるグループから選択される請求項２紀載のバイオセンサー。

４、ハイドロゲルがデキストランおよびその誘導体を含む請求項３記載のバイオセンサー。

５．８）　誘電性素材からなり、屈折率がｎ、である中空層と、ｂ）　屈折率が１１である銹電性基質と、Ｃ）　中空層と基質との間に挟まれた、屈折率が１２である誘電性のスペーサー層とを有し、かつｎ、とｎ、とかいずれもｎｔより大きい請求項１．　２．　３．　または４記載のバイオセンサー。

６、中空層が１ＩｌＩＩ性素材の薄膜である請求項６記載のバイオセンサー。

７、中空層が３０ｎｍ〜５０ｎｍの厚みを有し、かつ中空層が二酸化ジルプニウム、ハフニア、窒化シリコン、二酸化チタニウム、酸化タンタル、および酸化アルミニウムから選択される素材からなるとともに、スペーサー層が１５００ｎｍ〜１５００ｎｍの厚みを有し、かつスペーサー層が弗化マグネシウム、弗化リチウム、および二酸化シリコンから選択される素材からなり、しかも、これらの素材が、スペーサー層の屈折率が中空層の屈折率未満となるよう選択される請求項６記載のバイオセンサー。

８、少なくともその一部に生化学物質を含む生体適合性の多孔質素材が結合した、誘電性素材からなる中空層を有するＦＴＲバイオセンサーの製造方法であって、Ｓ）　多孔質素材の分子を改質する工程と、ｂ）　多孔質素材の分子を中空層の表面に結合させる工程と、Ｃ）　多孔質素材に生体高分子を固定化する工程とを含むＦＴＲバイオセンサーの製造方法。

フロントページの続き（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、ＪＰ、　ＵＳ（７２）発明者　ボラード−ナイト、デニス　ヴエライギリス国　ＡＬ４　０ＲＬ　セント　アルバンズ　ハイフィールド　レーン　ハイフィールド　ホール　２０

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくともその一部に生化学物質を含む生体適合性の多孔質素材が結合した、誘電性素材の層を有するバイオセンサー。
２．多孔質素材がハイドロゲルである請求項１記載のバイオセンサー。
３．ハイドロゲルが、例えはアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロースのような多糖類、例えばカルボキシメチル誘導体、キサンタンガム・ペクチンのような、これら多糖類の誘導体、および例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールのような、水膨潤性の有機高分子からなるグループから選択される請求項２記載のバイオセンサー。
４．ハイドロゲルがデキストランおよびその誘導体を含む請求項３記載のバイオセンサー。
５．多孔質素材が誘電性素材の層の表面に、表面の鋳導や活性化なしに直接結合する請求項１，２，３または４記載のバイオセンサー。
６．多孔質素材がデキストランおよびその誘導体を含む請求項５記載のバイオセンサー。
７．ａ）誘電性素材からなり、屈折率がｎ３である中空層と、ｂ）屈折率がｎ１である誘電性基質と、ｃ）中空層と基質との間に挟まれた、屈折率がｎ２である誘電性のスペーサー層とを有する請求項１，２，３，４，５または６記載のバイオセンサー。
８．中空層が誘電性素材の薄膜である請求項７記載のバイオセンサー。
９．中空層が３０ｎｍ〜５０ｎｍの厚みを有し、かつ中空層が二酸化ジルコニウム、ハフニア、窒化シリコン、二酸化チタニウム、酸化タンタル、および酸化アルミニウムから選択される素材からなるとともに、スペーサー層が５００ｎｍ〜１５００ｎｍの厚みを有し、かつスペーサー層が弗化マグネシウム、弗化リチウム、および二酸化シリコンから選択される素材からなり、しかも、これらの素材が、スペーサー層の屈折率が中空層の屈折率未満となるよう選択される請求項８記載のバイオセンサー。
１０．少なくともその一部に生化学物質を含む生体適合性の多孔質素材が結合した、誘電性素材からなる中空層を有するＦＴＲバイオセンサーの製造方法であって、ａ）孔質素材の分子を改質する工程と、ｂ）争孔質素材の分子を中空層の表面に結合させる工程と、ｃ）多孔質素材に生体高分子を固定化する工程とを含むＦＴＲバイオセンサーの製造方法。